CN103389377A - 液相芯片检测水产品中氯霉素的方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物工程技术领域，涉及一种液相芯片检测水产品中氯霉素的检测方法。该方法包括如下步骤：（1）制备氯霉素的人工抗原；（2）制备氯霉素的单克隆抗体并纯化；（3）利用步骤（1）得到的人工抗原偶联液相芯片荧光微球；（4）利用步骤（2）得到的单克隆抗体进行生物素化；（5）使用步骤（3）得到的偶联的微球以及步骤（4）得到的生物素化的抗体，通过液相芯片法检测水产品中氯霉素残留。本发明方法可检测氯霉素残留指标，快速、敏感、特异性强，氯霉素的检出限低于0.1ng/mL。

Description

液相芯片检测水产品中氯霉素的方法

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，涉及一种液相芯片检测水产品中氯霉素的检测方法。

背景技术

氯霉素(chloramphenicol,CAP)是从委内瑞拉链丝菌中提取制得的一类广谱抗生素，自1948年上市以来,一直是治疗伤寒、副伤寒和沙门氏菌的首选药物,并因其效高价廉,在国内外畜牧业中也广为应用。但是，随着对氯霉素临床应用的深人研究，发现长期微量摄人氯霉素，不仅使沙门氏菌、大肠埃希菌等产生耐药性，还会引起机体正常菌群失调，抑制骨髓机能,导致再生障碍性贫血和其他恶性血液病等相关疾病，严重危害着人类的健康。近年来美国、欧盟、日本等国家都规定禁止氯霉素用于食用动物，而且在出口产品中不得检出氯霉素。

我国农业部2002年《动物性食品中兽药最高残留限量》文件中明文规定该药为禁止用于所有食品的动物兽药，食品中不能检出。但是部分畜禽养殖户盲目追求经济效益、滥用CAP的现象仍然存在。

发明内容

本发明要解决的问题是提供一种可检测水产品中CAP的方法。旨在解决兽药残留检测单一、耗时、成本高等问题，也为进一步同时检测四个兽药残留指标奠定了基础。该方法的建立可满足水产品氯霉素的检测快速、准确的要求，同时，为我国水产品兽药残留的日常监控提供一种新的适用方法。

本发明提供了一种检测水产品中氯霉素的方法，所述方法具体步骤包括以下步骤：

（1）制备氯霉素的人工抗原；

（2）制备氯霉素的单克隆抗体并纯化；

（3）利用步骤（1）得到的人工抗原偶联液相芯片荧光微球；

（4）利用步骤（2）得到的单克隆抗体进行生物素化；

（5）使用步骤（3）得到的偶联的微球以及步骤（4）得到的生物素化的抗体，通过液相芯片法检测水产品中氯霉素残留。

所述的步骤（2）中，氯霉素的单克隆抗体的腹水效价为1:2.56×10⁶。

步骤（5）中，所述的检测水产品中氯霉素残留的步骤依次为：包被好的微球加入处理好的氯霉素样品溶液，随后分别加入偶联有CAP抗原的微球以及生物素化的氯霉素抗体；然后加入稀释好的SA-PE，最后加入终止液，检测荧光强度。

步骤（5）中，包被好的微球一部分加入处理好的氯霉素样品溶液，另一部分加入系列氯霉素标准溶液；标准溶液的浓度包括25ng/mL、12.5ng/mL、6.25ng/mL、,3.125ng/mL、1.6ng/mL、0.8ng/mL、0.4ng/mL、0.2ng/mL和0.1ng/mL。

所述的检测荧光强度是通过Luminex 200仪器检测荧光强度值，并用Luminex version2.1软件分析数据。

检测氯霉素的抗体稀释度为：1:3200。

所述的SA-PE的稀释度为1:100。

具体而言，本发明的方法包括如下步骤：

1，制备氯霉素人工抗原；

2，氯霉素单克隆抗体的制备和纯化；

3，氯霉素单克隆抗体的生物素化；

4，制备耦联有氯霉素抗原的液相芯片荧光微球；

5，建立检测水产品中氯霉素的液相芯片法。

步骤1中，所述氯霉素抗原的制备方法具体为：将氯霉素与卵清白蛋白进行偶联，形成人工抗原。

步骤2中，所述的氯霉素单克隆抗体的制备和纯化方法具体为：采用活性酯法将含有梭基的半抗原琥珀氯霉素与载体蛋白(OVA)进行偶联，用重氮化法将含有芳香氨基的半抗原与载体蛋白进行偶联，抗原乳化。免疫小鼠，加强免疫，采集氯霉素抗血清，获得较纯的氯霉素单克隆抗体。

