CN101705248A - 利用转录因子转染牛体细胞成为诱导性多能干细胞的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种利用转录因子转染牛体细胞产生诱导多能干细胞(iPSCs)的方法，具体包括下列步骤：1)牛皮肤成纤维细胞的分离与培养；2)牛维持多能性基因转录因子的克隆及其逆转录病毒载体的构建；3)逆转录病毒的包装与准备；4)逆转录病毒感染牛皮肤成纤维细胞以及牛的诱导性多能干细胞的获得。本发明首次采用脱细胞后人羊膜作为支持物代替小鼠胚胎成纤维细胞来维持牛iPSCs体外增殖并长期保持未分化的多能性状态。这种采用基因诱导产生多能性干细胞的方法，不但解决了动物特别是如牛、羊、猪等家畜多能性干细胞难以获得的技术难题，而且避免了应用鼠胚胎成纤维细胞作为干细胞的饲养层所带来的异种动物细胞污染问题。

Description

利用转录因子转染牛体细胞成为诱导性多能干细胞的方法

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种利用转录因子转染牛体细胞成为诱导性多能干细胞的方法。

背景技术

2006年，日本学者Yamanaka^[1]首次报道，利用小鼠转录因子Oct4，Sox2，c-Myc，Klf4组合共同转染小鼠体细胞，获得了小鼠的诱导性多能干细胞(inducted pluripotent stem cells，iPSCs)。随后，世界范围内掀起了诱导多潜能干细胞的研究热潮。从动物品种、转录因子种类和数量、转录因子组合方式以及外源基因导入方法等等许多方面都作了研究。2007年Yamanaka^[2]又利用同样的转录因子成功得到人类的iPSCs；同年，Yu(俞君英)与Thomson^[3]等人利用用另外四种转录因子(Oct3/4，Sox2，Nanog，Lin28)亦成功得到人类iPS细胞。随后又有恒河猴^[4]、大鼠^[5]、猪^[6]等动物iPSCs获得成功的报道(Li etal.，2009；Liao et al.，2009；Liu et al.，2008)。由于iPSCs与胚胎干细胞(ESCs)具有非常相似的生物学特性，所以在现有的iPSCs的建立过程中都借鉴了ES细胞的培养条件，例如应用ESCs的培养液，应用小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)作为饲养层来提供多种生长因子以维持iPSCs的多能性。但是，在家畜，例如猪、牛、羊等动物还没有公认的建系的胚胎干细胞^[7]，从早期胚胎中分离这些胚胎干细胞非常困难，而且培养体系没有完全确定。现有的胚胎干细胞培养条件，都是必须采用小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)作为培养层，才能维持ESCs处于未分化状态。在ESCs培养体系中应用小鼠胚胎成纤维细胞，直接引入了异种动物细胞，结果直接影响了ESCs细胞的临床应用，也增加了培养过程中的工作量与难度。自从1981年小鼠胚胎干细胞^[8]与1998年人类胚胎干细胞^[9]建系以来，至今已经过去了二十多年，可是家畜胚胎干细胞至今难以建系，则说明家畜要从早期胚胎材料分离获得胚胎干细胞还存在着许多技术上与理论上的制约因素。因此，利用基因工程原理，将多能性关键基因导入体细胞，使其重编程为具有多能性的干细胞，既解决了技术难关，而且也丰富了细胞重编程与干细胞建系的理论。

参考文献

[1]Takahashi，K.，and Yamanaka，S.(2006).Induction of pluripotent stemcells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors.Cell126，663-676.

[2]Takahashi，K.，Tanabe，K.，Ohnuki，M.，Narita，M.，Ichisaka，T.，Tomoda，K.，and Yamanaka，S.(2007).Induction of pluripotent stem cells from adult humanfibroblasts by defined factors.Cell 131，861-872.

[3]Yu，J.Y.，Vodyanik，M.A.，Smuga-Otto，K.，Antosiewicz-Bourget，J.，Frane，J.L.，Tian，S.，Nie，J.，Jonsdottir，G.A.，Ruotti，V.，Stewart，R.，et al.(2007).Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells.Science 318，1917-1920.

[4]Liu，H.S.，Zhu，F.F.，Yong，J.，Zhang，P.B.，Hou，P.P.，Li，H.G.，Jiang，W.，Cai，J.，Liu，M.，Cui，K.，et al.(2008).Generation of Induced Pluripotent StemCells from Adult Rhesus Monkey Fibroblasts.Cell Stem Cell 3，587-590.

[5]Li，W.L.，Wei，W.，Zhu，S.，Zhu，J.，Shi，Y.，Lin，T.，Hao，E.，Hayek，A.，Deng，H.，and Ding，S.(2009).Generation of Rat and Human Induced PluripotentStem Cells by Combining Genetic Reprogramming and Chemical Inhibitors(vol 4，pg 16，2009).Cell Stem Cell 4，370-370.

[6]Esteban，M.A.，Xu，J.，Yang，J.，Peng，M.，Qin，D.，Li，W.，Jiang，Z.，Chen，J.，Deng，K.，Zhong，M.，et al.(2009).Generation of Induced Pluripotent Stem CellLines from Tibetan Miniature Pig.Journal of Biological Chemistry 284，17634-17640.

[7]Keefer，C.L.，Pant，D.，Blomberg，L.，and Talbot，N.C.(2007).Challenges and prospects for the establishment of embryonic stem cell lines ofdomesticated ungulates.Animal Reproduction Science 98，147-168.

