CN104988107B - 一种高效表达***病毒抗原基因的重组乳酸杆菌及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种高效表达***病毒抗原基因的重组乳酸杆菌及其制备方法和应用，属于生物技术领域。本发明的重组乳酸杆菌含有在N端引入改造的乳酸杆菌信号肽基因并进行密码子优化的***病毒VP1基因序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。本发明对乳酸杆菌信号肽的结构进行改造，将改造的乳酸杆菌信号肽基因借一连接短肽GSGGSGG与密码子优化后的***病毒VP1基因进行融合，将融合后的基因序列***大肠杆菌‑乳酸菌穿梭表达载体中，构建重组质粒pSIP/opti‑FMDV‑A/VP1，将pSIP/opti‑FMDV‑A/VP1重组质粒转化至乳酸杆菌。本发明针对重组乳酸杆菌表达***，建立了适当改造信号肽结构以提高外源蛋白分泌效率的新思路和新方法，为进一步研发新型黏膜免疫疫苗提供理论依据和技术支持。

Description

一种高效表达***病毒抗原基因的重组乳酸杆菌及其制备 方法和应用

技术领域

本发明涉及一种重组乳酸杆菌及其制备方法和应用，特别涉及一种高效表达***病毒抗原基因的重组乳酸杆菌及其制备方法和应用，属于生物技术领域。

背景技术

***(Foot and mouth disease，FMD)是由***病毒(Foot and mouthdisease virus，FMDV)引起的偶蹄动物的一种急性、热性、高度接触传染的传染病，以传播迅速、发病率高而著称。世界动物卫生组织(OIE)将它列为93种法定报告的动物疫病之一。***病毒属于小RNA病毒科***病毒属，病毒基因组为单股正链RNA，约8.5kb，有7个血清型，型间无交叉保护。其开放阅读框由L基因、P1结构蛋白基因(包括VP4、VP2、VP3、VP1基因)、P2非结构蛋白基因(包括2A、2B、2C基因)和P3非结构蛋白基因(3A、3B、3C、3D基因)组成。其中，VP1蛋白带有诱导FMD免疫反应的关键表位，包括VP1的141-160,200-213和21-40位氨基酸。VP1基因全长636bp，是编码FMDV-VP蛋白的免疫原性基因。围绕VP1分子，目前研究较热的FMD基因工程疫苗包括亚单位疫苗、可饲疫苗、蛋白质载体疫苗、基因缺失疫苗、活载体疫苗和核酸疫苗等。目前对***的防制主要采取免疫与扑杀相结合政策，而安全有效的疫苗是成功防制乃至最终消灭***的先决条件。***弱毒疫苗有较好的免疫力，免疫持续时间长，疫苗接种量少，但弱毒疫苗存在散毒和毒力返祖现象，国际上已有多起由于使用弱毒疫苗而引发***的报道，因此，许多国家已明文禁止使用弱毒疫苗。灭活疫苗虽克服了弱毒疫苗的一些缺点，但疫苗接种剂量较大，免疫持续期短；疫苗中未完全灭活的病毒可能引起疾病的新爆发；此外灭活疫苗诱导的抗病毒免疫机制的广谱性有限，其局限性日渐突出，因此，世界各国的相关研究室都在致力于研制安全、有效的新型***疫苗。

黏膜分布在呼吸道、消化道、泌尿生殖道等器官脏器的表层，是外来物质进入机体的门户，也是机体免疫***的第一道防线。黏膜不仅具有强大物理、化学机制来清除和降解入侵的外来物质，也具有先天性和获得性免疫***来保护机体抵抗病原微生物的入侵和感染。黏膜免疫***是机体免疫***的重要组成部分，也是机体抵抗病原入侵的第一道防线。对于通过消化道和呼吸道感染的传染病而言，黏膜免疫具有重要的意义：能够诱导局部黏膜免疫应答的发生和sIgA的分泌，在入侵和感染部位抵抗病原菌，同时也能诱导体液免疫和细胞免疫。研究表明，黏膜免疫应答产生的抗体比血清中的抗体出现的时间早，持续时间长，在预防和抵抗病原微生物方面起到非常重要的作用。

