CN101182356A - 盐酸克伦特罗完全抗原及其单克隆抗体的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种盐酸克伦特罗完全抗原及其单克隆抗体的制备方法，首先在酸性条件下与亚硝酸钠反应，得到偶氮化的盐酸克伦特罗，然后在碱性条件下与牛血清白蛋白偶联制备成盐酸克伦特罗完全抗原。通过免疫Balb/c纯系小鼠，经IELISA检测免疫后小鼠的血清合格后，进行细胞融合制备成抗盐酸克伦特罗单克隆抗体。本发明方法制备的盐酸克伦特罗完全抗原，可用来免疫动物。制备的单克隆抗体，可用于检测肉及肉制品、畜类饲料以及兽类屠宰前其体内盐酸克伦特罗残留量。本发明方法获得的盐酸克伦特罗完全抗原中盐酸克伦特罗与牛血清蛋白的偶联率为17，其分子结构式如上。
Description
技术领域
本发明涉及一种盐酸克伦特罗完全抗原及抗盐酸克伦特罗单克隆抗体的制备方法，该抗体可用于检测盐酸克伦特罗在肉类制品及畜类饲料中的残留量。
背景技术
盐酸克伦特罗(CLB)，又名瘦肉精，是一种β2肾上腺受体激动剂。动物食用后可加速其体内脂肪的转化和分解，并促进蛋白质合成，所以被不法商贩用于饲养猪、牛来提高瘦肉率谋取暴利。但人食用了含有CLB的肉制品后会产生心悸、面颈和四肢肌肉颤动、头晕、乏力、心律失常等症状，严重影响了人民的生活和社会安定。因此，我国已经于1997年明令禁止CLB作为饲料添加剂用于禽畜的肉类生产，并制定了相应的残留标准及检测方法，即以气质分析(GC-MS)作为确定性方法，高效液相色谱法(HPLC)作为半确定性方法。然而这些方法的灵敏度受样品的纯化、浓缩等步骤的影响大；再者这些方法需要大多数实验室所不具备的复杂仪器，价格昂贵、需要专业人才操作，不能进行现场大批量检测，且检测耗时长、检测费用高，不能广泛使用。近年来利用免疫学法对畜产品中盐酸克伦特罗残留进行检测是一种极具发展前途和应用前景的新技术。该方法具有操作简便、批量检测、灵敏度高及费用低，但该技术的关键是需要获得高特异性的抗盐酸克伦特罗的单克隆抗体，目前国内已经报道的抗盐酸克伦特罗的单克隆抗体的特异性和亲和力都不高，其效价最高也只有10万左右，其主要原因还在于合成的盐酸克伦特罗完全抗原立体结构不强，刺激动物机体不能有效产生高特异性和高亲和力的抗体。因此，要获得高特异性的抗盐酸克伦特罗的单克隆抗体首先需要一个具有良好免疫原性的抗原盐酸克伦特罗。但盐酸克伦特罗分子量仅为313.7，对于分子量小于1000道尔顿的小分子化合物一般不具有免疫原性，不能直接免疫动物产生特异性抗体，必须与大分子载体连接构成有效的人工偶联物即合成完全抗原，以突出其分子立体结构的特异性部位即抗原决定簇，才能免疫动物产生针对这一目标小分子的特异性抗体。
目前已有的盐酸克伦特罗完全抗原的制备方法是通过游离的盐酸克伦特罗与丁二酸酐(即琥珀酸酐)反应生成盐酸克伦特罗半抗原化合物，然后利用碳二亚胺法，将盐酸克伦特罗半抗原连接到牛血清白蛋白上。该方法的主要缺点是制备繁琐，需要先制备盐酸克伦特罗半抗原；在利用碳二亚胺法过程中，需要N，N-二甲基甲酰胺、N-羟基琥珀酰亚胺等易挥发有机溶剂，易造成中毒事件，对操作人员健康造成极大危害；在这个过程中会连接一个一定长度的连接臂，在下一步的免疫操作试验中易产生针对连接臂的抗体，不仅影响针对盐酸克伦特罗抗体的产生，也将影响盐酸克伦特罗抗体的特异性和亲和力。
发明内容
本发明提供一种盐酸克伦特罗完全抗原及抗盐酸克伦特罗单克隆抗体的制备方法，克服现有技术存在的操作步骤繁琐，危险试剂，易产生针对其他抗原决定簇的抗体以及产生的抗体特异性和亲和力低等缺点。