[8]Martin，G.R.(1981).Isolation of a pluripotent cell line from early mouseembryos cultured in medium conditioned by tera-tocarcinoma stem cells.Proc NatlAcad Sci USA 78，7634-7638.

[9]Thomson，J.A.，Itskovitz-Eldor，J.，Shapiro，S.S.，Waknitz，M.A.，Swiergiel，J.J.，Marshall，V.S.，and Jones，J.M.(1998).Embryonic stem cell linesderived from human blastocysts.Science 282，1145-1147.

发明内容

针对家畜干细胞建系中存在的上述现有技术难题与不足，本发明的目的在于提供一种获得诱导性多能干细胞(iPSCs)的方法，用该方法获得细胞在细胞集落形态、生长特性、干细胞表面标记、表达干性基因、主要干性基因启动子序列区域甲基化模式、类胚体形成与体外分化能力、畸胎瘤形成能力，以及参与嵌合体形成等八个方面都与胚胎干细胞特性非常相似。

实现上述发明目的技术方案是一种利用转录因子转染牛体细胞产生诱导性多能干细胞的方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)牛皮肤成纤维细胞的分离与培养

以成年牛皮肤成纤维细胞(BDFs)和新生牛皮肤成纤维细胞(NDFs)经常规培养分别获得大量的成年牛皮肤成纤维细胞和新生牛皮肤成纤维细胞；

2)牛维持多能性转录因子基因的克隆及其逆转录病毒载体的构建

从50-60日龄牛胎儿中分离生殖嵴，提取总RNA，经过逆转录反应得到cDNA；以cDNA为模板，经过PCR反应得到牛Oct4、Sox2、c-Myc与Klf4四个基因扩增产物并经测序验证序列正确而后将目的基因***到逆转录病毒载体pMSCVneo中，构建这4种基因的逆转录病毒表达载体；

3)逆转录病毒的包装与准备

在应用脂质体包装病毒颗粒前1小时，包装细胞PT67的培养液DMEM培养基换成无血清培养液，4-8μg包含有转录因子基因的逆转录病毒质粒DNA和10-20μl脂质体分别加入到2份500μl Opti-MEM-I+GlutaMAX-I优化转染液中，轻柔混匀，室温孵育，然后将稀释的质粒DNA和脂质体轻柔混匀，再室温孵育，20分钟后，将质粒-脂质体混合液逐滴加入PT67细胞培养皿中。

将PT67包装细胞按照常规方法培养在含有15％胎牛血清的DMEM培养基中，应用脂质体将构建的逆转录病毒转染进入包装细胞PT67细胞；将8μg含有Oct4、Sox2、c-Myc与Klf4不同基因的逆转录病毒表达载体质粒与4份20μl转染试剂脂质体lipofectamine2000分别用两份500μlOpti-MEM-I+GlutaMAX-I转染优化液进行稀释，轻轻混匀，室温下孵育5分钟，然后将含有脂质体lipofectamine2000的稀释液缓慢滴入含有逆转录病毒质粒的稀释液中，轻轻混匀，室温下再孵育20分钟后，将上述混合液逐滴加入PT67包装胞培养皿中；转染24小时后，每24小时更换含有逆转录病毒颗粒的培养液一次，连续3天收集病毒悬浮液，在4℃条件下经25000转/分离心90分钟后，10倍浓缩病毒上清液；将包含有Oct4、Sox2、c-Myc和Klf4基因病毒上清液进行等量混合，并加入8μg/ml Polybrene组成特定的四因子基因组合，-80℃保存备用；

4)逆转录病毒感染牛皮肤成纤维细胞以及牛的iPS细胞的获得

将成年牛皮肤成纤维细胞BDFs和新生公牛皮肤成纤维细胞NDFs按照常规方法培养在60mm塑料培养皿中，待培养皿中细胞生长到70-80％融合时将包含Oct4、Sox2、c-Myc与Klf4基因转录因子的逆转录病毒上清液混合液混合液大约5ml，分别加入到成纤维细胞BDFs与NDFs培养皿中感染成纤维细胞；细胞长满培养皿后按1∶3常规传代，视细胞生长情况在第6-10d将细胞以1×10⁵细胞/孔的密度，转移至预先铺有人羊膜(HAM)6孔培养板上，用人羊膜代替小鼠胚胎成纤维细胞作为饲养层培养感染后的牛细胞，同时培养液更换成干细胞培养液；培养孔内每天半量换液，连续观察20-28d，直到有细胞集落出现为止，记为0代，即为牛iPSCs。

所述的干细胞培养液的组成为：每100ml溶液中含有：82.69ml的knockout-DMEM、15ml FBS、1ml浓度为200mM谷氨酰胺、1ml浓度为10mM非必需氨基酸、200μl浓度为55mM β-巯基乙醇、10μl浓度为400ng/mL人重组碱性成纤维生长因子(bFGF)、100μl浓度为10⁵U/mL白血病抑制因子(LIF)。

牛iPSCs传代时，应用0.05％trypsin+0.02％EDTA消化液消化，经过中和、离心与重悬再传代至新的HAM支持物上，在37-38℃，5％左右CO₂，饱和湿度条件下扩增培养，得到牛iPS细胞株。牛iPSCs每隔3-5天传代一次，目前已经传代120天，超过25代。液氮冻存，解冻后生长活力较好，约有80％-90％存活率。

本发明还有一个目的是提供c-Myc基因的重组逆转录病毒表达载体pMSCV-c-Myc及在基因基因工程中的应用。

本发明还有一个目的是提供Klf4基因的重组逆转录病毒表达载体pMSCV-Klf4及在基因基因工程中的应用。

本发明得到诱导性多能干细胞和其制备方法与现有技术相比，具有以下优点：

1、本发明中应用自主克隆牛的4种维持干细胞多能性关键基因，利用多种基因组合方式，通过干细胞逆转录病毒介导导进入牛皮肤成纤维细胞，使其重编程为完全具有胚胎干细胞生物特性的诱导性多能性干细胞.通过该方法所建立的多株多能型干细胞在体外已经传代超过25代，生长特性均表现正常.冻存与解冻试验表明，它们仍具有良好的多能性.

