CN103333920A - 一种建立猪iPS细胞系的培养基及其培养方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种建立猪iPS细胞系的培养基及其培养方法，经过OCT4、SOX2、KLF4和c-MYC四个转录因子进行转染，并通过培养基的诱导培养，第9天时出现典型的猪iPS细胞能够高效获得猪iPS细胞；所获得的猪iPS细胞克隆为扁平的克隆，边缘整齐，和人的ES细胞形态相似。本发明构建的猪iPS细胞系，传代培养的猪iPS细胞能保持不分化的状态，经AP染色显示结果为阳性，具有多能性标记，在体外、体外分化后的细胞表达NCSTN（内胚层）、NESTIN（外胚层）及DESMIN（中胚层）。

Description

一种建立猪iPS细胞系的培养基及其培养方法

技术领域

本发明属于诱导多能性干细胞技术领域，涉及一种建立猪iPS细胞系的培养基及其培养方法。

背景技术

多能性干细胞(pluripotent stem cells)是指具有形成人和动物个体所有类型细胞的多向分化潜能，可以不断自我更新的一类细胞。由于多能性干细胞的多向分化潜能和自我更新的特性，使其在细胞替代治疗、基因治疗、发育生物学研究、药理及毒理学等领域的研究中有着其独特的作用和优越性。目前，最为人类所熟知的多潜能性干细胞是胚胎干细胞(embryonic stem cells，ES细胞)，一般是从囊胚的内细胞团在适当的体外培养条件下而建立的细胞系。然而，ES细胞的获得，特别是人ES细胞的获得引发了许多伦理上的争议。另外，将ES细胞应用到临床治疗还会面临免疫排斥的问题。

诱导多能性干细胞（induced pluripotent stem cell，iPS）是将特定的转录因子导入体细胞，使体细胞重编程为ES样的多能干细胞。2006年，Takahashi和Yamanaka(Takahashi and Yamanaka2006)首次将Oct4,Sox2,Klf4及c-myc四个转录因子导入小鼠皮肤成纤维细胞，进而获得了类似于ES细胞的iPS细胞。2007年，Takahashi和Yu等分别报道了成功获得人的iPS细胞系。这之后iPS细胞的研究得到了迅速发展，取得了一系列突破性进展，并且建立了多种疾病特异的人iPS细胞，逐步应用到医学临床方面。至今为止，小鼠、人、猕猴、大鼠、猪等物种都已建立了iPS细胞系。iPS细胞具有和ES细胞相似的特性，并且相对于ES细胞具有避免伦理争议、能够获得患者定制的iPS系等多个优点，开展iPS细胞的研究对于生命科学的许多重大问题的解决意义重大。

猪是一种研究人类疾病的模式动物，它在生理解剖、心血管***、神经***、内分泌***及骨骼结构等方面和人高度相似。而且它与人类在遗传学上特别是遗传决定的代谢上也具有高度相似性。这使得猪成为人类疾病研究的最佳模式动物。

发明内容

本发明解决的问题在于提供一种建立猪iPS细胞系的培养基及其培养方法，能够在无饲养层细胞条件下高效获得猪iPS细胞系。

本发明是通过以下技术方案来实现：

一种建立猪iPS细胞系的培养方法，包括以下操作：

1）将Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc四种转录因子分别通过逆转录病毒载体和病毒包装载体转染细胞，在转染48h后分别收集包含了转录因子的重组病毒；

2）将猪胎儿成纤维细胞于转染前用胰酶消化，然后接种到猪胎儿成纤维细胞培养基上，然后再加入包含Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc四种转录因子的重组病毒进行病毒感染，于37℃、5%CO₂条件下培养，病毒感染后72h，再次加入重组病毒进行二次病毒感染；

所述的猪胎儿成纤维细胞培养基是在DMEM培养基上，添加体积浓度为10%的胎牛血清；

3）二次病毒感染后24h，将感染后的猪胎儿成纤维细胞用胰酶消化，接种到猪胎儿成纤维细胞培养基上贴壁生长24h，于37℃、5%CO₂条件下培养，然后将猪胎儿成纤维细胞培养基更换为猪iPS细胞诱导培养基，无饲养层条件下培养；

100ml所述的猪iPS细胞诱导培养基为：85ml DMEM培养基、15ml10%FBS、1ml0.1mM NEAA、1ml2mM谷氨酰胺，1μg bFGF，1μg hLIF，30μl10mM的CHIR99021，20μl10mM的SB431542，1μg hBMP4，185μl0.1mMβ-巯基乙醇，50IU/mL青霉素和50μg/mL链霉素；

