CN205015348U - 一种磺胺类药物金纳米棒快速检测试纸 - Google Patents
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Abstract
一种磺胺类药物金纳米棒快速检测试纸，由底板、吸水板、硝酸纤维素膜、样品吸液板、MAX线组成、微孔试剂组成；硝酸纤维素膜叠放在底板的中部上面；吸水板叠放在底板的其中一端的端头部分上面，样品吸液板叠放在底板的另一端的端头部分上面；硝酸纤维素膜两端分别与吸水板和样品吸液板相交叠；硝酸纤维素膜依次设置试验线和控制线；试验线由磺胺-大分子蛋白偶联物包被；控制线由羊抗鼠多克隆抗体包被；微孔试剂为冻干后的金纳米棒标记磺胺单克隆抗体复合物。本实用新型在传统的胶体金免疫层析试纸基础上进行改进，将胶体金标记抗体复合物直接冻干于微孔中，使得检测过程中待测样本与金标抗体充分反应，提高检测灵敏度。
Description
技术领域
本实用新型涉及动物性食品快速检测领域，尤其是涉及一种磺胺类药物的胶体金纳米棒快速检测试纸。
背景技术
磺胺类药物(Sulfonamides，SAs)是一类具有对氨基苯磺酰胺结构的化学治疗药物，通过影响细胞核蛋白质的合成，抑制细菌的繁殖。磺胺类药物能抑制革兰氏阳性菌及一些阴性菌，可以治疗多种细菌感染，在兽医临床上广泛应用于治疗由敏感细菌感染的各种畜禽疾病。由于磺胺类药物在体内的作用和代谢时间较长，通过任何途径摄入的磺胺都有可能在人体内蓄积。蓄积浓度超过一定值时，就会对人体造成损害。短时间大剂量或长时间小剂量的刺激可分别引起急性或慢性中毒，影响机体的泌尿、免疫***，破坏肌肉、肾脏和甲状腺等组织，如诱发人的甲状腺癌等。另外，人体内长期存在磺胺会导致许多细菌对磺胺类药物产生抗药性。因此，国际食品法典委员会(CAC)和许多国家规定，动物性食品中磺胺类总量的最大残留限量(MRL)为0.1mg/kg。
现有的磺胺类检测方法多为色谱法，但是这些方法的灵敏度受样品的净化、浓缩等步骤的影响较大，再者这些方法需要复杂的仪器，过程繁琐，不适应现场大量样本的筛查。胶体金免疫层析法以其灵敏、快速、准确、操作简便得到越来越广泛的应用，但目前的胶体金检测产品仍存在灵敏度低的状况。
实用新型内容
针对现有技术存在的上述问题，本申请人提供了一种快速检测动物性食品中磺胺类药物的胶体金试纸。本实用新型在传统的胶体金免疫层析试纸基础上进行了改进，将胶体金标记抗体复合物直接冻干于微孔中，使得检测过程中待测样本与金标抗体充分反应，提高检测灵敏度。
本实用新型的技术方案如下：
一种磺胺类药物金纳米棒快速检测试纸，由底板(7)、吸水板(1)、硝酸纤维素膜(5)、样品吸液板(2)、MAX线(6)和微孔试剂(8)组成；
所述硝酸纤维素膜(5)叠放在底板(7)的中部上面；所述吸水板(1)叠放在底板(7)的其中一端的端头部分上面，所述样品吸液板(2)叠放在底板(7)的另一端的端头部分上面；
所述硝酸纤维素膜(5)两端分别与吸水板(1)和样品吸液板(2)相交叠，且所述硝酸纤维素膜(5)位于吸水板(1)和样品吸液板(2)的下方；
从所述硝酸纤维素膜(5)靠近样品吸液板(2)的那一端开始，依次设置试验线(3)和控制线(4)；所述试验线(3)由磺胺-大分子蛋白偶联物包被；所述控制线(4)由羊抗鼠多克隆抗体包被；
所述微孔试剂(8)为冻干后的金纳米棒标记磺胺单克隆抗体复合物。