2、本发明在培养条件中首次采用脱细胞人羊膜(HAM)作为支持物代替小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)来维持牛iPSCs体外增殖并长期保持未分化的多能性状态，而且避免了应用小鼠胚胎成纤维细胞作为干细胞的饲养层所带来的异种动物细胞污染问题。

3、本发明采用基因诱导产生多能性干细胞的方法，解决了家畜特别是牛多能性干细胞难以获得的技术难题，为其他动物干细胞建系提供了理论依据和实验基础。

附图说明

图1成年母牛皮肤成纤维细胞(BDFs)50×显微镜图。

图2新生公牛皮肤成纤维细胞(NDFs)50×显微镜图。

图3PT67包装细胞50×显微镜图。

图4电镜下逆转录病毒颗粒10万倍电镜图。

图5集落碱性磷酸酶染色100×显微镜图。

图6集落碱性磷酸酶染色200×显微镜图。

图7SSEA-4明视野显微镜图。

图8SSEA-4染色(+++)显微镜图。

图9TERT明视野显微镜图。

图10TERT染色(+++)显微镜图。

图11囊腔样类胚体结构显微镜图。

图12代表外胚层细胞系的βIII-Tubulin染色阳显微镜图。

图13代表中胚层细胞系的α-actin染色阳性显微镜图。

图14代表内胚层细胞系的甲胎蛋白(α-fetoprotein)染色阳性显微镜图。

图15腺体样结构(内胚层)400×显微镜图。

图16骨骼肌结构(中胚层)400×显微镜图。

图17原始神经元结构(外胚层)400×显微镜图。

图18EB的RT-PCR检测结果凝胶电泳图。

图19嵌合体小鼠(雌雄各一只)各组织的PCR检测结果凝胶电泳图。

具体实施方式

以下通过申请人给出的获得牛iPSCs的具体方法以及经过多种试验证明牛iPSCs在集落形态、生长特性、干细胞表面标志、体内外分化能力与嵌合体形成等诸多方面都具有与胚胎干细胞相似的生物学特性。

实施例1牛皮肤成纤维细胞的分离与培养

成年牛皮肤成纤维细胞(female bovine dermal fibroblasts，BDFs)分离自成年雌性Holstein奶牛耳缘皮肤。将组织清洗消毒后剪成细小组织块，在常规培养条件下，用含15％-20％胎牛血清(FBS)(Gibco公司产品)的高糖DMEM(Gibco公司产品)中培养。每2-3d换养液1次，7-10d后就有成纤维细胞从组织块边缘移出，12-16d后大量成纤维细胞紧密排布于组织块周围。用胰蛋白酶与EDTA混合消化液液消化后传代，即获得大量的成年牛皮肤成纤维细胞，见图1。新生公牛皮肤成纤维细胞(male newborn bovine dermalfibroblasts，NDFs)来自Holstein品种新生公牛耳缘皮肤，见图2，分离和培养方法与上述母牛皮肤成纤维细胞方法相同。为了保证细胞活力，本发明采用2～6代以内的细胞作为诱导前靶细胞。

实施例2牛维持多能性关键基因转录因子的克隆及其逆转录病毒载体的构建

从50-60日龄荷斯坦(Holstein)品种奶牛的胎儿体内分离生殖嵴，组织匀浆后用TRIzol LS Reagent提取总RNA，经过DNaseI(RNase free)处理以除去基因组DNA污染。经反转录反应得到cDNA。然后以cDNA为模板，分别经PCR扩增Oct4、Sox2、c-Myc和Klf4等4种转录因子基因开放性阅读框(ORF)全序列，基因克隆所用引物序列见表1所示。

表1扩增牛Oct4，Sox2，c-Myc和Klf4四个基因所用引物信息

其中Oct4基因PCR扩增时循环参数是：94℃预变性5min，94℃变性45sec，60℃退火45sec，72℃延伸1min，循环35次，72℃再延伸10min，预期PCR产物长度应为1083bp。

Sox2基因的循环参数是：94℃预变性5min，94℃变性45sec，54℃退火30sec，72℃延伸1min，循环35次，72℃再延伸10min，预期PCR产物长度应为963bp。

c-Myc基因的循环参数是：94℃预变性4min，94℃变30s，54℃退火1min，72℃延伸1min30sec，共30个循环，72℃再延伸10min，预期PCR产物长度应为1320bp。

Klf4基因的循环参数是：94℃预变性4min，94℃变30s，60℃退火1min，72℃延伸1min30sec，共30个循环，72℃再延伸10min，预期PCR产物长度应为1434bp。