乳酸菌作为机体内的正常菌群，能长期的定植于机体内发挥其促进营养物质分子降解和吸收、维持肠道内菌落平衡、调节免疫***作用等益生作用。人们已经对乳酸菌的益生作用给予了相当大的关注，特别是在乳制品工业。目前，市场上已经能购买到含益生菌的奶制品，酸奶更是成为普通商品。在乳酸菌的益生作用已经被确证的今天，更多的关于乳酸菌作用机理和作用模式的研究仍然需要开展。

黏膜免疫的研究发展，使活菌载体疫苗成为疫苗研究中的热点。活细菌载体疫苗能在黏膜表层诱导黏膜免疫应答的发生，刺激sIgA的产生，将病原菌阻挡在体外。乳酸菌作为食品安全级的微生物，是动物和人体内的正常菌群，具有益生作用和免疫佐剂作用，这使得其成为细菌活载体疫苗研究中载体的有力候选菌株。乳酸菌作为载体用于活载体疫苗研究的优点如下：

(1)养容易，遗传操作(如电穿孔法转基因)方法成熟、简便、且效率高、重复性好；

(2)本身为食品级细菌，安全，做载体无免疫原性，可以有效提高疫苗的安全性，并可在一定程度上简化表达产物的后处理工艺；

(3)可在细胞内表达也可在细胞表面表达和分泌到胞外；

(4)乳酸菌对机体粘膜有极强的粘附作用，因此构建的乳酸杆菌基因工程菌就可以在粘膜处不断繁殖，持续向机体释放目的抗原蛋白；

(5)乳酸菌可直接口服，接种安全，简单有效，同时免去了目的蛋白的体外提纯等后加工处理工序；

(6)具有免疫佐剂作用，可诱发黏膜免疫、体液免疫和细胞免疫的发生。

近年来，随着分子生物学的发展和对乳酸菌认识的加深，乳酸菌用于活载体疫苗的研究取得很大进展。乳酸菌表达***已经成功用于猪流行性腹泻、新城疫、破伤风、轮状病毒等活载体疫苗的研究。Xu等构建了共表达经典猪瘟CD8+CTL表位290和猪细小病毒VP2抗原的基因工程乳酸杆菌并分析其作为猪口服疫苗的免疫效果。研究数据表明，在没有任何佐剂的情况下，重组乳酸杆菌能有效的诱导黏膜和***免疫应答来预防经典猪瘟。同时，重组乳酸杆菌也能诱导抗ppv-vp2的血清抗体IgG和黏膜抗体IgA的产生。这些结果暗示了，在未来经典猪瘟和猪细小病毒病疫苗的发展中，重组乳酸杆菌微生态制剂是一种有价值的策略。

Belkis Marelli等成功的构建了将轮状病毒纤突蛋白亚单位VP8表达于细胞质，分泌到细胞外、展示到菌体表面的重组乳酸杆菌，免疫老鼠后并评价其免疫反应。研究表明，口服免疫LL1的老鼠产生了显著水平的肠黏膜抗体而接种LL3的老鼠则产生了肠黏膜和***水平的抗VP8抗体。LL1免疫组的肠黏膜抗体的保护率达到50％，LL3免疫组的血清抗体保护率达到100％。这些令人鼓舞的结果描绘了轮状病毒疫苗发展的新方向。

Lei等成功的构建了表达并将禽流感HA1抗原展示在菌体表面的重组乳酸乳球菌。重组乳酸杆菌单独或和霍乱毒素单位B一起口服免疫试验动物。分析免疫反应的结果，最后小鼠攻毒致死剂量的H5N1病毒。在添加CTB的实验组中检测到了明显滴度的HA特异性血清IgG以及粪便IgA。细胞增殖实验和INF-γ酶联免疫斑点实验的结果揭示了细胞免疫应答的发生。更重要的是，CTB与重组乳酸杆菌联合免疫组的小鼠能够抵抗致死剂量的H5N1病毒感染。

发明内容

相对于大肠杆菌原核表达***，乳酸菌表达***还不够成熟，主要表现在外源蛋白的表达量较低、乳酸菌的某些遗传背景不够清楚，操作比较繁琐，表达条件相对不够稳定等，本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的缺陷，提供一种高效表达外源基因的乳酸杆菌载体***，提高外源基因表达量，从而实现口服免疫。

