CN102662062B - 检测***病毒非结构蛋白抗体的单克隆抗体阻断elisa试剂盒及方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了检测***病毒(FMDV)非结构蛋白(NSP)抗体的单克隆抗体阻断ELISA试剂盒及方法(FMD NSP B-ELISA)，包括酶标反应板、血清稀释液、25倍浓缩洗涤液、底物溶液、100×浓缩酶标检测抗体、终止液、阳性对照血清和阴性对照血清；所述酶标反应板为两块96孔高亲合力酶标板，先包被了6×组氨酸单克隆抗体或非结构蛋白2C多克隆抗体，并通过单抗或多抗将原核表达的带6×组氨酸标签的***病毒3ABC或2C3AB非结构蛋白捕获；本方法与其他同类试剂盒相比有较高的符合率，而且本方法有更高的阳性血清检出率，适于检测牛、羊与猪等多种易感动物血清。

Description

检测***病毒非结构蛋白抗体的单克隆抗体阻断ELISA试剂盒及方法

技术领域

本发明涉及检测***病毒非结构蛋白抗体的单克隆抗体阻断ELISA(FMDVNSPB-ELISA)试剂盒及方法，属于生物技术领域。

背景技术

***(foot-and-mouth disease，FMD)是由***病毒(foot-and-mouth disease virus，FMDV)感染引起的偶蹄动物共患的一种烈性传染病。由于其发病率极高，严重影响畜牧业生产和国际贸易，因而受到各国的高度重视。***防控主要采取疫苗免疫和屠宰感染和可疑畜的综合性防控措施，而疫苗免疫动物与感染动物都会产生结构蛋白抗体，因此检测结构蛋白抗体的诊断方法很难区分疫苗免疫动物与感染动物。目前畜牧业生产中使用的***疫苗主要是灭活疫苗，灭活疫苗在纯化的过程中除去了大部分非结构蛋白，免疫动物不产生非结构蛋白抗体。自然感染动物体内有病毒复制，既产生非结构蛋白抗体又产生结构蛋白抗体，因此学者们认为检测非结构蛋白抗体对于区别免疫动物与感染动物具有重要意义。

在FMDV几种非结构蛋白中，3D是最早用于诊断的非结构蛋白，但后来从疫苗免疫动物的体内也检测到3D抗体，说明3D蛋白不能区分感染动物和疫苗免疫动物。Mezencio等^[1]证明感染牛和猪体内的非结构蛋白2C抗体减少速度快于3ABC抗体减少速度，而疫苗免疫牛体内有时也能检测到2C的抗体。Mackay^[2]等人发现所有试验感染的有临床症状的动物，1个月能检测到3ABC抗体，1年后3ABC抗体仍为阳性，而亚临床感染动物，2个月后仅有80％动物能检测到血清阳性，从而得出3ABC抗体水平与临床症状之间正相关的结果。Bergmann等^[3]比较了3A、3B、2C、3D和3ABC作为诊断抗原，应用间接ELISA试验检测感染牛的敏感性和准确性，结果3ABC效果最好。现在各国学者以达成共识，检测非结构蛋白3ABC或者3AB抗体是确认动物是否感染FMD的最佳方法。

在***的诊断过程中，人们逐渐认识到ELISA与其他免疫学检测技术相比具有灵敏、特异、廉价、快速、稳定且易于实现自动化操作等优点，因此不仅适用于大量临床标本的检测，也适合血清流行病学调查。ELISA方法分不同的类型，通过间接法包被抗原发展的阻断ELISA或竞争ELISA又较一般的间接ELISA更为敏感与特异；本专利所描述的方法即是采用间接包被抗原的单克隆抗体阻断ELISA方法，属于ELISA方法中较为先进的反应模式。其特点在于，一是采用间接捕获法包被抗原，可以采用单克隆抗体或者单特异性多抗包被，消除了直接包被抗原所产生的非特异性反应，而且可以更好的展示抗原结构，有利于抗原与抗体的特异性结合；二是利用单克隆抗体(McAb)具有高度均质性和高度特异性的特点，以特异性单克隆抗体作为检测抗体，则使得该方法更加特异与敏感，而且可以用于检测牛、羊、猪以及野生反刍类动物等多种易感动物的血清，不同于间接ELISA方法，每种动物血清都要配备相应的酶标抗体。因此，本专利相对间接ELISA方法而言具有在方法学上的优越性。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足提供一种检测***病毒非结构蛋白抗体的单克隆抗体阻断ELISA(FMDV NSP B-ELISA)试剂盒及方法。