上述PCR产物各取5μl，在1％琼脂糖凝胶电泳以鉴定其大小，剩余PCR产物-20℃保存。电泳检测结果显示，PCR扩增产物长度与预期奶牛4种转录因子基因大小完全一致，符合试验设计要求。然后将4种PCR产物剩余部分分别经过DNA片段Gel Extraction kit纯化、回收；回收产物与克隆载体pMD18-T以solution I混合连接，16℃连接过夜.将连接产物转化入感受态细胞TGI内进行克隆.经含Ampicillin(80μg/ml)、X-gal与IPTG的LB平板上37℃筛选培养14-16小时.从4种培养物中分别挑取6-10个白色菌落接种含氨苄青霉素(Ampicillin)的LB培养液中小量摇菌，并按照质粒抽提试剂盒说明书步骤抽提微量质粒.包含Oct4，Sox2，c-Myc，Klf4等4种基因的质粒经过双酶切、单酶切和质粒PCR鉴定.四种质粒经过BglII+EcoRI双酶切和EcoRI单酶切以及质粒PCR鉴定，以获得pMD-18T-Oct4、pMD-18T-Sox2、pMD-18T-cMyc、pMD-18T-Klf4四种质粒的阳性克隆.选送鉴定结果为阳性的质粒到生物公司测序.测序结果应用DNAstart 7.10软件与GenBank中参考序列进行同源性比较分析。分析结果表明，Oct4，Sox2，c-Myc和Klf4基因序列与参考序列同源性分别为99.4％，99.6％，99.4％和99.3％。

将上述测序正确的pMD-18T-Oct4，pMD-18T-Sox2，pMD-18T-cMyc，pMD-18T-Klf4，4种质粒回收纯化后与逆转录病毒pMSCVneo载体分别经过BglII+EcoRI双酶切后的目的基因片段和线性化pMSCVneo载体。将线性化后反转录病毒载体pMSCVneo与回收的目的片段用DNA Ligation Kit Version2.0在16℃连接过夜，14-16小时后，连接产物转化入JM109感受态细胞，经过氨苄青霉素(Ampicillin，50μg/mL)LB平板上筛选出逆转录病毒质粒的阳性克隆。从4个培养物板中，每一种重组质粒分别挑取6-10个菌落小量摇菌，微量方法提取重组的逆转录病毒质粒。经过BglII+EcoRI(或者BglII+HapI)双酶消化鉴定、质粒PCR扩增鉴定及测序分析鉴定。4种重组逆转录病毒质粒经过双酶切后，都可以获得已知大小的目的基因片段与逆转录病毒载体片段，说明我们所构建的重组逆转录病毒表达载体结构正确。通过测序检测，所有重组逆转录病毒质粒中所包含的4个目的基因的序列与PCR扩增序列完全一致，也与GenBank中参考序列完全一致，表明在本专利中所构建得4种重组逆转录病毒质粒过程中目的基因没有发生阅读框的移码和碱基突变等情况，说明所应用的4种基因序列完全正确。本专利中所构建的4种重组逆转录病毒表达载体分别命名为：pMSCV-Oct4、pMSCV-Sox2、pMSCV-cMyc和pMSCV-Klf4。

实施例3逆转录病毒的包装与准备

PT67包装细胞按照常规方法培养在DMEM培养基中，待细胞达到70％-80％汇合时，应用脂质体将逆转录病毒转染进入包装细胞PT67细胞，进行病毒包装以获得具有感染性逆转录病毒颗粒。转染前1小时，DMEM培养基换成无血清培养液，4-8μg逆转录病毒质粒DNA和10-20μl脂质体分别加入到500μl Opti-MEM-I+GlutaMAX-I(Gibco公司产品)优化转染液中，轻柔混匀，室温孵育，然后将稀释的质粒DNA和脂质体轻柔混匀，再室温孵育20分钟后，将混合液逐滴加入PT67细胞培养皿中。细胞在37℃，5％CO₂和饱和湿度条件下培养4-6h后，转染液换成新的含15％FBS的DMEM培养液。经过24小时转染后，收集PT67细胞培养液上清，该上清中就包含感染性逆转录病毒颗粒。上清液经过0.45μm孔径的滤膜过滤。每24小时收集一次，连续收集3d。病毒悬浮液在4℃条件下，经过25,000转/分，离心90分钟，10倍浓缩病毒上清液。将Oct4、Sox2、c-Myc和Klf4四种基因病毒上清液进行等量混合，并添加8μg/ml polybrene组成特定的四因子基因组合，-80℃保存，准备转染牛皮肤成纤维细胞。

实施例4逆转录病毒感染牛皮肤成纤维细胞以及牛的iPS细胞的获得及传代

将成年牛皮肤成纤维细胞(BDFs)和新生公牛皮肤成纤维细胞(NDFs)按照常规方法培养在60mm塑料培养皿中接种2×10⁵个细胞，待培养皿中细胞生长到70-80％融合时，将包含Oct4、Sox2、c-Myc和Klf4基因转录因子的逆转录病毒上清液混合液分别加入到成纤维细胞BDFs与NDFs培养皿中感染成纤维细胞；细胞长满培养皿后按1：3常规传代，视细胞生长情况在第6-10d将细胞以1×10⁵细胞/孔的密度，转移至预先铺有人羊膜6孔培养板上，用HAM代替MEF作为饲养层培养感染后的牛细胞，同时培养液更换成干细胞培养液；培养孔内每天半量换液，连续观察20-28d，直到有ES细胞样集落出现为止，记为0代，即为牛iPSCs.

