CN105911277A - 一种动物疫病抗体类病毒胶体金定量检测***及制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物检测领域，尤其涉及一种动物疫病抗体类病毒胶体金定量检测***及制备方法，包括卡盒和试剂条，试剂条由基板、样品垫、胶体金垫、反应膜和吸水垫组成，其特征在于：胶体金垫上吸附有胶体金标记的猪病毒蛋白和牛血清白蛋白，反应膜上包被有检测抗原和质量控制抗体，检测抗原显示为检测线T，为猪病毒抗原；质量控制抗体显示为质控线C，为羊抗鼠IgG抗体。本发明充分应用了胶体金的操作简便、快速、实用于各种现场检测的技术优点，配套胶体金定量分析仪和特有的曲线建立方法，达到了胶体金能定量检测出样品的含量，综合了胶体金和ELISA的双重优点，形成两种技术的互补。

Description

一种动物疫病抗体类病毒胶体金定量检测***及制备方法
技术领域
本发明属于生物检测领域，尤其涉及一种动物疫病抗体类病毒胶体金定量检测***及制备方法。
背景技术
中国是农业大国，也是畜牧大国。以猪养殖为例，2009年全国性猪存栏约4.7亿头，出栏6.45亿头，猪肉产量4889万吨，约占全球总产量的50％，在世界上排名第一。但中国并不是畜牧强国，在每头母猪年平均分娩胎数、每头母猪提从断奶仔猪数、仔猪存活率及肉猪出栏率等方面，与世界畜牧强国仍然存在巨大的差距。其原因之一在于集约化养殖程度不高，规模不够，农户散养或小型化养殖场所占比重高，造成疫病多发，生产力低下，添加违禁药物和滥用抗生素现像严重，且环境污染严重。
由于中国养殖业比重较大的是农户散养或者小型养殖场养殖，规模分散，动物疫病防治水平和生产管理能力落后，在发生疫病流行时，难以有效控制。存在着兽医领域监管对像种类多、数量大、分布广、规模不一等问题，尤其养殖环节中具有极强的隐蔽性和时间性的特点，现场执法检查如果靠眼面检查从根本上不能积习难改现其问题和隐患。传统实验检测也存在程序复杂、检测时间长的技术问题，检测结果出来后产品已经销售或转移，无法及时处理，无法满足现场检测需要及时、高效、快速的需要。而且，目前成熟的快速检测技术大多是针对单一疫病或者药物残留进行，也难以达到对检测样品种类多样、检测项目繁多的检测的目的。
随着生物技术的发展，开始用生物技术来对动物疫病、动物产品质量进行安全检测。比如PCR检测法、酶联免疫法(ELISA)和操作比较简单的动物疫病免疫层析检测方法，PCR检测法常用于核酸方面的检测，敏感度好且准确性相对较高，酶联免疫法常用于检测兽药残留及动物疫病，具有特异性和灵敏度比较高的优点，对于现场初筛有较好的应用前景，但这两者都需要专业的仪器设备和操作人员进行检验操作，对试验条件要求较高，施行不方便，成本高。
目前应用比较成熟的现场快速检测方法还有免疫胶体金试纸检测方法，胶体金技术具有方便快捷、特异敏感、稳定性强、不需要特殊设备和试剂、结果判断直观等优势，适合于大批量检测和大面积普查等。
胶体金(colloidal gold)，又称金溶胶(gold solution)，是指分散相粒子直径在l—150nm之间的金溶胶，属于多相不均匀体系，颜色呈桔红色到***。胶体金可以作为标记物用于免疫组织化学，近10多年来胶体金标记已经发展为一项重要的免疫标记技术。胶体金免疫分析在药物检测、生物医学等许多领域的研究已经得到发展，并越来越受到相关研究领域的重视。胶体金作为标记物用于免疫组织化学始于1971年,Faulk等应用电镜免疫胶体金染色法(IGS)观察沙门氏菌,此后他们把胶体金与多种蛋白质结合.1974年Romano等将胶体金标记在第二抗体(马抗人IgG)上，建立了间接免疫胶体金染色法。1978年geoghega发现了胶体金标记物在光镜水平的应用。胶体金在免疫化学中的这种应用，又被称为免疫金.之后，许多学者进一步证实胶体金能稳定又迅速地吸附蛋白质，而蛋白质的生物活性无明显改变.它可以作为探针进行细胞表面和细胞内多糖、蛋白质、多肤、抗原、激素、核酸等生物大分子的精确定位,也可以用于日常的免疫诊断，进行免疫组织化学定位，因而在临床诊断及药物检测等方面的应用已受到广泛的重视。