免疫和纯化的过程具体为：取BALB/C小鼠4只，免疫前眼眶取血作为阴性血清，首次免疫用CAP-OVA与等体积完全弗氏佐剂乳化后腹腔注射，剂量为100μg/只；2周后用CAP-OVA与弗氏不完全佐剂混合后再次免疫；以后每隔1周加强免疫1次，改用不完全弗氏佐剂依次在尾部静脉注射注射。融合前3d强化免疫1次，小鼠尾静脉缓慢直接注射CAP-OVA 250μg/只。按常规方法进行细胞融合：将免疫小鼠的脾细胞与SP2/0骨髓细胞融合，再经过4次亚克隆，筛选到能稳定分泌CAP单克隆抗体的杂交瘤细胞株。对建株后的杂交瘤细胞进行扩增培养。腹腔注射7周龄的BALB/c雌性小鼠，用灭菌降植烷以每只0.5mL腹腔注射，10d后腹腔接种用不完全培养基稀释的处于对数生长期的杂交瘤细胞，每只分别注射2×10⁶个细胞，待小鼠腹部膨大，精神萎靡时，采集腹水，用硫酸铵沉淀法纯化腹水，并用DEAE纤维素层析柱纯化腹水后，得较纯的CAP单克隆抗体。

氯霉素的单克隆抗体的腹水效价为1:2.56×10⁶。

步骤3中，所述的氯霉素特异性单克隆抗体的生物素化，具体为：取氯霉素单克隆抗体1mg，用45μL 10mM Sulfo-NHS-Biotin进行溶解。室温下，搅拌反应4-5h，使抗体充分生物素化。接着用0.1mol/L，pH7.4的PBS过YM-10柱，置换缓冲液并除去未反应的小分子BNHS。小量分装各种生物素化抗体，-20℃冷冻保存。

步骤4中，所述的制备耦联有氯霉素抗原的液相芯片荧光微球，是将氯霉素单克隆抗体与发出不同荧光的微球偶联。具体操作步骤为：将4℃保存的微球放置于室温20～30min，涡旋微球（2～3min为宜），各吸取100μL荧光微球加入到2管1.5ml的离心管中，13000r/min离心4min去除保护液，用三蒸水洗涤后，用400μL0.1M pH 6.2磷酸缓冲液重悬微球。分别加入10μL 50mg/mL Sulfo-NHS和10μL 50mg/ml EDC，混匀后37℃作用20min。离心去上清，将微球用900μL 0.05M MES重新悬浮，离心去上清，洗涤微球两次。用400μL0.05M MES重悬微球，分别加入纯化的氯霉素人工抗原，混匀后37℃作用2～3h（期间，每隔15min涡旋混匀一次）。离心去上清，加入900μL PBS-TBN（含有0.05%Tween-20、0.1%BSA、0.05%叠氮钠的0.01M PBS）重悬微球，混匀后离心去上清，洗涤微球两次。加入200μL PBS-TBN重悬微球。用血细胞计数器进行计数。

步骤5中，所述的液相芯片法检测水产品中氯霉素的方法包括样品前处理、将微球与样品孵育、加入SA-PE反应以及终止。

所述前处理待测样品的步骤包括：匀浆好的组织加入蒸馏水和乙酸乙酯；离心，移取上清，氮气吹干；残留物用正己烷溶解，再加入PBS，离心；吸除上层正己烷，取下层溶液用于检测。

具体步骤为：

①样品前处理。准确称取已匀浆好的组织3.0g，3ml的蒸馏水混合，再加入6mL乙酸乙酯，最大速度震荡10min；室温条件下，6000rpm离心10min；移取4mL上清到另一新的试管，60℃水浴氮气吹干，残留物用1.0mL的正己烷溶解，再加入0.5mL的PBS，漩涡振荡1min；室温条件下，6000rpm离心10min，吸除上层正己烷，取50μL下层溶液用于检测。

②偶联好的微球放置室温20～30min，涡旋微球（2～3min为宜），于96孔培养板中分别加入25μL/孔配好的系列氯霉素标准溶液（25ng/mL、12.5ng/mL、6.25ng/mL、,3.125ng/mL、1.6ng/mL、0.8ng/mL、0.4ng/mL、0.2ng/mL和0.1ng/mL），在另外的微孔中加入处理好的样品溶液25μL，随后分别加入偶联有CAP的微球各1μL/2000个，以及生物素化的氯霉素抗体各25μL；还在一孔中加入25μL稀释液作空白对照，其余步骤同样品溶液的操作。37℃振荡作用60min。

