CN105385651B - 诱导性多能干细胞定向诱导分化为肝细胞的方法及肝细胞 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种诱导性多能干细胞定向诱导分化为肝细胞的方法及肝细胞。该方法通过在定向诱导分化的不同阶段加入不同的培养基进行诱导性多能干细胞的定向诱导分化。该方法在操作过程中可以随时观察细胞形态的变化，确保诱导的正常进行，可以快捷且高效地诱导出所需的肝脏前体细胞。该诱导性多能干细胞定向诱导分化为肝细胞的方法采用无饲养层细胞的培养体系，仅通过加入相应阶段的诱导培养基就能获得肝细胞，且经过检测，纯度较高。通过使用上述诱导性多能干细胞定向诱导分化为肝细胞的方法，诱导周期较短、效率高，且得到的肝细胞性能稳定，功能成熟，不存在基质细胞污染的问题。

Description

诱导性多能干细胞定向诱导分化为肝细胞的方法及肝细胞
技术领域
本发明涉及细胞工程领域，尤其是涉及一种诱导性多能干细胞定向诱导分化为肝细胞的方法及肝细胞。
背景技术
异体肝脏移植被认为是目前治疗终末期肝病的最有效手段，移植后长期生存率可达70％-85％。然而有限的肝脏供体远远不能满足临床需求，据报道，等待肝移植的患者在等待期病死亡率达15％。目前针对肝功能衰竭的其他治疗方法包括通过膜滤或树脂交换作用的体外人工肝、体外应用同种或异种肝细胞的生物人工肝以及体内肝细胞移植等。
上世纪70年代以细胞为基础治疗引起广泛关注，人胎肝治疗有着很好的临床的效果。向德栋等选取了40例慢性重型乙型肝炎患者，均有不同程度的乏力、纳差、腹胀等消化道症状，在20例患者中采用非生物人工肝联合肝胎细胞悬液治疗重型肝炎，有8例患者病情自然恢复，4例患者成功过度行肝移植治疗，好转存活率达60％，采用单纯非生物人工肝支持治疗好转存活率仅为45％，其疗效不如非生物人工肝联合肝胎细胞悬液治疗。郑宣鹤等采用血浆置换联合胎肝细胞悬液治疗138例患者，临床好转存活99例，有效提高了重型肝炎患者的好转治愈率，疗效优于单用胎肝细胞悬液或血浆置换组，而单用血浆置换组与单用肝胎细胞悬液组差异无显著性，该结果与大岛宣雄等单用血浆置换治疗117例患者，存活率仅24％等报道结果相符。但是因胎肝来源等存在伦理问题，人胎肝治疗已被禁止。有研究表明通过对慢性肝衰竭患者进行MSC(Mesenchymal Stem Cell，间充质干细胞)移植，可以改善肝功能和临床症状，且未出现严重不良反应。并且MSC不表达MHC-Ⅱ类分子，低表达甚至不表达MHC-Ⅰ类分子，几乎不存在免疫排斥问题。但是自体骨髓MSC也具有一定的局限性：如患者凝血功能差影响骨髓采集、患者自体细胞数量不足及增殖活性低下，因而限制了临床应用。
随着2007年11月，美国和日本的两个研究小组几乎同时宣布成功将人体皮肤细胞改造成几乎可以和胚胎干细胞相媲美的诱导性多能干细胞---“iPS细胞”，回避了历来已久的伦理争议，解决了干细胞移植免疫排斥问题，在生命科学基础研究和医学领域的优势已日趋明显。
发明内容
基于此，有必要提供一种诱导性多能干细胞定向诱导分化为肝细胞的方法及肝细胞。
一种诱导性多能干细胞定向诱导分化为肝细胞的方法，包括如下步骤：
步骤S1，提供或制备诱导性多能干细胞；
步骤S2，将所述诱导性多能干细胞初始培养在添加有人活化素A和Wnt3a的RPMI-1640培养基中，并在培养过程中更换添加有人活化素A及胎牛血清的RPMI-1640培养基，使所述诱导性多能干细胞向限定性内胚层诱导分化；
步骤S3，将步骤S2培养得到的细胞初始培养在添加有角质细胞生长因子和胎牛血清的KO/DMEM培养基中，并在培养过程更换添加有血清替代物、L-谷氨酰胺、非必需氨基酸、β-巯基乙醇及二甲基亚砜的KO/DMEM培养基，使培养的细胞向肝系细胞定向诱导分化；
步骤S4，将步骤S3培养得到的细胞培养在添加有胎牛血清、肝细胞生长因子、抑瘤素、***及L-谷氨酰胺的L-15培养基中，促进肝细胞成熟。