具有高效、快速、结果判断直观和稳定的检测动物疫病抗体类病毒的方法和相关的产品是目前市场所需。
具体实施方式
为了解决上述技术问题，本发明提供一种动物疫病抗体类病毒胶体金定量检测***及制备方法，其特点是充分应用了胶体金的操作简便、快速、实用于各种现场检测的技术优点，配套胶体金定量分析仪和特有的曲线建立方法，达到了胶体金能定量检测出样品的含量，综合了胶体金和ELISA的双重优点，形成两种技术的互补。
解决以上技术问题的本发明中的一种动物疫病抗体类病毒胶体金定量检测***，包括胶体金定量检测盒和手持式读卡仪器，其特征在于：所述检测***能够对待检测的动物样品给出准确的定量检测结果，该动物疫病可包括猪瘟、猪圆环、猪伪狂犬、猪***、猪蓝耳。所述待检测的动物样品为血清或全血；检测步骤为取50-150ul的动物样品加入到检测卡中，反应5-20分钟后放入手持式读卡仪进行T/C值读数，根据不同浓度的比值运用函数拟合建立标准曲线。
所述定量检测结果为根据手持式读卡仪测出的T/C值和抗体效价梯度值成相应的函数关系，该函数关系式按照对数函数进行拟合曲线，从而制定每批产品的内标曲线而得出定量检测结果；该手持式读卡仪器为通过成像***测量C/T线的反射光强度，并通过随机芯片将检测结果通过无限网络传输到中央***或云端服务器；该手持式读卡仪器包括智能手机、塑料模具、镜片、玻璃板、9V电池、LED灯带、抽屉式托盘。
所述函数关系式为：y＝aln(x)-b，其中y代表T/C值，x代表浓度，a代表斜率，b代表常数。
所述每个批次的产品的内标准曲线可以相应调整，这样减少了不同批次产品间定量分析关系的差别，确保不同批次产品对同一待测物定量检测关系的一致性，并将内标曲线输入软件制成二维码方便客户操作使用。
所述检测盒，包括卡盒和试剂条，试剂条由基板、样品垫、胶体金垫、反应膜和吸水垫组成，胶体金垫上吸附有胶体金标记的猪病毒蛋白和牛血清白蛋白，反应膜上包被有检测抗原和质量控制抗体，检测抗原显示为检测线T，为猪病毒抗原；质量控制抗体显示为质控线C，为羊抗鼠IgG抗体。
检测线T与质控线C距离可为5-10mm，间距太长了会增长检测时间，且对检测卡壳的视窗要求就更长。T线中猪病毒抗原质量浓度可为0.5-3mg/ml，T线浓度过低，对后面显色效果不理想，过高了会降低检测条的灵敏度，所以T线的浓度是需要在实验研发中选择一个合适浓度，进而达到市场产品的质量要求。
所述试剂条制备方法包括以下步骤，所用原料用量份数为重量份：
(1)胶体金溶液的制备：
将500份蒸馏水加热至沸腾后，再加入氯金酸1-5份和柠檬酸三钠1-5份，搅拌并煮沸8-12min，冷却至常温，用可见光分光光度计检测其峰值及半峰宽；原料在使用前经过纯化，纯度达到97％以上，特异性强，无非特异性结合。
胶体金溶液质量标准：清亮透明的橘红色或***，无悬浮颗粒、液体表面无飘金情况，用紫外检测波峰应该越陡峭半峰宽越窄，胶体金的质量越好。
(2)胶体金的标记及喷金：
取100份胶体金溶液，加入1.38％的碳酸钾缓冲液8-12份，搅拌中加入猪病毒蛋白0.015-0.025份继续搅拌8-12min，再加入牛血清白蛋白10-20份进行偶联，10000r/min离心4-7min，去掉上清，留下胶体金颗粒溶液进行喷金使用；一般胶体金在进行标记前都会进行方正梯度实验，既对胶体金的标记条件和标记量进行梯度实验，在最佳的PH值和标记量的条件下进行标记和封闭。
用喷金划膜机在玻璃纤维素膜上喷金，用量2.5-8.5ul/cm，再在温度35-38℃下干燥10-14h，密封保存备用；
(3)硝酸纤维素膜的C/T画线：
用DC缓冲液将羊抗鼠IgG稀释成0.5-3mg/ml的羊抗鼠IgG溶液，在PVC底板上贴好硝酸纤维素膜，中间用羊抗鼠IgG画C线，用量0.5-3ul/cm；
