CN103293304B - 一种检测磺胺类药物的试剂盒及方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种检测磺胺类药物的试剂盒及方法。试剂盒包括微孔试剂和试纸，所述微孔试剂中冻干有胶体金标记的磺胺类药物特异性抗体，所述磺胺类药物特异性抗体可为磺胺类药物单克隆抗体或磺胺类药物多克隆抗体；所述试纸由样品吸收垫、反应膜、吸水垫、保护膜、底板依次连接组成，所述反应膜上包括检测区和质控区，检测区包被有磺胺类药物半抗原-载体蛋白偶联物，质控区包被有抗抗体。用本发明试剂盒检测磺胺类药物的方法，简单、快速、直观、准确、适用范围广、成本低、易推广使用。

Description

一种检测磺胺类药物的试剂盒及方法

技术领域

本发明涉及一种检测磺胺类药物的试剂盒及方法，具体涉及一种用于检测磺胺类药物的胶体金试纸条，其特别适于牛奶样本中磺胺类药物残留的检测。

技术背景

磺胺类药物(Sulfonamides，SAs)是通过人工合成的氨苯磺胺衍生物，能抑制革兰氏阳性菌及一些阴性菌，可以治疗多种细菌感染，在兽医临床上广泛应用于治疗由敏感细菌感染的各种畜禽疾病，同时还可以作为饲料添加剂提高饲料的转化率和促进动物生长，目前常用的SAs有十几种。但该类药物存在严重副作用，人体中长期存在会导致许多细菌对磺胺类药物产生耐药性，且有潜在的致癌性，因此已引起了国内外的高度重视。我国农业部第235号文件规定其残留限量为100μg/kg。

目前，磺胺类药物残留的检测方法主要有微生物法、理化分析方法和免疫法等。微生物法简便、费用低，但操作费时且敏感性、特异性都较差，在定性定量上都存在困难，不能满足现代残留检测的需要，甚至有些检测结果还达不到最高残留限量的要求；理化法常作为确证方法用于测定动物组织中的药物残留，如气相色谱(GC)、高效液相色谱(HPLC)、气-质联用(GC-MS)、液-质联用(HPLC-MS)等，这些方法灵敏、准确，特异性强、分离度好，可以同时测定多种药物，但需要昂贵的仪器、样品的前处理复杂、繁琐费时、检测的成本较高，不能现场操作，而且需专业人员操作，所以限制了其应用；与之相比，免疫学测定方法具有特异性好、灵敏度高、操作简便、检测成本低、适合于批量样品的筛选检测等优点，能够更好地满足我国畜禽养殖户、食品企业、政府职能监管部门等开展检测工作。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种检测磺胺类药物的试剂盒。

本发明所提供的试剂盒包括微孔试剂和试纸，微孔试剂具有微孔塞，试纸包括底板、样品吸收垫、反应膜、吸水垫、保护膜，其依次连接；所述微孔试剂中冻干有磺胺类药物特异性抗体-胶体金标记物；磺胺类药物特异性抗体可为磺胺类药物单克隆抗体或磺胺类药物多克隆抗体；反应膜上包括检测区和质控区；当磺胺类药物特异性抗体为磺胺类药物单克隆抗体时，检测区包被磺胺类药物半抗原-载体蛋白偶联物，质控区包被羊抗鼠抗抗体；当磺胺类药物特异性抗体为磺胺类药物多克隆抗体时，检测区包被磺胺类药物半抗原-载体蛋白偶联物，质控区包被羊抗兔抗抗体。

所述磺胺类药物半抗原-载体蛋白偶联物是由磺胺类药物半抗原与载体蛋白偶联得到，所述载体蛋白可为牛血清白蛋白、卵清蛋白、血蓝蛋白、甲状腺蛋白、人血清白蛋白。

所述磺胺类药物特异性抗体-胶体金标记物中的磺胺类药物特异性抗体是以磺胺类药物半抗原-载体蛋白作为免疫原制备获得。

所述磺胺类药物为磺胺嘧啶、磺胺间二甲氧嘧啶、磺胺对甲氧嘧啶、磺胺二甲基嘧啶、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺异噁唑、磺胺喹噁啉、磺胺甲噁唑、磺胺甲氧哒嗪、磺胺氯哒嗪、磺胺苯酰、磺胺多辛。

