CN104961809B - 牛***o型结构蛋白vp1抗体酶联免疫检测试剂盒 - Google Patents

牛***o型结构蛋白vp1抗体酶联免疫检测试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种牛***病毒结构蛋白抗体酶联免疫检测试剂盒。一种***病毒结构蛋白抗体酶联免疫检测试剂盒，包括牛***病毒结构蛋白VP1抗原表位多肽包被的酶联反应板和酶标记抗抗体；所述***病毒结构蛋白VP1抗原表位多肽为序列表中序列1所示的多肽、序列表中序列2所示的多肽和序列表中序列3所示的多肽。本试剂盒使用化学合成VP1抗原肽包被反应板，抗原用量少、灵敏性和特异性高，可以高效地检测是否存在***病毒感染。本发明试剂盒特异性好、敏感、高效，具有良好的市场前景。

Description

牛***O型结构蛋白VP1抗体酶联免疫检测试剂盒
技术领域
本发明涉及一种***病毒结构蛋白抗体酶联免疫检测试剂盒，特别是牛***O型病毒结构蛋白VP1抗体酶联免疫检测试剂盒。
背景技术
***(Foot and Mouth Disease，FMD)是由***病毒(Foot-and-mouthdisease virus，FMDV)引起的以感染偶蹄动物为主的急性、热性、高度接触传染性和快速远距离传播的动物疫病，以传染性强、传播速度快、危害严重而著称。世界动物卫生组织(OIE)将其列为必须通报的多种动物共患传染病之一，我国将其列为一类动物传染病。
***传染性高，传播迅速，感染猪、牛、羊等牲畜常导致幼畜死亡，成年动物生产能力急剧下降。该病传播迅速，可以引起世界性的大流行，不仅对畜牧业造成巨大的经济损失，而且严重影响动物及其产品的国际贸易和声誉。由于FMD的巨大危害性，美国权威著作《家畜传染病》早在1981年版中就声明：FMD不仅是经济性疾病，同时也是政治性疫病。
***病毒属于小核糖核酸病毒科，***病毒属。由“假”20面体对称的衣壳和病毒核酸构成，该病毒粒子的整个外形是球形，不是严格的正20面体。完整的病毒颗粒包括衣壳和RNA两部分，衣壳由VP1，VP2，VP3和VP4等4种结构蛋白各60个分子组成。结构蛋白VP1大部分暴露在病毒粒子表面，是决定病毒抗原性的主要成分，也是刺激机体产生中和抗体的主要蛋白。4种结构蛋白中VP1变异性最大，VP2较为保守，VP4最保守。病毒衣壳蛋白的功能有：保护RNA免遭核酸酶降解；识别特异性细胞受体，决定宿主范围和组织嗜性；决定病毒的抗原性；释放和传递病毒RNA通过细胞膜进入易感细胞内；指导选择和包装病毒RNA。
2004年OIE公布的***血清学检测方法有3种：病毒中和试验(VNT)、液相阻断ELISA(LPB-ELISA)、固相竞争ELISA(SPC-ELISA)，其中病毒中和试验是3种方法中最为经典的方法，是评价其他方法的黄金标准。1996年，***世界参考实验室建立了液相阻断ELISA方法，经过不断完善和健全，已成为各国大规模血清学检测的方法，用于检测动物免疫抗体、评估动物免疫状况、进行血清学调查等，该方法的敏感性、特异性和稳定性一直在国际上得到公认，是目前使用最广的***血清学检测方法。2001年，***世界参考实验室建立了固相竞争ELISA方法，该方法除了具有液相阻断ELISA方法的传统优势外，其特异性更好，操作更为简单(其操作时间仅为3.5h)，2004年被OIE确立为***血清学调查的最新推荐方法。
***是关系到国家经济安全的重大动物疫病。目前，大多数发展中国家和地区都通过接种疫苗的方法来控制***的流行。我国防控FMD主要采取疫苗免疫和抗体监测为主的综合防控政策，通过接种疫苗提高畜群整体抗体水平来预防***的感染和传播。因此***感染的快速诊断、牛免疫效果评价、自然感染和疫苗免疫的鉴别诊断成为防控***的部分关键技术。
发明内容