DC缓冲液配方为：0.8g NaCl+0.05g KCl+0.144gNa2HPO4+0.067g NaH2PO4，用蒸馏水定容到100ml。
用DT缓冲液将猪病毒蛋白稀释成0.5-3mg/ml，在PVC底板上贴好硝酸纤维素膜C线往下5-10mm处用稀释后的猪病毒蛋白画T线，用量0.5-3ul/cm；原料猪病毒抗原质量浓度要达到1mg/ml。
DT缓冲液配方为：0.8g NaCl+0.15g KCl+0.288gNa2HPO4+0.134g NaH2PO4，用蒸馏水定容到100ml，再加入5％体积的海藻糖。
将画好线的PVC底板在温度35-38℃下干燥8-12h，密封保存备用；
(4)胶体金大板的制作：
在步骤(3)中的PVC底板上贴上喷好金的玻璃纤维塑模，贴上样品垫及吸水纸即可。
所述步骤(2)中胶体金颗粒大小为15-60nm，优化颗粒大小为20-40nm，胶体金颗粒溶液质量浓度为0.8-1.2％，优化浓度为1％。
所述样品垫使用前进行处理，用定量的DY缓冲液进行均匀涂抹，其中，100ml的D Y缓冲液配方为：10％tw20+表面活性剂5-15％+1％PEG20000+10％海藻糖，用蒸馏水定容到100ml。表面活性剂可为TritonX-100、Tween-20、Tween-80等。
样品垫处理步骤：将进口的Alhstorm8964裁切成2cm*30cm，用定量的DY缓冲液进行均匀涂抹，保证样品垫的均一性。
所述胶体金溶液PH值为6.2-7.8，原料的等电点ph值加0.5为最适PH标记点。
所述步骤(2)中猪病毒蛋白质量体积浓度为3-4mg/ml，牛血清白蛋白质量浓度10-15％。
本发明中的试剂盒基于胶体金双抗夹心技术，检测卡的硝酸纤维膜上预先包被了猪病毒抗原(T线)和羊抗鼠IgG抗体(C线)。其中T线为检测线，C线为质控线。金标抗原特异性结合猪病毒抗体，T线显色深度随猪病毒抗体浓度呈线性改变，通过手持检测仪的分析即可测出样本中猪病毒抗体效价高低。
本发明中的试剂盒检测时间快、方便、稳定、且准确，适合范围广。不即只显色，还可以定量测定，可测定出具体的数值，检测结果准确，易把握，误差少，减少人为评估带来的偏差。
附图说明
图1为本发明中猪瘟病毒抗体检测血清曲线图
图2为本发明中猪圆环病毒抗体检测血清曲线图
图3为本发明中猪蓝耳病毒抗体检测血清曲线图
具体实施方式
以下用具体实施例对本发明作进一步的说明：
以下实施例中待检测的动物样品为血清或全血；检测步骤为取50-150ul的动物样品加入到检测卡中，反应5-20分钟后放入手持式读卡仪进行T/C值读数，根据不同浓度的比值运用函数拟合建立标准曲线。
定量检测结果为根据手持式读卡仪测出的T/C值和抗体效价梯度值成相应的函数关系，该函数关系式按照对数函数进行拟合曲线，从而制定每批产品的内标曲线而得出定量检测结果；该手持式读卡仪器为通过成像***测量C/T线的反射光强度，并通过随机芯片将检测结果通过无限网络传输到中央***或云端服务器；该手持式读卡仪器包括智能手机、塑料模具、镜片、玻璃板、9V电池、LED灯带、抽屉式托盘。
每个批次的产品的内标准曲线可以相应调整，这样减少了不同批次产品间定量分析关系的差别，确保不同批次产品对同一待测物定量检测关系的一致性，并将内标曲线输入软件制成二维码方便客户操作使用。
实施例1
动物疫病抗体类病毒胶体金定量检测***：猪瘟病毒抗体胶体金定量检测试剂***，设有胶体金定量检测盒和手持式读卡仪器，对待检测的动物样品给出准确的定量检测结果。定量检测结果为根据手持式读卡仪测出的T/C值和抗体效价梯度值成相应的函数关系，函数关系式为：y＝aln(x)-b。
该函数关系式按照对数函数进行拟合曲线，从而制定每批产品的内标曲线而得出定量检测结果。
猪瘟病毒抗体胶体金定量检测试剂盒，包括卡盒和试剂条，试剂条由基板、样品垫、胶体金垫、反应膜和吸水垫组成，胶体金垫上吸附有胶体金标记的猪瘟病毒蛋白和牛血清白蛋白，反应膜上包被有检测抗原和质量控制抗体，检测抗原显示为检测线T，为猪瘟病毒抗原；质量控制抗体显示为质控线C，为羊抗鼠IgG抗体。