所述样品吸收垫上粘贴有保护膜，为检测端，上面有MAX标记线。

所述检测区位于近于有MAX标记的保护膜的一端，所述质控区位于远离有MAX标记的保护膜的一端。

所述底板可为PVC底板或其他硬质不吸水的材料；所述样品吸收垫可为吸滤纸或滤油纸；所述吸水垫为吸水纸；所述反应膜可为硝酸纤维素膜或醋酸纤维素膜；所述保护膜为PE材质保护膜。

本发明的另一个目的是提供一种制备上述试剂盒的方法，其包括步骤：

1)制备冻干有磺胺类药物特异性抗体-胶体金标记物的微孔试剂；

2)制备具有包被磺胺类药物半抗原-载体蛋白偶联物的检测区和包被抗抗体的质控区的反应膜；

3)将2)制备好的反应膜与样品吸收垫、吸水垫、保护膜、底板组装成试纸；

4)将1)和3)制备好的冻干有磺胺类药物特异性抗体-胶体金标记物的微孔试剂和试纸组装成试剂盒。

具体地说，步骤包括：

1)将4-乙酰氨基苯磺酰氯与6-氨基乙酸反应，制备磺胺类药物半抗原；

2)将磺胺类药物半抗原与载体蛋白偶联，制备磺胺类药物半抗原-载体蛋白偶联物；

3)用磺胺类药物半抗原-载体蛋白偶联物免疫小鼠，将小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞通过融合、筛选，得到分泌磺胺类药物单克隆抗体的杂交瘤细胞株或用磺胺类药物半抗原-载体蛋白免疫兔，得到磺胺类药物多克隆抗体；

4)提取小鼠IgG或兔IgG免疫健康山羊，得到羊抗鼠IgG抗体或羊抗兔抗抗体；

5)用柠檬酸三钠与氯金酸反应制备胶体金；

6)将制备的磺胺类药物特异性抗体加入到制备的胶体金中，得到磺胺类药物特异性抗体-胶体金标记物；

7)将磺胺类药物特异性抗体-胶体金标记物冻干在微孔试剂中，将微孔试剂加上微孔塞；

8)将样品吸收垫用含0.5％牛血清白蛋白(体积百分含量)、pH为7.2、0.1mol/L磷酸盐缓冲液浸泡2h，37℃下烘干2h；

9)在底板上按顺序粘贴上样品吸收垫、反应膜、吸水垫和保护膜；

10)将制备好的微孔试剂和试纸组装成试剂盒，2～8℃条件下保存12个月。

本发明的另一个目的是提供一种应用上述试剂盒检测牛奶样本中磺胺类药物残留的方法，它包括步骤：

(1)用试剂盒进行检测；

(2)分析检测结果。

本发明试剂盒的检测原理：将待检牛奶样本滴加于微孔试剂中，混匀后，孵育5min，将标有MAX标记线端向下，***孵育后的微孔试剂，待检样品液与微孔中的金标抗体结合后一起向反应膜扩散；若待检样品液中磺胺类药物的含量高，则扩散过程中待检样品液中的磺胺类药物可与金标抗体相结合，进而完全封闭金标抗体上磺胺类药物的抗原结合点，阻止金标抗体与反应膜上磺胺类药物半抗原-载体蛋白偶联物结合，检测区不显色，而抗抗体则可与金标抗体结合，质控区显色；若待检样品液中磺胺类药物的含量低或无，则金标抗体上的抗原结合位点不能被封闭，进而金标抗体会与反应膜上磺胺类药物半抗原-载体蛋白偶联抗原结合，检测区显色，同时抗抗体也可与金标抗体结合，质控区显色。如果质控区不显色，则试纸失效。如图4所示。