检测***病毒非结构蛋白抗体的单克隆抗体阻断ELISA试剂盒，包括酶标反应板、血清稀释液、25倍浓缩洗涤液、底物溶液、100×浓缩酶标检测抗体、终止液、阳性对照血清和阴性对照血清；所述酶标反应板为两块96孔高亲合力酶标板，先包被了6×组氨酸单克隆抗体或非结构蛋白2C多克隆抗体，并通过单抗或多抗将原核表达的带6×组氨酸标签的***病毒3ABC或2C3AB非结构蛋白捕获；

所述血清稀释液：含10％马血清，0.25％酪蛋白，1％海藻糖，0.01％硫柳汞的0.01M磷酸盐(PBS)溶液；

所述25倍浓缩洗涤液：500mL超纯水中加NaCl 200g、KCl 5g、Na₂HPO₄·12H₂O72.5g、KH₂PO₄5g和12.5mL吐温20，补超纯水定容至1000mL，pH为7.4，高压灭菌，室温存放备用；

所述底物溶液：为单组份3，3’，5，5’-四甲基联苯胺(TMB)底物；

所述100×浓缩酶标检测抗体：为辣根过氧化物酶标记的***病毒3B非结构蛋白单克隆抗体，该单克隆抗体针对3B蛋白中²⁴GPYAGPMER³²位表位，是3B蛋白中的自然优势抗原表位，不同血清型病毒之间相对保守；通过将HRP标记的3B单克隆抗体稀释于抗体保存液中制备；

所述终止液：0.3M H₂SO₄溶液，利用超纯水稀释分析纯浓硫酸配制而成；

所述阳性对照血清：采自***病毒感染后1～3个月的牛、羊或猪，经检测，非结构蛋白抗体与结构蛋白抗体均为阳性，经无菌处理后加保存剂制备；

所述阴性对照血清：采自非免疫健康牛、羊和猪，经检测***病毒结构蛋白与非结构蛋白抗体均为阴性，经无菌处理后加保存剂保存。

检测***非结构蛋白抗体的单克隆抗体阻断ELISA方法，包括以下步骤：

A1、于血清稀释板中，将待测血清按1∶5比例稀释于血清稀释液中，吸取稀释好的样品液加入包被好抗原的酶标板中，每孔加入100μL，室温过夜振荡作用18-24h；

A2、次日，用1×PBST洗涤液洗板，反复洗5次，最后一次拍干；

A3、将100×浓缩的酶标检测抗体1∶100稀释至血清稀释液中，加入酶标板，每孔加入100μL，37℃作用1小时；

A4、同上洗涤，最后一次拍干，每孔加入100μL的底物溶液，37℃作用10-15分钟，再底物作用过程中，要注意掌握显色程度，加终止液之前可以通过测定650nm吸光值来确定显色程度，于OD₆₅₀值接近0.7时终止反应，检测效果最佳；

A5、加终止液，每孔100μL，轻振混匀，于10分钟内用酶标仪读450nm吸光值(OD₄₅₀)；

A6、阻断率计算：阻断率(PI)＝1-样品OD₄₅₀/阴性对照OD₄₅₀；

A7、试验成立的条件：阴性对照OD₄₅₀值-阳性对照OD₄₅₀值≥0.8，且阳性对照阻断率应≥60％；

A8、判定标准：牛、羊与猪血清阻断率大于或等于0.46判为非结构蛋白抗体阳性，血清阻断率小于0.46判为非结构蛋白抗体阴性。

使用组氨酸单克隆抗体或非结构蛋白2C多抗作为捕获抗体，***病毒非结构蛋白3B单克隆抗体作为检测抗体，原核表达的***病毒非结构蛋白3ABC或2C3AB作为抗原，建立了一种检测***非结构蛋白3ABC或2C3AB抗体的阻断ELISA。使用该方法检测了大量牛、羊及猪的血清，并用公式(1-样品OD值/阴性对照OD值)来计算血清阻断率，最终确定：牛、羊与猪血清阻断率大于或者等于0.46判为阳性，血清阻断率小于0.46判为阴性。根据此标准检测健康动物血清的特异性≥99.2％，对感染后3～230天牛血清检测敏感性为90.4％。本方法与其他同类试剂盒相比有较高的符合率，而且本方法有更高的阳性血清检出率。