牛iPSCs传代时，应用0.05％trypsin+0.02％EDTA消化液消化，经过中和、离心与重悬再传代至新的HAM支持物上，在37-38℃，5％左右CO₂，饱和湿度条件下扩增培养，得到牛iPS细胞株。牛iPSCs每隔3-5天传代一次，目前已经传代120天，超过25代。液氮冻存，解冻后生长活力较好，大约有85％-90％存活率。

干细胞培养液组成为：每100ml溶液中含有：82.69ml的knockout-DMEM、15ml FBS、1ml浓度为200mM谷氨酰胺、1ml浓度为10mM非必需氨基酸、200μl浓度为55mM β-巯基乙醇、10μl浓度为400ng/mL人重组碱性成纤维生长因子(bFGF)、100μl浓度为10⁵U/ml白血病抑制因子(LIF)。

试验例1建立的牛iPSCs系的鉴定

为了鉴定本发明中所建立的牛诱导性多能干细胞(bovine inducedpluripotent stem cells，iPSCs)与传统意义上胚胎干细胞具有非常类似的生物学特性，发明人在多个不同方面设计鉴定本发明所建立的牛的iPS细胞，

1.作为靶细胞的牛皮肤成纤维细胞形态，见图1-2。

2.PT67包装细胞与包装后的逆转录病毒颗粒形态，见图3-4。

3.iPSCs集落形态与AP染色阳性(红色)鉴定，见图5-6。

4.iPSCs集落的免疫荧光细胞化学染色鉴定，见图7-10。

5.类胚体的形成于体外分化鉴定

利用牛iPSCs体外悬浮培养7天后就可以形成多个球形和囊腔样类胚体(Embryoid Body，EB)结构，见图11，其中A显示为球形的类胚体结构，B显示的是囊腔样类胚体结构。

利用牛iPSCs形成的类胚体(EB)，再经过贴壁培养14-21天，并通过添加诱导培养基的方法使其定向分化，形成代表3个胚层的不同细胞形态。3个胚层代表细胞系，见图12-14所示。

6.畸胎瘤形成与三个胚层细胞的分化

将牛iPSCs注射到裸鼠臀部皮下，经过6-9周时间发育，则会在裸鼠注射部位皮下形成肿瘤，即为畸胎瘤。将畸胎瘤采集、固定后制备成组织切片，经过H.E.染色后显微镜观察，可以观察到3个胚层细胞形态同时存在畸胎瘤中切片，说明牛iPSCs具有发育的多能性。观察结果如下图15-17所示(箭头)。另外，对畸胎瘤组织提取总RNA，应用三个胚层代表基因引物进行RT-PCR扩增检测，结果也显示了三个胚层细胞的存在，同样说明所建立的牛iPSCs具有发育多能性。类胚体三个胚层代表基因的RT-PCR检测结果见图18，图中泳道1：β-Actin为内参；泳道2：Nestin，泳道3：β-tubulin(外胚层)；泳道4：GATA4，泳道5：Actin alpha 2(中胚层)；泳道6：Keratin-14，泳道7：PDX-1，泳道8：AFP(内胚层)，所用引物见表2。

表2.检测分化细胞代表基因PCR所用引物

试验例2利用牛iPSCs建立“牛-小鼠”嵌合体

把其中一株牛iPSCs通过显微注射的方法注射入小鼠的8-细胞胚胎或桑椹胚内，每个胚胎注射12～15个牛iPS细胞，之后移植到假孕鼠的子宫。共注射115枚胚胎，移植给5只假孕鼠，其中一只妊娠，生下6只小鼠。根据牛的线粒体DNA的D-LOOP高变区序列设计引物，对其中两只新生小鼠(雌雄各一只)进行线粒体DNA的D-LOOP高变区PCR扩增检测，嵌合有牛组织细胞的组织包括有：心、肝、脾、肺、肾、血液、血管、睾丸(或卵巢)等多个组织，见图20，证明这两只新生小鼠不同组织器官中都嵌合有牛细胞。试验结果揭示了我们所建立牛iPS细胞参与了牛-小鼠嵌合体的形成。

当小鼠8-cell胚胎中注射入牛iPS细胞制作嵌合体小鼠时，共出生嵌合体小鼠6只，但是，所生6只嵌合体小鼠全身白色皮毛，未发现有皮毛嵌合。

电泳图19上部分1-17泳道代表嵌合雌性小鼠各组织检测结果：1心，2肝，3脑，4肺，5肾，6消化道，7肌肉，8脾，9脊髓，10卵巢，11胰，12血液，13皮肤(-)，14受体小鼠(-)，15普通小鼠(-)，16BDF细胞，17BDF-iPSO细胞。

牛的线粒体DNA的D-LOOP高变区PCR检测结果凝胶电泳图19所示：图中1-17泳道代表嵌合雄性小鼠各组织检测结果：1心，2肝，3脑，4肺，5肾，6消化道，7肌肉，8脾，9脊髓，10睾丸，11血液，12软骨(-)，13皮肤(-)，14BDF细胞，15BDF-iPSO细胞，16受体小鼠(-)，17普通小鼠(-)。

