CN116024112A

CN116024112A - 一种戊糖片球菌及其菌剂、制备方法和在降解黄曲霉毒素方面的应用

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Publication number: CN116024112A
Application number: CN202111248524.9A
Authority: CN
Inventors: 余祖华; 丁轲; 贾艳艳; 余祖玲; 廖成水; 何雷; 李静; 魏颖; 汪洋; 李旺; 李元晓
Original assignee: Henan University of Science and Technology
Current assignee: Henan University of Science and Technology
Priority date: 2021-10-26
Filing date: 2021-10-26
Publication date: 2023-04-28

Abstract

本发明属于黄曲霉毒素的生物降解领域，具体涉及一种戊糖片球菌及其菌剂、制备方法和在降解黄曲霉毒素方面的应用。该戊糖片球菌的分类命名为戊糖片球菌(Pediococcuspentosaceus)GNW‑AF13，保藏编号为CCTCC M 20211023。本发明的戊糖片球菌是从河南省洛阳市种植玉米的土壤中分离得到，戊糖片球菌属于国家允许使用的益生菌菌种之一，本发明为实际应用提供了一种可直接应用于农产品、饲料原料或饲料的益生菌，且能够降解其中的AF。

Description

一种戊糖片球菌及其菌剂、制备方法和在降解黄曲霉毒素方面的应用

技术领域

本发明属于黄曲霉毒素的生物降解领域，具体涉及一种戊糖片球菌及其菌剂、制备方法和在降解黄曲霉毒素方面的应用。

背景技术

黄曲霉毒素是主要由黄曲霉(Aspergillus flavus，AF)和寄生曲霉(Aspergillusparasiticus)等合成的次级代谢物，是一组由二呋喃环和香豆素的组成的结构类似物，目前已发现20余种，常见的有黄曲霉毒素有B1、B2、G1和G2(AFb1、AFb2、AFg1和AFg2)，其中黄曲霉毒素 B1(AFb1)的毒性最强，其毒性是砒霜的68倍，***的10倍，致癌性高达二甲基亚硝胺的 75倍。低剂量可抑制动物免疫机能，使消化***紊乱，高剂量会诱发癌变甚至死亡。黄曲霉毒素的毒性可使动物器官或组织的酶改变分子代谢，造成动物机体的严重紊乱。人和动物主要是通过肝脏对黄曲霉毒素进行代谢，黄曲霉毒素的毒性经过代谢后下降，因而黄曲霉毒素的代谢主要是肝脏对其解毒的过程，而在代谢过程中，也造成了肝脏的严重损坏，所以黄曲霉毒素具有肝毒性、致癌性、致畸性和免疫抑制等特点，被国际癌症研究机构划分为(IARC) 列为一级致癌物，严重危害动物养殖、食品安全和人类的健康。

谷物类粮食往往在生长后期会污染霉菌毒素，尤其是中国的中南部，在谷物收获季节常常会遇到阴雨天气，所以霉菌污染比较普遍。另外，由于谷物的生产过程中缺少严格的控制，也容易受黄曲霉毒素污染。畜禽通过食物链摄入污染AF的饲料，可引起动物生产性能下降，降低动物免疫力，使动物更易被传染病原感染。同时，AF还可残留在动物性产品中，如肉、蛋、奶等，再通过食物链，威胁人类健康。

目前常见的对AFB1降解的方法有物理法、化学法和生物法。

物理脱毒方法主要包括吸附剂吸附法、水洗法、剔出法、脱胚去毒法、溶剂提取法、加热去毒法和紫外线去毒法等，其中最常用的是吸附剂吸附法。吸附法主要是通过吸附剂结合水溶剂中的黄曲霉毒素，从而达到去毒的目的。据报道膨润土对水溶剂中黄曲霉毒素的吸附率有94％-100％。硅土、氧化铝、铝矽酸盐可以有效降低水中黄曲霉毒素的含量。动物体内的黄曲霉毒素可以通过Ca 2+-蒙脱石进行降低。活性炭、沸石、膨润土、高岭石、海泡石和水合铝硅酸钠钙等都可有效去除黄曲霉毒素。吸附剂吸附食品和饲料中的黄曲霉毒素，是一种经济、有效的去除方法，但吸附剂吸附毒素的同时也会吸附饲料中的营养物质，也难以判断去除过程会不会产生新的毒素。