本发明所要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的：

一种高效表达***病毒抗原基因的重组乳酸杆菌，其特征在于，所述重组乳酸杆菌含有在N端引入改造的乳酸杆菌信号肽基因并进行密码子优化的***病毒VP1基因序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

含有该核苷酸序列的表达载体pSIP/opti-FMDV-A/VP1也当然属于本发明的保护范畴之内。

在本发明中，优选的，改造后的乳酸杆菌信号肽基因借一连接短肽GSGGSGG与密码子优化后的***病毒VP1基因进行融合。

在本发明中，优选的，所述的***病毒为***A型病毒。

制备所述的重组乳酸杆菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)利用提高N端正电荷和H区疏水性的方法，对乳酸杆菌信号肽的结构进行改造，将改造后的乳酸杆菌信号肽基因借一连接短肽GSGGSGG与密码子优化后的***病毒VP1基因进行融合，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；

(2)将融合后的基因序列***大肠杆菌-乳酸菌穿梭表达载体中，构建重组质粒pSIP/opti-FMDV-A/VP1；

(3)将pSIP/opti-FMDV-A/VP1重组质粒转化至乳酸杆菌。

在本发明中，优选的，步骤(3)将重组质粒pSIP/opti-FMDV-A/VP1电转化导入到乳酸杆菌NC8中，电转化后的乳酸杆菌NC8涂布于MRS培养基上，在37℃培养箱中培养24h-72h，将平板上的菌落挑斑后分别于MRS液体培养基中过夜培养，将上述菌液以1:100的接种率接种于50mL MRS液体培养基中，37℃培养至OD值为0.6-0.8，并以浓度为50-100ng/mL乳杆菌肽(SppIP)为诱导物，诱导表达4-7h得到重组蛋白。

在本发明中，优选的，所述的重组蛋白在信号肽的引导下分泌到胞外，具有较好的免疫原性，分子量为25kD。

在本发明中，优选的，所述电转化的电压参数为2500V，5ms。

本发明将***病毒VP1基因按照乳酸杆菌密码子偏好进行优化，并在VP1基因的N端增加一段改造的信号肽基因和连接短肽，人工合成了一条全长为741bp的FMDV-A/VP1优化基因，命名为opti-FMDV-A/VP1，利用该基因构建了分泌性表达***病毒VP1基因的乳酸杆菌重组表达载体pSIP/opti-FMDV-A/VP1。通过电转化导入到乳酸杆菌NC8中，对转化过程中电转化参数进行优化，经乳杆菌肽SppIP诱导，目的基因在乳酸杆菌中得到了稳定的、高效的表达，SDS-PAGE分析表明融合蛋白分子量约为25kD，光密度扫描分析可知表达的重组蛋白占菌体总蛋白的18％。菌液上清经SDS-PAGE电泳和Western-blot检测有少量目的蛋白表达，初步证明目的蛋白能够有效地表达并在信号肽的引导下分泌到胞外，最终获得高效表达***病毒VP1基因的重组乳酸杆菌NC8，本发明通过对表达过程中诱导物浓度、诱导剂加入时间和诱导时间等多个影响表达的关键因素的探索，提供了一种高效表达外源基因的乳酸杆菌载体***。

乳酸菌是益生菌，使用较传统疫苗更为安全，并且其作为疫苗载体免疫方便，诸多研究表明乳酸菌作为微生态制剂能够显著增强其它疫苗如禽流感、新城疫疫苗的免疫效力，因此，乳酸菌活载体疫苗在应用上具有一定竞争优势。本研究针对***病毒研制的重组菌乳酸菌疫苗，国内外未见报道，为***新型黏膜免疫疫苗研制奠定了基础。

在本发明的一个具体实施例中，重组乳酸菌NC8用鲜奶重悬后口服免疫豚鼠，同时设空载体及鲜奶为阴性对照组，间接ELISA检测特异性抗体。结果表明，重组乳酸菌对豚鼠二免后9d，豚鼠抗FMDV特异性抗体水平较首免后9d有明显提高；三免后9d，抗体水平显著升高，说明重组乳酸菌NC8中表达的抗原蛋白具有良好的免疫原性。重组乳酸菌免疫组的抗病毒能力远远大于空白对照组，空白对照组豚鼠全部发病，而空载体免疫组一半豚鼠发病，也证明了乳酸菌具有黏膜免疫佐剂的作用。