检测线T与质控线C一般控制在5mm，间距太长了会增长检测时间，且多检测卡壳的视窗要求就更长。T线中猪病毒抗原质量浓度为0.3mg/ml。
试剂条制备方法包括以下步骤，所用原料用量份数为重量份：
(1)胶体金的制备：
将500份蒸馏水加热至沸腾后，再加入氯金酸1份和柠檬酸三钠1份，搅拌并煮沸10min，冷却至常温，用可见光分光光度计检测其峰值及半峰宽，峰值229-231，半峰宽580-585。
原料在使用前经过纯化，通过仪器检测其纯度达到97％以上，特异性强，无非特异性结合。胶体金液质量标准：清亮透明的橘红色或***，无悬浮颗粒、液体表面无飘金情况，用紫外检测波峰应该越陡峭半峰宽越窄，胶体金的质量越好。
胶体金溶液PH值为6.2，胶体金颗粒大小为30nm，胶体金浓度为0.8％。
(2)胶体金的标记及喷金：
取100份胶体金溶液，加入1.38％的碳酸钾缓冲液8份，搅拌中再加入3mg/ml猪病毒蛋白0.015份继续搅拌8min，再加入15％牛血清白蛋白15份进行偶联，10000r/min离心7min，去掉上清，留下清金颗粒溶液进行喷金使用；
用喷金划膜机在玻璃纤维素膜(GE公司进口的Acuuflow G)上喷金，用量2.5ul/cm，蛋白浓度为4ug/ml，再在温度35℃下干燥14h，密封保存备用；
猪瘟病毒原料通过仪器检测其纯度达到97％以上，特异性强，没有非特异性吸附；蛋白在使用前，一般都需要进行纯化或电泳，保证其纯度和蛋白含量。
(3)硝酸纤维素膜的C/T画线：
用DC缓冲液将羊抗鼠IgG稀释成0.5mg/ml的羊抗鼠IgG溶液，在PVC底板上贴好硝酸纤维素膜，中间用羊抗鼠IgG画C线，用量0.5ul/cm；
DC缓冲液配方为：0.8g NaCl+0.05g KCl+0.144gNa2HPO4+0.067g NaH2PO4，用蒸馏水定容到100ml。
用DT缓冲液将猪瘟病毒抗原稀释成0.5mg/ml，在PVC底板上贴好硝酸纤维素膜C线下端5mm处用稀释后的猪瘟病毒蛋白画T线，用量1ul/cm；原料猪瘟病毒抗原质量浓度要达到1mg/ml。
DT缓冲液配方为：0.8g NaCl+0.15g KCl+0.288gNa2HPO4+0.134g NaH2PO4，用蒸馏水定容到100ml，再加入5％体积的海藻糖。
将画好线的PVC底板在温度37℃下干燥12h，密封保存备用；
(4)胶体金大板的制作：
在步骤(3)中的PVC底板上贴上喷好金的玻璃纤维塑模，贴上样品垫及吸水纸即可。玻璃纤维素膜在贴的过程中要叠加硝酸纤维素膜1-2mm；贴样品垫按照样品垫下端与PVC底端边缘对齐，贴吸水纸时必须与硝酸纤维素膜上端叠加1-2mm即可。粘贴过程中一定要注意别再硝酸纤维素膜上留下痕迹，粘贴地方一定要牢固，叠加部分一定要相互接触，不能彼此脱离。
样品垫使用前进行处理：用定量的DY缓冲液将裁切好的样品垫进行均匀涂抹，可以用移液器、玻璃棒进行涂抹，或者直接用湿侵法，使其样品垫均匀涂抹。其中，100ml的D Y缓冲液配方为：10％tw20+Tween-20 15％+1％PEG20000+10％海藻糖，用蒸馏水定容到100ml。
样品垫处理步骤：将进口的Alhstorm8964裁切成2cm*30cm，用定量的DY缓冲液进行均匀涂抹，保证样品垫的均一性。
实施例2 猪圆环病毒抗体胶体金定量检测试剂***
其它内容如实施例1中，猪圆环病毒抗体定量检测试剂***，设有胶体金定量检测盒和手持式读卡仪器，对待检测的动物样品给出准确的定量检测结果。定量检测结果为根据手持式读卡仪测出的T/C值和抗体效价梯度值成相应的函数关系，函数关系式为：y＝aln(x)-b。
该函数关系式按照对数函数进行拟合曲线，从而制定每批产品的内标曲线而得出定量检测结果。
猪圆环病毒抗体胶体金定量检测试剂盒，包括卡盒和试剂条，试剂条由基板、样品垫、胶体金垫、反应膜和吸水垫组成，胶体金垫上吸附有胶体金标记的猪圆环病毒和牛血清白蛋白，反应膜上包被有检测抗原和质量控制抗体，检测抗原显示为检测线T，为猪圆环病毒抗原；质量控制抗体显示为质控线C，为羊抗鼠IgG抗体。