<110>西北农林科技大学

<120>利用转录因子转染牛体细胞成为诱导性多能干细胞的方法

<160>4

<210>1

<211>1083bp

<212>DNA

<213>OCT4

<400>1

ATGGCGGGACACCTCGCTTCTGACTTCGCCTTCTCGCCCCCGCCGGGCGGTGGAGGCGAT  60

GGGCCGGGAGGGCCAGAGCCGGGCTGGGTTGATCCTCGGACCTGGATGAGCTTCCAAGGG  120

CCTCCCGGTGGGTCGGGGATCGGGCCGGGGGTTGTGCCTGGCGCCGAGGTGTGGGGGCTT  180

CCCCCGTGCCCCCCGCCCTATGACTTGTGTGGAGGGATGGCCTACTGTGCGCCGCAGGTT  240

GGAGTGGGGCCGGTGCCCCCAGGCGGCCTGGAGACCCCTCAGCCCGAGGGCGAGGCGGGA  300

GCCGGGGTGGAGAGCAACTCCGAGGGGGCCTCCCCGGACCCCTGCGCCGCACCCGCAGGC  360

GCCCCGAAACTGGACAAGGAGAAGCTGGAGCCGAACCCTGAGGAGTCCCAGGACATCAAA  420

GCTCTTCAGAAAGACCTTGAACAATTTGCCAAGCTCCTAAAGCAGAAGAGGATCACACTA  480

GGATATACCCAGGCCGATGTGGGGCTCACCCTGGGGGTTCTCTTTGGAAAGGTGTTCAGC  540

CAAACGACTATCTGCCGTTTTGAGGCTTTGCAGCTCAGTTTCAAGAACATGCGTAAGCTG  600

CGGCCCCTGCTGCAGAAGTGGGTGGAGGAAGCTGACAACAACGAGAATCTGCAGGAGATA  660

TGCAAGGCAGAGACCCTTGTGCAGGCCCGAAAGAGAAAGCGGACGAGTATCGAGAACCGA  720

GTGAGAGGCAACCTGGAGAGCATGTTCCTGCAGTGCCCGAAGCCCACCCTGCAGCAAATT  780

AGCCACATCGCCCAGCAGCTCGGGCTGGAGAAAGACGTGGTCCGAGTGTGGTTTTGCAAC  840

CGTCGCCAGAAGGGCAAACGATCAAGCAGTGACTACTCCCAACGTGAGGATTTTGAGGCT  900

GCTGGGTCTCCTTTCGCAGGGGGACCCGTATCCTTTCCTCTGGCGCCGGGGCCCCATTTT  960

GGTACCCCAGGCTACGGGGGCCCTCACTTCACTACTCTGTACTCTTCGGTCCCATTCCCT  1020

GAGGGTGAGGCCTTTCCCTCGGTGTCTGTCACCGCTCTGGGCTCCCCTATGCATGCAAAC  1080

TGA                                                           1083

<210>2

<211>963bp

<212>DNA

<213>Sox2

<400>2

ATGTACAACATGATGGAGACGGAGCTGAAGCCGCCGGGCCCGCAGCAAACTTCGGGGGGC  60

GGCGGCGGCGGCGGCGGCAACTCCACCGCGGCGGCGGCGGGCGGCAACCAGAAGAACAGC  120

CCGGACCGAGTCAAGCGGCCCATGAACGCCTTCATGGTGTGGTCCCGCGGGCAGCGGCGC  180

AAGATGGCCCAAGAGAACCCTAAGATGCACAACTCGGAGATCAGCAAGCGCTTGGGCGCC  240

GAGTGGAAACTTTTGTCCGAGACGGAGAAGCGGCCGTTCATCGACGAGGCCAAGCGGCTG  300

CGAGCGCTGCACATGAAGGAACACCCGGATTATAAATACCGGCCCCGGCGGAAAACCAAG  360

ACGCTCATGAAGAAGGATAAGTACACACTGCCGGGAGGGCTGCTCGCCCCGGGCGGCAAC  420

AGCATGGCGAGCGGGGTCGGGGTGGGCGCCGGCCTCGGCGCGGGCGTGAACCAACGCATG  480

GACAGCTACGCGCACATGAACGGCTGGAGCAACGGCAGCTACAGCATGATGCAGGACCAG  540

CTGGGCTACCCGCAACACCCGGGCCTCAACGCGCACGGCGCCGCTCAGATGCAGCCCATG  600

CACCGCTACGACGTGAGCGCCCTGCAGTACAACTCTATGACCAGCTCGCAGACCTACATG  660

AACGGCTCGCCCACCTACAGCATGTCCTATTCTCAGCAGGGCACCCCTGGCATGGCGCTT  720

GGCTCCATGGGCTCGGTGGTGAAGTCCGAGGCCAGCTCCAGCCCCCCCGTGGTTACCTCT  780

TCTTCCCACTCCAGGGCGCCCTGCCAAGCCGGGGACCTCCGGGACATGATCAGCATGTAC  840

CTCCCCGGCGCCGAGGTGCCGGAGCCCGCCGCCCCCAGCAGACTTCACATGTCCCAGCAC  900

TACCAGAGCGGCCCGGTGCCCGGCACGGCCATTAACGGCACACTGCCCCTCTCGCACATG  960