本发明是通过重氮法直接在牛血清蛋白上连接上一定数量的盐酸克伦特罗分子，制备得到能用于免疫动物的完全抗原CL-BSA，用其免疫Balb/c纯系小鼠产生针对盐酸克伦特罗的特异性抗体，并通过细胞融合得到稳定分泌抗盐酸克伦特罗单克隆抗体的细胞株，最后对该细胞株进行培养通过纯化获得具有高亲和力、高特异性的抗盐酸克伦特罗单克隆抗体。该单克隆抗体的获得将为酶联免疫等免疫分析技术提供非常有应用价值的材料，从而提高酶联免疫等免疫分析技术检测盐酸克伦特罗的灵敏度。
盐酸克伦特罗完全抗原及其单克隆抗体的制备方法，其特征在于所述盐酸克伦特罗完全抗原的制备方法步骤如下：
A)配制1mol/L盐酸溶液，将其置入4℃冰箱中预冷；称取盐酸克伦特罗(CLB)置于烧杯中，缓慢滴加预冷的盐酸溶液，并用玻璃棒搅拌至溶解，然后将溶解完毕的上述溶液放入冰浴锅中；
B)将冰浴锅放置于磁力搅拌器上，打开开关，缓慢搅拌，并向烧杯中逐渐滴加30％亚硝酸钠(NaNO2)溶液，滴加NaNO2溶液时用玻璃棒沾取烧杯中少许液滴，用淀粉KI试纸检验，待其变化为深紫色时继续反应45min后，再向烧杯中滴加5％氨基磺酸铵终止反应，得到偶氮化的CLB；
C)称取牛血清白蛋白(BSA)300mg于另一烧杯中，缓慢滴加0.01mol/L、pH＝7.2-7.4的磷酸盐缓冲夜(PBS)至完全溶解；
D)用滴定管吸取烧杯中偶氮化的CLB溶液，缓慢滴入另一烧杯中溶解的BSA溶液中，玻璃棒搅拌，待反应液颜色变为亮黄色止；
E)同时向上述混合液中滴加1mol/L NaOH溶液，使pH值维持在9.0左右，在该烧杯中加入转子后，放置于磁力搅拌器上；
F)将该烧杯及磁力搅拌器放入冰箱中，打开磁力搅拌器开关，避光缓慢搅拌24小时，搅拌期间，每间隔1h检测其pH值，滴加NaOH溶液，使pH值维持在9.0左右；
G)反应完毕，将样品由玻璃棒导流加入透析袋中，置于0.01M磷酸盐缓冲液(PBS)中透析，3-4h换液一次，透析72h，透析完毕，将得到的盐酸克伦特罗完全抗原样品分装，置于-20℃冰箱中贮藏备用。
盐酸克伦特罗(CLB)小分子经过偶氮化过程得到的偶氮化合物分子结构如下：
经过与牛血清白蛋白酚羟基发生化学反应产生的盐酸克伦特罗完全抗原中盐酸克伦特罗分子与牛血清蛋白的偶联率为17，其分子结构如下：
所述的单克隆抗体制备方法包括下述步骤：
1)选用6-8周大小、体重18-22g的雌性的纯系Balb/c小鼠，免疫剂量基础免疫为50μg/只，加强免疫为100μg/只；用PBS缓冲液稀释置备好的盐酸克伦特罗完全抗原；初次免疫时加入等体积的福氏完全佐剂，充分乳化，直至滴入水中乳滴不扩散，采用腹腔注射方法；2-3周后进行加强免疫，以后每隔两周再次进行加强免疫，加强免疫时采用福氏不完全佐剂；从第三次免疫开始，每次免疫第三天进行眼眶采血，测定效价及特异性；待免疫血清效价合格后，准备进行细胞融合；
2)通过间接酶联免疫法(IELISA)检测到合格血清后，将该小鼠取脾脏破碎成单个的细胞悬液与SP2/0骨髓瘤细胞按照3-10∶1的比例混匀，离心去掉上清液；使用用PBS缓冲液溶解的质量体积比为50％的聚乙二醇4000加入到混匀的细胞中进行融和1min，融合过程中，对融合液缓慢摇匀；
3)融合完毕后，将融合细胞加入HAT培养基中，并将该细胞培养液加入96孔细胞培养板中，置于5％CO2 37℃培养箱中进行培养；两周后用HT培养基进行培养，并对细胞培养液上清进行IELISA检测，最终筛选得到高特异性杂交瘤细胞株，经过四次体外传代和冻存复苏，细胞生长良好，并稳定分泌抗体，其效价大于3×106；
4)取6-8周Balb/c小鼠，按照1ml/只向其腹腔注射液体石蜡，七天后腹腔接种处于生长对数期的杂交瘤细胞，每只注射1×106个，间隔三天后，每天观察小鼠腹水产生情况，待其腹部变大，毛发稀疏，濒死不动时，采集得到6mL腹水，将腹水离心，得到5mL的上清，然后加入50g/100mL的硫酸铵法，离心后得到沉淀即为抗盐酸克伦特罗的单克隆抗体，将其用适量的PBS缓冲溶液溶解，分装后放置于-20度冰箱中长期保存。