因此进一步的，本发明提供了所述的重组乳酸杆菌在制备A型***口服疫苗中的应用。及

所述的重组乳酸杆菌在制备A型***黏膜免疫佐剂中的应用。

与现有技术相比，本发明的有益效果体现在：

(1)本发明表达的目的蛋白能够有效地表达，并在信号肽的引导下分泌到胞外。因此我们可以在培养上清中获得可溶性的表达产物。既可以用纯化的表达产物进行免疫，也可以直接用重组菌进行口服免疫，这样就省去了常规原核表达***表达后的复杂的纯化过程和复性过程，口服免疫则更适合于规模化养殖。

(2)动物免疫试验证实本发明制备的重组乳酸杆菌NC8表达的抗原具有较好的免疫原性；乳酸杆菌属于肠道益生菌，作为食品安全级微生物，是动物和人体内的正常菌群，具有益生作用和免疫佐剂作用，这使得其成为细菌活载体疫苗研究中载体的有力候选菌株，对人畜安全，无病原污染；用乳酸菌表达蛋白后无需经过提取纯化过程，具有工艺简单、免疫效果好和对动物保护力强等优点，适用于家畜的免疫使用。

附图说明

图1是重组载体pSIP/opti-FMDV-A/VP1的构建路线图；

图2是重组质粒pSIP/opti-FMDV-A/VP1的酶切鉴定图；其中，M为DNA分子质量标准；1为质粒pSIP/opti-FMDV-A/VP1经NcoⅠ/XholⅠ双酶切后；

图3是重组乳酸杆菌NC8目的基因的PCR分析图；其中，M为DNA分子量标准；2为是重组乳酸杆菌NC8PCR产物；

图4是重组乳酸杆菌NC8表达蛋白的SDS-PAGE电泳图；其中中，M为预染marker；1为空载体pSIP411在NC8中诱导7h后的表达产物；2为重组质粒pSIP411-VP1在NC8中未经诱导7h后的表达产物；3为重组质粒pSIP411-VP1在NC8中经诱导7h后的表达产物；4-5为重组质粒pSIP411-VP1在NC8中经诱导7h后的表达产物经过超声处理后的上清和菌体沉淀；

图5是重组乳酸杆菌NC8表达蛋白的Western-blot检测图；其中，1为经SppIP诱导的重组乳酸杆菌NC8表达目的蛋白；2为含有空载体的乳酸杆菌NC8表达蛋白；3为未经诱导的重组乳酸杆菌NC8表达的蛋白；M为蛋白分子量标准；

图6是豚鼠唾液中sIgA抗体水平的动态变化图；

图7是豚鼠粪便浸出液中sIgA抗体水平的动态变化图；

图8是豚鼠血液中IgA抗体水平的动态变化图；

图9是豚鼠血液中IgG抗体水平的动态变化图；

图10是豚鼠脾脏T淋巴细胞增殖反应图。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实施例1 opti-FMDV-A/VP1基因的获得

1材料与方法

1.1材料及来源

***A型病毒为本实验室保存。大肠杆菌-乳酸菌穿梭质粒表达载体pSIP411及乳酸杆菌NC8购自北京毕特博生物技术有限公司，克隆载体pUC57由南京金斯瑞生物科技有限公司提供。

1.2试验方法

1.2.1基因的改造及合成

乳酸杆菌信号肽Usp45原始序列为GenBank数据库在线工具检索的基因序列，序列号为ADJ57691，利用增加Usp45信号肽N端正电荷和H区疏水性的方法，最终设计出全长81bp的改造后的U_SP45信号肽结构；A型FMDV VP1基因的原始序列全长639bp，将VP1基因与Usp45基因利用一连接短肽(GSGGSGG)连接到一起，根据乳酸菌密码子偏好对该融合基因进行优化，改造后序列由南京金斯瑞生物技术有限公司全基因合成，克隆到载体pUC57上，受体菌为大肠杆菌DH5α，命名为pUC/opti-FMDV-A/VP1，优化序列送上海桑尼公司进行序列测定。