TGA                                                           963

<210>3

<211>1320bp

<212>DNA

<213>CMYC

<400>3

ATGCCCCTCAACGTCAGCTTCGCCAACAAGAACTATGACCTCGACTACGATTCGGTGCAG  60

CCTTATTTCTACTGCGACGAGGAGGAGAACTTCTACCACCAGCAGCAGCAGAGCGAACTG  120

CAGCCGCCGGCGCCCAGCGAGGATATCTGGAAGAAATTCGAGCTGCTGCCCACCCCGCCC  180

CTGTTCCCTAGCCGCCGCTCCGGGCTCTGCTCGCCGTCGTACGTCGCGGTCGCCTCCTTC  240

TCGCCCAGGGGAGACGACGACGGCGGCGGCGGCAGCTTCTCCTCAGCGGACCAGTTGGAG  300

ATGGTGACCGAGCTACTAGGAGGCGACATGGTGAACCAGAGCTTCATCTGCGACCCCGAC  360

GATGAGACCCTCATCAAAAACATCATCATCCAGGACTGTATGTGGAGCGGCTTCTCGGCC  420

GCCGCCAAGCTCGTCTCGGAGAAGCTGGCCTCTTACCAGGCTGCGCGCAAAGACGGCGGC  480

AGCCCGAGCCCCGCCCGCGGGCACGGCGGCTGCTCCACCTCCAGCTTGTACCTGCAGGAC  540

CTGAGCGCCGCCGCCTCCGAATGCATCGACCCCTCGGTGGTCTTCCCCTACCCGCTCAAC  600

GACAGCAGCTCGCCCAAGCCCTGCGCTTCCCCGGACTCCACCGCCTTTTCTCCGTCCTCT  660

GACTCTCTGCTCTCCTCTGCTGAGTCCTCCCCGCGGGCCAGTCCCGAGCCCCTGGCGCTC  720

CATGAGGAGACCCCACCCGCGACCAGTAGCGACTCTGAGGAAGAACAAGAGGATGAGGAA  780

GAAATTGATGTTGTTTCTGTGGAAAAGAGGCAGCCCCCTGCCAAAAGGTCAGAATCGGGG  840

TCACCCTCTGCCGGCAGCCACAGCAAACCTCCTCACAGCCCGTTAGTCCTAAAGAGATGC  900

CACGTGTCTACCCATCAGCACAATTACGCAGCGCCCCCCTCCACTAGGAAGGACTATCCC  960

GCCGCCAAGAGGGCTAAGTTGGACAGTGGCAGGGTCCTGAAACAGATCAGCAACAACCGC  1020

AAATGTGCCAGCCCGAGGTCTTCGGACACGGAGGAGAATGACAAGAGGCGGACACACAAC  1080

GTTTTGGAGCGCCAGAGGAGAAACGAGCTGAAACGCAGCTTTTTTGCTCTTCGTGACCAG  1140

ATCCCAGAGTTGGAGAACAATGAAAAAGCCCCCAAGGTAGTTATCCTTAAAAAAGCCACA  1200

GCGTACATCCTGTCGGTCCAAGCAGAGCAGCAAAAGCTCAAGTCAGAAATAGACGTGTTG  1260

CAGAAGAGGCGAGAACAGTTGAAACTCAAACTTGAACAGATACGGAACTCTTGCGCCTAA  1320

<210>4

<211>1434bp

<212>DNA

<213>KLF4

<400>4

ATGGCTGTCAGCGACGCGCTGCTCCCGTCCTTCTCCACGTTCGCGTCCGGCCCGGCGGGA  60

AGGGAGAAGACACTGCGTCCAGCAGGTGCCCCAAATAACCGCTGGCGGGAGGAGCTCTCC  120

CACATGAAGCGACTTCCCCCGGTGCTTCCCGGCCGCCCCTACGACCTGGCGGCGGCGACC  180

GTGGCCACCGACCTGGAGAGTGGAGGAGTCGGCGCGGCTTGCGGCAGCAGCAACCCGGCT  240

CTCCTGCCCCGGAGGGAGACGGAGGAGTTCAATGATCTCCTGGACCTGGACTTTATCCTC  300

TCCAACTCGCTGTCCCATCAGGAGTCCGTGGCCGCCACGGTGTCCTCGTCGGCATCAGCC  360

TCATCCTCGTCCTCCCCGTCGAGCAGCGGTCCAGCCAGTGCGCCTTCCACCTGCAGCTTC  420

AGCTATCCAATCCGGGCCGGGGGCGACCCGGGCGTGGCGGCGCCGGGCGGCGCGGGCGGC  480

GGCCTCCTGTACGGCCGGGAGTCTGCACCGCCTCCGACGGCTCCCTTCAACCTGGCGGAC  540

ATCAACGATGTGAGCCCCTCCGGCGGCTTCGTGGCCGAGCTCCTGCGGCCTGAATTGGAC  600

CCAGTGTACATTCCGCCGCAGCAGCCGCAGCCGCCAGGTGGCGGGCTGATGGGCGAGTTC  660

GTGTTGAAGGCGTCGCCGAGTGCCCCTGGCAGCGAGTACGGCAGCCCGTCGGTCATCAGT  720

GTTAGCAAAGGCAGCCCGGACGGCAGCCACCCGGTGGTGGTGGCGCCCTACAGCGGCGGG  780