阳性：当质控区(C)显示出红色条带，而检测区(T)不显色时，判为阳性。

阴性：当质控区(C)显示出红色条带，检测区(T)同时也显示出红色条带，判为阴性。

无效：当质控区(C)不显示出红色条带，则无论测试区(T)显示出红色条带与否，该试纸判为无效。

本发明的试剂盒具有灵敏度高、特异性强、成本低、操作简单、检测时间短、适合各种单位使用、储存简单、保质期长的优点。其中，采用高特异性的磺胺类药物单克隆抗体，保证了检测结果的可靠性；将金标抗体冻干在微孔试剂中，在检测过程中，能够使金标抗体与待检样品液充分接触，充分反应，从而减少误差，增加整个体系的反应灵敏度。用本发明试剂盒检测磺胺类药物抗生素的方法简便、快速、直观、准确、适用范围广、成本低、易推广使用。

附图说明

图1为试纸剖面结构示意图。

图2为试纸俯视图。

图3为微孔试剂图。

图4为试纸检测结果判定图。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

实施例1检测磺胺类药物的试剂盒的构成

一、试纸(称作试纸条)(图1)

所述试纸是由底板、样品吸收垫、反应膜、吸水垫、保护膜组成；

所述样品吸收垫1、反应膜2、吸水垫3和保护膜7依次按顺序粘贴在底板6上，样品吸收垫的末端与反应膜相连，反应膜的末端与吸水垫相连，样品吸收垫的始端与底板的始端对齐，吸水垫的末端与底板的末端对齐；

所述试纸粘贴有保护膜，保护膜7覆盖在样品吸收垫上，为检测端，上面印有MAX字样(图2)；

所述反应膜上有检测区4和质控区5，均呈与所述试纸条的长相垂直的条带状，检测区位于近于有MAX标记的保护膜的一端，质控区位于远离有MAX标记的保护膜的一端，检测区包被有磺胺类药物半抗原-载体蛋白偶联物(磺胺类药物半抗原-卵清蛋白的偶联物)，质控区包被有羊抗鼠抗抗体；

所述底板为PVC底板；所述样品吸收垫为吸滤纸；所述吸水垫为吸水纸；所述反应膜为硝酸纤维素膜；所述保护膜为PE材质保护膜。

二、微孔试剂(图3)

所述微孔试剂8上冻干有磺胺类药物单克隆抗体-胶体金标记物，包被量0.20～0.25μg/ml；所述微孔试剂具有微孔塞9。

将上述微孔试剂与试纸组装成试剂盒，在2～8℃环境中保存，有效期12个月。

实施例2实施例1中所述试剂盒的制备方法

一、试剂盒的制备

该试剂盒的制备方法主要包括以下步骤：

1)制备冻干有磺胺类药物单克隆抗体-胶体金标记物的微孔试剂；

2)制备具有包被磺胺类药物半抗原-载体蛋白偶联物的检测区和包被羊抗鼠抗抗体的质控区的反应膜；

3)将2)制备好的反应膜与样品吸收垫、吸水垫、保护膜、底板组装成试纸；

4)将1)和3)制备好的冻干有磺胺类药物单克隆抗体-胶体金标记物的微孔试剂和试纸组装成试剂盒。

下面分步详细叙述：

(一)各部件的制备

1.磺胺类药物半抗原-载体蛋白偶联物的合成与鉴定

磺胺类药物是小分子物质，只有免疫反应性，没有免疫原性，不能诱发机体产生免疫应答，必须与大分子载体蛋白偶联后才具有免疫原性。

(1)磺胺类药物半抗原的制备

a)于25ml单口瓶中加入6-氨基烟酸0.87g，乙醇20ml，12mol/L盐酸3.7ml，加热回流，反应8h，TLC监测，反应完毕，减压除去溶剂，溶于饱和NaHCO₃水溶液，乙酸乙酯萃取，无水Na₂SO₄干燥，柱层析(乙酸乙酯/石油醚，2/1，v/v)纯化；

b)于25ml单口瓶中加入a)所得产物0.89g，三乙胺(Et₃N)1.6ml，CH₂Cl₂10ml，搅拌溶解后，加入催化剂4-二甲氨基吡啶(DMAP)。缓慢滴入4-乙酰氨基苯磺酰氯的2ml二氯甲烷溶液，TLC监测，5h，反应完毕后处理，干燥，柱层析纯化(乙酸乙酯/石油醚，1/10，v/v)；

c)于25ml单口瓶中加入b)所得产物1g，2mol/LNaOH水溶液120ml，加热回流，TLC监测，反应10h，完毕，调节pH4～5，有固体析出，即为磺胺类药物半抗原。