2试验结果

获得的opti-FMDV-A/VP1基因的碱基序列如SEQ ID NO:1所示：

测序结果表明，人工合成的opti-FMDV-A/VP1与原设计的DNA序列完全相同，共741bp。Usp45信号肽全长81bp，编码27个氨基酸(MEKKIISAILMSTVILSAAAPLSGVYA)，连接短肽21bp，编码7个氨基酸序列(GSGGSGG)。VP1基因全长639bp，编码213个氨基酸。一般作为人工融合蛋白的连接肽都是结构简单或具有特殊功能的氨基酸，如Gly、Ser、Pro、Ala和Thr，尤其是Gly和Ser最为常用，它们能提供了足够的空间及柔软性。野生型VP1基因639bp中，改变了420bp，占全序列的66.04％，从而使G十C含量由59.53％降低到47.49％，213个密码子(Codon)中，改变140个密码子，优化密码子占66.04％。

实施例2重组表达载体pSIP/opti-FMDV-A/VP1的获得

1材料与方法

1.1材料及来源

限制性内切酶NcoI、Xhol及T4连接酶均购自NEB公司，Taq酶、dNTP、DNAMarkerDL2，000、DL15，000、Agarose Gel DNA Purification Kit、MiniBEST PlasmidPurification Kit购自大连宝生物公司。克隆载体pUC57由南京金斯瑞生物科技有限公司提供。

1.2试验方法

实施例1的质粒pUC/opti-FMDV-A/VP1以NcoⅠ/Xhol双酶切后的小片段，与经同样双酶切的大肠杆菌-乳酸菌穿梭表达载体pSIP411大片段连接(图1)、转化、碱裂解法提质粒，用电泳、酶切方法鉴定转化子，得到阳性重组质粒命名为pSIP/opti-FMDV-A/VP1。

2试验结果

重组质粒pSIP/opti-FMDV-A/VP1经酶切的片段与预计大小相符，说明密码子优化的VP1基因的大肠杆菌-乳酸菌穿梭表达载体pSIP/opti-FMDV-A/VP1构建正确(图2)。在pSIP/opti-FMDV-A/VP1载体中，Usp45信号肽基因、连接短肽、VP1基因共741个核苷酸，编码247个氨基酸。

实施例3表达A型***病毒VP1基因的制备及检测

1材料与方法

1.1材料及来源

(1)诱导物：杆菌肽(SppIP)(20mg/mL)由上海生工生物工程有限公司合成；

(2)抗生素：氨苄(Amr)、红霉素(Emr)购自拜尔迪生物技术有限公司。

1.2试验方法

1.2.1目的基因在乳酸杆菌NC8中的电转化与抗性菌株的筛选：电转化后的乳酸杆菌NC8涂布于MRS培养基上，在37℃培养箱中培养24h-72h，将平板上的菌落挑斑后分别于MRS液体培养基中过夜培养；

1.2.2重组乳酸杆菌NC8的PCR检测：取5mL过夜培养菌液进行质粒的提取，PCR扩增检测目的基因，同时以未转基因的载体pSIP411做阴性对照；

1.2.3不同浓度诱导物浓度、诱导时间对目的基因诱导表达的影响：将上述菌液以1:100的接种率接种于50mL MRS液体培养基中，37℃培养至OD值为0.6-0.8(约3h)，此时记为0h诱导，在培养基中加入诱导物SppIP，诱导物的终浓度分别为10ng/mL、20ng/mL、30ng/mL、40ng/mL、50ng/mL、60ng/mL、70ng/mL、100ng/mL，确定诱导物的浓度后每隔1h取菌液，至7h。同样诱导含有空载体pSIP411的重组乳酸杆菌，作为对照组，诱导结束后分别处理菌体沉淀和培养液上清做电泳分析，通过光密度扫描对表达产物进行定量分析，得出最佳诱导物浓度。