底板(7)是PVC背板，样品吸液板(2)是玻璃纤维材料，微孔试剂(8)的微孔是聚苯乙烯材料。
所述硝酸纤维素膜(5)两端与吸水板(1)和样品吸液板(2)相交叠的部分长度分别为1～2毫米。
本试剂盒的使用方法如下：将水相待测样品加入金标微孔试剂(8)至微孔中固体充分溶解，样品中若含有磺胺类药物，样品中的磺胺类药物将与微孔试剂(8)中磺胺单克隆抗体-金纳米棒标记物发生特异性结合。***试纸条，由于毛细管作用样品将沿着试纸条吸水板端移动，当移动至固定有磺胺-大分子蛋白偶联物试验线时，由于磺胺单克隆抗体-金纳米棒标记物与样品中磺胺类药物优先结合成复合物而不能与磺胺-大分子蛋白偶联物结合，因此显色的金纳米棒不能滞留于试验线上，试验线处没有色带显示，即只有一条控制线为阳性。相反如果样品中没有磺胺类药物，磺胺单克隆抗体-金纳米棒标记物移动到试验线上，磺胺单克隆抗体就会与磺胺-大分子蛋白偶联物发生特异结合，使胶体金滞留于试验线上，即二条色带为阴性。
当移动至羊抗鼠多克隆抗体控制线时，无论样品中有无磺胺类药物，控制线都会显色。因此控制线无色带产生则代表操作有误，即检测时样品液面超过MAX线或试纸已经过期。
本实用新型有益的技术效果在于：
本试剂盒改变了以往采用胶体金标记待测物质抗体的方法，而是采用金纳米棒标记待测物质的单克隆抗体。本实用新型所提供的检测试剂盒具有灵敏度高、操作简便、方便携带、成本低、检测结果可靠等特点。
附图说明
图1为本实用新型中检测试纸部分的结构图；
图2为本实用新型微孔试剂部分的结构图；
图3为本实用新型的使用方法图；
图4为本实用新型的阴性结果图；
图5为本实用新型的阳性结果图；
图6为本实用新型的无效结果图；
图中：1、吸水板，2、样品吸液板，3、试验线，4、控制线，5、硝酸纤维素膜，6、MAX线，7、底板，8、微孔试剂。
具体实施方式
下面结合附图，对本实用新型进行具体描述。
一、本试剂盒的组成：
本实用新型所涉及的试剂盒是由检测试纸和微孔试剂8组成，如图1所示。其中检测试纸由底板7、吸水板1、硝酸纤维素膜5、样品吸液板2、MAX线6组成。底板7中部上方叠加硝酸纤维素膜5，硝酸纤维素膜上5有平行的一条试验线(T线)3和一条控制线(C线)4；底板7一端端头上方叠加吸水板1，另一端端头上方叠加样品吸液板2，硝酸纤维素膜5两端分别与吸水板1和样品吸液板2相互交叠连接(交叠连接部分1～2毫米)，且位于吸水板1和样品吸液板2的下方。其中试验线3由磺胺-大分子蛋白偶联物包被，控制线4靠近吸水板，由羊抗鼠多克隆抗体包被。微孔试剂8为将磺胺单克隆抗体-金纳米棒标记物直接冻干于微孔中制成，如图2所示。
二、磺胺类药物胶体金检测试剂盒的制备：
1、磺胺-大分子蛋白偶联物即磺胺类药物半抗原-载体蛋白偶联物的合成与鉴定
磺胺类药物是小分子物质，只有免疫反应性，没有免疫原性，不能诱发机体产生免疫应答，必须与大分子载体蛋白偶联后才具有免疫原性。
(1)磺胺类药物半抗原的合成
2-氨基-3-吡啶甲醛0.48g和三乙胺2ml溶入10ml二氯甲烷中，加入适量催化剂4-二甲氨基吡啶(DMAP)。室温下缓慢滴入4-乙酰氨基苯磺酰氯的2ml二氯甲烷溶液，滴加完毕后继续反应5h，蒸除溶剂，柱层析纯化后，加入2mol/LNaOH水溶液80ml，加热回流10h，乙酸乙酯萃取，柱层析纯化后得到磺胺类药物半抗原醛基磺胺吡啶。
(2)免疫原的制备——磺胺类药物半抗原与牛血清白蛋白偶联物合成