在其中一个实施例中，在所述步骤S1中，采用病毒感染、质粒转染、mRNA导入、miRNA导入或化学分子添加方式将诱导因子导入人类细胞中，诱导所述人类细胞分化为诱导性多能干细胞；所述诱导因子包括OCT4、SOX2、NANOG及Lin28。
在其中一个实施例中，在所述步骤S2中，使用所述添加有人活化素A和Wnt3a的RPMI-1640培养基培养22-50小时后，更换使用所述添加有人活化素A及胎牛血清的RPMI-1640培养基培养46-98小时，并且在后续培养过程中每22-26小时更换一次培养基。
在其中一个实施例中，所述添加有人活化素A和Wnt3a的RPMI-1640培养基中所述人活化素A的浓度为5-300ng/ml，所述Wnt3a的浓度为20-100ng/ml。
在其中一个实施例中，所述添加有人活化素A及胎牛血清的RPMI-1640培养基中所述人活化素A的浓度为10-200ng/ml，所述胎牛血清的体积浓度为0.2-2％。
在其中一个实施例中，在所述步骤S3中，使用所述添加有角质细胞生长因子和胎牛血清的KO/DMEM培养基培养22-98小时后，再使用添加有血清替代物、L-谷氨酰胺、非必需氨基酸、β-巯基乙醇及二甲基亚砜的KO/DMEM培养基培养118-170小时，并且在培养过程中，每隔22-26小时更换一次相应的培养基。
在其中一个实施例中，所述添加有角质细胞生长因子和胎牛血清的KO/DMEM培养基中所述角质细胞生长因子的浓度为15-100ng/ml，所述胎牛血清的体积浓度为2-3％。
在其中一个实施例中，所述添加有血清替代物、L-谷氨酰胺、非必需氨基酸、β-巯基乙醇及二甲基亚砜的KO/DMEM培养基中所述血清替代物的体积浓度为20％，所述L-谷氨酰胺的浓度为1-3mM，所述非必需氨基酸的质量浓度为0.1-15％，所述β-巯基乙醇的浓度为0.1-0.12mM，所述二甲基亚砜的体积浓度为0.2-2％。
在其中一个实施例中，在所述步骤S4中，培养周期为142-242小时，且每个22-26小时更换一次培养基。
在其中一个实施例中，所述添加有胎牛血清、肝细胞生长因子、抑瘤素、***及L-谷氨酰胺的L-15培养基中所述胎牛血清的体积浓度为10％，所述肝细胞生长因子的浓度为10-300ng/ml，所述抑瘤素的浓度为1-150ng/ml，所述***的浓度为0.05-1.2μM，所述L-谷氨酰胺的浓度为2-3mM。
本发明还提供了一种采用上述任一实施例所述的诱导性多能干细胞定向诱导分化为肝细胞的方法构建得到的肝细胞。
本发明通过合理的使用细胞生长因子提供一种优化的诱导性多能干细胞在体外条件下定向诱导分化为肝脏前体细胞的方法，该方法在操作过程中可以随时观察细胞形态的变化，确保诱导的正常进行，可以较为快捷且高效地诱导出所需的肝脏前体细胞。该诱导性多能干细胞定向诱导分化为肝细胞的方法采用无feeder(饲养层细胞)的培养体系，仅通过加入相应阶段的诱导培养基就能获得肝细胞，且经过检测，纯度较高。通过使用上述诱导性多能干细胞定向诱导分化为肝细胞的方法，诱导周期较短、效率高，且得到的肝细胞性能稳定，不存在基质细胞污染的问题。
附图说明
图1为本发明实施例中hiPS诱导形成过程中细胞形态变化示意图，其中，A：人胚胎成纤维细胞，B：病毒感染后第四天细胞形态，C：感染2周左右形成的非ES样克隆，D-F：人feeder上传代培养的典型的iPS克隆，F：iPSCs周边自发分化的克隆，A-D和F标尺为200μm，E标尺为50μm；
图2为本发明实施例1hiPSCs中的全能型相关基因表达检测示意图；
图3为本发明实施例hiPSCs与hESCs来源的EB不同分化时间点内、中、外三胚层代表基因表达示意图，其中，SOX17：内胚层，RUNX1：中胚层，PAX6：外胚层；
图4为本发明实施例hiPSCs中端粒酶水平检测示意图；
图5为本发明实施例hiPSCs的免疫组化分析示意图，其中，A：AKP染色，B：SSEA-3，C：SSEA-4，D：TRA-1-60，E：TRA-1-81，F：OCT4，A标尺为200μm，B-F标尺为100μm；