1.2.4表达产物的SDS-PAGE分析：由于乳酸杆菌pSIP/opti-FMDV-A/VP1为细胞外表达,可将蛋白分泌到培养基中，因此取37℃过夜培养的菌液离心后，保留上清分别进行4℃透析和冷冻干燥以50倍浓缩蛋白，浓缩后加入1ⅹSDS凝胶加样缓冲液(含DTT)，充分混匀，煮沸10min，1000g离心10min，取上清10ul上样。同时将的菌液离心后所得菌体沉淀也进行SDS-PAGE电泳分析。

1.2.5重组蛋白表达效率分析：脱色后的凝胶用干胶膜作成干胶片保存，对干胶片用双波长TCL扫描仪(shimadzu CS-930)分析，可定量分析表达蛋白的含量

1.2.6重组乳酸杆菌NC8的Western-blot检测：取10mL经SppIP诱导的重组乳酸杆菌上清，加入一定体积的上样缓冲液，煮沸10min，按常规法电泳、转印、封闭、漂洗，FMD阳性猪血清37℃孵育1h，漂洗后以辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗猪IgG于37℃孵育1h，漂洗后进行ECL显色。

2试验结果

2.1重组乳酸杆菌NC8的获得：电转化涂板后所长的菌落在液体培养基中培养物经提取质粒后双酶切鉴定，条带大小合适；实验证明2500V，5ms的电压参数是最合适的，电转化效率最高。

2.2重组乳酸杆菌NC8的PCR检测：提取重组乳酸杆菌质粒进行PCR检测，重组质粒可扩增出目的片段，空质粒没有扩增出任何条带(图3)。

2.3不同浓度诱导物浓度、诱导时间对目的基因诱导表达的影响：活化的种子菌以1％接种于改良的MRS液体培养基，初始培养基pH值在6.0～7.0之间，37℃培养至OD值为0.6-0.8，并以乳杆菌素(SppIP)为诱导物，诱导物浓度在50-100ng/mL时诱导表达蛋白量最高；加入诱导物后乳酸菌在4h左右表达蛋白量开始较高，在7h达到最高水平且趋于稳定；通过光密度扫描分析可知表达的重组蛋白占菌体总蛋白的18％(图4)。

2.4分泌性表达：诱导的菌液上清分别经4℃透析和冷冻干燥浓缩50倍后，SDS-PAGE电泳和Westblot检测有少量目的蛋白表达，初步证明目的蛋白能够有效地表达并在信号肽的引导下分泌到胞外(图4)。因此我们可以在培养上清中获得可溶性的表达产物。既可以用纯化的表达产物进行免疫，也可以直接用重组菌进行口服免疫，这样就省去了常规原核表达***表达后的复杂的纯化过程和复性过程，口服免疫则更适合于规模化养殖。试验通过对乳酸杆菌pSIP411质粒表达***理想表达条件的探索为更好利用该***表达活性蛋白奠定了基础。

2.5重组乳酸杆菌NC8的Western-blot检测：重组乳酸杆菌蛋白提取液经电泳和转膜杂交后，结果显示：表达蛋白能被***病毒阳性猪血清抗体识别，经诱导的重组菌株在约25KD处可见较微弱的特异性免疫反应条带，而未诱导的菌株和和含空载体的菌株无此杂交带(图5)。说明VP1基因在转基因重组乳酸杆菌中已表达，且所表达的蛋白具有免疫反应活性。

实施例4动物免疫试验

1材料与方法

1.1材料及来源

健康豚鼠(300-500g)由本所实验动物养殖场提供。包被抗原、辣根过氧化物酶(HRP)标记的兔抗豚鼠IgG、OPD、双氧水等试剂为ELISA诊断试剂盒所配备。

1.2试验方法

1.2.1动物分组及免疫与攻毒

将豚鼠随机分为5组，每组6只，分别为含重组质粒pSIP/opti-FMDV-A/VP1的NC8(A组)、含质粒pSIP411的NC8(B组)、含重组质粒pSIP/opti-FMDV-A/VP1的WCFS1(C组)、含质粒pSIP411的WCFS1(D组)和阴性对照(只灌服奶,E组)，免疫三次，免疫时间每次间隔为一周，每次连续免疫三天，每天一次，第四周攻毒，第五周杀死豚鼠，检测各项指标。