检测线T与质控线C一般控制在5mm，间距太长了会增长检测时间，且多检测卡壳的视窗要求就更长。
T线中猪圆环病毒抗原质量浓度为3ug/ml。
试剂条制备方法包括以下步骤，所用原料用量份数为重量份：
(1)胶体金的制备：
将500份蒸馏水加热至沸腾后，再加入氯金酸5份和柠檬酸三钠5份，搅拌并煮沸10min，冷却至常温，用可见光分光光度计检测其峰值及半峰宽；
胶体金溶液PH值为7.3，胶体金颗粒大小为40nm，胶体金浓度为1.2％。
(2)胶体金的标记及喷金：
取100份胶体金溶液，加入1.38％的碳酸钾缓冲液12份，搅拌中再加入3.5mg/ml猪病毒蛋白0.025份继续搅拌8min，再加入10％牛血清白蛋白20份进行偶联，10000r/min离心4min，去掉上清，留下清胶体金颗粒溶液进行喷金使用；
用喷金划膜机在玻璃纤维素膜(GE公司进口的Acuuflow G)上喷金，用量4.5ul/cm，蛋白浓度为6ug/ml，再在温度37℃下干燥10h，密封保存备用；
(3)硝酸纤维素膜的C/T画线：
用DC缓冲液将羊抗鼠IgG稀释成3mg/ml的羊抗鼠IgG溶液，在PVC底板上贴好硝酸纤维素膜，中间用羊抗鼠IgG画C线，用量3ul/cm；
DC缓冲液配方为：0.8g NaCl+0.05g KCl+0.144gNa2HPO4+0.067g NaH2PO4，用蒸馏水定容到100ml。
用DT缓冲液将猪病毒蛋白稀释成3mg/ml，在PVC底板上贴好硝酸纤维素膜C线往下用稀释后的猪病毒蛋白画T线，用量8ul/cm；
DT缓冲液配方为：0.8g NaCl+0.15g KCl+0.288gNa2HPO4+0.134g NaH2PO4，用蒸馏水定容到100ml，再加入5％体积的海藻糖。
将画好线的PVC底板在温度37℃下干燥8h，密封保存备用；
(4)胶体金大板的制作：
在步骤(3)中的PVC底板上贴上喷好金的玻璃纤维塑模，贴上样品垫及吸水纸即可。
样品垫使用前进行处理：用定量的DY缓冲液将裁切好的样品垫进行均匀涂抹，可以用移液器、玻璃棒进行涂抹，或者直接用湿侵法，使其样品垫均匀涂抹。其中，100ml的D Y缓冲液配方为：10％tw20+Tween-80 5％+1％PEG20000+10％海藻糖，用蒸馏水定容到100ml。
实施例3 猪蓝耳病毒抗体胶体金定量检测***
其它内容如实施例1中，猪圆环病毒胶体金抗体定量检测试剂***，设有胶体金定量检测盒和手持式读卡仪器，对待检测的动物样品给出准确的定量检测结果。定量检测结果为根据手持式读卡仪测出的T/C值和抗体效价梯度值成相应的函数关系，函数关系式为：y＝aln(x)-b。
该函数关系式按照对数函数进行拟合曲线，从而制定每批产品的内标曲线而得出定量检测结果。
猪蓝耳病毒抗体胶体金定量检测试剂盒，包括卡盒和试剂条，试剂条由基板、样品垫、胶体金垫、反应膜和吸水垫组成，胶体金垫上吸附有胶体金标记的猪病毒蛋白和牛血清白蛋白，反应膜上包被有检测抗原和质量控制抗体，检测抗原显示为检测线T，为猪蓝耳病毒抗原；质量控制抗体显示为质控线C，为羊抗鼠IgG抗体。
检测线T与质控线C一般控制在8mm，间距太长了会增长检测时间，且多检测卡壳的视窗要求就更长。
T线中猪蓝耳病毒抗原质量浓度为0.6mg/ml，牛血清白蛋白质量浓度为。
试剂条制备方法包括以下步骤，所用原料用量份数为重量份：
(1)胶体金的制备：
将500份蒸馏水加热至沸腾后，再加入氯金酸5份和柠檬酸三钠3份，搅拌并煮沸10min，冷却至常温，用可见光分光光度计检测其峰值及半峰宽；
胶体金溶液PH值为7，原料的等电点ph值加0.5。胶体金颗粒大小为40nm，胶体金浓度为1％。
(2)胶体金的标记及喷金：
取100份胶体金溶液，加入1.38％的碳酸钾缓冲液9份，搅拌中加入3.8mg/ml猪病毒蛋白0.022份继续搅拌10min，再加入12％牛血清白蛋白10份进行偶联，10000r/min离心6min，去掉上清，留下清金颗粒溶液进行喷金使用；