CCGCCACGCATGTGCCCCAAGATCAAGCAGGAGGCTGTCTCCTCGTGCACCGTCGGTCGG  840

CCCCTAGAGGCCCACTTGGGCACTGGACCTCCTCTCAGCAATGGCCACCGGCCGCCTGCT  900

CACGACTTTCCCTTGGGGCGGCAGCTCCCCAGCAGGACTACCCCGACCCTGGGTGCCGAG  960

GAACTGCTGAGCAGCCGGGACTGTCATCCTGCCCTGCCGCTCCCCCCGGGCTTCCATCCC  1020

CACCCCGGGCCCAACTACCCTCCCTTCCTGCCCGACCAGATGCAGCCGCAGGTCCCACCG  1080

CTCCATTACCAAGAGCTCATGCCACCCGGTTCCTGCATGCCGGAGGAGCCCAAACCAAAG  1140

AGGGGAAGACGGTCGTGGCCCCGGAAAAGGACGGCCACTCACACTTGTGATTATGCAGGC  1200

TGCGGCAAAACCTACACGAAGAGTTCTCATCTCAAGGCACACCTGCGCACCCACACAGGT  1260

GAGAAACCTTACCACTGTGACTGGGATGGTTGTGGGTGGAAGTTTGCCCGCTCAGATGAA  1320

CTGACCAGGCACTACCGCAAACACACCGGGCACCGCCCCTTCCAGTGCCAGAAGTGCGAC  1380

CGGGCATTCTCGAGGTCGGACCACCTCGCCTTACACATGAAGAGGCACTTTTAA        1434

Claims (7)

1.一种利用转录因子转染牛体细胞成为诱导性多能干细胞的方法，包括如下步骤：

1)牛皮肤成纤维细胞的分离与培养

以成年牛皮肤成纤维细胞BDF和新生牛皮肤成纤维细胞NDF，经常规培后养分别获得大量的成年牛皮肤成纤维细胞和新生牛皮肤成纤维细胞；

2)牛维持多能性转录因子基因的克隆及其逆转录病毒载体的构建

从50-60日龄牛胎儿中分离生殖嵴，提取总RNA，经过逆转录反应得到cDNA；以cDNA为模板，经过PCR反应得到牛Oct4、Sox2、c-Myc与Klf4四个基因扩增产物并经测序验证序列正确而后将目的基因***到逆转录病毒载体pMSCVneo中，构建这4种基因的逆转录病毒表达载体；

3)逆转录病毒的包装与准备

将PT67包装细胞按照常规方法培养在含有15％胎牛血清的DMEM培养基中，应用脂质体将构建的逆转录病毒转染进入包装细胞PT67细胞；将8μg含有Oct4、Sox2、c-Myc与Klf4四个不同基因的逆转录病毒表达载体质粒与4份20μl转染试剂脂质体lipofectamine2000分别用500μlOpti-MEM-I+GlutaMAX-I转染优化液进行稀释，轻轻混匀，室温下孵育5分钟，然后将含有脂质体lipofectamine2000的稀释液缓慢滴入含有逆转录病毒质粒的稀释液中，轻轻混匀，室温下再孵育20分钟后，然后将上述混合液逐滴加入PT67包装胞培养皿中；转染24小时后，每天更换含逆转录病毒颗粒的培养液一次，连续3天，收集病毒悬浮液，在4℃条件下经25000转/分离心90分钟后，10倍浓缩病毒上清液；将包含有Oct4、Sox2、c-Myc与Klf4基因病毒上清液进行等量混合，并加入8μg/ml Polybrene组成特定的四因子基因组合，-80℃保存备用；

4)逆转录病毒感染牛皮肤成纤维细胞以及牛的iPS细胞的获得

将成年牛皮肤成纤维细胞BDFs和新生公牛皮肤成纤维细胞NDFs按照常规方法培养在60mm塑料培养皿中，待培养皿中细胞生长到70-80％融合时将包含Oct4、Sox2、c-Myc与Klf4基因转录因子的逆转录病毒上清液的混合液分别加入到成纤维细胞BDFs与NDFs培养皿中感染成纤维细胞；细胞长满培养皿后按1∶3常规传代，视细胞生长情况在第6-10d将细胞以1×10⁵细胞/孔的密度，转移至预先铺有人羊膜(HAM)6孔培养板上，作为饲养层培养感染后的牛细胞，同时培养液更换成干细胞培养液；培养孔内每天半量换液，连续观察20-28d，直到有细胞集落出现为止，记为0代，即为牛iPSCs。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：在应用脂质体包装病毒颗粒前1小时，将包装细胞PT67的培养液DMEM培养基换成无血清培养液，4-8μg包含有转录因子基因的逆转录病毒质粒DNA和10-20μl脂质体分别加入到2份500μl Opti-MEM-I+GlutaMAX-I优化转染液中，轻柔混匀，室温孵育，然后将稀释的质粒DNA和脂质体轻柔混匀，再室温孵育20分钟后，将质粒-脂质体混合液逐滴加入PT67细胞培养皿中。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的干细胞培养液的组成为：每100ml溶液中含有：82.69ml的knockout-DMEM、15ml FBS、1ml浓度为200mM谷氨酰胺、1ml浓度为10mM非必需氨基酸、200μl浓度为55mM β-巯基乙醇、10μl浓度为400ng/ml人重组碱性成纤维生长因子、100μl浓度为10⁵U/mL白血病抑制因子。

4.权利要求1所述c-Myc基因的重组逆转录病毒表达载体pMSCV-c-Myc。

5.权利要求4所述重组逆转录病毒表达载体pMSCV-c-Myc在基因基因工程中的应用。

6.权利要求1所述Klf4基因的重组逆转录病毒表达载体pMSCV-Klf4。

7.权利要求6所述重组逆转录病毒表达载体pMSCV-Klf4在基因基因工程中的应用。

Images