表1

免疫程序

将7h诱导的重组乳酸杆菌上清重悬于鲜奶中；分每只豚鼠注射0.2ml；分别于0d、9d、19d、29d采血，间接ELISA法测定血清抗体；第三次免疫后28d攻毒，豚鼠后跖部皮内穿刺攻毒，每只豚鼠接种100ID50/0.2mL的A型FMDV，连续观察7d，以病变出现的严重程度作为保护效果的判定：完全保护为不出现任何病变；部分保护为病变仅发生于攻毒接种的单只脚；不保护为两只及以上脚均出现病变。

1.2.2黏膜样品中(唾液和粪便中)sIgA的检测

于免疫前(0d)及初次免疫后第5d、7d、10d、15d、17d、20d、25d、27d、30d分别采集免疫豚鼠的粪便样品和唾液样品检测sIgA水平。方法如下：

A型***兔抗血清用PBST 1:1000稀释，96孔板每孔50μL，室温封板8h。用PBST洗96孔板清洗5次并拍板后，加入A型***病毒灭活抗原(PBST 1:6稀释)每孔100μL，37℃培养1h。用PBST洗96孔板清洗5次并拍板后，每孔加入100μL的待检样品(血清1:10稀释，唾液1:2稀释，粪便上清液不稀释)，设立阴性孔、阳性孔和空白对照孔，37℃培养1h。用PBST洗96孔板清洗5次并拍板后，加入HRP标记的兔抗豚鼠IgA二抗(1:1000PBST稀释)每孔100μL，37℃培养50min。用PBST洗96孔板清洗5次并拍板后，每孔加入50μL的OPD显色剂(H2O2每mL100μL)，37℃培养15min后加入终止液(稀硫酸)，15min内在492nm波长下读取OD值。

1.2.3血液中IgA、IgG的检测

于免疫前(0d)及初次免疫后第10d、20d、30d采集免疫豚鼠心脏血液检测IgA、IgM，方法同上。IgG检测方法如下：

96孔板每孔100μL***A型灭活抗原(用PBST以1:6稀释)，4℃孵育8h。用PBST洗板5次并拍板后，每孔加入200μL含1％脱脂奶粉的PBST溶液，37℃培养2h。PBST洗板5次并拍板后，每孔加入100μL的待检血清(1:8稀释，依次倍比稀释)。同时设立阴性、阳性和空白对照孔，37℃培养1h。PBST洗板5次并拍板后，每孔加入100μL的HRP标记的兔抗豚鼠IgG二抗(1:1000稀释)，37℃培养50min。PBST洗板5次并拍板后，每孔加入50μL的OPD显色剂，37℃15min。每孔加入50μL终止液(稀硫酸)，492nm下读取OD值。

1.2.4脾淋巴细胞增殖试验

于30d采集免疫豚鼠脾脏，无菌条件下解剖豚鼠取其脾脏，用无菌注射器将脾脏研磨碎，制成细胞悬浮液(30mL左右)，放于细胞培养皿中用CFSE法染色法检测淋巴细胞增殖试验。

将分离的淋巴细胞用不含血清的RPMI-1640培养基重悬，加入到6孔板中，37℃温箱孵育15min，吸取上清(弃掉贴壁细胞)，用1640稀释到细胞数为1.0～2.0×107个/mL(一个豚鼠脾脏分8管，每个5mL)；然后将CFSE液(2.5μL 2mM)加入到细胞悬液中；混匀后37℃条件下培养15min后，加入与细胞悬液等体积(5mL)的FBS；然后加入5mL含3％FBS的PBS，充分混匀后，2000r/min离心10min，弃去上清；重复上述步骤3次；最后用稀释液(含有10％FBS、15mM HEPES液及0.05mMβ-ME的RPMI-1640培养液)稀释细胞至浓度为2×106个/mL。向24孔细胞培养板中每孔加入1mL上述稀释好的细胞悬液，每个免疫组设立三个实验组，每组3个平行重复，实验组分别为：