图6为本发明实施例hiPSCs体外三胚层分化检测示意图，其中，A：B-tubulin/DAPI，B：SMA/DAPI，C：AFP/DAPI，畸胎瘤组织切片显示三胚层来源的细胞D：软骨(中胚层)；E：腺上皮细胞(内胚层)；F：色素细胞(外胚层)；
图7为本发明实施例各阶段IPS细胞的形态变化情况；
图8为本发明实施例AFP、ALB免疫荧光染色图；
图9为本发明实施例RT-QPCR的检测结果
图10为本发明实施例ICG胞吞与胞吐实验；
图11为本发明实施例iPS来源的肝脏细胞具有合成糖原的能力；
图12为本发明实施例iPS来源的肝脏前体细胞具有摄取低密度脂蛋白能力。
具体实施方式
以下主要结合附图及具体实施例对本发明的诱导性多能干细胞定向诱导分化为肝细胞的方法作进一步详细的说明。
一实施方式的诱导性多能干细胞定向诱导分化为肝细胞的方法，包括如下步骤：
步骤S110，提供或制备诱导性多能干细胞。
在本实施方式中，诱导性多能干细胞优选采用病毒感染、质粒转染、mRNA导入、miRNA导入或化学分子添加方式将诱导因子导入人类细胞中，如导入至成纤维细胞等，诱导人类细胞分化为诱导性多能干细胞。其中，诱导因子包括OCT4、SOX2、NANOG及Lin28。成纤维细胞可以为离体的成人、婴儿或胎儿的皮肤成纤维细胞等。可理解，在其他实施方式中，诱导性多能干细胞不限于由人类皮肤成纤维细胞分化得到，也可以采用其他的人类细胞构建得到。
步骤S120，将诱导性多能干细胞初始培养在添加有人活化素A和Wnt3a的RPMI-1640培养基中，并在培养过程中更换添加有人活化素A及胎牛血清的RPMI-1640培养基，使诱导性多能干细胞向限定性内胚层诱导分化。
在步骤S120中，使用添加有人活化素A和Wnt3a的RPMI-1640培养基(即在RPMI-1640基础培养基的基础上添加人活化素A和Wnt3a，以下同理)培养22-50小时后，更换使用添加有人活化素A及胎牛血清的RPMI-1640培养基培养22-50小时，并且在后续培养过程中每22-50小时更换一次培养基。在本实施方式中，添加有人活化素A和Wnt3a的RPMI-1640培养基中人活化素A的浓度为5-300ng/ml，优选100ng/ml，Wnt3a的浓度为20-100ng/ml，优选25ng/ml。添加有人活化素A及胎牛血清的RPMI-1640培养基中人活化素A的浓度为10-200ng/ml，胎牛血清的体积浓度为0.2-2％。
进一步，在本实施方式中，在诱导性多能干细胞培养之前还包括对诱导性多能干细胞进行复苏和增殖扩大培养的步骤。其中，复苏的步骤包括：将诱导性多能干细胞从液氮罐中取出，立即于37℃恒温水浴箱中恒温解冻，离心弃上清取出二甲基亚砜，加入ES培养基重悬细胞沉淀，将其种植到准备好的小鼠胚胎成纤维饲养层细胞上，每天换液一次，每周传代一次。增殖扩大培养的步骤包括：在检测确定无支原体、细菌污染后，选取长势良好的诱导性多能干细胞克隆，手工切割传代至预先包被好Matrigel胶的培养皿中培养，在mTESR培养体系中培养细胞约2-4天后，换用鼠成纤维细胞条件培养基培养一天后更换诱导培养基(即添加有人活化素A和Wnt3a的RPMI-1640培养基)。
步骤S130，将步骤S2培养得到的细胞初始培养在添加有角质细胞生长因子和胎牛血清的KO/DMEM培养基中，并在培养过程更换添加有血清替代物、L-谷氨酰胺、非必需氨基酸、β-巯基乙醇及二甲基亚砜的KO/DMEM培养基，使培养的细胞向肝系细胞定向诱导分化；
在步骤S130中，使用添加有角质细胞生长因子和胎牛血清的KO/DMEM培养基培养22-98小时后，再使用添加有血清替代物、L-谷氨酰胺、非必需氨基酸、β-巯基乙醇及二甲基亚砜的KO/DMEM培养基培养118-170小时，并且在培养过程中，每隔22-26小时更换一次相应的培养基。进一步，在本实施方式中，添加有角质细胞生长因子和胎牛血清的KO/DMEM培养基中角质细胞生长因子的浓度为15-100ng/ml，胎牛血清的体积浓度为2-3％。添加有血清替代物、L-谷氨酰胺、非必需氨基酸、β-巯基乙醇及二甲基亚砜的KO/DMEM培养基中血清替代物的体积浓度为20％，L-谷氨酰胺的浓度为1-3mM，非必需氨基酸的质量浓度为0.1-15％，β-巯基乙醇的浓度为0.1-0.12mM，二甲基亚砜的体积浓度为0.2-2％。
