CN103387996B - 犬细小病毒病毒样颗粒、其制备方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种犬细小病毒病毒样颗粒，其是根据昆虫细胞偏爱密码子，对犬细小病毒VP2基因进行优化，将优化后的VP2基因与昆虫表达载体连接，利用杆状病毒/昆虫细胞表达***来生产犬细小病毒病毒样颗粒。将所述犬细小病毒病毒样颗粒与防腐剂和佐剂混合，即制备得到犬细小病毒性肠炎疫苗。本发明的犬细小病毒性肠炎疫苗具有产量高、生产成本低、免疫原性高、安全性好、便于大规模生产等优点，对犬细小病毒性肠炎具有良好的免疫及预防效果。

Description

犬细小病毒病毒样颗粒、其制备方法及应用

技术领域

本发明涉及微生物领域、基因工程领域及兽医生物制药领域，具体地说，涉及犬细小病毒病毒样颗粒、其制备方法及应用。

背景技术

1978年，澳大利亚人Kelly和加拿大人Thomson等从患出血肠炎的病犬中分离到犬细小病毒病原，为了与犬极细小病毒区别，将此分离出的病原命名为CPV-2。1979年和1984年，又有两种犬细小病毒的亚型CPV-2a、CPV-2b相继出现并取代CPV-2，在全球范围内广泛流行。2002年出现关于CPV-2c的报道。CPV感染犬科动物，具有高度接触传染性，主要引起出血性腹泻和心肌炎，幼犬中发病率和死亡率都很高。该病已成为犬科动物的一种重要传染病，给经济动物养殖业造成极大的危害。

犬细小病毒属于细小病毒科细小病毒属成员，病毒外观呈六角形，无囊膜，二十面体等轴对称，直径约为20nm，衣壳由32个壳粒组成。该病毒血凝特性较强，能够凝集猪和恒河猴的红细胞。CPV基因组长约5.2kb，包括两个开放阅读框，分别编码非结构蛋白和结构蛋白。其中病毒结构蛋白VP1和VP2由相同的mRNA通过选择性剪接后翻译而来，VP1包括VP2蛋白的全部序列，VP2是病毒衣壳的主要组成蛋白，并决定病毒的主要生物学特性。

目前用于犬细小病毒的疫苗主要是弱毒疫苗和灭活疫苗，但各自存在缺点，例如，弱毒疫苗存在毒力返祖及重组的危险，灭活疫苗免疫原性较弱，且不能引起细胞免疫应答等。因此，研制新型的CPV疫苗成为亟待解决的技术问题。

发明内容

本发明的目的是提供一种犬细小病毒病毒样颗粒、其制备方法及应用。

本发明的另一目的是提供一种犬细小病毒性肠炎疫苗、其制备方法及应用。

为了实现本发明目的，本发明利用杆状病毒/昆虫细胞表达***来生产犬细小病毒病毒样颗粒。

本发明首先提供一种优化的犬细小病毒VP2基因，即根据昆虫细胞偏爱密码子对犬细小病毒VP2基因进行优化，得到优化的犬细小病毒VP2基因。优化前犬细小病毒VP2基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，优化后的犬细小病毒VP2基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。优化后的VP2基因编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示。

本发明还提供一种犬细小病毒病毒样颗粒的制备方法，包括以下步骤：（1）重组杆状病毒Bacmid质粒的构建：将前述优化的VP2基因***到昆虫细胞表达载体pFastBac1中，转化大肠杆菌DH10Bac感受态细胞，提取阳性质粒即为重组杆状病毒Bacmid质粒；（2）重组杆状病毒的拯救：用重组杆状病毒Bacmid质粒转染昆虫细胞，拯救获得重组杆状病毒；（3）犬细小病毒病毒样颗粒的制备：将获得的重组杆状病毒按MOI=0.1接种昆虫细胞，4-5天后收获上清，即得犬细小病毒病毒样颗粒。

前述方法中，步骤（2）-（3）中使用的昆虫细胞为Sf9细胞。

步骤（2）中待Sf9细胞的细胞汇合度达到80%以上时进行转染。本发明还提供由上述方法制备的犬细小病毒病毒样颗粒。

本发明还提供所述犬细小病毒病毒样颗粒在制备犬细小病毒性肠炎疫苗中的应用。

本发明还提供一种犬细小病毒性肠炎疫苗，其是将上述制备的犬细小病毒病毒样颗粒辅以防腐剂和佐剂制备而成。其中，所述防腐剂为叠氮钠等，优选终浓度为0.01%；所述佐剂为磷酸铝等，优选终浓度为0.4%。