所述的单克隆抗体通过试剂盒检测确定该抗体的亚型为IgG1，其轻链为κ。
本发明采用重氮法直接将牛血清蛋白连接到盐酸克伦特罗制备成完全抗原，该制备步骤简便，所用试剂为无机试剂，对人体潜在危害小；无需连接臂，直接将盐酸克伦特罗小分子抗原连接到牛血清白蛋白上，最大程度的保存其立体结构，避免产生针对其他抗原决定簇的抗体，且利于其免疫动物产生针对盐酸克伦特罗的特异性抗体，并通过细胞融合能得到稳定分泌抗盐酸克伦特罗单克隆抗体细胞株，进而对该细胞株进行培养通过纯化可获得具有高亲合力高特异性的抗盐酸克伦特罗单克隆抗体。该方法制备得到的单克隆抗体将为酶联免疫等免疫分析技术提供非常有应用价值的材料，从而提高酶联免疫分析技术检测盐酸克伦特罗的灵敏度和特异性。
附图说明
图1为电泳图。
M：标记物，1：偶联样品，2：标准牛血清白蛋白。
具体实施方式
以下提供较为详细的盐酸克伦特罗完全抗原的制备方法。
基本方法是首先将盐酸克伦特罗小分子置于酸性条件下活化，然后将其置于冰浴条件下进行重氮化，最后在碱性条件下与载体蛋白牛血清白蛋白进行偶联。
实施例1：完全抗原的合成与纯化
配制1mol/L盐酸溶液，将其置入4℃冰箱中预冷。称取盐酸克伦特罗(CLB)80.00mg置于烧杯中，缓慢滴加预冷的盐酸溶液，并用玻璃棒搅拌至CLB溶解，然后将溶解完毕的上述溶液置入冰浴锅中，并加入转子。将冰浴锅放置于磁力搅拌器上，打开开关，缓慢搅拌，并逐渐滴加30％NaNO2溶液。滴加NaNO2溶液时用玻璃棒沾取少许反应液液滴，用淀粉KI试纸检验，待其变化为深紫色时停止添加30％NaNO2溶液。反应液继续进行，待45min后滴加5％氨基磺酸铵1ml终止反应。称取BSA 300mg于烧杯中，缓慢滴加0.01mol/L pH＝7.2-7.4磷酸盐缓冲液(PBS)至完全溶解。用滴定管吸取偶氮化的CLB溶液，缓慢滴加入溶解的BSA溶液中，玻璃棒搅拌，待反应液颜色变为亮黄色止。同时，滴加1mol/LNaOH溶液，使pH值维持在9.0左右。在烧杯中加入转子后，放置于磁力搅拌器上。将烧杯及磁力搅拌器放入冰箱中，打开磁力搅拌器开关，避光缓慢搅拌24小时。搅拌期间，每1h检测其pH值，滴加NaOH溶液，pH值维持在9.0左右。反应完毕，将样品由玻璃棒导流加入透析袋中，置于PBS缓冲液中透析。3-4h换液一次，透析72h。透析完毕，得到盐酸克伦特罗-牛血清白蛋白偶联液(CLB-BSA)，分装后置于-20℃冰箱中贮藏备用。
紫外吸光法鉴定盐酸克伦特罗完全抗原
在200-500nm波长下分别对盐酸克伦特罗、牛血清白蛋白及经过透析提纯的偶联液进行紫外吸收扫描，测定得到盐酸克伦特罗和牛血清白蛋白最大吸收波长。根据吸光度可叠加的原理，在本研究中牛血清白蛋白(BSA)、偶联物(CLB-BSA)，在BSA，CLB的最大吸收波长处的吸收度作为计算偶联率的吸收值，以降低实验的误差。通过使用UV1700紫外分光光度计扫描，BSA和CLB最大吸收波长分别为280nm和296nm。
以BSA为指标，将以上CLB-BSA偶联溶液配置成相应BSA浓度的CLB-BSA溶液，并配置相同浓度的标准BSA溶液，检测在280nm和296nm处吸光值，并计算吸光差。根据吸光值可叠加，在同样BSA浓度下，吸收值的增加来自于交联上的CL对其的贡献，将此贡献值与制备的标准曲线对比，确定CLB在样品中的浓度，再由公式：偶联率＝CLB分子数/BSA分子数，得出偶联率。经过计算结果盐酸克伦特罗小分子与牛血清白蛋白的比例为：17∶1。
电泳法鉴定盐酸克伦特罗完全抗原