用喷金划膜机在玻璃纤维素膜(GE公司进口的Acuuflow G)上喷金，用量3.2ul/cm，蛋白浓度为8ug/ml，再在温度36℃下干燥13h，密封保存备用；
(3)硝酸纤维素膜的C/T画线：
用DC缓冲液将羊抗鼠IgG稀释成2mg/ml的羊抗鼠IgG溶液，在PVC底板上贴好硝酸纤维素膜，中间用羊抗鼠IgG画C线，用量2ul/cm；
DC缓冲液配方为：0.8g NaCl+0.05g KCl+0.144gNa2HPO4+0.067g NaH2PO4，用蒸馏水定容到100ml。
用DT缓冲液将猪病毒蛋白稀释成0.6ug/ml，在PVC底板上贴好硝酸纤维素膜C线往下6mm处用稀释后的猪病毒蛋白画T线，用量5ul/cm；
DT缓冲液配方为：0.8g NaCl+0.15g KCl+0.288gNa2HPO4+0.134g NaH2PO4，用蒸馏水定容到100ml，再加入5％体积的海藻糖。
将画好线的PVC底板在温度37℃下干燥9h，密封保存备用；
(4)胶体金大板的制作：
在步骤(3)中的PVC底板上贴上喷好金的玻璃纤维塑模，贴上样品垫及吸水纸即可。
粘贴过程中一定要注意别再硝酸纤维素膜上留下痕迹，粘贴地方一定要牢固，叠加部分一定要相互接触，不能彼此脱离。
样品垫使用前进行处理：用定量的DY缓冲液将裁切好的样品垫进行均匀涂抹，可以用移液器、玻璃棒进行涂抹，或者直接用湿侵法，使其样品垫均匀涂抹。其中，100ml的D Y缓冲液配方为：10％tw20+TritonX-100 10％+1％PEG20000+10％海藻糖，用蒸馏水定容到100ml。
实施例4 猪***病毒抗体胶体定量检测***
其它内容如实施例1中的内容，生产工艺如下：
(1)胶体金的制备
胶体金的制备，500ml蒸馏水加热至沸腾后，快速加入氯金酸5mg，在加入4mg的柠檬酸三钠还原剂，持续搅拌并煮沸10分钟，停止加热后冷却至常温，通过可见光分光光度计检测其峰值及半峰宽即可。
(2)胶体金的标记及喷金
取100ml胶体金溶液，加入10ml碳酸钾(称取13.8g无水K2CO3，定容到1000ml)缓冲液，在搅拌中加入3mg/ml的猪病毒蛋白20ul继续搅拌10min，再加入15％的牛血清白蛋白BSA(称取15gBSA加蒸馏水100ml)15ml进行偶联，10000r/min离心5min，去掉上清；留下清金颗粒溶液进行喷金使用。用喷金划膜机按照3ul/cm的量在玻璃纤维素膜上进行均匀喷金，在37℃恒温干燥箱里进行12h干燥；用自封袋进行密封保存。
(3)硝酸纤维素膜的c/t的画线
先将羊抗鼠IgG用DC缓冲液(0.8g NaCl+0.05g KCl+0.144gNa2HPO4+0.067gNaH2PO4用蒸馏水定容到100ml)稀释成1.5mg/ml，在PVC底板上贴好硝酸纤维素膜中间用羊抗鼠IgG按照1ul/cm进行画C线；T线用DT缓冲液(0.8g NaCl+0.15g KCl+0.288gNa2HPO4+0.134gNaH2PO4用蒸馏水定容到100ml，在加入5％体积的海藻糖)将猪病毒蛋白稀释成2mg/ml或2.5mg/ml，在PVC底板上贴好硝酸纤维素膜C线往下用稀释后的猪病毒蛋白按照8ul/cm进行画T线；在37℃的恒温干燥箱干燥10h即可，用自封袋进行密封保存。
试验一：对猪瘟病毒抗体的检测
阴性血清的验证：根据已知(经过国家动物疾控中心定的金标法测定的)的20份阴性血清，进行双样平行性的测定，最终结果应该是C线显色，T线不显色即为正确结果。
阳性血清的验证：根据经过国家动物兽医规定的金标法测定的的5份强阳性猪血清，分别按照等比稀释成7个浓度点(1:8 1:16 1:32 1:64 1:128 1:256 1:512)各1ml，再用本发明中的猪病毒检测试剂条分别测定其以上不同浓度的35份血清。