本发明的目的是提供一种新的用于诊断***易感动物牛是否感染***O型病毒的结构蛋白抗体酶联免疫检测试剂盒。
本发明提供还一种***病毒结构蛋白VP1抗原表位多肽，为序列表中序列1所示的多肽、序列表中序列2所示的多肽或序列表中序列3所示的多肽。
本发明提供还一种***病毒结构蛋白VP1抗原表位多肽组合物，为由序列表中序列1所示的多肽、序列表中序列2所示的多肽和序列表中序列3所示的多肽组成的混合物。
本发明的***病毒结构蛋白抗体酶联免疫检测试剂盒，包括***病毒结构蛋白VP1抗原表位多肽包被的酶联反应板和酶标记抗抗体；所述***O型病毒结构蛋白VP1抗原表位多肽为序列表中序列1所示的多肽、序列表中序列2所示的多肽和序列表中序列3所示的多肽。
所述序列表中序列1所示的多肽、序列表中序列2所示的多肽和序列表中序列3所示的多肽的质量比为(0.5～2.0)∶(0.5～2.0)∶1，优选为1∶1∶1。所涉及的包被抗原采用固相化学合成的方法生产，包被抗原含有***病毒结构蛋白VP1的主要抗原位点，可与***病毒感染后或免疫后产生的结构蛋白VP1抗体特异结合。所述酶标记抗抗体的标记酶为辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶；所述酶标记抗抗体为酶标记羊抗牛IgG；所述酶标记抗抗体优选为辣根过氧化物酶标记的羊抗牛IgG。
所述酶联反应板为可拆卸96孔酶标板；所述***病毒结构蛋白VP1抗原表位多肽为化学人工合成得到。
所述***病毒结构蛋白VP1抗原表位多肽包被的酶联反应板的最佳制备条件是：将所述***病毒结构蛋白VP1抗原表位多肽溶于100μl的pH9.6的碳酸盐溶液，然后加到96孔聚苯乙烯酶联反应板，每孔150ng，在37℃放置2～4h，再4～8℃下放置过夜(8-12小时)，使多肽抗原与酶联反应板充分结合，然后按照300μl/孔加入含有1％(g/ml)牛血清白蛋白(BSA)的PBS缓冲液(pH＝7.4)，37℃封闭处理2～3h，用洗涤缓冲液(浓缩洗涤液用蒸馏水或去离子水20倍稀释得到洗涤缓冲液)洗涤后甩干，待酶联反应板干燥后4℃密封保存。
所述试剂盒中含有显色液和终止液；当标记酶为辣根过氧化物酶时显色液由显色液A液和显色液B液组成，所述显色液A液为含0.6mg/ml过氧化氢尿素的柠檬酸磷酸盐缓冲液；所述显色液B液为0.2mg/ml的四甲基联苯胺(TMB)溶液，使用时两者以1∶1的比例混合；当标记酶为碱性磷酸酶时，显色液为4-硝基酚磷酸盐缓冲液；所述终止液为2mol/L的硫酸溶液。
所述试剂盒还包括阴性对照血清、阳性对照血清；所述阴性对照血清为用无***抗体的正常牛血清；所述阳性对照血清为以所述***病毒结构蛋白VP1抗原表位多肽为免疫原免疫牛得到的血清；
所述的阳性对照血清具体是以上述人工化学合成的包被抗原(***病毒结构蛋白VP1抗原表位多肽)作为免疫原，免疫6月龄健康黄牛(***病毒抗体阴性)牛，制备高免血清，加入1000U/ml链霉素和1000U/ml青霉素，过0.2μm滤膜除菌，作为试剂盒的阳性对照血清。
所述的阴性对照血清是用6月龄健康黄牛(***病毒抗体阴性)隔离观察7日后，颈静脉无菌采集血液，加入1000U/ml链霉素和1000U/ml青霉素，过0.2μm滤膜除菌，作为试剂盒阴性对照血清。
所述试剂盒还包括样品稀释液和浓缩洗涤液；样品稀释液为含有0.5％(g/ml)酪蛋白的0.01M、pH为7.4的PBS缓冲液(过0.45μm滤膜)；浓缩洗涤液：0.01M，pH 7.4，含有0.5％(ml/ml)Tween-20和0.05％(g/ml)叠氮钠防腐剂的磷酸盐缓冲液(经过0.2μm滤膜除菌)。
本发明试剂盒的检测程序为：
1、平衡：将试剂盒从冷藏环境中取出，置室温平衡30min备用；液体试剂用前混匀。
2、配液：将浓缩洗涤液用蒸馏水或去离子水20倍稀释得到洗涤缓冲液；