步骤S140，将步骤S3培养得到的细胞培养在添加有胎牛血清、肝细胞生长因子、抑瘤素、***及L-谷氨酰胺的L-15培养基中，促进肝细胞成熟。
在步骤S140中，培养周期为142-242小时，且每个22-26小时更换一次培养基。进一步，在本实施方式中，添加有胎牛血清、肝细胞生长因子、抑瘤素、***及L-谷氨酰胺的L-15培养基中胎牛血清的体积浓度为10％，肝细胞生长因子的浓度为10-300ng/ml，抑瘤素的浓度为1-150ng/ml，***的浓度为0.05-1.2μM，L-谷氨酰胺的浓度为2-3mM。
本实施方式通过合理的使用细胞生长因子提供一种优化的诱导性多能干细胞在体外条件下定向诱导分化为肝脏前体细胞的方法，该方法在操作过程中可以随时观察细胞形态的变化，确保诱导的正常进行，可以随时剔除异常克隆，从而可以较为快捷且高效地诱导出所需的肝脏前体细胞。该诱导性多能干细胞定向诱导分化为肝细胞的方法采用无feeder(饲养层细胞)的培养体系，仅通过加入相应阶段的诱导培养基就能获得肝细胞，且经过检测，纯度较高。通过使用上述诱导性多能干细胞定向诱导分化为肝细胞的方法，诱导周期较短、效率高，且得到的肝细胞性能稳定，不存在基质细胞污染的问题。
以下为具体实施例部分：
一、所用到的试剂及其设备
1.iPSC(诱导性多能干细胞)：选择人类干细胞国家工程研究中心建系的2系人类诱导多能干细胞。
2.细胞培养试剂：
人活化素A(R&D，338-AC-050，即R&DSystems公司，货号338-AC-050，以下同理)，Wnt3a(R&D，1324-WN-010)，胎牛血清(Life，10099141)，角质细胞生长因子(KGF)(R&D，251-KG-050)，血清替代物(Life，N10828-028)，L-谷氨酰胺(Gibco，25030-081)，非必需氨基酸(Gibco，1140-050)，β-巯基乙醇(Gibco，21985023)，二甲基亚砜(DMSO)(Sigma，D2650)，肝细胞生长因子(HGF)(R&D，294-HG-025)，抑瘤素(OSM)(R&D，295-OM-050)，***(Calbiochem，265005)，mTESR(Stem cell，05850)，RPMI-1640(Life，11875-085)，KO/DMEM(Life，10829-018)，L-15(Life，21083-027)，Matrigel胶(BD，354234)。
二、具体的诱导及其鉴定过程
(一)人iPSC细胞系的建系
实验对象：分离得到的8-10周流产胎儿的皮肤成纤维细胞，该实验样品来自于湘雅医院，本实施例的研究通过了中信湘雅生殖与遗传专科医院伦理委员会的讨论通过，并且取得了流产胎儿亲人的同意。可理解，在其他实施例中，该皮肤成纤维细胞或者其他人类细胞样本也可以取自一些样本冻存库或者治疗机构等。
采用慢病毒感染的方法将OCT4、SOX2、NANOG及Lin28四种诱导因子导入成纤维细胞获得诱导性多能性细胞(iPSCs)。具体过程如下：
将pOCT4、pSOX2、pNANOG、pLin28四个慢病毒质粒(质粒由湖南光琇高新生命科技有限公司克隆制备)分别与慢病毒包装质粒pCMV8.91、pCMV-VSVG混合，加入培养中的293T细胞中，48小时后收取细胞上清，上清中即含有可用于感染的慢病毒颗粒。