附图说明

图1.不同血清稀释度对应阳性标准血清阻断率对比分析图

图2.不同温度与作用时间下对应阳性血清阻断率对比分析图

图3.牛血清样品阻断率统计图

图4.羊血清样品阻断率统计图

图5.猪血清样品阻断率统计图

图6.三种方法检测两只羊抗体持续时间结果对比图.1～24号与25～48号血清分别对应于40号与54号羊在攻击感染后第3、9、16～418天之间间隔7～30天时间，连续采血24次的检测结果。

图7.三种方法检测4头牛抗体持续时间结果对比图.A、B、C与D分别对应于4009、738、4007与4017号牛在攻击感染后第3、7、22、52、88、123、158、175、229天时抗体检测结果。

具体实施方式

以下结合具体实施例，对本发明进行详细说明。

1  材料与方法

1.1材料

碳酸盐缓冲液(Na₂CO₃/NaHCO₃)及明胶购自SIGMA公司。组氨酸单克隆抗体为购买的商品化试剂(Abmart或Genscript产品)。BCA蛋白浓度测定试剂盒购自Beyotime公司。EZ-Link Plus Activated Peroxidase试剂盒购自Thermo公司。pTriEx-3ABC重组表达质粒(含组氨酸标签)参考以下文献构建：曹轶梅，刘在新，卢曾军，等.***病毒非结构蛋白基因3ABC在大肠杆菌中的表达[J].畜牧兽医学报，2004，35(1)：115-118。pET-2C3AB表达载体参考以下文献构建：张小丽，田美娜，卢曾军，等.FMDV非结构蛋白2C主要表位区与3AB基因的组合表达与活性分析.生物工程学报，2009，25(1)：10-15[J]。表达3B单克隆抗体的杂交瘤细胞由本实验室采用常规方法研制并保存。标准对照血清和其他相关试剂均由国家***参考实验室购买。Ceditest NS ELISA试剂盒为Prionics公司产品(Schlieren-Zurich，Switzerland)，是一种国外研制的阻断ELISA试剂盒，3ABC-ELISA试剂盒为本实验室研制的产品，已经获得新兽药证书并上市销售。

1.2血清样本

来自临床健康的动物血清包括：135份牛血清样品，130份羊血清样品，208份猪血清样品，经检测O、A、Asia 1型结构蛋白抗体均为阴性。感染动物血清样品包括：O型或Asia 1型FMDV攻击感染后3～230天的牛血清样品共94份(其中36份血清来自4头牛于感染后间隔一定时间采样9次)，O型攻击感染后12天至1年的羊血清样本51份(其中48份血清来自2只羊感染后间隔一定时间持续采集的血样)，O型与Asia 1型攻击后11天至6个月猪血清样本48份(其中16份血清来自1只感染发病猪间隔一定时间持续采血约6个月)。田间血清样本：包括193份田间牛血清样本，来自曾发生疫情地区的临床健康牛群。

1.3非结构蛋白3ABC或2C3AB融合蛋白的表达、纯化及复性；参考以下文献：

曹轶梅，刘在新，卢曾军，等.***病毒非结构蛋白基因3ABC在大肠杆菌中的表达[J].畜牧兽医学报，2004，35(1)：115-118。

曹轶梅，卢曾军，刘在新，等.大肠埃希氏菌表达FMDV 3ABC非结构蛋白的纯化复性与活性检测[J].中国兽医科技，2003，33(8)：22-25。

1.4.非结构蛋白3B单克隆抗体的制备、纯化及鉴定；参考以下文献：

李永亮，田美娜，卢曾军，等.***病毒非结构蛋白3B单克隆抗体的制备和鉴定[J].江苏农业学报，2009，25(2)：296-300。

1.5试剂的处理

1.5.1相关试剂的绝对定量

使用BCA蛋白浓度测定试剂盒对3B单克隆抗体及***病毒非结构蛋白3ABC或2C3AB进行蛋白质含量的测定。

1.5.2单克隆抗体的标记

使用EZ-Link Plus Activated Peroxidase试剂盒对***病毒非结构蛋白3B单克隆抗体进行辣根过氧化物酶标记，并用ELISA法对比标记前、后单克隆抗体的效价。