本发明的犬细小病毒性肠炎疫苗为肌肉注射疫苗或口服疫苗。

本发明进一步提供上述制备的犬细小病毒性肠炎疫苗在预防犬/猫科动物细小病毒性肠炎中的应用。

本发明利用杆状病毒/昆虫细胞表达***来生产犬细小病毒病毒样颗粒，以杆状病毒作为表达载体，以Sf9细胞作为生物反应器，制备的犬细小病毒性肠炎疫苗具有产量高、生产成本低、免疫原性高、安全性好、便于大规模生产等优点，对犬细小病毒性肠炎具有良好的免疫及预防效果。

附图说明

图1为本发明实施例1中重组杆状病毒表达质粒Bac-VP2的构建示意图。

图2为本发明实施例1中重组表达质粒Bac-VP2转染Sf9昆虫细胞后的情况；其中，A为正常细胞对照组，B为重组表达质粒转染细胞组。

图3为本发明实施例1中重组杆状病毒感染细胞上清的电镜检测结果。

图4为本发明实施例1中重组杆状病毒感染Sf9细胞后间接免疫荧光检测结果；其中，A为重组杆状病毒感染组，B为正常细胞组。

图5为本发明实施例2中犬细小病毒性肠炎疫苗免疫豚鼠后机体内血凝抑制抗体效价。

图6为本发明实施例2中犬细小病毒性肠炎疫苗免疫犬后机体内血凝抑制抗体效价消长情况。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。

实施例1犬细小病毒病毒样颗粒的制备及鉴定

1材料

供体质粒pFastBac1购自Invitrogen公司，菌种E.coli DH10Bac、昆虫细胞Sf9、犬细小病毒由长春西诺生物科技有限公司提供。

pEASY-blunt simple、IPTG、X-gal购自大连宝生物公司，PhusionDNA聚合酶、T4DNA连接酶、限制性内切酶购自NEB公司，感受态细胞购自Takata公司，基因组DNA提取试剂盒、凝胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒购自Axygen公司，脂质体Lipofectin2000购自Invitrogen公司，氨苄青霉素、四环霉素、卡那霉素、庆大霉素购自Sigma公司，胎牛血清为长春西诺生物科技有限公司生产，TC-100昆虫细胞培养基购自Applichem公司，兔抗犬细小病毒多克隆抗体购自长春西诺生物科技有限公司，FITC标记的山羊抗兔二抗购自北京中衫公司。

2方法

2.1病毒基因组的提取

将犬细小病毒同步接种F81细胞，接种4天后反复冻融3次后收毒，用商品化试剂盒提取总DNA，操作方法参见试剂盒说明书。

2.2CPV VP2基因序列的测定与优化

参考GenBank上公布的犬细小病毒VP2基因序列（FJ435347.1），利用Primer5.0软件设计PCR引物VP2-F1、VP2-R1（表1）。通过PCR扩增，将得到的产物（CPV-VP2）与pEASY-blunt simple载体4℃过夜连接，连接产物转化感受态细胞Trans5α，挑选阳性克隆进行测序分析，得到的犬细小病毒VP2基因序列如SEQ ID NO.1所示。

将得到的犬细小病毒VP2基因序列进行优化，即在保证编码的氨基酸序列（SEQ ID NO.3）不变的情况下，通过碱基替换，得到昆虫细胞偏爱的密码子。优化后的VP2基因序列如SEQ ID NO.2所示，将其克隆至载体pMD18上，得到的重组载体命名为opti-CPV-VP2。

2.3重组供体质粒pF-CPV-VP2的构建

以opti-CPV-VP2为模板，VP2-F2、VP2-R2为引物（表1），进行PCR扩增，得到的扩增产物命名为SF-CPV-VP2。通过NotI和HindIII双酶切将SF-CPV-VP2连入昆虫表达载体pFastBac1中，得到的重组载体命名为pF-CPV-VP2。