(2)免疫原的制备——磺胺类药物半抗原与牛血清白蛋白偶联物合成

取12mg磺胺类药物半抗原，溶解于1mlN,N-二甲基甲酰胺(DMF)中，得到溶液I；取15mg碳化二亚胺(EDC)用0.2ml水充分溶解后于加入I中，室温下搅拌24h，得到溶液Ⅱ；称取牛血清白蛋白(BSA)40mg，使之充分溶解在3mlPBS(pH7.2)中，将溶液Ⅱ逐滴缓慢滴加到蛋白溶液中，并于室温下搅拌24h；用0.01mol/LPBS4℃透析3天，每天换3次透析液，以除去未反应的小分子物质，即得到磺胺类药物免疫原；分装，于-20℃保存备用。

(3)包被原的制备——磺胺类药物半抗原与卵清蛋白偶联物合成

取15mg磺胺类药物半抗原用0.8mlDMF溶解，冷却至10℃，得到溶液I；取氯甲酸异丁酯10μl加入I中，10℃搅拌反应30min；取30mg卵清蛋白用2.2ml50mmol/LNa₂CO₃溶解，10℃反应4h，然后4℃过夜；用0.01mol/LPBS4℃透析3天，每天换3次透析液，以除去未反应的小分子物质，即得到磺胺类药物包被原；分装，于-20℃保存备用。

(4)磺胺类药物半抗原-载体蛋白偶联物的鉴定

将载体蛋白、磺胺类药物半抗原、磺胺类药物半抗原-载体蛋白偶联物用pH7.4的PBS配成0.5mg/ml的溶液，以0.01mol/LpH7.4PBS调零，用紫外分光光度计在波长200～800nm范围内扫描，得到载体蛋白、磺胺类药物半抗原、磺胺类药物半抗原-载体蛋白偶联物的吸收曲线。三者出现不同的吸收曲线，表明磺胺类药物半抗原与载体蛋白偶联成功。

2.磺胺类药物单克隆抗体的制备

(1)动物免疫

将步骤1得到的免疫原注入Balb/c小鼠体内，免疫剂量为150μg/只，使其产生抗血清。

(2)细胞融合和克隆化

取免疫Balb/c小鼠脾细胞，按8:1(数量配比)比例与SP2/0骨髓瘤细胞融合，筛选得到稳定分泌磺胺类药物单克隆抗体的磺胺类药物单克隆杂交瘤细胞株。

(3)细胞冻存和复苏

将杂交瘤细胞用冻存液制成1×10⁹个/ml的细胞悬液，在液氮中长期保存。复苏时取出冻存管，立即放入37℃水浴中速融，离心去除冻存液后，移入培养瓶内培养。

(4)单克隆抗体的制备与纯化

增量培养法：将杂交瘤细胞置于细胞培养基中，在37℃条件下进行培养，用辛酸-饱和硫酸铵法将得到的培养液进行纯化，得到单克隆抗体，-20℃保存。

所述细胞培养基为向RPMI1640培养基中添加小牛血清和碳酸氢钠，使小牛血清在细胞培养基中的终浓度为20％(质量百分含量)，使碳酸氢钠在细胞培养基中的终浓度为0.2％(质量百分含量)；所述细胞培养基的pH为7.4。

3.羊抗鼠抗抗体的制备

以羊作为免疫动物，以鼠源抗体为免疫原对无病原体羊进行免疫，得到羊抗鼠抗抗体。

4.磺胺类药物单克隆抗体-胶体金标记物的制备

(1)胶体金的制备

用双蒸去离子水将1％氯金酸(购于sigma公司，产品目录号T09041)稀释成0.01％(质量百分含量)，取100ml置于锥形瓶中，用恒温电磁搅拌器加热至沸腾，在持续高温、持续搅拌下加入2.5ml1％柠檬酸三钠(购于广州化学试剂厂，产品目录号BG11-AR-01KG)，继续匀速搅拌加热至溶液呈透亮的红色时停止，冷却至室温后用去离子水恢复到原体积，4℃保存。制备好的胶体金外观纯净、透亮、无沉淀和漂浮物。