3、设定：留1个空白孔，3个阴性对照孔，和2个阳性对照孔，其余为待测样本孔。
4、待测标本预稀释：使用样品稀释液将待检样品血清、阴性对照血清、阳性对照血清按照1∶21的比例稀释；往稀释板孔内每孔加100μl样本稀释液，分别加入5μl待测样本。
5、加样：空白孔不加样；3个阴性对照孔各加100μl阴性对照，2个阳性对照孔各加100μl阳性对照；其余孔分别按预先设定加100μl稀释的待测样本。加样过程时间跨度应尽量短。
6、温育：震荡混匀，置37℃温箱或水浴锅中，反应30min。
7、洗板：弃去反应液，每孔加300μl稀释后的洗涤缓冲液，浸泡15s，甩弃洗液。连续洗板4次后拍干。
8、加酶：空白孔不加酶；其余各孔加100μl辣根过氧化物酶标记的羊抗牛IgG。
9、温育：置37℃温箱或水浴锅中，反应30min。
10、洗板：弃去反应液，每孔加入稀释后的洗涤缓冲液300μl，浸泡15s，甩弃洗涤液。连续洗板5次后拍干。
11、显色：每孔分别加入100μl的底物显色液(其中溶液A和溶液B以体积比为1∶1的比例混合)。加盖，37℃恒温箱里反应15min；
12、每孔分别加入50μl终止液终止反应，混匀；
13、测定每孔的OD450值(加终止液的反应板应在15min内读取OD450值)。
检测结果的判定：
1、阴性对照OD450平均值应该≤0.15，否则无效。
2、阳性对照每个检测值应该在0.9-1.9之间，否则无效。
3、临界值的计算：临界值＝0.17×阳性对照OD450值平均值。
待检血清测定OD450值≥临界值者判为阳性；待检血清测定OD450值＜临界值者判为阴性。
本发明的试剂盒，可用于检测***结构蛋白抗体，以判断被检动物是否感染***病毒或接种***疫苗，其中，动物***病毒病为牛***病毒病，具体可以为牛***O型病毒引起的牛***病毒病。
上述***病毒结构蛋白VP1抗原表位多肽或权利要求2所述的***病毒结构蛋白VP1抗原表位多肽组合物在制备检测是否感染动物***病毒病的试剂盒中的应用也属于本发明的保护范围。
本发明的积极效果在于：
本发明采用生物信息学方法对结构蛋白的抗原表位进行精确分析，从VP1蛋白上的主要抗原表位上筛选出适合ELISA检测用的肽段。该肽段集中了抗原表位，具有灵敏性高、特异性强的优点。
同时，采用先进的固相合成肽技术合成多肽抗原用于包被酶标反应板以及制备试剂盒中的阳性对照血清。
另外，由于试剂盒中使用的包被抗原是化学合成多肽，不含杂蛋白，纯度高，进一步提高了检测***结构蛋白抗体的效率，以判断被检动物是否感染***病毒或接种疫苗。
总之，本发明利用VP1结构蛋白，建立一种特异性、敏感性和重复性好的间接ELISA方法，为牛***免疫抗体的检测和感染抗体的诊断提供一种简便有效的新方法，为***综合防控提供技术支持。本发明的***病毒结构蛋白酶联免疫吸附试验诊断试剂盒用于检测动物是否感染***病毒或接种***疫苗，有利于减少我国***爆发所带来的损失，也有利于我国***防控体系的建立。
本发明试剂盒采用化学合成结构蛋白VP1主要抗原位点的抗原肽包被酶联反应板，抗原用量少、灵敏度高、特异性强，可以有效地检测***病毒感染或接种灭活疫苗后产生的结构蛋白VP1抗体，以判断被检动物是否感染***病毒或接种疫苗，与牛***病毒非结构蛋白抗体检测试剂盒联用，可区分***病毒感染动物及疫苗免疫动物。实验结果表明，本发明的试剂盒重复性好，特异性强，灵敏度高。能满足不同层次人员的需要，具有广阔的市场前景和良好的经济、社会效益。
具体实施方式
以下参照具体的实施例来说明本发明。本领域技术人员能够理解，这些实施例仅用于说明本发明，其不以任何方式限制本发明的范围。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的药材原料、试剂材料等，如无特殊说明，均为市售购买产品。