即检测具体操作步骤为：每个检测条加入液稀释后的150ul血清后，在10-30℃的条件下静置15min后，用手持式读卡仪器进行共计35份不同浓度的血清的测定；分别测定其每个检测条的C值、T值、T/C值三个数据。
标准曲线的建立：根据这5份血清的七个数据点测定其值进行标准曲线的建立(横坐标为效价，纵坐标也为T/C值)，具体如图1：
再根据T和C线的色度变化通过仪器的检测和方程式计算出数值,T/C值和抗体效价梯度值成相应的函数关系即标准曲线方程式为y＝aln(x)-b，如图1。
结果分析：当被检测样品抗体效价＞＝16时，呈阳性，说明检测样品中猪瘟病毒抗体的滴度较高，暂不需要接种猪瘟疫苗。当被检测样品抗体效价<16时，说明检测样品中猪瘟病毒抗体效价不能达到抵御猪瘟病毒强毒攻击的最低保护效价，应当及时补种猪瘟病毒疫苗。当被检测样品检测结果呈阴性时，说明被检测样品中没有猪瘟病毒抗体。如果猪群健康，应当及时接种猪瘟病毒疫苗。
试验二：对猪圆环病毒抗体的检测
其它内容如试验一中的操作步骤，曲线图如图2：
结果分析：当被检测样品抗体效价＞＝40时，说明检测样品中猪圆环病毒抗体的滴度较高，暂不需要接种猪圆环疫苗。当被检测样品抗体效价<40时，说明检测样品中猪圆环病毒抗体效价不能达到抵御猪圆环病毒强毒攻击的最低保护效价，应当及时补种猪圆环病毒疫苗。当被检测样品检测结果呈阴性时，说明被检测样品中没有猪圆环病毒抗体。如果猪群健康，应当及时接种猪圆环病毒疫苗。
试验三：对猪蓝耳病毒抗体的检测
其它内容如试验一中的操作步骤，曲线图如图3：
结果分析：当被检测样品抗体效价＞＝40时，说明检测样品中猪蓝耳病毒抗体的滴度较高，暂不需要接种猪蓝耳疫苗。当被检测样品抗体效价<40时，说明检测样品中猪蓝耳病毒抗体效价不能达到抵御猪蓝耳病毒强毒攻击的最低保护效价，应当及时补种猪蓝耳病毒疫苗。当被检测样品检测结果呈阴性时，说明被检测样品中没有猪蓝耳病毒抗体。如果猪群健康，应当及时接种猪蓝耳病毒疫苗。
试验四：
检测操作方法如试验一，设置对照组1(进口爱德士试剂盒，ELISA试剂盒)，对照组2(间接血凝试剂盒)和实验组(本发明中的检测盒)，对比结果如下：
(注：其中“+”代表阳性，“—”代表阴性，符合率都达到了90％及以上)
从以上可以看出，本发明中的检测盒检测出的结果与目前国际认可的检测盒的检测结果基本一致，且速度快，操作方便，适用范围广，对检测操作人员的要求不高，检测结果稳定、准确。
本发明中进行动物疫病检测，步骤可如下：
(1)将检测箱的拉杆缩放到箱体里面，箱体正面向上平放于台面，打开正面的两个保险扣；
(2)详细阅读检测箱里面的使用说明书、技术参数表；
(3)取出血清板、移液器、离心机，用移液器移取一定量的动物血液在离心机的作用下分离出血清；
(4)取出检测试剂条、计时器，打开外包装平放于台面，用移液器量取一定量的血清于检(5)测条的加样孔中，开始计时20min；
(6)取出手持检测仪，打开电源开关，待15分钟时将检测条放入检测仪进行定量读数。
本发明中试剂和样本用量较小，血清样品量150ul，不需γ－计数器、荧光显微镜、酶标检测仪等贵重仪器，更适于现场应用，没有诸如放射性同位素、邻苯二胺等有害物质参与，实验结果可以长期保存，时间大大缩短，提高了检测速度。因此胶体金定量检测试剂盒在霉菌毒素检测行业中可以得到广泛应用，从重复性、准确性、灵敏度三方面结果来说都符合检测要求；对于现场大量样品筛选检测来说，为客户提供了操作简单、仪器化程度低、专业性低、快速等优势，极大的缩短了客户的检测时间，提高了工作效率。

Claims (10)

1.一种动物疫病抗体类病毒胶体金定量检测***，包括胶体金定量检测盒和手持式读卡仪器，其特征在于：所述检测***对待检测的动物样品给出准确的定量检测结果；该动物疫病类包括猪瘟、猪蓝耳、猪圆环、猪伪狂犬和猪***。
2.根据权利要求1所述的一种动物疫病抗体类病毒胶体金定量检测***，其特征在于：所述待检测的动物样品为血清或全血；检测步骤为取50-150ul的动物样品加入到检测卡中，待检测卡层析反应5-20分钟后放入手持式读卡仪进行读数。