取磺胺类药物半抗原23mg用3ml二甲基甲酰胺(DMF)溶解完全，制成溶液Ⅰ；取牛血清白蛋白(BSA)100mg用7ml0.1mol/LPBS(pH7.0)溶解完全，制成溶液Ⅱ；将溶液Ⅰ加入溶液Ⅱ中，室温反应24h后，用0.01mol/LPBS透析三天，每天换液三次，得免疫原。
(3)包被原的制备——磺胺类药物半抗原与卵清蛋白偶联物合成
取磺胺类药物半抗原23mg用3mlDMF溶解完全，制成溶液Ⅰ；取卵清蛋白(OVA)100mg用7ml0.1mol/LPBS(pH7.0)溶解完全，制成溶液Ⅱ；将溶液Ⅰ加入溶液Ⅱ中，室温反应24h后，用0.01mol/LPBS透析三天，每天换液三次，得包被原。
(4)磺胺-大分子蛋白偶联物即磺胺类药物半抗原-载体蛋白偶联物的鉴定
将磺胺类药物半抗原、载体蛋白、磺胺类药物半抗原-载体蛋白偶联物用pH7.4的PBS配成0.5mg/ml的溶液，以0.01mol/LpH7.4PBS调零，用紫外分光光度计在波长200～800nm范围内扫描，得到磺胺类药物半抗原、载体蛋白、磺胺类药物半抗原-载体蛋白偶联物的吸收曲线。三者出现不同的吸收曲线，表明磺胺类药物半抗原与载体蛋白偶联成功。
2、磺胺单克隆抗体的制备
(1)动物免疫
将步骤1得到的免疫原注入Balb/c小鼠体内，免疫剂量为150μg/只，使其产生抗血清。
(2)细胞融合和克隆化
取免疫Balb/c小鼠脾细胞，按8:1(数量配比)比例与SP2/0骨髓瘤细胞融合，采用间接竞争ELISA测定细胞上清液，筛选阳性孔。利用有限稀释法对阳性孔进行克隆化，直到得到分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株。
(3)细胞冻存和复苏
将杂交瘤细胞用冻存液制成1×106个/ml的细胞悬液，在液氮中长期保存。复苏时取出冻存管，立即放入37℃水浴中速融，离心去除冻存液后，移入培养瓶内培养。
(4)单克隆抗体的制备与纯化
增量培养法：将杂交瘤细胞置于细胞培养基中，在37℃条件下进行培养，用辛酸-饱和硫酸铵法将得到的培养液进行纯化，得到单克隆抗体，-20℃保存。
所述细胞培养基为向RPMI1640培养基中添加小牛血清和碳酸氢钠，使小牛血清在细胞培养基中的质量分数为20％，碳酸氢钠在细胞培养基中的质量分数为0.2％；所述细胞培养基的pH为7.4。
3、羊抗鼠抗抗体的制备
以羊作为免疫动物，以鼠源抗体为免疫原对无病原体羊进行免疫，得到羊抗鼠抗抗体。
4、金纳米棒标记微孔试剂的制备
(1)制备金纳米棒
2.5ml2.5×104的HAuCl4溶液与2.5ml2.5×104的CTAB溶液混合，然后加入0.6ml的冰冻的0.01MNaBH4溶液并搅拌10min得到种子溶液。5ml的0.08M十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)水溶液与4ml的0.25ml的5×104的氯金酸水溶液混合，加入0～50微升的0.01M硝酸银(AgNO3)溶液，搅拌均匀然后加入20微升0.1M抗坏血酸，搅拌2min得到无色透明的生长溶液。1ml种子溶液加入到9ml的生长溶液中，搅拌1min，然后静置一周，得到深紫蓝色纳米金棒溶液。
把磺胺类药物单克隆抗体标记的金纳米棒液，吸附微孔上，冻干后得到微孔试剂8备用，如图2所示。
5、试验线和控制线的制备