如图1所示，将上述4种慢病毒颗粒按照1：1：1：1比例混合后加入培养中的皮肤成纤维细胞中(图1A)，大约两周后有小克隆出现，部分克隆形态与hES克隆不同(图1C)，部分克隆呈现典型的hES样，传代扩增可维持hES克隆样的形态(图1D-F)。从1×105的hEF中大约有大于30个典型hES样克隆生长。经重复实验检测iPS的形成效率约为10-5--4。在人feeder上培养的hES样的克隆，细胞紧密，核质比大，与hES相似(图1D-F)。培养过程中同时可观察到iPS克隆周边出现自发分化(图1F)。这些克隆与hES相似，即为hiPS。从本株成纤维细胞共分离了16个iPS克隆，对其中hiPS-#2及hiPS-#5进行了细致的检测。检测到与人类胚胎干细胞特性相同的克隆即为hiPSC，可用于下一步实验。具体检测如下：
1.1多能性相关基因以及拟胚体(EB)分化基因的检测
收集未分化hESCs、iPSCs和EB分化不同时间点的细胞，抽提RNA进行全能性相关基因或分化基因的检测。方法如下：
1)RNA抽提：
收集相应的细胞，加1ml的TRIZOL，裂解细胞。每1ml TRIZOL加0.2ml氯仿，在室温下孵育2-3分钟。在4℃下12，000×g的离心力高速冷冻离心15分钟。离心后混合物分成三层，RNA存在于水样层当中。将水样层转移到一干净的试管中。加入0.5ml异丙醇充分混合。将混合的样品在室温下孵育10分钟并在4℃下以不超过12，000g的离心力高速冷冻离心10分钟。移去上层悬液。用75v/v％(即乙醇的体积分数为75％，以下同理)的乙醇洗涤RNA沉淀一次，在2-8℃下以不超过7，500g的离心力高速冷冻离心5分钟。简单干燥RNA沉淀(空气干燥5—10分钟)。用无RNA酶的DEPC水溶解，完全溶解后紫外分光光度计检测RNA浓度。
2)逆转录(RT)合成cDNA：
采用A RevertAidTM first strand cDNA synthesis kit(Fermentas LifeSciences)，参照说明书进行，具体步骤如下：取1μg总RNA，oligo(d T)primer 1μl，加入RNase-free水使终反应体积12μl于EP管中，70℃变性5min，冰上迅速冷却。然后依次加入5X逆转录反应缓冲液4μl，10mM dNTP 2μl，RNA酶抑制剂1μl，轻轻混匀，快速离心，25℃处理5min，加AMV逆转录酶1μl，终反应体积20μl，25℃10min；42℃60min，70℃10min，4℃冷却。所得cDNA放置-20℃保存或继续行PCR扩增目的基因。
以RNA为模板，常用的β-actin引物进行PCR扩增，确定无gDNA的污染。
再以cDNA为模板进行RT-PCR，以检测其中多能性相关基因OCT3/4、NANOG、REX-1、SOX2、THY1、TDGF1、TERF1、LEFTB、DPPA2和FGF4的表达或三胚层分化代表基因(外胚层：Pax6，中胚层：Runx1，内胚层：Sox17)，β-actin为反应体系阳性对照。PCR反应条件：95℃1分30秒；30个循环(94℃40秒，54℃-64℃40秒，72℃40秒)；72℃延伸7分钟。
如图2A所示，RT-PCR显示hiPS细胞表达很多未分化的ES细胞标记基因，如OCT3/4，SOX2，NANOG，reduced expression 1(REX1)，fibroblast growth factor 4(FGF4)，developmental pluripotency-associated 2(DPPA2)，and telomerase reversetranscriptase(hTERT)等，与hES表达水平相似。
如图2B所示，采用针对内外源OCT4、NANOG表达的引物检测显示hiPS细胞中存在内源性的OCT4、NANOG的表达，可见hiPS中总的OCT4，NANOG的表达水平与内源表达水平相当。
如图3所示，hiPSC体外自发分化实验显示，与hESC一样，hiPSC体外自发分化而成的EB有内、中、外三个胚层的代表性基因表达，说明hiPSC与hESC一样具有多能性。
1.2端粒酶分析