化学脱毒的方法主要采用氧化剂或强碱进行脱毒。氧化剂脱毒主要是利用氧化剂诱导使毒素的某些基团结合在二氢呋喃的第15、16位置上，从而失去毒性。该脱毒方法主要是使用亚硫酸氢钠。强碱脱毒主要是通过打开黄曲霉毒素的内酯环，使其转换成香豆素钠盐或铵盐。该脱毒方法主要是使用氢氧化钠和氨水。虽然这种方法能通过破坏毒素的内酯环而使其脱毒，但是在酸性条件下会发生可逆反应，黄曲霉毒素的毒性又会重新释放。化学法脱毒存在效果不稳定、脱毒不完全、化学物质残留会导致营养物质和微量元素的流失、难以规模化生产等缺点，无法实际应用于实际生活及生产中。

生物法主要包含生物吸附法和生物降解法。生物吸附法主要是通过微生物细胞壁吸附结合毒素，但这种吸附是一个可逆的过程，虽然能有效吸附毒素，但随着培养时间的延长，部分毒素会重新释放到培养基质中。而生物降解主要是将毒素的毒性基团分解破坏，同时产生低毒或者无毒的代谢产物的过程，是一种生物化学反应的过程，完全不同于吸附结合作用。所以选择合适的微生物降解黄曲霉毒素需要具备以下特点：(1)去除后不产生新的毒性物质； (2)不会对产品的营养和风味产生影响；(3)方便操作，价格低廉。因而，寻找能够高效安全降解AFb 1的菌株已成为现今的研究热点。

因此，生物法降解是解决农产品、饲料原料及饲料中AF污染最有效的途径，而要通过该方法解决这一问题，最核心的问题就是要获得能够降解AF的微生物，尤其是可直接在实际生产中应用的微生物菌种，通过使用该菌株发酵农产品、饲料原料及饲料，以降解污染的 AF，从而为动物提供安全的饲料，为人类提供安全的食品。众多专家已做过这方面的研究，据国家知识产权局官网公布，目前已提交的降解黄曲霉毒素的专利菌株涉及枯草芽孢杆菌、毕赤酵母菌、伯克霍尔德菌、土曲霉菌、阿耶波多氏芽孢杆菌、贝莱斯芽孢杆菌、浑浊红球菌、暹罗芽孢杆菌、短黄杆菌、微嗜酸寡养单胞菌、中华单胞菌、曲霉菌、蒙氏假单胞菌、大肠杆菌等，但未见有利用戊糖片球菌降解黄曲霉毒素的专利。

发明内容

本发明的目的是提供一种戊糖片球菌，属于国家允许使用的益生菌菌种，且能够高效降解戊糖片球菌。

本发明的第二个目的是提供以上述戊糖片球菌为活性成分的菌剂。

本发明的第三个目的是提供上述菌剂的制备方法。

本发明的第四个目的提供上述戊糖片球菌、发酵上清液、菌剂在降解黄曲霉毒素中的应用。

为了实现以上目的，本发明的戊糖片球菌的技术方案是：

一种戊糖片球菌，其分类命名为戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)GNW-AF13，保藏编号为CCTCC M 20211023。保藏单位名称为：中国典型培养物保藏中心。保藏单位地址为：湖北省武汉市武昌区八一路299号，保藏日期为：2021年8月13日。

本发明的戊糖片球菌是从河南省洛阳市种植玉米的土壤中分离得到。戊糖片球菌GNW-AF13仍可能会发生突变或变异。如，采用紫外诱变、辐射诱变，或采用亚硝基胍(NTG)诱变，或通过离子诱变所得菌株，只要还具有降解AF b1的能力特征，均属于本发明保护的权利范围。