(2)磺胺类药物单克隆抗体-胶体金标记物的制备

在磁力搅拌下，用0.2mol/L碳酸钾溶液调胶体金的pH值至7.0，按每毫升胶体金溶液中加入50～100μg的标准向胶体金溶液中加入上述磺胺类药物单克隆抗体，继续搅拌混匀10min，加入10％牛血清白蛋白(BSA)使其在胶体金溶液中的终浓度为1％(体积百分含量)，静置10min。12000rpm，4℃离心40min，弃上清液，沉淀用复溶缓冲液洗涤两次，用体积为初始胶体金体积1/10的复溶缓冲液将沉淀重悬，得到的磺胺类药物单克隆抗体-胶体金标记物溶液的浓度为50μg/ml，置4℃备用。

复溶缓冲液：含牛血清白蛋白0.1％～0.3％(体积百分含量)、吐温-800.05％～0.2％(质量百分含量)、pH7.2的0.02mol/L磷酸盐缓冲液。

5.将磺胺类药物单克隆抗体-胶体金标记物冻干到微孔试剂上

向微孔试剂微孔板中加入100μl磺胺类药物单克隆抗体-胶体金标记物，放入冷冻干燥机中，在冷阱温度为-70℃条件下，预冻4h后，再冻干14h，即可取出，得到冻干有磺胺类药物单克隆抗体-胶体金标记物的微孔试剂。磺胺类药物单克隆抗体-胶体金标记物冻干量为0.20～0.25μg/ml。

6.样品吸收垫的制备

将样品吸收垫置于含0.5％牛血清白蛋白(体积百分含量)、pH7.2、0.1mol/L磷酸盐缓冲液中浸泡2h，37℃烘2h备用。

7.反应膜的制备

包被过程：用磷酸缓冲液将磺胺类药物半抗原-卵清蛋白偶联物稀释到10mg/mL，用Biodot点膜仪将其包被于硝酸纤维素膜上的检测区(T)，包被量为1.0μg/cm²；用0.01mol/L、pH7.4的磷酸盐缓冲液将羊抗鼠IgG抗体稀释到200μg/ml，用Biodot点膜仪将其包被于硝酸纤维素膜上的质控区(C)，包被量为1.0μg/cm²。将包被好的反应膜置于37℃条件下干燥2h，备用。

(二)各部件的组装

1.试纸的组装

将所述样品吸收垫、反应膜、吸水垫、保护膜依次按顺序粘贴在所述底板上；样品吸收垫的末端与反应膜的始端相连，反应膜的末端与吸水垫的始端相连，样品吸收垫的始端与底板的始端对齐，吸水垫的末端与底板的末端对齐；在组装好的试纸上粘贴保护膜，保护膜上印有MAX标记线的一端粘贴在样品吸收垫上。

2.试剂盒的组装

将上述步骤1得到的试纸与微孔试剂组装成试剂盒，在2～8℃的环境中贮存，有效期12个月。

实施例3牛奶中磺胺类药物的检测

1.用试剂盒检测

从原包装中取出试剂桶(若低温存放需要预先平衡至室温)，打开后取出所需数目的微孔试剂和试纸条，并做好标记；吸取待检牛奶溶液，用微量移液器移取200μl于微孔中，缓慢抽吸且充分与微孔中试剂混匀；将标记好的试纸条***微孔中——印有“MAX”线端朝下，使之充分浸入溶液中；室温(20℃-25℃)孵育5min后，取出试纸条，判定结果。