表1PCR引物序列

2.4重组杆状病毒表达质粒Bac-VP2的构建

将pF-CPV-VP2转化感受态DH10Bac：取1μL pF-CPV-VP2加入到50μL感受态DH10Bac细胞中，冰浴30min，42℃热激45s，冰浴2min，加入1mL无抗性LB培养基，37℃200rpm/min4h，将菌液取80μL涂LB平板（含卡那霉素、庆大霉素、四环素三种抗生素），37℃培养36-48h，挑选白斑菌落，加入LB培养基（卡那霉素、庆大霉素、四环霉素终浓度分别为50μg/mL、7μg/mL、10μg/mL），37℃200rpm/min摇床培养12h。提取质粒DNA，进行PCR鉴定。将鉴定为阳性的重组质粒命名为Bac-VP2。

2.5重组杆状病毒的拯救与鉴定

将重组杆状病毒表达质粒Bac-VP2转染昆虫细胞：转染前一天，将Sf9细胞置于12孔板中，在10%TC-100培养基中27℃培养，当细胞密度达到80%以上时进行转染。将1μg的Bac-VP2加入至100μL的双无（无血清、无双抗）TC-100培养液中轻柔混匀；将4μL脂质体加入到100μL双无TC-100培养液中轻柔混匀；将质粒与脂质体混匀，室温静置15min。此间用双无TC-100培养液洗12孔板细胞两次，然后将800μL质粒与脂质体混合物加入Sf9细胞中，置于27℃培养箱中培养，待细胞肿胀，变圆，脱落后，取上清，标记为P1代重组杆状病毒。将拯救获得的P1代重组杆状病毒感染正常生长的Sf9细胞，培养4-5天，待细胞肿胀，变圆，脱落后，取上清，提取DNA，以VP2-F2和VP2-R2（表1）为引物，进行PCR鉴定。

2.6间接免疫荧光

将1×10⁶个/孔Sf9细胞铺6孔细胞培养板，用0.1个MOI接毒，感染30h后，用80%的预冷丙酮于-20℃固定过夜，用PBST洗3次，每次3min，加入PBST1:200稀释的一抗（兔抗犬细小病毒多克隆抗体），37℃孵育1h，用PBST洗2次，每次3min，加入PBST1:500稀释的FITC标记的山羊抗兔二抗，37℃孵育1h，用PBST洗3次，每次3min，观察荧光。

2.7电镜观察

收获产生细胞病变的昆虫细胞，反复冻融3次，2000rpm/min离心5min，取上清，以磷钨酸染色，电镜观察病毒样粒子的包装情况。

2.8犬细小病毒病毒样颗粒含量测定

将拯救获得的重组杆状病毒接种Sf9细胞，待产生细胞病变后收获病毒液，反复冻融3次，2000rpm/min离心5min，取上清，以血凝试验（HA）检测形成的犬细小病毒病毒样颗粒含量。

3结果

3.1VP2基因优化结果

经序列测定分析，犬细小病毒VP2基因开放阅读框全长1755bp，编码584个氨基酸。根据昆虫细胞对密码子的偏爱性，将获得的犬细小病毒VP2序列进行优化，优化原则遵循以下几点：编码的氨基酸序列不变；将稀有密码子去除；将影响mRNA稳定性并影响与核糖体结合的茎环结构破坏。优化后的犬细小病毒VP2基因序列如SEQ IDNO.2所示。

3.2重组杆状病毒表达质粒构建结果

将供体质粒pF-CPV-VP2转染感受态DH10Bac后，可通过多克隆酶切位点两侧的Tn7R、Tn7L进行转座重组，得到重组杆状病毒表达质粒Bac-VP2（构建示意图见图1），Bac-VP2中包括犬细小病毒VP2基因。

3.3重组杆状病毒的拯救

将重组表达质粒Bac-VP2转染Sf9昆虫细胞，进行重组病毒的拯救。转染72h后，同正常细胞（图2A）对照孔相比，转染孔细胞（图2B）开始脱落、肿胀、裂解，形态不规则，表明重组表达质粒转染细胞后包装产生了重组杆状病毒，引起细胞病变。

3.4电镜观察结果

将收获的病毒液，以磷钨酸染色后，经电子显微镜观察病毒样颗粒的包装情况。结果表明：包装形成的CPV病毒粒子形态为正二十面体的球形颗粒，大小约为25nm（图3），说明重组杆状病毒在昆虫细胞内表达的VP2蛋白成功组装形成了病毒样颗粒。