③加入稀释好的SA-PE，37℃振荡作用30min。

④加入100μL终止液，通过Luminex 200仪器检测荧光强度值（median fluorescenceintensity,MFI），并用Luminex version 2.1软件分析数据。

本发明提供了一种检测水产品中氯霉素的液相芯片的方法。首先制备氯霉素的人工抗原，同时，制备了氯霉素单克隆抗体并将之纯化。分别将氯霉素人工抗原耦联液相芯片荧光微球，分别将氯霉素抗体生物素化。根据间接竞争ELISA的原理，建立同时检测水产品中氯霉素残留的液相芯片法，并确定最佳试验条件。本发明方法可以检测氯霉素残留指标，整个反应可以在2小时内完成，其快速、敏感、特异和同步检测多个兽药残留的特点可以应用于水产品兽药残留的日常监控，其检测灵敏度为氯霉素的最低检出限低于0.1ng/mL。

上述同时检测水产品中氯霉素的液相芯片方法使用了液相芯片技术，该技术使用了特定的荧光微球，这些微球以聚苯乙烯为基质，在微球制造过程中掺入了红色和橙色两种荧光染料（这两种染料各有10种不同区分），从而可标记上100种不同的颜色，形成一个具有独特光谱地址的含有100个不同微球的阵列。利用这100种微球，可以分别标记上100种不同的探针分子，不同微球上的探针分子与样品中需要检测的各种目标分子进行特异性结合，报告分子与目标分子特异性结合，即构成了液相芯片***，能同时对一个样品中多达100种不同目标分子进行检测。

与传统的检测诊断方法相比，液相芯片技术具有如下优点：

①灵敏度高、特异性强、稳定性好、重复性好。液相芯片的灵敏度是常规的ELISA方法的灵敏度10～100倍；液相芯片的反应发生在准均相的液体环境中，在反应中液相环境更有利于保持蛋白质的天然构象，不仅有利于探针和被检测物的反应，也更能保证反应的特异性和稳定性；检测***中的两束激光同时分别检测微球分类荧光（特异性）和报告荧光（敏感性），只有与分类荧光同时出现的报告荧光信号才被检测记录，更加提高了结果的特异性。液相芯片技术在对每个指标的检测中，在同一个反应体系中有其相对应的1000～5000颗相同的微球。检测时，抽取其中的100～500颗微球读数，最终的数据是取其所有值的中位数，这样可以把误差减到最小，从而使检测结果重复性好。

②样本需要量小，成本相对较低。液相芯片技术的血清用量较ELISA法、化学发光法、电化学发光法要少得多。液相芯片中微球表面积大，单个微球可结合多达约（1～2）×10⁶个目标分子，因此只需极少量样品即可同时进行多种成分检测，便于临床采样分析；同时试剂用量少，所需成本较低，可节约成本，减少人力消耗。

③反应快速，耗时短。液相芯片技术的反应环境为液相，微球上固定的探针（或抗体）与待检样品均在溶液中反应，其彼此间碰撞几率与速度相对于固相芯片或ELISA等反应模式可增加10倍以上，反应时间甚至可缩短到十几分钟，因此可提高反应速度。而且微球直径很小（约5～6μm），容易混悬在液体中，为生物分子反应提供近似生理的液相环境，反应快速、充分、需时短。抗原-抗体等蛋白质分子相互作用的结果可在瞬间经流式细胞检测***判定后由电脑以数据信息的形式记录下来，更节省了反应过程的时间。

④高通量，可进行多元化分析，适用范围广。目前商业化微球采用双色荧光编码技术，可同时对100种目标分子进行检测。一次可以同时检测多种指标，这与传统方法的逐个检测相比是一个质的飞跃；通过对微球表面的修饰，微球表面可以包被抗体、抗原、细胞因子、蛋白质或核酸、配体、受体等各种抗体或受体分子，从而满足不同检测和功能的研究需要，可适用于各种分析研究；强大的软件分析***和高通量检测***，更方便快捷直观地获得更多信息。

与现有技术相比，本发明可以检测CAP并且可以根据需要进行灵活组合，联合检测，且操作简单，用时短，传统的高效色谱法和ELISA方法无法做到这点。利用该发明可以快速、廉价、准确地检测水产品中的兽药残留。