进一步地，所述戊糖片球菌GNW-AF13菌株在MRS培养基上生长，菌落乳白色、圆形、表面光滑、不透明、中间凸起、边缘整齐；显微形态：革兰氏阳性菌，菌体呈球形、较小、单个存在。该菌株石蕊试验阳性；过氧化氢酶试验、吲哚试验、明胶液化试验、硝酸盐试验阴性；能够发酵葡萄糖、麦芽糖、L-***糖、核糖等产酸，不能利用乳糖、鼠李糖等。

根据北京天根生物科技有限公司细菌基因组DNA提取试剂盒所述步骤，提取戊糖片球菌GNW-AF13基因组DNA，并采用北京天根生物科技有限公司PCR试剂盒扩增该菌株的16S rRNA基因序列，扩增序列送上海生工生物工程有限公司进行测序，测定16S rRNA基因序列的全长约为1473bp，将所测序列提交到NCBI进行Blast比对，从GenBank数据库中对相关序列进行***发育分析，结果发现与Pediococcus pentosaceus OCPP3 MK605953 16SrRNA基因序列具有99.6％的同源性，在***进化树上处于同一个分支，亲缘关系最近，结合形态学特征和生理生化特征，鉴定为戊糖片球菌。

本发明的降解黄曲霉毒素的菌剂的技术方案是：

一种降解黄曲霉毒素的菌剂，所述菌剂的活性成分为戊糖片球菌(Pediococcuspentosaceus)GNW-AF13或其衍生的突变菌株，所述戊糖片球菌(Pediococcuspentosaceus) GNW-AF13的保藏编号为CCTCC M 20211023。

本发明的降解黄曲霉毒素的菌剂，本身属于益生菌菌种，可直接应用于农产品、饲料原料或饲料的益生菌，且能够降解其中的AF。

优选地，所述菌剂为固态菌剂或液态菌剂。进一步优选地，所述固态菌剂为粉剂、片剂或颗粒剂。

本发明的降解黄曲霉毒素的菌剂的制备方法的技术方案是：

一种降解黄曲霉毒素的菌剂的制备方法，包括以下步骤：使用MRS培养基对戊糖片球菌 GNW-AF13在pH为6.2～6.4、温度为35℃～38℃下进行厌氧培养，制得液态菌剂；液态菌剂添加保护剂后，制成固态菌剂。

可利用MRS培养基通过常规菌种活化、种子液培养、发酵培养步骤获得液态菌剂，并在液态菌剂的基础上通过本领域的通用技术制成固态菌剂。

优选地，所述保护剂为玉米芯粉或碳酸钙。保护剂的添加量为5～10％(w/v)。

上述戊糖片球菌或其发酵上清液在降解黄曲霉毒素方面的应用。

取戊糖片球菌GNW-AF13的发酵上清液、菌体细胞和胞内裂解物应用于降解AF b1，发现发酵上清液对AFb1的降解率显著高于菌体细胞和胞内提取物，证明戊糖片球菌GNW-AF13 降解AF活性组分存在于发酵上清液中。戊糖片球菌GNW-AF13对黄曲霉毒素起到降解效果的是一种分泌型的胞外酶，故可直接利用该戊糖片球菌的发酵上清液实现对黄曲霉毒素的降解。

优选地，所述黄曲霉毒素为AFb1。降解典型条件为：戊糖片球菌GNW-AF13的初始浓度为(1.0～3.0)×10⁹CFU/mL，pH值为6.2～6.4，培养温度为35℃～38℃。当AFb1初始浓度为5μg/mL时，48h后枯草芽孢杆菌对其降解率达88.86％。

上述菌剂在降解黄曲霉毒素方面的应用。

优选地，所述菌剂为液态菌剂，活菌数为(1.0～3.0)×10⁹CFU/mL。将所述液态菌剂按质量比0.5～1:100和黄曲霉毒素污染的谷物、饲料原料或者饲料混合，调节水分终含量为 (30～40)％，然后在35℃～38℃厌氧发酵实现黄曲霉毒素的降解。

优选地，所述菌剂为固态菌剂，活菌数为(1.0～3.0)×10¹⁰CFU/g。将所述固态菌剂按照 (0.1～0.2)％的添加量加入到谷物、饲料原料或者饲料中，调节水分终含量为(30～40)％，然后在35℃～38℃厌氧发酵实现黄曲霉毒素的降解。