实施例1、牛***O型结构蛋白VP1抗体酶联免疫检测试剂盒包被抗原的制备
本试验针对国内***流行毒株的不同，采用生物信息学方法对***O型病毒VP1结构蛋白多个亚型进行精确分析，筛选出合适的肽段，用全自动多肽合成仪分别合成出根据流行毒株序列设计的3条肽，序列分别为序列表中序列1、序列2和序列3所示，制成纯度约90％的更新更全的包被抗原，能够适应***病毒不断突变的特性，提高抗体阳性的检出率。多肽合成方法可为常规方法，本发明使用如下方法合成本发明的三条多肽，作为本发明试剂盒的包被原。
本发明的包被抗原可使用Applied Biosystem全自动多肽合成仪(型号433A)制备。运用Merrifield固相合成法，采用的是Fmoc(9-fluorenylmethyloxycarbonyl，9-芴甲氧羰基)修饰的氨基酸，使用Rink Amide MBHA树脂做为固相载体。生产过程包括多肽抗原固相合成、多肽裂解和鉴定、抗原纯化、冷冻干燥以及保存五部分。以下分别进行说明：
一、包被抗原固相合成
1、合成试剂的准备
合成包被抗原氨基酸序列如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示。
依据包被抗原序列以及合成规模准备合适的Fmoc修饰的氨基酸(购自NOVA公司)，加入至相应的Cartridge中。同样按要求合成规模称树脂5g，放入反应腔，将上下盖子拧紧，贴标签，记录所合成肽的名称，批号，反应腔的TARE及所称树脂的重量。将反应腔装入合成仪。配制适量的合成试剂包括100％的NMP、3％的AIM(己酰咪唑)、35％的PIP(哌啶)、100％的MeOH(甲醇)等放置到相对应的试剂瓶中。
2、合成仪状态的检测
检查433A多肽合成仪器是否正常运行，开机后，运行Run Self Test程序，仪器自检各项指标是否正常。另外检查氮气是否充足，***表压是否正常(433A正常表压10.2psi)。合成前应对仪器的性能有所了解，所以要对每种合成试剂的流速进行测定。433A合成仪：发送Flow Rate1-18到合成仪，选择Main Menu-Module Test-按Prer或next找Module A、ModuleD、ModuleI、ModuleI、Module A)-按Start-按more进行测量或观察，若流量不合适，则调节下阀门压力，直至达到要求(具体检测要求见下表1)。
表1.多肽合成仪流速检测标准表
试剂 瓶号 Module 标准范围
35％Piperidine 1 A 1.0～1.2ml
3％AIM 4 D 1.0～1.2ml
100％MeOH 9 I 3.5～4.0ml
DIC 8 I 0.45～0.55g
100％NMP 10 A 2.6～2.8ml
3、包被抗原合成开始
在433A合成仪的程序中将要合成的氨基酸序列发送Std Fmoc 1.0 Sol DIC90到合成仪上。File-New-Sequence-编辑合成肽的序列，保存。File-New-Run，检查Chemistry是否为Std Fmoc 1.0 Sol DIC 90；Sequence是否为所存名字；设定Cycles；保存。最后发送到合成仪上。
Main Menu-Cycle Monitor-begin，开始运行。
4、包被抗原合成进行
Fmoc基团的脱除，Fmoc基团的芴环系的吸电子作用使9-H具有酸性，易被较弱碱除去，反应时用哌啶(PIP)进攻9-H，β消除形成二苯芴烯，很容易被二级环胺进攻形成稳定的加成物。Fmov基团的脱除后暴露出“-NH2”基团以进行合成反应。然后加入活化的下一个Fmoc基团保护的氨基酸和1-羟基苯并***(1-hydroxybenzotriazole，HOBT)至反应器内。