4）待培养基上出现猪iPS细胞克隆后，挑去克隆并扩大培养。

所述的Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc四种转录因子分别通过逆转录病毒载体pMXs和病毒包装载体pCL-Eco转染293T细胞，以表达分别包含Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc的重组病毒。

所述通过磷酸钙法转染接种在100mm培养皿上的293T细胞，转染后5%CO₂、37℃培养过夜后更换新鲜培养液，293T细胞转染后48h，收集病毒上清；按体积比，将四种病毒上清加入到PEF培养基中进行病毒感染。

所述在二次病毒感染后9d，在显微镜下选取形态较好的iPS克隆，用IV型胶原酶处理10～15min后，将其接种到小鼠胎儿成纤维细胞（MEF）饲养层上，此时的培养基为DMEM+10%胎牛血清，进行传代培养。

所述传代培养的iPS细胞能保持不分化的状态，经碱性磷酸酶染色显示结果为阳性。

所述的iPS细胞表达NANOG，SOX2，SSEA-1，SSEA-4，TRA-1-60及TRA-1-81标记。

所述将猪iPS细胞接种到低吸附的培养皿中用DMEM+10%KSR培养基进行体外分化诱导培养EB细胞，EB细胞贴壁后能够自发的分化。

100ml所述的猪iPS细胞诱导培养基为：85ml DMEM培养基、15ml10%FBS、1ml0.1mM NEAA、1ml2mM谷氨酰胺，1μg bFGF，1μg hLIF，30μl10mM的CHIR99021，20μl10mM的SB431542，1μg hBMP4，185μl0.1mMβ-巯基乙醇，50IU/mL青霉素和50μg/mL链霉素。

与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：

本发明提供的建立猪iPS细胞系的培养基及其培养方法，提供了一种独特的培养基和培养方法，经过OCT4、SOX2、KLF4和c-MYC四个转录因子进行转染，并通过培养基的诱导培养，第9天时出现典型的猪iPS细胞能够高效获得猪iPS细胞；所获得的猪iPS细胞克隆为扁平的克隆，边缘整齐，和人的ES细胞形态相似。

本发明构建的猪iPS细胞系，传代培养的猪iPS细胞能保持不分化的状态，经AP染色显示结果为阳性；而且具有NANOG，SOX2，SSEA-1，SSEA-4，TRA-1-60及TRA-1-81等多能性标记；在体外、体外分化后的细胞表达NCSTN（内胚层）、NESTIN（外胚层）及DESMIN（中胚层）。

附图说明

图1为逆转录病毒报告载体pMXs-GFP转染包装细胞293T后GFP荧光表达情况，A.荧光显微镜下照片；B.普通光镜下照片；

图2为逆转录病毒感染PEF后48h后的GFP荧光表达情况，A.荧光显微镜下照片；B.普通光镜下照片；

图3为感染后的PEF在第九天形成的典型的iPS克隆；

图4为传代培养的猪iPS细胞（A）及AP染色情况（B）；

图5为免疫荧光染色检测猪iPS细胞中SOX2，NANOG，SSEA1，SSEA4，TRA-1-60和TRA-1-81的表达；

图6-1为体外分化鉴定，猪iPS细胞悬浮培养形成的类胚体（左），和类胚体贴壁后的分化情况（右）；

图6-2为PCR检测三胚层标志基因的表达情况；

图7-1为猪iPS注射到裸鼠背部皮下形成的畸胎瘤；

图7-2为畸胎瘤HE染色情况。

具体实施方式

下面结合具体的实施例对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。

一种获得猪iPS细胞的方法，分别通过逆转录病毒载体pMXs向PEF中导入人OCT4、SOX2、KLF4和c-MYC后，在诱导培养基上进行培养，可以在在无饲养层的条件下高效诱导PEF形成猪iPS细胞，其诱导效率为0.54%。

所述的诱导培养基为：DMEM+15%FBS+hLIF（10ng/ml）+bFGF（10ng/ml）+CHIR99021（5μM）+SB431542（2μM）+hBMP4（10ng/ml）

所形成的猪iPS细胞其碱性磷酸酶（AP）染色为阳性、表达Nanog，Sox2，SSEA-1，4等多能性标记、能实现体外及体内三胚层分化。

具体的，一种建立猪iPS细胞系的培养方法，操作过程如下：

1）293T细胞及PEF细胞（猪胎儿成纤维细胞）的培养；

293T细胞及PEF细胞的培养基为：DMEM+10%胎牛血清（FBS，体积浓度），常规条件下培养；

2）用四种逆转录病毒质粒（pMXs-Oct4-GFP、pMXs-Sox2-GFP、pMXs-Klf4-GFP、pMXs-c-Myc-GFP，均购自Addgene）分别转染293T细胞以制备病毒液；其中转染pMXs-GFP为了指示转染效率。