采用考马斯亮蓝法检测得到CLB-BSA偶联溶液中样品的浓度，并将其稀释至10μg/ml.分离胶浓度浓度12％，浓缩胶浓度5％，以考马斯亮蓝6250染色，经凝胶成像仪鉴定得到如图1所示，通过图1可以看出，偶联样品1的分子量明显比标准牛血清白蛋白的分子量大，说明偶联成功，得到盐酸克伦特罗完全抗原。
盐酸克伦特罗抗血清的鉴定
将制备得到的盐酸克伦特罗完全抗原对Balb/c纯系小鼠进行五次免疫后，通过间接酶联免疫法分别测定用磷酸盐缓冲液和含有5％BSA的磷酸盐缓冲液稀释1000倍后的小鼠血清中抗盐酸克伦特罗抗体效价，结果见下表。
从表中可以看出，1，2，3，6，7号小鼠的血清在中和掉可能存在的抗BSA的抗体后，其针对盐酸克伦特罗的间接酶联免疫法(IELISA)检测结果显示阳性(OD450nm＞1.0即为阳性)，表明免疫效果明显，获得了高效价的血清。以上结果也充分说明采用本研究合成的完全抗原免疫小鼠能产生针对盐酸克伦特罗的抗体。
间接酶联免疫法测定结果表
| 样品 | 中性实验* | 非中性实验料 | ||
| 123456 | CLB-BSA***1.9671.6301.6660.003-0.0050.879 | BSA***0.0320.0740.045-0.0100.0060.004 | CLB-BSA***1.4661.1461.0690.0060.0131.196 | BSA***1.2541.1631.166-0.010O.0291.001 |
| 7 | 1.545 | 0.201 | 1.282 | 1.273 |
*样品使用含有5％BSA的PBS缓冲液进行稀释
**样品使用PBS缓冲液进行稀释
***CLB-BSA及BSA分别包被在酶标板上
实施例2：动物免疫制备抗盐酸克伦特罗单克隆抗体
1)选用6-8周大小、体重18-22g的雌性的纯系Balb/c小鼠。免疫剂量基础免疫为50μg/只，加强免疫为100μg/只。用PBS缓冲液分别稀释定量人工抗原复合物，初次免疫时加入等体积的福氏完全佐剂，充分乳化，直至滴入水中乳滴不扩散。采用腹腔注射方法。2-3周后进行加强免疫，以后每隔两周再次进行加强免疫，加强免疫时采用福氏不完全佐剂。从第三次免疫开始，每次免疫第三天进行眼眶采血，测定效价及特异性。待免疫血清效价合格后，准备进行细胞融合。
2)通过间接酶联免疫法(IELISA)检测到合格血清后，将该小鼠取脾脏破碎成单个的细胞悬液与SP2/O骨髓瘤细胞按照3-10∶1的比例混匀，离心去掉上清液。使用用PBS缓冲夜溶解的质量体积比为50％的聚乙二醇4000加入到混匀的细胞中进行融和1min，融合过程中，对融合液缓慢摇匀。
3)融合完毕后，将融合细胞加入HAT培养基中，并将该细胞培养液加入96孔细胞培养板中，置于5％CO2 37℃培养箱中进行培养。两周后用HT培养基进行培养，并对细胞培养液上清进行IELISA检测，最终筛选得到高特异性杂交瘤细胞株，经过四次体外传代和冻存复苏，细胞生长良好，并稳定分泌抗体，其效价大于3×106。将高特异性杂交瘤细胞株保存在～70℃冰箱中备用。
4)取6-8周Balb/c，用液体石蜡注射1ml/只，七天后腹腔接种处于生长对数期的杂交瘤细胞，每只注射1×106个，间隔三天后，每天观察小鼠腹水产生情况，待其腹部变大，毛发稀疏，濒死不动时，采集得到6mL腹水，将腹水离心，得到5mL的上清，然后加入50g/100mL的硫酸铵法，离心后得到沉淀即为抗盐酸克伦特罗的单克隆抗体，将其用适量的PBS缓冲溶液溶解，分装后放置于-20度冰箱中长期保存。
Claims (4)
1.盐酸克伦特罗完全抗原及其单克隆抗体的制备方法，其特征在于所述盐酸克伦特罗完全抗原的制备方法步骤如下：
A)配制1mol/L盐酸溶液，将其置入4℃冰箱中预冷；称取盐酸克伦特罗(CLB)置于烧杯中，缓慢滴加预冷的盐酸溶液，并用玻璃棒搅拌至溶解，然后将溶解完毕的上述溶液放入冰浴锅中；