3.5间接免疫荧光

将重组杆状病毒感染Sf9细胞，以间接免疫荧光法检测犬细小病毒VP2蛋白的表达情况。如图4A所示，可见大量绿色荧光，表明VP2大量表达（图4B为阴性细胞对照）。

3.6犬细小病毒病毒样颗粒含量测定

将收获的病毒液，以血凝试验（HA）检测其中形成病毒样颗粒的含量。结果表明：重组杆状病毒感染Sf9细胞后包装形成的犬细小病毒病毒样颗粒可以成功凝集猪红细胞，其血凝效价为1:2¹²。

实施例2犬细小病毒性肠炎疫苗的制备及动物免疫试验

1材料

将磷酸铝用等渗盐水配成适当浓度后，超声破碎20min，配制成悬液，高温灭菌后备用。雌性豚鼠（250g左右）、中华田园犬（2-4月龄，CPV血凝抑制抗体效价小于1:2³）购自长春生物制品研究所。

2方法

2.1犬细小病毒性肠炎疫苗的制备

将表达犬细小病毒VP2基因的重组杆状病毒接种Sf9细胞，27℃连续培养4-5天，待细胞出现病变后，收获细胞悬液，反复冻融3次，2000rpm离心10min，收获上清液，即得犬细小病毒病毒样颗粒。将收获的犬细小病毒病毒样颗粒加入叠氮钠（0.01%）和磷酸铝（0.4%），制备犬细小病毒性肠炎疫苗。

2.2血凝抑制试验

将采集的犬和豚鼠血清经56℃灭活30min，加入1/10体积猪红血球混匀，室温放置2h，然后以2000rpm离心10min。取干净v型96孔板，每孔加入25μL PBS，向第一孔中加入灭活并吸附后血清25μL，从左向右连续倍比稀释至第十孔，第十一孔为8单位抗原的阳性对照，第十二孔为阴性对照。然后加入8单位抗原25μL至第十孔，第十一孔中加入8单位抗原25μL，并在该列向下进行二倍倍比稀释，再向第十一、十二孔加入PBS25μL。振荡混匀后，37℃孵育1h，再加入1%猪红血球悬液（含0.5%兔血清）50μL，振荡混匀后，4℃放置1h，观察血凝抑制（HI）效价。

2.3豚鼠免疫实验

取雌性豚鼠25只（250g左右）随机分为5组，每组5只（表2）。其中M1、M2组进行肌肉注射，O3、O4组进行口服免疫，C5组为正常对照。M1、O3免疫1次，M2、O4免疫2次，间隔14天。免疫后第0、7、14、21、28天采血，进行血凝抑制抗体水平的检测。

2.4犬免疫实验

取12只中华田园犬，依次标号为M1、O2、O3、C4，具体分组及免疫程序见表3。其中M1组进行肌肉注射，O2、O3组进行口服免疫，第0天首免，第15天加强免疫。于免疫当天和免疫后的每15天采血，进行血凝抑制抗体水平的检测。C4组作为正常对照。

表2豚鼠免疫分组

表3犬免疫分组及免疫程序

3结果

3.1豚鼠免疫结果

按表2免疫程序对豚鼠进行免疫，第14天加强免疫后，血凝抑制抗体效价逐步升高，相同时间点下肌肉注射组抗体效价高于口服免疫组，2次免疫效果优于1次免疫（图5）。其中，肌肉注射后，血凝抑制抗体效价最高可达1:2⁹，口服免疫后，血凝抑制抗体效价最高可达1:2⁷。

3.2犬免疫结果

按表3免疫程序对犬进行犬细小病毒性肠炎疫苗免疫。结果表明：免疫后15天各组犬均能检测到犬细小病毒血凝抑制抗体，肌肉注射组高于口服免疫组。口服免疫2次（加强免疫）后，犬体内血凝抑制抗体效价明显增高，达到与肌肉注射组相同的水平。其中，肌肉注射或口服免疫后，血凝抑制抗体效价均最高可达1:2¹²（图6）。免疫持续期试验表明：肌肉注射或口服免疫2次组各犬在免疫后12个月，机体内细小病毒血凝抑制抗体效价仍高于1:2⁵，即犬细小病毒性肠炎疫苗刺激机体产生的抗体效价至少可以维持12个月。

实施例3犬细小病毒性肠炎疫苗对犬的保护试验

1材料

犬细小病毒性肠炎疫苗按实施例2中所述方法制备，中华田园犬（2-4月龄，CPV血凝抑制抗体效价小于1:2³）购自长春生物制品研究所。

2方法

2.1动物免疫

取12只中华田园犬，依次标号为M1、O2、O3、C4，按实施例2中表3进行分组和免疫。其中M1组进行肌肉注射，O2、O3组进行口服免疫，第0天首免，第15天加强免疫。