1.6FMDV非结构蛋白阻断ELISA(FMDV NSP B-ELISA)最佳反应条件的确定

1.6.1方阵滴定法测定3ABC或2C3AB抗原的工作浓度

以不同浓度3ABC或2C3AB蛋白抗原(纵向梯度)包被酶标板4℃过夜，加1∶21稀释的标准阴阳性血清与之反应1h后，加不同倍数稀释的(横向梯度)酶标二抗反应1h，加底物显色，终止，酶标仪读数，确定抗原的最适工作浓度。

1.6.2方阵滴定法测定单克隆抗体的工作浓度

以不同浓度的组氨酸单克隆抗体或2C多抗(纵向梯度)包被酶标板4℃过夜，加工作浓度的3ABC或2C3AB蛋白反应1h，再加不同浓度的酶标3B单克隆抗体(横向梯度)与之反应1h，加底物显色，终止，酶标仪读板，方阵滴定法确定组氨酸单克隆抗体及3B单克隆抗体的工作浓度。

1.6.3最佳血清稀释度的确定

3ABC或2C3AB抗原、组氨酸单抗及3B单抗的最适工作浓度确定之后，将牛、羊及猪标准阴、阳性血清做1∶5，1∶10，1∶20，1∶40四个稀释度，进行阻断ELISA检测。根据每个稀释度标准阴、阳性血清OD值计算出阳性标准血清阻断率(阻断率＝1-样品或标准阳性血清OD值/阴性标准血清OD值)。对获得的阻断率进行比较，取阻断率最大的稀释度作为最佳血清稀释度。

1.6.4加入血清后反应时间及反应温度的优化

在本试验中发现，加入血清后，不同的反应时间及反应温度的组合对反应最终的阻断率影响很大，因此设定了以下几个反应条件：①37℃反应1小时；②37℃反应2小时；③37℃反应3小时；④室温反应12小时；⑤室温反应18小时；⑥室温反应24小时。对各反应条件下的标准阳性血清阻断率进行对比分析，取阻断率达最大时的最短作用时间为最佳反应条件。

1.7判定标准的确定

根据背景清楚的临床健康的非免疫动物血清与感染动物血清样本阻断率的检测结果，来确定本方法的判定标准；基于检测非免疫健康牛阴性血清135份，感染牛血清94份；健康羊阴性血清123份，感染羊血清59份；健康猪阴性血清203份，感染猪血清48份的结果，统计阴、阳性血清阻断率分布区间，确定本阻断ELISA的判定标准。

1.8本方法的特异性和敏感性检测

根据确定的判定标准，对来自非免疫健康动物的阴性血清样本与感染动物血清样本的检测结果进行分析，确定本方法对阴性样本检测的特异性和对感染动物血清样本检测的敏感性。

1.9同类试剂盒的符合率对比试验

分别用Ceditest NS ELISA试剂盒、FMDV 3ABC-ELISA试剂盒及本方法检测135份健康牛血清，193份田间牛血清样本，94份感染牛血清；130健康羊血清，51份感染羊血清；208份健康猪血清、36份感染猪血清，确定本方法与另外两种方法检测结果之间的符合性。

2 试验结果

2.1非结构蛋白3ABC与2C3AB蛋白鉴定结果

3ABC与2C3AB融合蛋白通过包涵体纯化、亲合层析等纯化过程后，经过SDS-PAGE电泳分析，目的蛋白的纯度达到了90％以上，电泳显示3ABC融合蛋白分子量大小为59ku的蛋白带，2C3AB融合蛋白分子量大小为47.6ku，与预期大小一致。

2.23B单克隆抗体的鉴定

腹水纯化后经过SDS-PAGE电泳分析，有两条大小分别45ku及25ku的蛋白带。经过间接ELISA鉴定，与3B及3ABC蛋白反应，而与2C及3D蛋白不反应，可知其是3B单克隆抗体。