所述谷物包括各种粕类、小麦、玉米、麸皮、水稻、高粱等；饲料原料及饲料包括豆粕、花生粕、菜籽粕及相关粕类以及玉米、小麦、水稻、高粱等饲料原料及其由它们加工而成的饲料；也包括由各种秸秆、牧草等制备的青贮饲料或黄贮饲料。

与现有技术相比本发明的有益效果为：

1、本发明使用的戊糖片球菌GNW-AF13，目前还未见报道使用该种菌株进行黄曲霉毒素降解。

2、本发明使用的戊糖片球菌GNW-AF13能够降解AFb1。当AFb1初始浓度为5μg/mL时，48h后对其降解率达88.86％；

3、通过对培养上清液、菌体细胞和胞内裂解物分别进行AFb1降解试验，确定其降解功能主要来自于培养上清液，说明降解成分为戊糖片球菌GNW-AF13分泌代谢的一种酶。

4、本发明所使用的戊糖片球菌GNW-AF13，可以直接作为益生菌饲料添加剂加入饲料中使用，不仅不会破坏饲料的营养成分，对饲料的感官品质也没有影响，反而由于在发酵过程中会将饲料中的大分子养分分解成小分子物质，同时也会产生酸类物质，能够改善饲料的口感。另外戊糖片球菌GNW-AF13是一种国家允许使用的益生菌菌种，具有安全、生产成本低、易操作等优点。最重要的是能够解决饲料原料及饲料中AF的污染问题，提高动物的生产性能和免疫功能，为人类提供安全的动物性食品，从而保障人类安全。

附图说明

图1为本发明菌株GNW-AF13的菌落形态图；

图2为本发明菌株GNW-AF13的显微形态图；

图3为本发明菌株GNW-AF13的16S rRNA片段PCR扩增图；

图4为本发明基于菌株GNW-AF13的16S rRNA序列***进化树。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件。另外，对于本领域技术人员而言，在不偏离本发明的实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

实施例1降解AFb1的戊糖片球菌GNW-AF13的分离与鉴定：

本发明是从河南省洛阳市种植玉米的土壤中分离得到一株能够高效降解黄曲霉毒素的戊糖片球菌。

(1)目的菌株的分离

分别取5g不同样品置于100mL无菌水，在涡旋振荡器上震荡10min，静置20min后取上层悬浊液100μL，涂布于以1％香豆素为唯一碳源的MRS培养基平板，37℃厌氧培养48h，选取生长良好的单菌落，连续2次划线于香豆素MRS培养基平板，待长出单菌落后进行纯化并保存菌株。

(2)菌株的复筛

取上述纯化的菌株，分别按2％接种于含0.1mg/mL AFb1的MRS培养基，以未接菌的含 0.1mg/mL AFb1的MRS培养基为对照组，每株菌做3个重复，37℃厌氧培养48h后取样，按照北京华安麦客生物技术有限公司AFb1 ELISA检测试剂盒说明书检测AFb1的残余量。按照下列公式计算AFb1的降解率：

AFb1降解率(％)＝[(对照组AFb1含量-处理组AFb1含量)/对照组AFb1含量]×100％。

比较分析结果如下表1所示，获得1株对AFb1降解效率最高的菌，该菌株编号为GNW-AF13。

表1分离菌株对AFb1降解率(平均值±标准差)

(3)菌株形态学鉴定

将菌株在MRS培养基上划线，使其长出单个菌落，观察其形态，并挑取少许菌落革兰氏染色，进行显微镜检。菌落形态图如图1所示，显微形态图如图2所示。

结果表明筛选菌株GNW-AF13菌落乳白色、圆形、表面光滑、不透明、中间凸起、边缘整齐；显微形态：革兰氏阳性菌，菌体呈球形，较小、单个存在。

(4)菌株的生理生化鉴定

菌株的生理生化特征依据《伯杰细菌鉴定手册》进行鉴定。结果如下表2所示。

表2菌株的生理生化鉴定结果

注：+，阳；-，阴

结果表明，筛选菌株GNW-AF13石蕊试验阳性；过氧化氢酶试验、吲哚试验、明胶液化试验、硝酸盐试验阴性；能够发酵葡萄糖、麦芽糖、L-***糖、核糖等产酸，不能利用乳糖、鼠李糖等。生化特性符合戊糖片球菌的特征。