收集未分化iPSCs，使用TRAPeze Telomerase detection kit(Chemicon)试剂盒，按照说明进行端粒酶检测。多能性细胞中hERT是高表达的，如图4所示，本实施例检测也发现人hiPS也高表达端粒酶活性。
1.3AKP染色及免疫荧光染色
1)AKP染色：
采用Fast Red Substrate Pack(Zymed Laboratories)试剂盒和AKP试剂盒(invitrogen)按照相应的说明书进行AKP染色。
(1)将培养的hESCs尽量去除残余培养基；
(2)加入PBS洗涤两次，去除PBS；
(3)加入4℃预冷的4％多聚甲醛固定hESCs克隆，置室温固定15-20min；
(4)取出固定细胞，采用双蒸水洗涤2次；
(5)按照试剂盒说明，新鲜配置的染液染色，加入染液染色；
(6)室温下一般染色10分钟；
(7)当染色满意时，用蒸馏水洗涤3次；
(8)显微镜下观察并摄像。
2)免疫荧光染色
多聚甲醛固定未分化的iPS克隆，作多能性干细胞抗原染色，包括：OCT4、SSEA-3、SSEA-4和TRA-1-60、TRA-1-81；多聚甲醛固定EB贴壁后的细胞进行三胚层特异性标记染色，包括：AFP(内胚层)、β-tubulin(外胚层)、SMA(中胚层)。具体方法如下：
免疫荧光染色步骤：
(1)加4wt％(即质量浓度，以下同理)的多聚甲醛溶液室温下固定检测细胞15分钟，加PBS清洗3遍；
(2)胞内和核内染色用0.1％的triton-X-100透膜10min(胞膜抗原染色省略此步)；
(3)加封闭液即10％驴或山羊血清(与二抗来源一致)处理45分钟，加PBS清洗3遍；
(4)按比例加入相应一抗，4℃孵育过夜，加PBS清洗3遍；
(5)加荧光二抗室温避光孵育1小时，用PBS清洗3遍；
(6)加DAPI染核，室温避光孵育5分钟，用PBS清洗2遍；
(7)荧光显微镜下观察结果。
1.4hiPSCs体内体外分化能力
为检测hiPS的体外分化能力，本实施例采用悬浮培养法形成EB。体式镜下将iPS克隆切割至合适大小(比传代克隆团块稍大)，用TIP头轻轻将克隆团块铲下，将克隆块摇至培养皿中央，转移至加有4ml EB培养基的60mm的细菌培养皿(petridish)中，37℃，5％CO2培养箱中培养。隔天换液。换液时用1ml的tip头对EB轻轻吹吸，去除EB表面的死细胞，将EB团块摇至皿中央，转移至加有新鲜EB培养基的细菌培养皿(Petri dish)中。悬浮培养10天后，将EBs转移至FBS包被的24孔板中。如图5所示，用相同的培养基继续贴壁培养1周后进行免疫细胞荧光染色，免疫细胞化学检测发现β-tubulin(外胚层)，SMA(中胚层)，AFP(内胚层)呈阳性。为检测hiPS的体内分化能力，收集未分化iPSCs克隆，约1-2×106细胞，注射入6-8周龄雄性SCID小鼠的后肢肌肉中，观察畸胎瘤的形成情况。如图6所示，8-12周后取出肿瘤，常规石腊包埋切片后，HE染色后可见内中外三胚层组织结构形成。
(二)、iPS细胞来源的肝脏细胞定向分化培养
1、iPS细胞的复苏：从液氮罐从取出细胞，立即于37℃恒温水浴箱中恒温解冻，离心弃上清去除二甲基亚砜，加入ES培养基重悬细胞沉淀，将其种植到准备好的小鼠胚胎成纤维饲养层细胞(feeder)上，每天换液一次，每周传代一次。
2、iPS细胞的培养：检测确定无支原体、细菌污染后，选取长势良好的iPS细胞克隆，手工切割传代至新的饲养层细胞上，传代后的细胞，每24h小时换液一次，每天观察细胞的生长状况。
3、iPS细胞的诱导分化：待iPS细胞在Feeder上处于生长状态最佳时，将细胞手工切割传代至预先包被好Matrigel胶的培养皿中培养。在mTESR培养体系培养细胞2-4天，换用鼠成纤维细胞条件培养基培养一天之后更换诱导培养基。具体诱导过程如下：