2.3.1BCA蛋白浓度测定试剂盒测得3B单克隆抗体的浓度为0.932mg/mL，3ABC融合蛋白的浓度为0.0507mg/mL。

2.3.2辣根过氧化物酶标记前的3B单克隆抗体经间接ELISA测定其效价为1∶400000，标记后3B单克隆抗体的效价为1∶200000。

2.4FMDV NSP B-ELISA最佳反应条件的确定结果

2.4.13ABC抗原、组氨酸单抗及3B单抗的最适工作浓度

通过方阵滴定法确定的3ABC抗原的最适工作浓度为0.128μg/mL，组氨酸单抗的最适工作浓度为1μg/mL，3B单抗的最适工作浓度为0.117μg/mL。

2.4.2血清稀释度的优化结果

对各稀释度阳性标准血清阻断率进行对比分析(见图1)，血清1∶5稀释进行检测，获得的阴、阳性血清的阻断率差异最大，能够满足对检测敏感性的要求，而且按此比例稀释血清，血清用量也可以接受，因而确定血清最佳稀释度为1∶5。

2.4.3加入血清后反应时间及反应温度的优化结果

对不同反应温度与作用时间的阻断率进行对比(见图2)，37℃较室温作用达到最大阻断率的时间缩短，但室温过夜反应18～24小时的敏感性最好，减少作用时间将会降低检测的敏感性。因而，确定最佳反应条件是，室温(20～25℃)作用18～24h。

2.4.4经过以上反应条件最终制定了FMDV NSP B-ELISA的操作流程

①包被：用包被缓冲液(0.05mol/L pH 9.6碳酸盐缓冲液)稀释组氨酸单抗或2C多抗至工作浓度，加入酶标板，每孔加100μL，4℃过夜。将此酶标板用PBST洗涤5遍，拍干。

②封闭：每孔加封闭液(含1％明胶的PBS溶液)100μL，37℃封闭1h，用PBST洗涤3遍，拍干。

③用组氨酸单克隆抗体捕获3ABC蛋白或用2C多抗捕获2C3AB蛋白：用血清稀释液将3ABC或2C3AB蛋白稀释至工作浓度，每孔100μL加入酶标板，37℃反应1h，PBST洗涤5遍，拍干。

④加待测血清：用血清稀释液将阳性、阴性对照血清及待测血清样品1∶5稀释，每孔100μL加入酶标板，反应24小时，PBST洗涤5遍，拍干。

⑤加酶标3B单抗：用血清稀释液将酶标3B单抗稀释至最适工作浓度，每孔100μL加入酶标板，37℃反应1h，PBST洗涤5遍，拍干。

⑥加底物显色：每孔100μL加入TMB底物溶液，37℃避光反应10～15min。

⑦终止：每孔加入0.3mol/L H₂SO₄使反应终止。

⑧测定OD值：用酶标仪测定450nm波长OD值。

⑨计算血清样品抗体阻断率。

2.5阳性及阴性判定标准(临界值)的确定

根据阴性血清与阳性血清的检测结果(图3、4、5)，确定牛、羊与猪血清非结构蛋白抗体阴、阳性判定标准为：阻断率大于或等于0.46判为阳性，如阻断率小于0.46判为阴性。非结构蛋白抗体为阳性，说明该动物或者该动物的来源群体曾经感染或存在FMDV感染的情况，应该采取相应的防控措施。

2.6特异性及敏感性判定结果

检测非免疫健康动物血清及感染动物血清后，以检测阴性血清数量与总健康血清数的比值计算特异性，以检测阳性血清数与感染动物血清总数的比值计算敏感性。从结果(表1)可以看出本方法的对94份来自感染后3～230天牛检测敏感性为90.4％，对感染后12天至1年的51份羊血清的检测敏感性达96.1％，对48份感染后10天～6个月的猪血清的检测敏感性达85.4％。对来自健康牛、羊与猪血清的特异性在99.2％以上。

表1.FMDVNSP B-ELISA特异性及敏感性判定结果

2.7对比试验结果

2.7.1通过对比试验可以看出，本方法与Ceditest NS ELISA试剂盒和3ABC-ELISA试剂盒检测牛血清的符合率为95.4％(331/347)和93.6％(395/422)(表2)，检测羊血清的符合率为90.2％(37/41)和95.6％(173/181)(表3)，检测猪血清的符合率为93.6％(73/78)和98.4％(240/244)(表4)，显示本方法的特异性与同类试剂盒相近，而对感染动物血清与疫区田间牛血清的阳性检出率均高于同类试剂盒，显示本检测方法较好的特异性与敏感性，具有很好的开发应用前景。