(5)菌株的16S rRNA鉴定

利用细菌基因组DNA快速提取试剂盒提取分离菌株GNW-AF13的全基因组，以DNA为模板用细菌16S rRNA通用引物(上游引物27F:5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’，下游引物1429R:5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’)进行PCR反应。PCR反应体系为:Premix Taq 12.5μL，模板1μL，上游引物、下游引物各1μL，加ddH2O至25μL。PCR扩增程序： 94℃预变性5min；95℃变性40s，55℃退火30s，72℃延伸1min，34个循环；72℃再延伸7min。PCR产物用1％琼脂糖凝胶检测，然后通过凝胶成像***检测观察结果。

菌株GNW-AF13的16S rRNA片段PCR扩增图如图3所示。

(6)基于16S rRNA序列***进化树分析

将PCR产物送至上海生物工程有限公司测序。将拼接后的序列在NCBI网站(美国国立生物技术中心网站)进行BLAST比对分析，将目标序列与同源性较高的序列运用MEGA7.0软件包中的Kimura2-parameter法计算遗传距离，运用Neighbor-Joining法构建***进化树(如图4所示)。

结果表明，以菌株GNW-AF13基因组DNA为模板，经PCR扩增产物电泳，在约1500bp处有一条特异性条带，与预期大小相符。测序结果见SEQ IDNO:1，显示该菌株的16S rRNA序列长度为1473bp，将序列提交GenBank获得登录号为SUB9959985。将测序结果与NCBI 中已有的16S rRNA序列进行BLAST比对，通过MEGA7.0软件中的“Neighbor-Joining(NJ)” 模块对该序列进行***进化树分析，菌株GNW-AF13与Pediococcus pentosaceus OCPP3MK605953在进化树上处于同一个分支，亲缘关系最近，因此，可鉴定该菌株为戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)，命名为戊糖片球菌GNW-AF13(Pediococcus PentosaceusGNW-AF13)。

SEQ ID NO:1：

GATGTCGCGTGCTATACTGCAGTCGAACGAACTTCCGTTAATTGATTATGACGTACTTGT 60

ACTGATTGAGATTTTAACACGAAGTGAGTGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCT 120

GCCCAGAAGTAGGGGATAACACCTGGAAACAGATGCTAATACCGTATAACAGAGAAAACC 180

GCATGGTTTTCTTTTAAAAGATGGCTCTGCTATCACTTCTGGATGGACCCGCGGCGTATT 240

AGCTAGTTGGTGAGGTAAAGGCTCACCAAGGCAGTGATACGTAGCCGACCTGAGAGGGTA 300

ATCGGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAAT 360

CTTCCACAATGGACGCAAGTCTGATGGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGGTTTCGGC 420

TCGTAAAGCTCTGTTGTTAAAGAAGAACGTGGGTAAGAGTAACTGTTTACCCAGTGACGG 480

TATTTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGC 540

AAGCGTTATCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGAGCGCAGGCGGTCTTTTAAGTCTAATGT 600

GAAAGCCTTCGGCTCAACCGAAGAAGTGCATTGGAAACTGGGAGACTTGAGTGCAGAAGA 660

GGACAGTGGAACTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATATGGAAGAACACCAGTGG 720

CGAAGGCGGCTGTCTGGTCTGCAACTGACGCTGAGGCTCGAAAGCATGGGTAGCGAACAG 780

GATTAGATACCCTGGTAGTCCATGCCGTAAACGATGATTACTAAGTGTTGGAGGGTTTCC 840

GCCCTTCAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGTAATCCGCCTGGGGAGTACGACCGCAAGGT 900

TGAAACTCAAAAGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGA 960

AGCTACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCTTCTGACAGTCTAAGAGATTAGAGGT 1020

TCCCTTCGGGGACAGAATGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATG 1080

TTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATTACTAGTTGCCAGCATTAAGTTGGGC 1140

ACTCTAGTGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAAATCATCAT 1200

GCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGATGGTACAACGAGTCGCGAAACC 1260

GCGAGGTTAAGCTAATCTCTTAAAACCATTCTCAGTTCGGACTGTAGGCTGCAACTCGCC 1320

TACACGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCG 1380

GGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGAGAGTTTGTAACACCCAAAGCCGGTGGGGT 1440

AACCTTTTAGGAGCTAGCCGTCTAAGGTACAAA 1473

实施例2戊糖片球菌GNW-AF13对AFb1的降解作用：

(1)AFb1测定方法

采用ELISA法检测AF，按照北京华安麦客生物技术有限公司AFb1 ELISA检测试剂盒测定，根据对比标准曲线得到AFb1含量。

(2)戊糖片球菌GNW-AF13对AFb1的降解

1)将戊糖片球菌GNW-AF13 1mL接种到装有50mL灭菌MRS培养基(蛋白胨10.0g、牛肉浸取物10.0g、酵母提取液5.0g、葡萄糖20.0g、乙酸钠5.0g、柠檬酸二胺2.0g、吐温-801.0g、磷酸氢二钾0.4g、硫酸镁0.58g、硫酸锰0.25g，加蒸馏水补充到1000mL，pH为6.2～6.4)中，接种前向培养液中加入AFb1，使其终浓度为5μg/ml，同时，以含相同终浓度AFb1 的MRS培养基作为对照，分别37℃厌氧培养，并分别在0h、6h、12h、18h、24h、30h、36h、 42h、48h、54h、60h取样，测定AFb1的浓度。

2)按下式计算AFb1降解率：

AFb1降解率(％)＝(初始AFb1浓度-取样后测得的AFb1浓度)/初始AFb1浓度×100％。

3)结果分析

表3为不同发酵时间戊糖片球菌GNW-AF13对黄曲霉毒素的降解率。

表3为不同发酵时间戊糖片球菌GNW-AF13对黄曲霉毒素的降解率

结果表明，与对照组相比，随着时间的增加，原培养液中AFb1含量逐渐下降。在48h时，对AFB1的降解率达到88.86％，其后降解率基本变化不大，考虑到发酵成本，发酵到48h即可。

(3)戊糖片球菌GNW-AF13降解AFb1活性组分的确定

(a)培养上清液的准备：取100mL戊糖片球菌GNW-AF13发酵液，4℃5000r/min冷冻离心10min，取出上清液备用(置于冰中)；

(b)菌体细胞的准备：将(1)中离心所得菌体细胞，用PBS缓冲液冲洗2次，再用PBS液进行重悬，并置于冰中备用；

(c)细胞提取物的准备：取100mL戊糖片球菌GNW-AF13发酵液，4℃5000r/min冷冻离心10min，弃上清液，取菌体细胞沉淀，用PBS缓冲液冲洗2次，再用PBS液进行重悬，使用超声波细胞粉碎仪将菌体细胞破碎两次，释放胞内活性物质，4℃、5000r/min冷冻离心20min，取上清液，并用灭菌的0.22μm的纤维素膜过滤，得到菌体的胞内提取物，置于冰中备用。

(d)分别取900μL发酵上清液、细胞悬浮液、胞内提取物，与100μL AFb1标准品(终浓度为5μg/mL)混合；同时以含相同终浓度AFb1的MRS培养基作对照，反应5h后测定 AFb1浓度，计算AFb1的降解率。

(e)结果分析：发酵上清液对AFB1的降解率显著高于菌体细胞和胞内提取物，发酵上清液对AFB1的5h降解率为88.52％，而菌体细菌对AFB1的5h降解率为1.51％，胞内提取物对AFB1的降解率为28.46％，证明戊糖片球菌GNW-AF13降解AFb1的活性组分是一种细胞代谢分泌物，存在于发酵上清液中。