B)将冰浴锅放置于磁力搅拌器上，打开开关，缓慢搅拌，并向烧杯中逐渐滴加30％亚硝酸钠(NaNO2)溶液，滴加NaNO2溶液时用玻璃棒沾取烧杯中少许液滴，用淀粉KI试纸检验，待其变化为深紫色时继续反应45min后，再向烧杯中滴加5％氨基磺酸铵终止反应，得到偶氮化的CLB；
C)称取牛血清白蛋白(BSA)300mg于另一烧杯中，缓慢滴加0.01mol/L、pH＝7.2-7.4的磷酸盐缓冲夜(PBS)至完全溶解；
D)用滴定管吸取烧杯中偶氮化的CLB溶液，缓慢滴入另一烧杯中溶解的BSA溶液中，玻璃棒搅拌，待反应液颜色变为亮黄色止；
E)同时向上述混合液中滴加1mol/L NaOH溶液，使pH值维持在9.0左右，在该烧杯中加入转子后，放置于磁力搅拌器上；
F)将该烧杯及磁力搅拌器放入冰箱中，打开磁力搅拌器开关，避光缓慢搅拌24小时，搅拌期间，每间隔1h检测其pH值，滴加NaOH溶液，使pH值维持在9.0左右；
G)反应完毕，将样品由玻璃棒导流加入透析袋中，置于0.01M磷酸盐缓冲液(PBS)中透析，3-4h换液一次，透析72h，透析完毕，将得到的盐酸克伦特罗完全抗原样品分装，置于-20℃冰箱中贮藏备用。
2.根据权利要求1所述的盐酸克伦特罗完全抗原及其单克隆抗体的制备方法，其特征在于：
盐酸克伦特罗(CLB)小分子经过偶氮化过程得到的偶氮化合物分子结构如下：
经过与牛血清白蛋白酚羟基发生化学反应产生的盐酸克伦特罗完全抗原中盐酸克伦特罗分子与牛血清蛋白的偶联率为17，其分子结构如下：
3.盐酸克伦特罗完全抗原及其单克隆抗体的制备方法，其特征在于单克隆抗体制备方法包括下述步骤：
1)选用6-8周大小、体重18-22g的雌性的纯系Balb/c小鼠，免疫剂量基础免疫为50μg/只，加强免疫为100μg/只；用PBS缓冲液稀释置备好的盐酸克伦特罗完全抗原；初次免疫时加入等体积的福氏完全佐剂，充分乳化，直至滴入水中乳滴不扩散，采用腹腔注射方法；2-3周后进行加强免疫，以后每隔两周再次进行加强免疫，加强免疫时采用福氏不完全佐剂；从第三次免疫开始，每次免疫第三天进行眼眶采血，测定效价及特异性；待免疫血清效价合格后，准备进行细胞融合；
2)通过间接酶联免疫法(IELISA)检测到合格血清后，将该小鼠取脾脏破碎成单个的细胞悬液与SP2/0骨髓瘤细胞按照3-10∶1的比例混匀，离心去掉上清液；使用用PBS缓冲液溶解的质量体积比为50％的聚乙二醇4000加入到混匀的细胞中进行融和1min，融合过程中，对融合液缓慢摇匀；
3)融合完毕后，将融合细胞加入HAT培养基中，并将该细胞培养液加入96孔细胞培养板中，置于5％CO2 37℃培养箱中进行培养；两周后用HT培养基进行培养，并对细胞培养液上清进行IELISA检测，最终筛选得到高特异性杂交瘤细胞株，经过四次体外传代和冻存复苏，细胞生长良好，并稳定分泌抗体，其效价大于3×106；
4)取6-8周Balb/c小鼠，按照1ml/只向其腹腔注射液体石蜡，七天后腹腔接种处于生长对数期的杂交瘤细胞，每只注射1×106个，间隔三天后，每天观察小鼠腹水产生情况，待其腹部变大，毛发稀疏，濒死不动时，采集得到6mL腹水，将腹水离心，得到5mL的上清，然后加入50g/100mL的硫酸铵法，离心后得到沉淀即为抗盐酸克伦特罗的单克隆抗体，将其用适量的PBS缓冲溶液溶解，分装后放置于-20度冰箱中长期保存。
4.根据权利要求3所述的盐酸克伦特罗完全抗原及其单克隆抗体的制备方法，其特征在于：
单克隆抗体通过试剂盒检测确定该抗体的亚型为IgG1，其轻链为κ。
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