附图说明

图1是液相芯片检测CAP的标准曲线。

图2是液相芯片检测CAP特异性图。

具体实施方式

下面对本发明的实施例作详细说明：本实施例在本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明的保护范围应以所附权利要求为准。

实施例1制备氯霉素人工抗原

将氯霉素与卵清白蛋白进行偶联，形成人工抗原。

实施例2氯霉素单克隆抗体的制备和纯化

用活性酯法将含有梭基的半抗原琥珀氯霉素与载体蛋白(OVA)进行偶联，用重氮化法将含有芳香氨基的半抗原与载体蛋白进行偶联，抗原乳化。取BALB/C小鼠4只，免疫前眼眶取血作为阴性血清，首次免疫用CAP-OVA与等体积完全弗氏佐剂乳化后腹腔注射，剂量为100μ/只；2周后用CAP-OVA与弗氏不完全佐剂混合后再次免疫；以后每隔1周加强免疫1次，改用不完全弗氏佐剂依次在尾部静脉注射注射。融合前3d强化免疫1次，小鼠尾静脉缓慢直接注射CAP-OVA 250μL/只。按常规方法进行细胞融合：将免疫小鼠的脾细胞与SP2/0骨髓细胞融合，再经过4次亚克隆，筛选到能稳定分泌CAP单克隆抗体的杂交瘤细胞株。对建株后的杂交瘤细胞进行扩增培养。腹腔注射7周龄的BALB/c雌性小鼠，用灭菌降植烷以每只0.5mL腹腔注射，10d后腹腔接种用不完全培养基稀释的处于对数生长期的杂交瘤细胞，每只分别注射2×10⁶个细胞，待小鼠腹部膨大，精神萎靡时，采集腹水，用硫酸铵沉淀法纯化腹水，并用DEAE纤维素层析柱纯化腹水后，得较纯的CAP单克隆抗体。

实施例3氯霉素特异性单克隆抗体的生物素化

分别取氯霉素单克隆抗体1mg，用45μL 10mM Sulfo-NHS-Biotin进行溶解。室温下，搅拌反应4-5h，使抗体充分生物素化。接着用0.1mol/L，pH7.4的PBS过YM-10柱，置换缓冲液并除去未反应的小分子BNHS。小量分装各种生物素化抗体，-20℃冷冻保存。

实施例4制备耦联有氯霉素抗原的液相芯片微球

将4℃保存的微球放置于室温20～30min，涡旋微球（2～3min为宜），各吸取100μL荧光微球加入到2管1.5mL的离心管中，13000r/min离心4min去除保护液，用三蒸水洗涤后，用400μL0.1M pH 6.2磷酸缓冲液重悬微球。分别加入10μL50mg/mL Sulfo-NHS和10μL 50mg/ml EDC，混匀后37℃作用20min。离心去上清，将微球用900μL 0.05M MES重新悬浮，离心去上清，洗涤微球两次。用400μL 0.05M MES重悬微球，分别加入纯化的氯霉素人工抗原，混匀后37℃作用2～3h（期间，每隔15min涡旋混匀一次）。离心去上清，加入900μL PBS-TBN（含有0.05%Tween-20、0.1%BSA、0.05%叠氮钠的0.01M PBS）重悬微球，混匀后离心去上清，洗涤微球两次。加入200μL PBS-TBN重悬微球。用血细胞计数器进行计数。

实施例5样品前处理

准确称取已匀浆好的组织3.0g，3ml的蒸馏水混合，再加入6mL乙酸乙酯，最大速度震荡10min；室温条件下，6000rpm离心10min；移取4mL上清到另一新的试管，60℃水浴氮气吹干，残留物用1.0mL的正己烷溶解，再加入0.5mL的PBS，漩涡振荡1min；室温条件下，6000rpm离心10min，吸除上层正己烷，取50μL下层溶液用于检测。

实施例6液相芯片法同时检测水产品中氯霉素

取偶联好的微球放置室温20～30min，涡旋微球（2～3min为宜），于96孔培养板中分别加入25μL/孔配好的系列氯霉素标准溶液（25ng/mL、12.5ng/mL、6.25ng/mL、,3.125ng/mL、1.6ng/mL、0.8ng/mL、0.4ng/mL、0.2ng/mL和0.1ng/mL），在另外的微孔中加入处理好的样品溶液25μL，随后分别加入偶联有CAP的微球各1μL/2000个，以及生物素化的氯霉素抗体各25μL；还在一孔中加入25μL稀释液作空白对照，其余步骤同样品溶液的操作。37℃振荡作用60min。加入稀释好的SA-PE，37℃振荡作用30min。加入100μL终止液，通过Luminex 200仪器检测荧光强度值（median fluorescence intensity,MFI），并用Luminex version 2.1软件分析数据。