实施例3降解AFb1的戊糖片球菌GNW-AF13液态菌剂的制备：

(1)菌种活化：将戊糖片球菌GNW-AF13或其衍生的突变株菌液划线接种于MRS液体培养基，37℃厌氧培养24h。所述的MRS培养基配方为：蛋白胨10.0g、牛肉浸取物10.0g、酵母提取液5.0g、葡萄糖20.0g、乙酸钠5.0g、柠檬酸二胺2.0g、吐温-80 1.0g、磷酸氢二钾0.4g、硫酸镁0.58g、硫酸锰0.25g，加蒸馏水补充到1000mL，pH调至6.2～6.4，在121℃、0.1Mpa下灭菌20min。

(2)种子液培养：挑取步骤(1)菌液按2％比例接种于200mL的MRS液体培养基中，37℃厌氧培养18h，至菌液OD600＝0.8～0.9，即为一级种子液。所述的MRS液体培养基配方为：蛋白胨10.0g、牛肉浸取物10.0g、酵母提取液5.0g、葡萄糖20.0g、乙酸钠5.0g、柠檬酸二胺2.0g、吐温-80 1.0g、磷酸氢二钾0.4g、硫酸镁0.58g、硫酸锰0.25g，加蒸馏水补充到1000mL， pH调至6.2～6.4，在121℃、0.1Mpa下灭菌20min。

(3)发酵培养：采用10L的发酵罐，将上述种子液200ml接种入MRS液体培养基中，总体积10L。所述的MRS液体培养基配方为：蛋白胨10.0g、牛肉浸取物10.0g、酵母提取液5.0g、葡萄糖20.0g、乙酸钠5.0g、柠檬酸二胺2.0g、吐温-80 1.0g、磷酸氢二钾0.4g、硫酸镁0.58g、硫酸锰0.25g，加蒸馏水补充到1000mL，pH调至6.2～6.4，在121℃、0.1Mpa下灭菌20min。发酵条件：密闭罐口，厌氧培养，温度37℃，每间隔30min搅拌5min，培养时间 20～24h，最终制得液态菌剂。

实施例4降解AF的戊糖片球菌GNW-AF13固态菌剂的制备：

采用大容量低温离心机将实施例3中生产的戊糖片球菌GNW-AF13液态菌剂进行离心，弃去70％的上清液，然后向其中加入5～10％(w/v)的保护剂(玉米芯粉或碳酸钙；例如可以为5％、6％、7％、8％、9％、10％，效果相当)，搅拌均匀后进行低温干燥，所述的低温干燥条件为：干燥温度35℃～40℃，制得固态菌粉剂，水份含量约10％。若要制成片剂，则采用压片机进行压片。

实施例5戊糖片球菌GNW-AF13液态菌剂对谷物中AF的降解效果：

将实施例3中产生出来的戊糖片球菌GNW-AF13液态菌剂(活细胞数量达1.0～3.0× 10⁹CFU/mL)按照质量比1:100的配比喷施于AFb1污染的玉米粉中，同时，用发酵培养基以同样的配比喷洒到AF b1污染的玉米粉作为对照组，并使试验组和对照组样品中水份终含量为35％，混合均匀后，37℃厌氧发酵48h。

分别从试验组和对照组随机选取称取5g样品，置于100mL具塞三角瓶中，加入60％甲醇水溶液25mL，于振荡器上200r/min剧烈振荡10min，取液体于4000r/min离心5min，取上清，加入4mL去离子水，振荡5s混匀，取50μL混合液，采用北京华安麦客生物技术有限公司AFb1 ELISA检测试剂盒进行检测，结果表明戊糖片球菌GNW-AF13液态菌剂对AFb1 污染的玉米粉降解率达85.35％，对照组无降解作用。

实施例6戊糖片球菌GNW-AF13固态菌剂对谷物中AF的降解效果：

将实施例4中制备得到的ASAG212固态菌剂【活细胞数量达(1.0～3.0)×10¹⁰CFU/g)】，按照(0.1～0.2)％的添加量加入AFb1污染的玉米粉中，并使试验组和对照组样品中水份终含量为35％，混合均匀，37℃厌氧发酵48h。按照实施例5的方法对加入固态菌剂和未加固态菌剂的AFb1污染的玉米粉中AFb1含量进行测定，结果表明戊糖片球菌GNW-AF13固态菌剂对AF污染的玉米粉降解率达83.98％。