表2.FMDV NSP B-ELISA与其他两种方法检测牛血清的符合率

*括号内为一一对应符合数

表3.FMDV NSP B-ELISA与其他两种方法检测羊血清的符合率

表4.FMDV NSP B-ELISA与其他两种方法检测猪血清的符合率

2.7.2对非结构蛋白抗体持续时间的对比检测结果

两只试验感染羊与4头试验感染牛，于间隔一定时间后分别采集血清，分别用Ceditest NS ELISA试剂盒及3ABC-ELISA试剂盒及本方法检测，绘制抗体消长曲线，结果见图6与图7。根据图6与图7显示，FMDVNSP B-ELISA方法可检测到感染后第7天到418天血清中的NSP抗体，与CeditestNS ELISA试剂盒具有非常好的符合性。

实施例2

试剂盒组成

试剂盒由8种试剂包括：酶标反应板，血清稀释液，25倍浓缩洗涤液，底物溶液，100×浓缩酶标检测抗体，终止液，阳性对照血清和阴性对照血清，另外还有4张封板膜和说明书。

配制方法：

1、酶标反应板(Antigen Coated Plates)：两块96孔高亲合力酶标板，先包被了6×组氨酸单克隆抗体或单特异性的2C多抗，并通过单克隆抗体或2C多抗将原核表达的带组氨酸标签的***病毒3ABC或2C3AB非结构蛋白捕获，酶标板通过加封闭稳定剂、干燥等处理过程后，真空密封保存，保存期可达1.5年。

2、血清稀释液(Serum Dilution Buffer)：含10％马血清(Hyclone)，0.25％酪蛋白，1％海藻糖，0.01％硫柳汞的0.01M磷酸盐(PBS)溶液，保存期可达1.5年。

3、25倍浓缩洗涤液(25×PBST Buffer)：500mL超纯水中加NaCl200g、KCl5g、Na₂HPO₄·12H₂O72.5g、KH₂PO₄5g和12.5mL吐温20，补超纯水定容至1000mL，pH为7.4。高压灭菌(10pa 15min)，室温存放备用。

4、底物溶液(Substrate Solution)：为单组份3，3’，5，5’-四甲基联苯胺(TMB)底物，为购买的商品化试剂(BioFX，Freiburg，Germany)，直接分装使用，保存期4年。

5、100×浓缩酶标检测抗体(HRP Tagged Detecting Antibody)：为辣根过氧化物酶(HRP)标记的***病毒3B非结构蛋白单克隆抗体，该单克隆抗体针对3B蛋白中²⁴GPYAGPMER³²位表位，是3B蛋白中的优势抗原表位；通过将HRP标记的3B单克隆抗体稀释于抗体保存液(Sigma)中制备，保存期可达1.5年。

6、终止液(Stop Solution)：0.3M H₂SO₄溶液，利用超纯水稀释分析纯浓硫酸配制而成。

7、阳性对照血清(Positive Control)：采自感染发病康复后1-3个月的牛、羊或猪，经检测，非结构蛋白抗体与结构蛋白抗体均为阳性，经无菌处理后加保存剂制备，保存期可达1.5年。

8、阴性对照血清(Negative Control)：采自非免疫健康牛、羊和猪，经检测结构蛋白与非结构蛋白抗体均为阴性，经无菌处理后加保存剂保存，保存期可达1.5年。

9、其他物品：包括一次性封板膜4片与使用说明书。

检测方法：

1、于血清稀释板中，将待测血清按1∶5比例稀释于血清稀释液中，吸取稀释好的样品液加入包被好抗原的酶标板中，每孔加入100μL，室温过夜振荡作用18～24h。

2、次日，用1×PBST洗涤液洗板，反复洗5次，最后一次拍干。

3、将100倍浓缩的酶标检测抗体1∶100稀释至血清稀释液中，加入酶标板，每孔加入100μL，37℃作用1小时。

4、同上洗涤，最后一次拍干，每孔加入100μL的底物溶液，37℃作用10～15分钟，在底物作用过程中，要注意掌握显色程度，加终止液之前可以通过测定650nm吸光值(OD)来确定显色程度，于OD₆₅₀值接近0.7时终止反应，检测效果最佳。