实施例7检测结果判定

先计算标准样品的平均荧光强度（median fluorescence intensity,MFI）为纵坐标，以CAP的浓度的对数值分别做横坐标，做标准曲线。根据每个检测样品的MFI就可从标准曲线上读出其相对应的样品的浓度。再乘以相应的稀释倍数。

1）标准曲线与灵敏度

以MFI为纵坐标，CAP标准溶液浓度的对数值为横坐标，绘制出标准曲线（图1）。如图1所示，该方法绘制出的两种兽药残留液相芯片检测的Logistic回归标准曲线方程，曲线关系良好，决定系数R²＞0.99。该方法的检测灵敏度低于0.1ng/mL。

2）精确度试验

以批内误差和批间误差来表示该方法的精确度。①批内误差：每一标准样品浓度作5次重复，以其批内变异系数表示批内误差。②批间误差：重复已建立的方法操作，连续作5次，以其批间变异系数表示批间误差。检测结果经SPSS检验，批内（见表1）和批间的结果都无显著性差异，重复性好。

表1同一批标准品重复结果

3）回收率计算

取在3g空白黄鳝肉样中分别加入氯霉素，添加量分别为20ng/g、8ng/g、1ng/g，各添加浓度样品作三个重复，进行样品前处理，提取液进行测定。从标准曲线上求出浓度值，以回收率确定其准确度（见下表2）。

表2黄鳝肉样氯霉素添加回收试验结果

实施例10液相芯片法特异性检测

用梯度稀释的醋酸甲孕酮、甲羟孕酮、醋酸甲地孕酮、己烯雌酚、无色孔雀绿、有色孔雀石绿、醋酸甲羟孕酮、甲砜霉素、氟苯尼考作为抑制物，进行实验，得到样品的平均荧光强度，结果如图2所示，图2显示了各药品浓度为100ng/ml的平均荧光值，其中氯霉素对荧光强度有强抑制，而其他药物的平均荧光强度则于空白对照值相近，结果表明，该体系中无交叉反应，与醋酸甲地孕酮、甲羟孕酮、己烯雌酚、无色孔雀绿、有色孔雀石绿、醋酸甲羟孕酮、甲砜霉素、氟苯尼考等其他兽药物无交叉反应。

Claims (7)

1.一种液相芯片检测水产品中氯霉素的方法，其特征在于，其包括步骤：

（1）制备氯霉素的人工抗原；

（2）制备氯霉素的单克隆抗体并纯化；

（3）利用步骤（1）得到的人工抗原偶联液相芯片荧光微球；

（4）利用步骤（2）得到的单克隆抗体进行生物素化；

（5）使用步骤（3）得到的偶联的微球以及步骤（4）得到的生物素化的抗体，通过液相芯片法检测水产品中氯霉素残留。

2.根据权利要求1所述的液相芯片检测水产品中氯霉素的方法，其特征在于，所述的步骤（2）中，氯霉素的单克隆抗体的腹水效价为1:2.56×10⁶。

3.根据权利要求1所述的液相芯片检测水产品中氯霉素的方法，其特征在于，步骤（5）中所述的检测水产品中氯霉素残留的步骤依次为：包被的微球加入处理好的氯霉素样品溶液，随后分别加入偶联有CAP抗原的微球以及生物素化的氯霉素的抗体；然后加入稀释的SA-PE，最后加入终止液，检测荧光强度。

4.根据权利要求3所述的液相芯片检测水产品中氯霉素的方法，其特征在于，包被的微球一部分加入处理的氯霉素样品溶液，另一部分加入系列氯霉素标准溶液；标准溶液的浓度包括25ng/mL、12.5ng/mL、6.25ng/mL、3.125ng/mL、1.6ng/mL、0.8ng/mL、0.4ng/mL、0.2ng/ml和0.1ng/ml。

5.根据权利要求3所述的检测水产品中氯霉素的方法，其特征在于，所述的检测荧光强度是通过Luminex 200仪器检测荧光强度值，并用Luminex version 2.1软件分析数据。

6.根据权利要求3所述的液相芯片检测水产品中氯霉素的方法，其特征在于，检测氯霉素的抗体稀释度为：1:3200。

7.根据权利要求3所述的液相芯片检测水产品中氯霉素的方法，其特征在于，SA-PE的稀释度为1:100。

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