如上述的多肽序列，合成的时候是从C端开始至N端，依照特定的顺序，依次不断地重复合成步骤(合成仪按程序自动完成，具体循环步骤如下表2)。期间观察记录试剂用量及运行情况。
表2.包被抗原合成循环步骤
5、包被抗原合成结束
包被抗原合成结束后合成仪将自动停止，并且肽树脂(肽现在还连接在树脂上)基本洗涤干净。然后从多肽合成仪上取下反应器，再用100％甲醇洗涤肽树脂3次后，在通风橱内吹干，然后将多肽树酯全部转移至棕色的聚乙烯瓶内，放入-20℃冰箱内，封口膜密封备用。
二、包被抗原的裂解及鉴定
1、多肽抗原的裂解
经上述反应所得到的多肽是与固相载体通过化学键结合在一起的，必须通过特定的有机强酸的酸解把多肽与固相载体分离。酸解的同时也除去了各个氨基酸官能团上的保护基。步骤如下：
从冰箱内取出合成的多肽树酯(指肽还连接在树脂上)，放入一只2L的圆底烧瓶内，在通风橱内向烧瓶中加入90ml三氟乙酸(Trifluoroacetic acid，TFA)、10ml的三丙基硅烷(TIS)和磁搅拌子，然后稳定地将烧瓶放置在磁力搅拌器上，室温下持续搅拌1h至反应完全。反应结束后，使用带冷阱的旋转蒸发仪持续蒸发30～120min除去粗产品中的TFA。然后用二甲基甲酰氨(DMF)多次清洗多肽抗原的粗品，最后将混合在一起的树脂用砂心漏斗过滤出来，既得到包被抗原。
2、包被抗原的鉴定
多肽抗原合成完毕后用基质辅助激光解吸飞试时间质谱法
(MODAL-TOF)和反相高压液相色谱法(RP-HPLC)进行定性定量分析，用常见的氨基酸分析来鉴定所合成的肽。
3、包被抗原纯化
将环化后的多肽抗原使用循环式切向过滤膜包进行超滤(用PALL公司生产的Tangential Flow Device循环式切向过滤膜包以及与其配套的蠕动泵)，多肽抗原作为大分子不能通过一定孔径的滤膜，而前期合成过程以及后期环化反应形成或引进的小分子杂质则可以通过滤膜。然后再通过孔径为0.2μm过滤器除菌，将最后所得溶液分装到无菌塑料瓶内，贴上标签。标签上注明多肽的名称、编号、生产批号、浓度、生产日期、保存期限及保存条件，分装后，储存于-20℃或-40℃备用。
4、包被抗原冷冻干燥
为了便于长期保存和运输，需要将包被抗原进行冷冻干燥以得到固体状态的多肽。将预先冷冻好的包被抗原放置于Labconco的冷冻干燥机上进行干燥，得到固体状态的包被抗原。包装后贴上标签。标签上注明多肽的名称、编号、生产批号、浓度、生产日期、保存期限及保存条件。
实施例2、牛***O型结构蛋白VP1抗体酶联免疫检测试剂盒的制备
***病毒结构蛋白抗体酶联免疫检测试剂盒包括：
(1)包被有***病毒抗原的96孔可拆聚苯乙烯酶联反应板；2×96孔。
(2)辣根过氧化物酶标记的羊抗牛IgG多克隆抗体(购自SouthernBiotech公司，货号6030-05)，2瓶(各12ml)。
(3)阳性对照血清：是以实施例1中人工化学合成的包被抗原作为免疫原，免疫6月龄健康黄牛(***病毒抗体阴性)制备的高免血清，加入1000U/ml链霉素和1000U/ml青霉素，过0.2μm滤膜除菌，作为试剂盒的阳性对照血清。1管(1ml)。
(4)阴性对照血清：是用6月龄健康黄牛(***病毒抗体阴性)隔离观察7日后，颈静脉无菌采集血液，加入1000U/ml链霉素和1000U/ml青霉素，过0.2μm滤膜除菌，作为试剂盒阴性对照血清。1管(1.5ml)。
(5)底物显色液：由两种溶液混合组成，溶液A为含0.6mg/ml过氧化氢尿素的柠檬酸磷酸盐缓冲液(1瓶(12ml))；溶液B为0.2mg/ml的四甲基联苯胺(TMB)溶液(1瓶(12ml))；使用时两者以体积比为1∶1的比例混合。
(6)浓缩洗涤液(20×)：含有0.5％(ml/ml)Tween-20和0.05％(g/ml)叠氮钠防腐剂的0.01M磷酸盐缓冲液，pH为7.4，后经过0.2μm滤膜除菌。50ml/瓶，2瓶。
(7)终止液：2mol/L的硫酸溶液。1瓶(12ml).