2.1）293T细胞的准备

转染前24小时，将293T细胞用0.25%的胰酶消化，计数后铺5个10cm-皿，每个皿种4×10⁶个细胞。

2.2）磷酸钙法转染293T细胞

转染前将每个皿换7ml新鲜PEF培养液。每个皿转染病毒载体及包装载体pCL-Eco（购自Addgene）各12μg，具体步骤如下：

2.2.1）将去离子水和待转染的病毒载体、包装载体混合；

2.2.2）向上述混合液中加入156.25μl2M CaCl₂，混匀；

2.2.3）向上步混合液中加入1250μl2×HBS（280mM NaCl，10mM KCl，1.5mM Na₂HPO₄，50mM Heapes，12mM Glucose），反复吹打30次混匀；

2.2.4）将上步混合液在室温静置2分钟，然后逐滴均匀的滴加到准备转染的细胞中，轻轻摇晃混匀；

2.2.5）5%CO₂，37℃培养过夜（11-14小时）；

2.2.6）11-14小时后小心换液，每皿8ml新鲜培养液，5%CO₂，37℃培养。

转染293T细胞24h后，在荧光显微镜下观察绿色荧光表达情况，如图1所示80-90%的细胞表达绿色荧光，表明质粒的转染效率为80-90%。

3）PEF细胞的准备

3.1)猪胎儿成纤维细胞（PEF）的分离与培养

3.1.1)将35d孕龄的怀孕母猪送屠宰场宰杀，取回子宫；

3.1.2)在无菌条件下将胎儿从子宫内取出，用含高浓度青/链霉素（500IU/mL）的PBS充分清洗3次以上，分别去除头，内脏，四肢，选取肌肉组织，将其充分剪碎；

3.1.3)往每个胎儿组织中加入0.1%的IV型胶原酶，将其转移至15mL离心管中，37℃消化4-6h；

3.1.4)加入等体积的培养液（DMEM+15%FBS+100IU/mL青链霉素），吹打混匀；

3.1.5)将细胞/细胞团块悬液用100目孔径的滤纱过滤，1000rpm离心5min；

3.1.6)弃去上清，加入细胞培养液重悬细胞（5×10⁵个/mL）；

3.1.7)取3mL移入100mm培养皿中，并添加7mL培养液，摇匀后置于培养箱中培养过夜（37℃，5%CO₂，饱和湿度）；

3.1.8)第二天吸去培养液，用PBS清洗2次后，加入10mL新鲜培养液继续培养，以后隔天换液，直至细胞长满皿底后对其进行冻存或传代培养；

3.1.9)待细胞长至80%密度左右，即可对其进行传代培养。吸去原培养液，用PBS清洗2遍后，加入2～3mL0.25%胰酶和0.04%EDTA的细胞消化液，37℃孵育消化2～3min；

3.1.10)加入等体积的细胞培养液终止消化，然后轻轻吹打细胞，离散悬浮后转移至15mL离心管中；

3.1.11)1000rpm离心5min，弃去上清，用细胞培养液重悬细胞团块，重新接种于新的细胞培养皿中，添加培养液继续培养，直至细胞再次铺满皿底。

3.2)转染前PEF准备

293T细胞转染后36小时，将PEF用0.25%的胰酶消化，计数后按5×10⁵个细胞/10cm-皿的量接到10cm-皿中。

4）收集病毒并感染PEF

4.1）293T细胞转染后48h，用巴氏吸管收集病毒上清，并用0.45μM滤膜过滤与15ml离心管中。加入终浓度为8μg/ml polybrene，混匀。293T培养皿中再加入8ml293T培养基（DMEM+10%胎牛血清），继续培养。

293T细胞转染后48h，收集四个转录因子及GFP病毒。将逆转录病毒收集后加入PEF细胞的培养皿中感染PEF细胞。其中为了指示病毒感染效率单独用GFP病毒感染PEF细胞。

4.2）将Oct4，Sox2，Klf4及c-myc四种病毒液等体积加入PEF培养皿中（10cm皿每种病毒加5ml）；另一个皿加入5ml pMXs-GFP病毒，作为感染对照，测试病毒感染效率。感染过夜后换新鲜的PEF培养液（DMEM+10%胎牛血清）。