2.检测结果分析

阳性：当质控区(C)显示出红色条带，而检测区(T)不显色时，判为阳性，如图4a所示；

阴性：当质控区(C)显示出红色条带，检测区(T)同时也显示出红色条带，判为阴性，如图4b所示；

无效：当质控区(C)不显示出红色条带，则无论检测区(T)显示出红色条带与否，该试纸判为无效，如图4c、4d所示。

实施例4试剂盒技术参数的确定

1.灵敏度试验

将磺胺嘧啶、磺胺间二甲氧嘧啶、磺胺对甲氧嘧啶、磺胺二甲基嘧啶、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺异噁唑、磺胺喹噁啉、磺胺甲噁唑、磺胺甲氧哒嗪、磺胺氯哒嗪、磺胺苯酰、磺胺多辛标准品(购自Sigma公司)稀释成如下不同浓度：磺胺嘧啶0、30、60、120μg/L；磺胺间二甲氧嘧啶、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺苯酰0、25、50、100μg/L；磺胺对甲氧嘧啶、磺胺氯哒嗪0、15、30、60μg/L；磺胺二甲基嘧啶0、10、20、40μg/L；磺胺异噁唑0、5、10、20μg/L；磺胺喹噁啉、磺胺甲噁唑0、40、80、160μg/L；磺胺甲氧哒嗪、磺胺多辛0、35、70、140μg/L；所用稀释液为pH7.2、0.2mol/L的磷酸盐缓冲液。

用试剂盒进行检测，结果为：当磺胺嘧啶标准品浓度为0、30μg/L，磺胺间二甲氧嘧啶、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺苯酰标准品浓度为0、25μg/L，磺胺对甲氧嘧啶、磺胺氯哒嗪标准品浓度为0、15μg/L，磺胺二甲基嘧啶标准品浓度为0、10μg/L，磺胺异噁唑标准品浓度为0、5μg/L，磺胺喹噁啉、磺胺甲噁唑标准品浓度为0、40μg/L，磺胺甲氧哒嗪、磺胺多辛标准品浓度为0、35μg/L时，试纸条上显示出肉眼可见的两条红色条线，呈阴性；当磺胺嘧啶标准品浓度为60、120μg/L，磺胺间二甲氧嘧啶、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺苯酰标准品浓度为50、100μg/L，磺胺对甲氧嘧啶、磺胺氯哒嗪标准品浓度为30、60μg/L，磺胺二甲基嘧啶标准品浓度为20、40μg/L，磺胺异噁唑标准品浓度为10、20μg/L，磺胺喹噁啉、磺胺甲噁唑标准品浓度为80、160μg/L，磺胺甲氧哒嗪、磺胺多辛标准品浓度为70、140μg/L时，试纸条质控区显色，但检测区不显色，呈阳性，表明本试剂盒对磺胺嘧啶、磺胺间二甲氧嘧啶、磺胺对甲氧嘧啶、磺胺二甲基嘧啶、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺异噁唑、磺胺喹噁啉、磺胺甲噁唑、磺胺甲氧哒嗪、磺胺氯哒嗪、磺胺苯酰、磺胺多辛的检测灵敏度分别为60μg/L、50μg/L、30μg/L、20μg/L、50μg/L、10μg/L、80μg/L、80μg/L、70μg/L、30μg/L、50μg/L、70μg/L。

2.假阳性率、假阴性率试验

取已知磺胺嘧啶含量大于60μg/L的牛奶阳性样本20份和磺胺嘧啶含量小于60μg/L的牛奶阴性样本20份，用3个批次生产的试剂盒分别进行检测，计算其阴阳性率。结果见表1、表2。

表1检测阳性样本结果

表2检测阴性样本结果

结果表明：用3个批次生产的试剂盒检测阳性牛奶样本时，结果全为阳性，可知阳性符合率为100％，假阴性率为0；检测20份阴性牛奶样本时，结果全为阴性，可知阴性符合率为100％，假阳性率为0。说明本发明的检测磺胺类药物试剂盒可以对牛奶样本中磺胺类药物残留进行快速检测。