试纸的试验线3和控制线4平行于硝酸纤维素膜5上，试验线3由磺胺-大分子蛋白偶联物包被，控制线4靠近吸水板由羊抗鼠多克隆抗体包被。
6、检测试纸的组合
检测试纸由底板7、吸水板1、硝酸纤维素膜5、样品吸液板2、MAX线6组成，底板中部为硝酸纤维素膜5，硝酸纤维素膜上有一条试验线3(T线)和一条控制线4(C线)，在底板7一端端头为吸水板1，另一端端头为样品吸液板2，硝酸纤维素膜5两端分别与吸水板1和样品吸液板4相互交叠连接(交叠连接部分1～2毫米)。
7、使用方法
如图3所示，用移液枪移取100μl待检液加入金标孔后反复吹打直至金标孔中蓝紫色固体充分溶解混匀，孵育2min；***试纸条，同时开始计时；5分钟读取结果，5分钟后结果无效。
三、结果判读
(1)阴性：T线色度比C线深或一样深，表示样品中待检物浓度低于检测限，或不含待检物，如图4所示。
(2)阳性：T线色度比C线浅，或T线不显色，则表示样品中待检浓度高于检测限；T线比C线越浅，表示样品中待检物浓度越高，如图5所示。
(3)无效：未出现质控线C线显色，表明操作过程不正确或检测卡已失效，即检测时样品液面超过MAX线或试纸已经过期。如图6所示。
四、测试结果
本测试盒可以检出的磺胺类药物的最低浓度如表1所示。本试剂盒检测环境的要求是：室温。
表1
| 药物名称 | 检出下限ppb(μg/kg) |
| 磺胺二甲基嘧啶 | 6 |
| 磺胺甲基嘧啶 | 4 |
| 磺胺嘧啶 | 3 |
| 磺胺间甲氧嘧啶 | 6 |
| 磺胺索嘧 | 4 |
| 磺胺二甲氧嘧啶 | 3 |
| 磺胺喹噁啉 | 8 |
| 磺胺甲噁唑 | 20 |
| 磺胺异噁唑 | 15 |
| 磺胺甲氧哒嗪 | 5 |
| 磺胺多辛 | 4 |
| 磺胺对甲氧嘧啶 | 5 |
| 磺胺氯吡嗪 | 4 |
| 磺胺苯酰 | 6 |
| 磺胺甲噻二唑 | 3 |
| 磺胺氯哒嗪 | 5 |
从表1的数据可以看到，本测试盒灵敏度远高于目前市场上常见的类似产品，大大拓展了磺胺类药物的检测手段。
Claims (3)
1.一种磺胺类药物金纳米棒快速检测试纸，其特征在于由底板(7)、吸水板(1)、硝酸纤维素膜(5)、样品吸液板(2)、MAX线(6)和微孔试剂(8)组成；
所述硝酸纤维素膜(5)叠放在底板(7)的中部上面；所述吸水板(1)叠放在底板(7)的其中一端的端头部分上面，所述样品吸液板(2)叠放在底板(7)的另一端的端头部分上面；
所述硝酸纤维素膜(5)两端分别与吸水板(1)和样品吸液板(2)相交叠，且所述硝酸纤维素膜(5)位于吸水板(1)和样品吸液板(2)的下方；
从所述硝酸纤维素膜(5)靠近样品吸液板(2)的那一端开始，依次设置试验线(3)和控制线(4)；所述试验线(3)由磺胺-大分子蛋白偶联物包被；所述控制线(4)由羊抗鼠多克隆抗体包被；
所述微孔试剂(8)为冻干后的金纳米棒标记磺胺单克隆抗体复合物。
2.根据权利要求1所述的磺胺类药物金纳米棒快速检测试纸，其特征在于所述底板(7)是PVC背板，样品吸液板(2)是玻璃纤维材料，微孔试剂(8)的微孔是聚苯乙烯材料。
3.根据权利要求1所述的磺胺类药物金纳米棒快速检测试纸，其特征在于所述硝酸纤维素膜(5)两端与吸水板(1)和样品吸液板(2)相交叠的部分长度分别为1～2毫米。
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