如图2所示，GFP病毒感染PEF后48h后，大约80-90%的PEF细胞表达绿色荧光，表明病毒的感染效率为80-90%。

4.3）转染后72h，重复4.1）及4.2）的病毒感染操作进行二次病毒感染。

5）感染后PEF重新铺板

第二次病毒感染后24h，将感染后的PEF用0.05%胰酶消化后计数，以4×10⁴个细胞接种到10cm-皿中。此时的培养基为PEF培养基（DMEM+10%胎牛血清）。

6）更换猪iPS细胞诱导培养基

感染后的PEF细胞重新铺板后贴壁生长24h，将PEF培养基更换为猪iPS细胞诱导培养基，其成分为：DMEM+15%FBS+hLIF（10ng/ml）+bFGF（10ng/ml）+CHIR99021（5μM）+SB431542（2μM）+hBMP4（10ng/ml），每天换液。

诱导培养基的配制（以100ml为例）如下：取85ml DMEM培养基，加15ml FBS（Hyclone），1ml0.1mM NEAA（Gibco），1ml2mM谷氨酰胺（Gibco），1μg bFGF（StemRD），1μg hLIF（Millipore），30μl10mM的CHIR99021（StemRD），20μl10mM的SB431542（StemRD），1μg hBMP4（StemRD），185μl0.1mMβ-巯基乙醇，50IU/mL青霉素和50μg/mL链霉素。

如图3所示，第9天时出现典型的猪iPS细胞。该克隆为扁平的克隆，边缘整齐，和人的ES细胞形态相似。

7）克隆的挑取及扩大培养

7.1）感染后第9d，在显微镜下选取形态较好的iPS克隆，用玻璃针将克隆切割后吸出，放入已经铺好MEF饲养层的4孔板中。

7.2）将4孔板中的克隆进行传代培养，扩增。

用IV型胶原酶处理细胞10-15min后，用PBS洗一遍。用黄色枪头将克隆刮成小块，然后用巴氏吸管将克隆吹下。将吹下的克隆重新接种到铺好的MEF饲养层的新皿中，得到猪iPS细胞系。

8）猪iPS细胞的鉴定

8.1）碱性磷酸酶（AP）染色

将要进行AP染色的传代培养的猪iPS细胞用4%多聚甲醛室温固定15min，用PBS洗两遍，加入AP显色液（0.002gα-萘酚盐和0.005g坚固红溶解到5mL pH8.9的0.1M Trish-HCl中），室温避光静置15min，用PBS洗两遍，加入适量PBS，照相。

如图4所示，传代培养的猪iPS细胞能保持不分化的状态，经AP染色显示结果为阳性。

8.2）免疫荧光鉴定

将要鉴定的细胞用4%多聚甲醛室温固定15min，然后用PBS洗两遍。之后，在0.1%的Triton X-100中孵育10min，孵育完后用PBS洗三遍。然后用1%BSA封闭30min，封闭过后加入用BSA稀释好的一抗，过夜。第二天，将一抗吸出，用PBS洗三遍，然后加入用BSA稀释好的二抗，室温孵育1小时。之后，用10μg/ml Hochest33342染核1min，用PBS洗两遍后在荧光显微镜下观察。

按照上述方法进行NANOG，SOX2，SSEA-1，SSEA-4，TRA-1-60及TRA-1-81等多能性标记的免疫荧光染色。如图5所示，本发明得到的猪iPS细胞表达上述多能性标记。

8.3）体外分化

将猪iPS细胞接种到低吸附的培养皿中用DMEM+10%KSR培养基（分化培养基）进行培养，形成类胚体（EB）。每两天换液，第8天将EB接种到明胶包被的培养皿中培养。5天和10天时，收集细胞提取RNA，对三个胚层的标志基因（外胚层Nestin、中胚层Desmin、内胚层NCSTN）进行PCR鉴定。

所用到的引物序列如下：

NESTIN：S:5’-TAGAGCCCGTGTTGGAAGAT

A:5’-CATCACTTCCACTGTGGTGC

DESMIN：S:5’-CCTCAACTTCCGAGAAACAAGC

A:5’-TCACTGACGACCTCCCCATC

NCSTN：S:5’-CAGCAAAGAACTGGAGTTCATCACTCT

A:5’-AGGAAAAGCTGGGGTCCTCTTCAG

如图6-1所示，本发明获得的猪iPS细胞在低吸附的培养皿中用分化培养基培养可以形成形态很好的EB，将EB贴壁后能实现自发的分化。

分化不同天数的细胞利用RT-PCR检测三胚层的标志基因，如图6-2所示，结果表明分化后的细胞表达NCSTN（内胚层）、NESTIN（外胚层）及DESMIN（中胚层）。