第一个阶段(3-6天)为iPS细胞向限定性内胚层诱导：第1-2天的诱导培养基为向基础培养基RPMI-1640中添加人人活化素A和Wnt3a，其中人人活化素A和Wnt3a的使用浓度分别为5-300ng/ml和20-100ng/ml，优选浓度分别为100ng/ml和25ng/ml；第3-4天的培养基为向基础培养基RPMI-1640中添加人人活化素A和胎牛血清，其中人活化素A的终浓度为10-200ng/ml，胎牛血清的终浓度为0.2-2％；第5-6天培养基为向基础培养基RPMI-1640中添加人人活化素A和胎牛血清，其中人人活化素A的终浓度10-200ng/ml，胎牛血清的终浓度为0.2-2％；诱导前几天的死细胞较多，为了避免死细胞影响诱导过程的进行，在进行更换培养基时尽量吸净培养基并且用RPIM-1640清洗一至两遍，再更换培养基。
第二阶段(6-12天)为向肝系定向分化：第二阶段前1-4天所用的培养基为向基础培养基KO/DMEM中添加15-100ng/ml角质细胞生长因子和终浓度为2-3％的胎牛血清。在第二阶段的培养过程中，细胞数量较之前几天有较大的改变，此时应根据细胞的数量酌情添加培养基，以保证细胞的正常生长；此后5-12天的培养基为向基础培养基KO/DMEM添加血清替代物(SR)、L-谷氨酰胺、非必需氨基酸、β-巯基乙醇及二甲基亚砜，每24小时更换一次培养基，其中血清替代物的终浓度为20％，L-谷氨酰胺的终浓度为1-3mM，非必需氨基酸的终浓度为0.1％-15％，β-巯基乙醇的终浓度为0.1-0.12mM，二甲基亚砜的终浓度为0.2-2％。
第三个阶段(6-10天)为促进肝细胞成熟阶段：培养基为向基础培养基L-15中添加牛血清、肝细胞生长因子、抑瘤素、***、L-谷氨酰胺，每24小时更换一次培养基，其中胎牛血清的终浓度为10％，肝细胞生长因子的终浓度为10-300ng/ml，抑瘤素的终浓度为5-150ng/ml，***的终浓度为0.05-1.2μM，L-谷氨酰胺的终浓度为2-3mM。
整个诱导过程历时15-28天。
(三)肝细胞的鉴定
1、细胞诱导过程分化情况的观察：从诱导的第一天开始，每天在显微镜下观察细胞的生长状态、贴壁情况、分化状况，iPS细胞核质比高，细胞排列紧密，呈不规则球形集落生长。诱导开始后细胞开始发生形态学改变，诱导3天的细胞进入内胚层阶段，细胞变得扁平呈卵圆形；进入第二阶段诱导后细胞开始进入肝细胞特化阶段，细胞逐渐变成边界明显的多角形；第三阶段细胞开始进入肝脏细胞成熟阶段，细胞集落更加致密，细胞体积增大，呈立方体，胞浆丰富，具有一个或多个细胞核，核仁明显。如图7所示，培养得到的细胞与肝实质细胞更为趋近。
2.免疫荧光检测AFP、ALB的表达：将细胞在室温下用4wt％(即质量浓度，以下同理)多聚甲醛固定15分钟，然后0.2v/v％的Triton X100渗透15分钟，用4v/v％正常山羊血清封闭1小时，一抗稀释于封闭液，在4℃下孵育一抗过夜。室温孵育二抗一小时。加入DAPI复染5分钟。于荧光显微镜下观察阳性细胞，结果如附图8所示。
3.RT-QPCR：收集每个诱导阶段最后一天的细胞进行检测，TRIzol溶解抽提RNA。根据操作说明应用逆转录试剂盒进行逆转录，每个样品含有1μg的RNA。PCR反应体系包括0.2μl的cDNA，10μl的PCR Green Mix，7.8μl水，1μM的正反向引物各1μl，验证引物对的序列分别见SEQ ID NO.1-2、SEQ ID NO.3-4、SEQ ID NO.5-6、SEQ ID NO.7-8、SEQ ID NO.9-10、SEQID NO.11-12、SEQ ID NO.13-14、SEQ ID NO.15-16、SEQ ID NO.17-18、SEQ ID NO.19-20、SEQ ID NO.21-22、SEQ ID NO.23-24及SEQ ID NO.25-26。循环进行如下：95℃5分钟，然后45个循环的95℃10秒，58℃10秒，72℃10秒，结果如附图9所示。
4.iPS细胞来源的肝脏前体细胞吸收和释放ICG检测：将ICG溶解在二甲基亚砜中，浓度为5mg/ml，然后用分化培养基稀释至终浓度为1mg/ml。在细胞诱导的第20天，将细胞在含有ICG的培养基中常规培养90分钟，用磷酸盐缓冲液冲洗后，通过显微镜观察记录细胞的ICG的吸收情况，然后换成普通培养基培养6个小时以上，检测ICG的释放情况，结果如附图10所示。