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本领域的技术人员在本发明揭示的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。

<110> 河南科技大学

<120> 一种戊糖片球菌及其菌剂、制备方法和在降解黄曲霉毒素方面的应用

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1473

<212> DNA

<213> 戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)

<400> 1

gatgtcgcgt gctatactgc agtcgaacga acttccgtta attgattatg acgtacttgt 60

actgattgag attttaacac gaagtgagtg gcgaacgggt gagtaacacg tgggtaacct 120

gcccagaagt aggggataac acctggaaac agatgctaat accgtataac agagaaaacc 180

gcatggtttt cttttaaaag atggctctgc tatcacttct ggatggaccc gcggcgtatt 240

agctagttgg tgaggtaaag gctcaccaag gcagtgatac gtagccgacc tgagagggta 300

atcggccaca ttgggactga gacacggccc agactcctac gggaggcagc agtagggaat 360

cttccacaat ggacgcaagt ctgatggagc aacgccgcgt gagtgaagaa gggtttcggc 420

tcgtaaagct ctgttgttaa agaagaacgt gggtaagagt aactgtttac ccagtgacgg 480

tatttaacca gaaagccacg gctaactacg tgccagcagc cgcggtaata cgtaggtggc 540

aagcgttatc cggatttatt gggcgtaaag cgagcgcagg cggtctttta agtctaatgt 600

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ggacagtgga actccatgtg tagcggtgaa atgcgtagat atatggaaga acaccagtgg 720

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agctacgcga agaaccttac caggtcttga catcttctga cagtctaaga gattagaggt 1020

tcccttcggg gacagaatga caggtggtgc atggttgtcg tcagctcgtg tcgtgagatg 1080

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actctagtga gactgccggt gacaaaccgg aggaaggtgg ggacgacgtc aaatcatcat 1200

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Claims

1.一种戊糖片球菌，其特征在于，其分类命名为戊糖片球菌(Pediococcuspentosaceus)GNW-AF13，保藏编号为CCTCC M 20211023。

2.一种降解黄曲霉毒素的菌剂，其特征在于，所述菌剂的活性成分为戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)GNW-AF13或其衍生的突变菌株，所述戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)GNW-AF13的保藏编号为CCTCC M 20211023。

3.如权利要求2所述的菌剂，其特征在于，所述菌剂为固态菌剂或液态菌剂。

4.如权利要求3所述的菌剂，其特征在于，所述固态菌剂为粉剂、片剂或颗粒剂。

5.一种如权利要求2所述的降解黄曲霉毒素的菌剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：使用MRS培养基对戊糖片球菌GNW-AF13在pH为6.2～6.4、温度为35℃～38℃下进行厌氧培养，制得液态菌剂；或者液态菌剂添加保护剂后，制成固态菌剂。

6.如权利要求5所述的降解黄曲霉毒素的菌剂的制备方法，其特征在于，所述保护剂为玉米芯粉或碳酸钙。

7.一种如权利要求1所述的戊糖片球菌或其发酵上清液在降解黄曲霉毒素方面的应用。

8.一种如权利要求3所述的菌剂在降解黄曲霉毒素方面的应用。

9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述菌剂为液态菌剂，活菌数为1.0～3.0×10⁹CFU/mL；将所述液态菌剂按质量比0.5～1:100和黄曲霉毒素污染的谷物、饲料原料或者饲料混合，调节水分终含量为30～40％，然后在35℃～38℃厌氧发酵实现黄曲霉毒素的降解。

10.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述菌剂为固态菌剂，活菌数为1.0～3.0×10¹⁰CFU/g；将所述固态菌剂按照0.1～0.2％的添加量加入到谷物、饲料原料或者饲料中，调节水分终含量为30～40％，然后在35℃～38℃厌氧发酵实现黄曲霉毒素的降解。