5、加终止液，每孔100μL，轻振混匀，于10分钟内用酶标仪读450nm吸光值(OD₄₅₀)。

6、阻断率计算：阻断率(PI)＝1-样品OD₄₅₀/阴性对照OD₄₅₀。

7、试验成立的条件：阴性对照OD₄₅₀值-阳性对照OD₄₅₀值≥0.8，且阳性对照阻断率应≥60％。

8、判定标准：牛、羊与猪血清阻断率大于或等于0.46判为非结构蛋白抗体阳性，血清阻断率小于0.46判为非结构蛋白抗体阴性。

应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。

Claims (1)

1.检测***病毒非结构蛋白抗体的单克隆抗体阻断ELISA试剂盒，其特征在于，包括酶标反应板、血清稀释液、25倍浓缩洗涤液、底物溶液、100×浓缩酶标检测抗体、终止液、阳性对照血清和阴性对照血清；所述酶标反应板为两块96孔高亲合力酶标板，先包被了非结构蛋白2C多克隆抗体，并通过2C多抗将原核表达的***病毒2C3AB非结构蛋白捕获于酶标板；所述血清稀释液：含10％马血清，0.25％酪蛋白，1％海藻糖，0.01％硫柳汞的0.01M磷酸盐(PBS)溶液；所述25倍浓缩洗涤液：500mL超纯水中加NaCl 200g、KCl5g、

Na₂HPO₄·12H₂O72.5g、

KH₂PO₄5g和12.5mL吐温20，补超纯水定容至1000mL，pH为7.4，高压灭菌，室温存放备用；

所述底物溶液：为单组份3，3’，5，5’-四甲基联苯胺(TMB)底物；

所述100×浓缩酶标检测抗体：为辣根过氧化物酶标记的***病毒3B非结构蛋白单克隆抗体，该单克隆抗体针对3B蛋白中₂₄GPYAGPMER₃₂位表位，是3B蛋白中的自然优势抗原表位，不同血清型病毒之间相对保守；通过将HRP标记的3B单克隆抗体稀释于抗体保存液中制备；

所述终止液：0.3M H₂SO₄溶液，利用超纯水稀释分析纯浓硫酸配制而成；

所述阳性对照血清：采自***病毒感染后1～3个月的牛、羊或猪，经检测，非结构蛋白抗体与结构蛋白抗体均为阳性，经无菌处理后加保存剂制备；

所述阴性对照血清：采自非免疫健康牛、羊和猪，经检测***病毒结构蛋白与非结构蛋白抗体均为阴性，经无菌处理后加保存剂保存；检测***非结构蛋白抗体的单克隆抗体阻断ELISA方法，

步骤：

A1、于血清稀释板中，将待测血清按1∶5比例稀释于血清稀释液中，吸取稀释好的样品液加入包被好抗原的酶标板中，每孔加入100μL，室温过夜振荡作用18-24h；

A2、次日，用1×PBST洗涤液洗板，反复洗5次，最后一次拍干；

A3、将100×浓缩的酶标抗体1∶100稀释至血清稀释液中，加入酶标板，每孔加入100μL，37℃作用1小时；

A4、同上洗涤，最后一次拍干，每孔加入100μL的底物溶液，37℃作用10-15分钟，再底物作用过程中，要注意掌握显色程度，加终止液之前可以通过测定650nm吸光值来确定显色程度，于OD₆₅₀值接近0.7时终止反应，检测效果最佳；

A5、加终止液，每孔100μL，轻振混匀，于10分钟内用酶标仪读450nm吸光值(OD₄₅₀)；

A6、阻断率计算：阻断率(PI)＝1-样品OD₄₅₀/阴性对照OD₄₅₀；

A7、试验成立的条件：阴性对照OD₄₅₀值-阳性对照OD₄₅₀值≥0.8，且阳性对照阻断率应≥60％；

A8、判定标准：牛、羊与猪血清阻断率大于或等于0.46判为非结构蛋白2C3AB抗体阳性，血清阻断率小于0.46判为非结构蛋白2C3AB抗体阴性。