2.2动物感染

免疫后21天进行犬细小病毒强毒攻击。具体方法如下：口服接种犬细小病毒强毒2mL（病毒含量为10⁶TCID₅₀），接种后每日观察犬的食欲、精神状态、体温变化及死亡情况。同时每日采集粪便，检测粪便中CPV病毒含量，确定其排毒情况。

3结果

对照组（C4）犬在攻毒后3-5天，相继出现典型的犬细小病毒性肠炎临床症状，主要表现为：食欲减退、精神萎靡、白细胞减少、拉稀等，粪便中可检测到犬细小病毒。攻毒后8-10天，3只对照犬相继死亡。口服1次（O2）免疫组，有1只犬出现食欲减退、精神萎靡症状，在攻毒后4天的粪便内检测到了病毒，但症状在感染后6天逐渐消失，并最终康复。肌肉注射（M1）和口服2次（O3）免疫组犬均未出现临床症状，在粪便中也未检测到细小病毒。结果表明：制备的犬细小病毒性肠炎疫苗对犬安全、无致病性，并对犬细小病毒性肠炎毒具有很好的免疫和预防效果。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (5)

1.犬细小病毒病毒样颗粒在制备犬细小病毒性肠炎疫苗中的应用，其特征在于，所述犬细小病毒病毒样颗粒的制备方法包括以下步骤：

(1)根据昆虫细胞偏爱密码子对犬细小病毒VP2基因进行优化，得到优化的犬细小病毒VP2基因；

(2)重组杆状病毒Bacmid质粒的构建：将优化的VP2基因***到昆虫细胞表达载体pFastBac1中，转化大肠杆菌DH10Bac感受态细胞，提取阳性质粒即为重组杆状病毒Bacmid质粒；

(3)重组杆状病毒的拯救：用重组杆状病毒Bacmid质粒转染昆虫细胞，拯救获得重组杆状病毒；

(4)犬细小病毒病毒样颗粒的制备：将获得的重组杆状病毒按MOI＝0.1接种昆虫细胞，4-5天后收获上清，即得犬细小病毒病毒样颗粒；

步骤(1)中优化的犬细小病毒VP2基因的核苷酸序列如SEQ IDNo.2所示；

步骤(3)-(4)中使用的昆虫细胞为Sf9细胞；

步骤(3)中待Sf9细胞的细胞汇合度达到80％以上时进行转染；

所述的疫苗为将犬细小病毒病毒样颗粒辅以防腐剂和佐剂制备而成；

所述疫苗为肌肉注射疫苗或口服疫苗。

2.犬细小病毒性肠炎疫苗，其特征在于，将犬细小病毒病毒样颗粒辅以防腐剂和佐剂制备而成；其中，所述犬细小病毒病毒样颗粒的制备方法包括以下步骤：

(1)根据昆虫细胞偏爱密码子对犬细小病毒VP2基因进行优化，得到优化的犬细小病毒VP2基因；

(2)重组杆状病毒Bacmid质粒的构建：将优化的VP2基因***到昆虫细胞表达载体pFastBac1中，转化大肠杆菌DH10Bac感受态细胞，提取阳性质粒即为重组杆状病毒Bacmid质粒；

(3)重组杆状病毒的拯救：用重组杆状病毒Bacmid质粒转染昆虫细胞，拯救获得重组杆状病毒；

(4)犬细小病毒病毒样颗粒的制备：将获得的重组杆状病毒按MOI＝0.1接种昆虫细胞，4-5天后收获上清，即得犬细小病毒病毒样颗粒；

步骤(1)中优化的犬细小病毒VP2基因的核苷酸序列如SEQ IDNo.2所示；

步骤(3)-(4)中使用的昆虫细胞为Sf9细胞；

步骤(3)中待Sf9细胞的细胞汇合度达到80％以上时进行转染；

其中，所述的防腐剂为叠氮钠；

其中，所述的佐剂为磷酸铝。

3.根据权利要求2所述的疫苗，其特征在于，所述防腐剂终浓度为0.01％。

4.根据权利要求2所述的疫苗，其特征在于，所述佐剂终浓度为0.4％。

5.根据权利要求2所述的疫苗，其特征在于，所述疫苗为肌肉注射疫苗或口服疫苗。