8.4）体内分化

将猪iPS细胞注射到裸鼠的背部皮下部位（>2×10⁶个细胞），畸胎瘤大约25天左右出现，40天左右将畸胎瘤从裸鼠背部切除，进行HE染色，观察三胚层结构。

图7-1为40d左右裸鼠背部畸胎瘤，图7-2为畸胎瘤组织切片HE染色情况。可发现，明显的三胚层组织，如：肌肉组织（中胚层）、脂肪组织（中胚层）、神经上皮（外胚层）及腺管（内胚层）。

Claims (8)

1.一种建立猪iPS细胞系的培养方法，其特征在于，包括以下操作：

1）将Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc四种转录因子分别通过逆转录病毒载体和病毒包装载体转染细胞，在转染48h后分别收集包含了转录因子的重组病毒；

2）将猪胎儿成纤维细胞于转染前用胰酶消化，然后接种到猪胎儿成纤维细胞培养基上，然后再加入包含Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc四种转录因子的重组病毒进行病毒感染，于37℃、5%CO₂条件下培养，病毒感染后72h，再次加入重组病毒进行二次病毒感染；

所述的猪胎儿成纤维细胞培养基是在DMEM培养基上，添加体积浓度为10%的胎牛血清；

3）二次病毒感染后24h，将感染后的猪胎儿成纤维细胞用胰酶消化，接种到猪胎儿成纤维细胞培养基上贴壁生长24h，于37℃、5%CO₂条件下培养，然后将猪胎儿成纤维细胞培养基更换为猪iPS细胞诱导培养基，无饲养层条件下培养；

100ml所述的猪iPS细胞诱导培养基为：85ml DMEM培养基、15ml10%FBS、1ml0.1mM NEAA、1ml2mM谷氨酰胺，1μg bFGF，1μg hLIF，30μl10mM的CHIR99021，20μl10mM的SB431542，1μg hBMP4，185μl0.1mMβ-巯基乙醇，50IU/mL青霉素和50μg/mL链霉素；

4）待培养基上出现猪iPS细胞克隆后，挑去克隆并扩大培养。

2.如权利要求1所述的建立猪iPS细胞系的培养方法，其特征在于，所述的Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc四种转录因子分别通过逆转录病毒载体pMXs和病毒包装载体pCL-Eco转染293T细胞，以表达分别包含Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc的重组病毒。

3.如权利要求2所述的建立猪iPS细胞系的培养方法，其特征在于，通过磷酸钙法转染接种在100mm培养皿上的293T细胞，转染后5%CO₂、37℃培养过夜后更换新鲜培养液，293T细胞转染后48h，收集病毒上清；按体积比，将四种病毒上清加入到PEF培养基中进行病毒感染。

4.如权利要求1所述的建立猪iPS细胞系的培养方法，其特征在于，在二次病毒感染后9d，在显微镜下选取形态较好的iPS克隆，用IV型胶原酶处理10～15min后，将其接种到小鼠胎儿成纤维细胞（MEF）饲养层上，此时的培养基为DMEM+10%胎牛血清，进行传代培养。

5.如权利要求1或4所述的建立猪iPS细胞系的培养方法，其特征在于，传代培养的iPS细胞能保持不分化的状态，经碱性磷酸酶染色显示结果为阳性。

6.如权利要求1或4所述的建立猪iPS细胞系的培养方法，其特征在于，所述的iPS细胞表达NANOG，SOX2，SSEA-1，SSEA-4，TRA-1-60及TRA-1-81标记。

7.如权利要求1或4所述的建立猪iPS细胞系的培养方法，其特征在于，将猪iPS细胞接种到低吸附的培养皿中用DMEM+10%KSR培养基进行体外分化诱导培养EB细胞，EB细胞贴壁后能够自发的分化。

8.一种建立猪iPS细胞系的培养基，其特征在于，100ml所述的猪iPS细胞诱导培养基为：85ml DMEM培养基、15ml10%FBS、1ml0.1mM NEAA、1ml2mM谷氨酰胺，1μg bFGF，1μg hLIF，30μl10mM的CHIR99021，20μl10mM的SB431542，1μg hBMP4，185μl0.1mMβ-巯基乙醇，50IU/mL青霉素和50μg/mL链霉素。

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