抗原刺激组：每孔加入200μL的FMDV灭活抗原(用RPMI-1640培养基稀释，终浓度为10μg/mL)；

阳性对照组：每孔加入200μL的ConA溶液(RPMI-1640培养基稀释终浓度为10μg/mL)；

阴性对照组：每孔加入200μL的RPMI-1640培养基；

做好标记后于37℃CO2温箱(5％)中培养60h后收集细胞用流式细胞仪检测。

2试验结果

2.1黏膜样品中(唾液和粪便中)sIgA的检测结果

从图中可以清楚地看出口服免疫重组乳酸杆菌NC8能够诱导豚鼠产生sIgA，并且在第三次免疫后抗体水平到达最高。空白对照组抗体水平动态变化曲线基本无变化，而含有空载体的乳酸菌对照组在免疫期间有缓慢的升高但峰值较低，该变化证明用乳酸菌口服免疫动物可在动物黏膜处产生轻微的免疫反应(图6，图7)。

2.2血液中IgA、IgG的检测结果

以各实验组的血清样品OD值的平均值绘制IgA、IgG抗体水平的动态变化曲线(图8，图9)。从图中可以清楚看出抗体的变化，在一免后三种抗体都被诱导产生并在三免时含量达到最高，但IgG上升水平较IgA高。

2.3脾淋巴细胞增殖试验结果分析

用CFSE法检测豚鼠脾脏淋巴细胞的增殖结果表明：在无外源抗原刺激时都基本处于静息状态，各免疫组豚鼠淋巴细胞检测不到增殖；在收到非特异性有丝***原刀豆蛋白A(Concanavalin A，ConA)刺激时则淋巴细胞表现出迅速且明显的***状态。

从图10可以看出，重组NC8和WCFS1免疫组豚鼠的脾脏T淋巴细胞出现增殖反应都很明显，重组WCFS1免疫组略弱于重组NC8免疫组，含有空载体的两个对照组也有轻微的增殖反应，但不明显。空白对照组的T淋巴细胞未出现增殖反应，处于静止状态。

2.4攻毒保护试验结果

表2

在初免后第30天对每组4只豚鼠进行攻毒实验。从上表中可分析出两组重组乳酸菌在动物攻毒后都发挥了很好的保护作用，并且重组WCFS1组起到了全保护作用。阴性对照组有一只未发病可能的原因是该豚鼠瘦小体质较弱，临床症状表现不明显或延迟发病时间。含有空载体的对照组也表现了一定的保护力证明了乳酸菌能够调节机体免疫的益生作用。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种高效表达***病毒抗原基因的重组乳酸杆菌，其特征在于，所述重组乳酸杆菌含有在N端引入改造的乳酸杆菌信号肽基因并进行密码子优化的***病毒VP1基因的核苷酸序列，改造的乳酸杆菌信号肽基因通过连接短肽GSGGSGG与密码子优化后的***病毒VP1基因进行融合，所述核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2.根据权利要求1所述的重组乳酸杆菌，其特征在于，所述的***病毒为***A型病毒。

3.一种重组载体pSIP/opti-FMDV-A/VP1，其特征在于，包含权利要求1所述的核苷酸序列。

4.制备权利要求1或2所述的重组乳酸杆菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)利用提高N端正电荷和H区疏水性的方法，对乳酸杆菌信号肽的结构进行改造，将改造的乳酸杆菌信号肽基因通过连接短肽GSGGSGG与密码子优化后的***病毒VP1基因进行融合，融合后的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；

(2)将融合后的所述核苷酸序列SEQ ID NO：1***大肠杆菌-乳酸菌穿梭表达载体中，构建重组质粒pSIP/opti-FMDV-A/VP1；

(3)将pSIP/opti-FMDV-A/VP1重组质粒转化至乳酸杆菌。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(3)将重组质粒pSIP/opti-FMDV-A/VP1电转化导入到乳酸杆菌NC8中，电转化后的乳酸杆菌NC8涂布于MRS培养基上，在37℃培养箱中培养24h-72h，将平板上的菌落挑斑后分别于MRS液体培养基中过夜培养，将菌液以1:100的接种率接种于50mL MRS液体培养基中，37℃培养至OD值为0.6-0.8，并以浓度为50-100ng/mL乳杆菌肽SppIP为诱导物，诱导表达4-7h得到重组蛋白。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述电转化的电压参数为2500V，5ms。

7.权利要求1或2所述的重组乳酸杆菌在制备A型***口服疫苗中的应用。

8.权利要求1或2所述的重组乳酸杆菌在制备A型***黏膜免疫佐剂中的应用。