(8)样品稀释液：含有0.5％(g/ml)酪蛋白的0.01M、pH为7.4的PBS缓冲液，过0.45μm滤膜。2瓶(各12ml)。
根据需要，试剂盒中还可以有血清稀释板2块(96孔)，用于血清样品的梯度稀释。
其中，包被有***病毒抗原的96孔可拆聚苯乙烯酶联反应板的制备方法为：将实施例1制备的多肽抗原溶于pH 9.6的碳酸盐溶液，然后加到96孔聚苯乙烯酶联反应板，每孔150ng(其中序列表中序列1所示的多肽与序列表中序列2所示的多肽及序列表中序列3所示的多肽，三种多肽的质量比为1∶1∶1)，在37℃放置2～4h，再4～8℃下放置过夜使多肽抗原与酶联反应板充分结合。然后按照300μl/孔加入含1％(g/ml)牛血清白蛋白(BSA)的PBS缓冲液(pH＝7.4)，37℃封闭2～3h，用洗涤缓冲液(浓缩洗涤液用蒸馏水或去离子水20倍稀释得到洗涤缓冲液)洗涤后甩干，待酶联反应板干燥后4℃密封保存。
实施例3、牛***O型结构蛋白VP1抗体酶联免疫检测试剂盒的符合率试验
一、牛***O型结构蛋白VP1抗体酶联免疫检测试剂盒使用方法
1、平衡：将保存在4℃的试剂盒取出，平衡至室温备用；液体试剂用前混匀。
2、配液：将浓缩洗涤液用蒸馏水或去离子水20倍稀释得到洗涤缓冲液；
3、设定：留1个空白孔，3个阴性对照孔，和2个阳性对照孔，其余为待测样本孔。
4、待测标本预稀释：使用样品稀释液将待检样品血清、阴性对照血清、阳性对照血清按照1∶21的比例稀释；往稀释板孔内每孔加100μl样本稀释液，分别加入5μl待测样本。
5、加样：空白孔不加样；3个阴性对照孔各加100μl阴性对照，2个阳性对照孔各加100μl阳性对照；其余孔分别按预先设定加100μl稀释的待测样本。加样过程时间跨度应尽量短。
6、温育：震荡混匀，置37℃温箱或水浴锅中，反应30min。
7、洗板：弃去反应液，每孔加300μl步骤2中得到的洗涤缓冲液，浸泡15s，甩弃洗液。连续洗板4次后拍干。
8、加酶：空白孔不加酶；其余各孔加100μl辣根过氧化物酶标记的羊抗牛IgG多克隆抗体。
9、温育：置37℃温箱或水浴锅中，反应30min。
10、洗板：弃去反应液，每孔加入稀释后的洗涤缓冲液300μl，浸泡15s，甩弃洗涤液。连续洗板5次后拍干。
11、显色：每孔分别加入100μl的底物显色液(其中溶液A和溶液B以体积比为1∶1的比例混合)。加盖，37℃恒温箱里反应15min；
12、每孔分别加入50μl终止液终止反应，混匀；
13、测定每孔的OD450值(加终止液的反应板应在15min内读取OD450值)。
检测结果的判定：
1、阴性对照OD450平均值应该≤0.15，否则无效。
2、阳性对照每个检测值应该在0.9-1.9之间，否则无效。
3、临界值的计算：临界值＝0.17×阳性对照OD450值平均值。
待检血清测定OD450值≥临界值者判为阳性；待检血清测定OD450值＜临值者判为阴性。
二、乳鼠血清中和试验(MSN)方法
目前国内常用的***血清学检测方法之一是乳鼠中和试验(MSN)，因此用本试剂盒同乳鼠中和试验进行符合率试验。
材料
1.免疫血清50份抗体阳性血清(牛口蹄灭活疫苗免疫后的阳性血清)，由中牧实业股份有限公司兰州生物药厂提供。
2.健康牛血清50份由中牧实业股份有限公司兰州生物药厂提供。
3.试验用病毒为***OM II病毒(O型鼠化弱毒OMII毒株，购自兰州兽医研究所，由中牧实业股份有限公司兰州生物药厂保存和使用)将病毒经6～8日龄乳鼠balb/c传2代后，收集病毒。用3～4日龄乳鼠测定并调整其毒价至1000LD50/0.2ml，置于-20℃保存待用。
乳鼠血清中和试验方法如下：将血清用PBS作2倍稀释，取1ml与等量100LD50/ml的OM II系病毒液混合，于37℃孵育1小时，然后接种3日龄乳鼠(颈部皮下注射0.2ml)，每组(亦即每个待检血清)4只，同时设立病毒对照、健康对照及标准阳性血清对照组，每组3只，观察7d，记录乳鼠死亡比率并判定结果，若乳鼠4/4或3/4健活，则待检血清为阳性(R)，若乳鼠4/4或3/4死亡，则待检血清为阴性(-)；若乳鼠2/4健活或2/4死亡，则判定结果可疑(±)，需加倍重复测定，重复试验中，有1组呈阳性，则判定为阳性。
敏感性＝判定阳性血清样本数/待测血清样本数
三、符合率试验结果：
利用实施例2制备的牛***O型结构蛋白VP1抗体酶联免疫检测试剂盒与乳鼠中和试验(MSN)分别检测100份牛血清，其中阳性血清(上述免疫血清)50份，阴性血清(上述健康牛血清)50份，结果显示如表3，牛***病毒结构蛋白VP1抗体酶联免疫检测试剂盒的敏感性为98％，而乳鼠血清中和试验的敏感性只有90％，在50份阳性血清中，两种方法检测结果一致的为46份，因此，本试剂盒和乳鼠血清中和试验的符合率为92％，因此本试剂盒具有较高的敏感性。对阴性血清的测试两者的符合率为100％，检测结果均为阴性(见表3)。