3.特异性试验

特异性常用交叉反应率表示，是指抗体与结构不同的抗原决定簇发生结合的能力。本试剂盒对磺胺嘧啶、磺胺间二甲氧嘧啶、磺胺对甲氧嘧啶、磺胺二甲基嘧啶、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺异噁唑、磺胺喹噁啉、磺胺甲噁唑、磺胺甲氧哒嗪、磺胺氯哒嗪、磺胺苯酰、磺胺多辛的检测灵敏度分别为60μg/L、50μg/L、30μg/L、20μg/L、50μg/L、10μg/L、80μg/L、80μg/L、70μg/L、30μg/L、50μg/L、70μg/L，将牛奶中常检的其他药物(氟喹诺酮类、氯霉素类、氨基糖苷类、四环素类)用pH7.2、0.2mol/L的磷酸盐缓冲液进行稀释，用实施例1中所述的试剂盒进行检测。结果显示，用该试剂盒检测氟喹诺酮类、氯霉素类、氨基糖苷类、四环素类等药物时，试纸条质控区和检测区均显色，说明本试剂盒对这些药物无交叉反应。

Claims (7)

1.一种检测磺胺类药物试剂盒的制备方法，其特征在于包括步骤：

1)制备冻干有磺胺类药物特异性抗体-胶体金标记物的微孔试剂；

2)制备具有包被磺胺类药物半抗原-载体蛋白偶联物的检测区和包被抗抗体的质控区的反应膜；

3)将2)制备好的反应膜与样品吸收垫、吸水垫、保护膜、底板组装成试纸；

4)将1)和3)制备好的冻干有磺胺类药物特异性抗体-胶体金标记物的微孔试剂和试纸组装成试剂盒；

其中，所述磺胺类药物半抗原的合成方法为：a)于25ml单口瓶中加入6-氨基烟酸0.87g，乙醇20ml，12mol/L盐酸3.7ml，加热回流，反应8h，TLC监测，反应完毕，减压除去溶剂，溶于饱和NaHCO₃水溶液，乙酸乙酯萃取，无水Na₂SO₄干燥，乙酸乙酯:石油醚＝2:1(v:v)柱层析纯化；b)于25ml单口瓶中加入a)所得产物0.89g，三乙胺1.6ml，CH₂Cl₂10ml，搅拌溶解后，加入催化剂4-二甲氨基吡啶，缓慢滴入4-乙酰氨基苯磺酰氯的2ml二氯甲烷溶液，TLC监测，5h，反应完毕后处理，干燥，乙酸乙酯:石油醚＝1:10(v:v)柱层析纯化；c)于25ml单口瓶中加入b)所得产物1g，2mol/LNaOH水溶液120ml，加热回流，TLC监测，反应10h，完毕，调节pH4～5，有固体析出，即为磺胺类药物半抗原；所述磺胺类药物半抗原的分子结构式为：

2.根据权利要求1所述的检测磺胺类药物试剂盒的制备方法，其特征在于所述试纸由样品吸收垫、反应膜、吸水垫、保护膜依次粘贴在底板上组成，所述微孔试剂上具有微孔塞。

3.根据权利要求1或2任一项所述的检测磺胺类药物试剂盒的制备方法，其特征在于所述样品吸收垫上粘贴有保护膜，作为检测端，上面有MAX标记线。

4.根据权利要求3所述的检测磺胺类药物试剂盒的制备方法，其特征在于所述检测区位于近于有MAX标记的保护膜的一端，所述质控区位于远离有MAX标记的保护膜的一端。

5.根据权利要求1所述的检测磺胺类药物试剂盒的制备方法，其特征在于所述磺胺类药物半抗原-载体蛋白偶联物由磺胺类药物半抗原与载体蛋白偶联得到，所述载体蛋白为牛血清白蛋白、卵清蛋白、血蓝蛋白、甲状腺蛋白或人血清白蛋白。

6.根据权利要求1所述的检测磺胺类药物试剂盒的制备方法，其特征在于所述磺胺类药物特异性抗体-胶体金标记物中的磺胺类药物特异性抗体是以磺胺类药物半抗原-载体蛋白偶联物作为免疫原制备获得，所述磺胺类药物特异性抗体为磺胺类药物单克隆抗体或磺胺类药物多克隆抗体。

7.一种检测牛奶样本中磺胺类药物残留的方法，其包括步骤：

1)用权利要求1-6任一项所述的检测磺胺类药物试剂盒的制备方法制备的试剂盒进行检测；

2)分析检测结果。