3.根据权利要求1所述的一种动物疫病抗体类病毒胶体金定量检测***，其特征在于：所述定量检测结果为根据手持式读卡仪测出的T/C值和抗体效价梯度值成相应的函数关系，该函数关系式按照对数函数进行拟合曲线，从而制定每批产品的内标曲线而得出定量检测结果；该手持式读卡仪器为通过成像***测量C/T线的反射光强度，并通过随机芯片将检测结果通过无限网络传输到中央***或云端服务器；该手持式读卡仪器主要由智能手机、塑料模具、镜片、玻璃板、9V电池、LED灯带、抽屉式托盘组成。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的一种动物疫病抗体类病毒胶体金定量检测***，其特征在于：所述检测盒包括试剂条和试剂盒，试剂条由基板、样品垫、胶体金垫、反应膜和吸水垫组成，胶体金垫上吸附有胶体金标记的猪病毒蛋白和牛血清白蛋白，反应膜上包被有检测抗原和质量控制抗体，检测抗原显示为检测线T，为猪病毒抗原；质量控制抗体显示为质控线C，为羊抗鼠IgG抗体。
5.根据权利要求3所述的一种动物疫病抗体类病毒胶体金定量检测***，其特征在于：所述函数关系式为：y＝aln(x)-b，其中y代表T/C值，x代表浓度，a代表斜率，b代表常数。
6.根据权利要求3所述的一种动物疫病抗体类病毒胶体金定量检测***，其特征在于：所述每个批次的产品的内标准曲线可以进行相应调整，这样减少了不同批次产品间定量分析关系的差别，确保不同批次产品对同一待测物定量检测关系的一致性，并将内标曲线输入软件制成二维码方便客户操作使用。
7.根据权利要求1或4所述的一种动物疫病抗体类病毒胶体金定量检测***的制备方法，其特征在于：所述检测盒中的试剂条制备方法包括以下步骤，所用原料用量份数为重量份：
(1)胶体金溶液的制备：
将500份蒸馏水加热至沸腾后，再加入氯金酸1-5份和柠檬酸三钠1-5份，搅拌并煮沸8-12min，冷却至常温；
(2)胶体金的标记及喷金：
取100份胶体金溶液，加入1.38％的碳酸钾缓冲液8-12份，搅拌中加入猪病毒蛋白0.015-0.025份继续搅拌8-12min，再加入牛血清白蛋白10-20份进行偶联，10000r/min离心4-7min，去掉上清，留下层胶体金颗粒溶液进行喷金使用；
在玻璃纤维素膜上喷金，用量2.5-8.5ul/cm，蛋白浓度2-10ug/ml，再在温度35-38℃下干燥10-14h，密封保存备用；
(3)硝酸纤维素膜上的C/T画线：
用DC缓冲液将羊抗鼠IgG稀释成0.5-3mg/ml的羊抗鼠IgG溶液，在PVC底板上贴好硝酸纤维素膜中间用羊抗鼠IgG画C线，用量0.5-3ul/cm；
用DT缓冲液将猪病毒抗原稀释成0.5-3mg/ml，在PVC底板上贴好硝酸纤维素膜C线往下5-10mm处用稀释后的猪病毒蛋白画T线，用量0.5-3ul/cm；
将画好线的PVC底板在温度35-38℃下干燥8-12h，密封保存备用；
(4)胶体金大板的制作：
在步骤(3)中的PVC底板上贴上喷好金的玻璃纤维塑模，贴上样品垫及吸水纸即可。
8.根据权利要求7所述的一种动物疫病抗体类病毒胶体金定量检测***的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)中胶体金颗粒大小为15-60nm，胶体金颗粒溶液质量浓度为0.5-2％。
9.根据权利要求7所述的一种动物疫病抗体类病毒胶体金定量检测***的制备方法，其特征在于：所述步骤(4)中的样品垫使用前进行处理，即用定量的DY缓冲液进行均匀涂抹，其中，100ml的D Y缓冲液配方为：10％tw20+表面活性剂5-15％+1％PEG20000+10％海藻糖，用蒸馏水定容到100ml。
10.根据权利要求7所述的一种动物疫病抗体类病毒胶体金定量检测***的制备方法，其特征在于：所述胶体金溶液PH值为6.2-7.8。
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