牛***病毒结构蛋白VP1抗体酶联免疫检测试剂盒与乳鼠中和试验一共检测100份牛血清，其中96份牛血清两种方法检测结果一致，4份牛血清检测结果有差异，符合率为96％。
表3.牛***O型结构蛋白VP1抗体酶联免疫检测试剂盒(ELISA)及乳鼠血清中和试验法(MSN)对阳性血清和阴性血清的检测结果
实施例4、牛***O型结构蛋白VP1抗体酶联免疫检测试剂盒的敏感性试验
敏感性试验是使用实施例2中制备的牛***O型结构蛋白VP1抗体酶联免疫检测试剂盒检测牛感染血清(牛血清由中牧实业股份有限公司兰州生物药厂提供，经鉴定为牛***O型病毒感染血清)和疫苗免疫后血清(牛口蹄灭活疫苗免疫后的阳性血清，由中牧实业股份有限公司云南保山厂提供)的结果。使用实施例2制备的三批***病毒结构蛋白抗体酶联免疫吸附试验诊断试剂盒(批次NOZM001、NOZM002、NOZM003)，依照实施例3中牛***O型结构蛋白VP1抗体酶联免疫检测试剂盒使用方法对200份牛***O型病毒感染血清及200份牛口蹄灭活疫苗免疫后的阳性血清检测敏感性试验。
批号为NOZM001试剂盒的检测结果显示本试剂盒对200份感染牛血清的敏感性为195/200×100％＝97.5％；对200份牛***疫苗免疫牛血清的敏感性为198/200×100％＝99％。批号为NOZM002试剂盒的检测结果显示本试剂盒对200份感染牛血清的敏感性为197/200×100％＝98.5％；对200份***疫苗免疫牛血清的敏感性为197/200×100％＝98.5％。批号为NOZM003试剂盒的检测结果显示试剂盒对200份感染牛血清的敏感性为197/200×100％＝98.5％；对200份***疫苗免疫牛血清的敏感性为195/200×100％＝97.5％。
实施例5、牛***O型结构蛋白VP1抗体酶联免疫检测试剂盒的特异性试验
使用实施例4中的三批试剂盒依照实施例3中所述的***合成肽结构蛋白抗体酶联免疫检测试剂盒的使用方法对300份健康牛血清(中牧实业股份有限公司保山厂和兰州生物药厂提供)、10份牛***亚洲I型(Asia1)阳性血清(中牧实业股份有限公司兰州生物药厂提供)、10份牛***A型(A)阳性血清(中牧实业股份有限公司兰州生物药厂提供)和10份牛病毒性腹泻病毒(BVDV)阳性血清(中牧实业股份有限公司兰州生物药厂提供)分别进行检测。
试剂盒的特异性检测结果如下表(表4)显示，对300份健康牛血清的检测结果显示，NOZM001试剂盒的特异性为99.0％，NOZM002试剂盒的特异性为98.6％，NOZM003试剂盒的特异性为99.3％。对10份牛***亚洲I型(Asia I)阳性血清、10份牛***A型(A)阳性血清和10份牛病毒性腹泻病毒阳性血清检测结果均显示为阴性，因此三个试剂盒对这30份阳性血清检测的特异性均为100％。
表4.***合成肽结构蛋白抗体酶联免疫检测试剂盒特异性检测结果
实施例6、牛***O型结构蛋白VP1抗体酶联免疫检测试剂盒与同类制品比较试验
使用实施例4中的三批试剂盒依照实施例3中所述的牛***O型结构蛋白VP1抗体酶联免疫检测试剂盒的使用方法对276份临床血清样本(中牧实业股份有限公司云南保山厂、兰州生物药厂提供)进行检测，同时使用上海优耐特生物医药公司(UBI)生产的牛、羊***病毒VP1结构蛋白抗体酶联免疫吸附试验诊断试剂盒对该276份临床血清进行平行检测，操作方法与判定标准分别按照(UBI)说明书的操作步骤及判定标准进行。上海优耐特生物医药公司的牛、羊***病毒VP1结构蛋白抗体酶联免疫吸附试验诊断试剂盒的判定标准：(1)阴性对照孔平均OD值应≤0.15，每个阳性对照孔OD值应≥0.9，且≤1.9.否则，试验无效。临界值＝0.23×阳性对照孔平均OD值。(2)被检样品孔OD值＜临界值时，判为阴性，即为抗***病毒VP1结构蛋白抗体阴性。(3)被检样品孔OD值＞临界值，判为阳性。
使用实施例4中的试剂盒检测276份血清，其阳性率为37.0(102/276)，阴性率为63.0％(174/276)。上海优耐特生物医药公司(UBI)的牛、羊***病毒VP1结构蛋白抗体酶联免疫吸附试验诊断试剂盒检测的阳性率为36.2％(100/276)，阴性率为63.8％(176/276)。两者的阳性符合率为98.0％(100/102)，阴性符合率为98.9％(174/176)。两个试剂盒对276份血清样本进行检测，共有258份血清的检测结果一致，其总符合率为93.5％(258/276)。