5.高碘酸-雪夫氏反应检测糖原的合成：将诱导20天的肝脏前体细胞用4wt％多聚甲醛和1v/v％的Triton X100处理，然后按照高碘酸-雪夫氏染色***(Sigma-Aldrich公司，匹兹堡，USA)的说明书进行染色，结果如附图11所示。
6.低密度脂蛋白摄取实验：将细胞在含10μg/ml Alexa-Flour 488-labeled LDL的无血清培养基中培养3至4个小时。然后用DAPI复染，荧光显微镜下观察荧光，结果如附图12所示。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (2)

1.一种诱导性多能干细胞定向诱导分化为肝细胞的方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤S1，提供或制备诱导性多能干细胞；
步骤S2，第一阶段培养，共3～6天，在第一阶段的第1-2天，将所述诱导性多能干细胞初始培养在添加有人活化素A和Wnt3a的RPMI-1640培养基中，并在第一阶段接来下的培养过程中更换添加有人活化素A及胎牛血清的RPMI-1640培养基，使所述诱导性多能干细胞向限定性内胚层诱导分化；所述添加有人活化素A和Wnt3a的RPMI-1640培养基中所述人活化素A的浓度为100ng/ml，所述Wnt3a的浓度为25ng/ml；所述添加有人活化素A及胎牛血清的RPMI-1640培养基中所述人活化素A的浓度为10-200ng/ml，所述胎牛血清的体积浓度为0.2-2％；第一阶段诱导前几天的死细胞较多，为了避免死细胞影响诱导过程的进行，在进行更换培养基时尽量吸净培养基并且用RPIM-1640清洗一至两遍，再更换培养基；
步骤S3，第二阶段培养，共6-12天，在第二阶段的前1-4天，将步骤S2培养得到的细胞初始培养在添加有角质细胞生长因子和胎牛血清的KO/DMEM培养基中，并在第二阶段此后的培养过程中更换为添加有血清替代物、L-谷氨酰胺、非必需氨基酸、β-巯基乙醇及二甲基亚砜的KO/DMEM培养基，使培养的细胞向肝系细胞定向诱导分化；所述添加有角质细胞生长因子和胎牛血清的KO/DMEM培养基中所述角质细胞生长因子的浓度为15-100ng/ml，所述胎牛血清的体积浓度为2-3％；所述添加有血清替代物、L-谷氨酰胺、非必需氨基酸、β-巯基乙醇及二甲基亚砜的KO/DMEM培养基中所述血清替代物的体积浓度为20％，所述L-谷氨酰胺的浓度为1-3mM，所述非必需氨基酸的质量浓度为0.1-15％，所述β-巯基乙醇的浓度为0.1-0.12mM，所述二甲基亚砜的体积浓度为0.2-2％；在第二阶段的培养过程中，细胞数量较之前几天有较大的改变，此时应根据细胞的数量酌情添加培养基，以保证细胞的正常生长；
步骤S4，在第三阶段，将步骤S3培养得到的细胞培养在添加有胎牛血清、肝细胞生长因子、抑瘤素、***及L-谷氨酰胺的L-15培养基中培养6-10天，促进肝细胞成熟，每24小时更换一次培养基；所述添加有胎牛血清、肝细胞生长因子、抑瘤素、***及L-谷氨酰胺的L-15培养基中所述胎牛血清的体积浓度为10％，所述肝细胞生长因子的浓度为10-300ng/ml，所述抑瘤素的浓度为5-150ng/ml，所述***的浓度为0.05-1.2μM，所述L-谷氨酰胺的浓度为2-3mM；
整个诱导过程历时15-28天。
2.如权利要求1所述的诱导性多能干细胞定向诱导分化为肝细胞的方法，其特征在于，在所述步骤S1中，采用病毒感染、质粒转染、mRNA导入、miRNA导入或化学分子添加方式将诱导因子导入人类细胞中，诱导所述人类细胞分化为诱导性多能干细胞；所述诱导因子包括OCT4、SOX2、NANOG及Lin28。
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