Claims (13)

1.***病毒结构蛋白VP1抗原表位多肽，为序列表中序列1所示的多肽。
2.***病毒结构蛋白VP1抗原表位多肽组合物，为由序列表中序列1所示的多肽、序列表中序列2所示的多肽和序列表中序列3所示的多肽组成的混合物；所述序列表中序列1所示的多肽和序列表中序列2所示的多肽及序列表中序列3所示的多肽的质量比为(0.5～2.0):(0.5～2.0):1。
3.一种***病毒结构蛋白抗体酶联免疫检测试剂盒，包括***病毒结构蛋白VP1抗原表位多肽包被的酶联反应板和酶标记抗抗体；所述***病毒结构蛋白VP1抗原表位多肽选自序列表中序列1所示的多肽、或者序列表中序列1所示的多肽和序列表中序列2所示的多肽组成的混合多肽、或者序列表中序列1和序列表中序列3所示多肽组成的混合多肽、或者序列表中序列1所示的多肽、序列表中序列2所示的多肽和序列表中序列3所示的多肽组成的混合多肽。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：当所述***病毒结构蛋白VP1抗原表位多肽为由序列表中序列1所示的多肽、序列表中序列2所示的多肽和序列表中序列3所示多肽组成的混合多肽时，所述序列表中序列1所示的多肽和序列表中序列2所示的多肽及序列表中序列3所示的多肽的质量比为(0.5～2.0):(0.5～2.0):1。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于：所述序列表中序列1所示的多肽、序列表中序列2所示的多肽和序列表中序列3所示多肽的质量比为1:1:1。
6.根据权利要求3-5中任意一项的试剂盒，其特征在于：所述酶标记抗抗体的标记酶为辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶；所述酶标记抗抗体为酶标记羊抗牛IgG。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于：所述酶标记抗抗体优选为辣根过氧化物酶标记的羊抗牛IgG。
8.根据权利要求3-5中任意一项的试剂盒，其特征在于：所述酶联反应板为可拆卸96孔酶标板；所述***病毒结构蛋白VP1抗原表位多肽为化学人工合成得到。
9.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于：所述***病毒结构蛋白VP1抗原表位多肽包被的酶联反应板的获得方法是将所述***病毒结构蛋白VP1抗原表位多肽溶于100μl的pH 9.6的碳酸盐溶液，然后加到96孔聚苯乙烯酶联反应板，每孔150ng，在37℃放置2-4小时，再4-8℃下放置8-12小时，使多肽抗原与酶联反应板充分结合，然后按照300μl/孔加入含有1g/100ml牛血清白蛋白的pH7.4的PBS缓冲液，37℃封闭处理2-3小时，洗涤后甩干，待酶联反应板干燥后4℃密封保存。
10.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中还含有显色液和终止液；当标记酶为辣根过氧化物酶时显色液由显色液A液和显色液B液组成，所述显色液A液为含0.6mg/ml过氧化氢尿素的柠檬酸磷酸盐缓冲液，所述显色液B液为0.2mg/ml的四甲基联苯胺溶液；当标记酶为碱性磷酸酶时，显色液为4-硝基酚磷酸盐缓冲液；所述终止液为2mol/L的硫酸溶液。
11.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括阴性对照血清、阳性对照血清；所述阴性对照血清为用无***抗体的正常牛血清；所述阳性对照血清为以所述***病毒结构蛋白VP1抗原表位多肽为免疫原免疫牛得到的血清；所述试剂盒还包括样品稀释液和浓缩洗涤液；样品稀释液为含有0.005g/100ml酪蛋白的0.01M、pH为7.4的PBS缓冲液；浓缩洗涤液：0.01M，pH 7.4，含有体积百分浓度为0.8％～1.2％的Tween-20和0.05g/100ml叠氮钠防腐剂的磷酸盐缓冲液。
12.权利要求1所述的***病毒结构蛋白VP1抗原表位多肽或权利要求2所述的***病毒结构蛋白VP1抗原表位多肽组合物在制备检测是否感染动物***病毒病的试剂盒中的应用；其中，动物***病毒病为牛***病毒病。
13.根据权利要求12所述的应用，其特征在于：所述动物***病毒为牛***O型病毒引起的牛***病毒病。
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