CN103376316B - 一种检测链霉素的试纸条及方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种检测链霉素和双氢链霉素的试纸条及方法。试纸条包括试纸和微孔试剂,所述微孔试剂中冻干有胶体金标记的链霉素特异性抗体,所述链霉素特异性抗体可为链霉素单克隆抗体或链霉素多克隆抗体;所述试纸由样品吸收垫、反应膜、吸水垫、保护膜、底板依次连接组成,所述反应膜上包括检测区和质控区,检测区包被有链霉素半抗原‑载体蛋白偶联物,质控区包被有抗抗体。用本发明试纸条检测链霉素药物的方法简单、快速、直观、准确、适用范围广、成本低、易推广使用。
Description
技术领域
本发明涉及一种检测链霉素和双氢链霉素的试纸条及方法,具体涉及一种用于检测样品中链霉素的胶体金试纸条。
背景技术
链霉素(Streptomycin)是一种重要的氨基糖苷类抗生素,被广泛应用于动物疾病的治疗,链霉素对鸡、羊、牛、猪的各类炎症,如鸡传染性鼻炎、猪急性支气管炎、猪白痢、奶牛子***等有很好的疗效,因此经常作为饲料添加剂使用。如果不正确使用,可造成链霉素残留超标。研究证明,链霉素可对肾脏和听神经造成不可逆转的损耗,长期使用还会使细菌产生耐药性。为了保障动物源性食品的安全,农业部第235号文件《动物性食品中兽药最高残留限量》中规定链霉素在牛奶中为200μg/L,在肌肉、脂肪、肝中为600μg/kg,在肾中为1000μg/kg。
目前链霉素残留的检测主要有仪器分析和免疫学方法。其中仪器分析法主要用高效液相色谱法(HPLC)、气相色谱法(GC),这些方法具有灵敏度高、结果准确、重复性好、假阳性少等优点,但仍存在一定缺点,如样品前处理过程复杂,仪器化程度高且价格昂贵,分析速度慢,不适合进行大规模现场检测等。胶体金免疫层析试纸条已广泛用于药物残留检测中,具有操作简便、快速、不需要任何设备等优点,目前已成为免疫学检测发展方向之一。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种检测链霉素和双氢链霉素的试纸条。
本发明所提供的试纸条包括试纸、微孔试剂,微孔试剂具有微孔塞,试纸包括反应膜、样品吸收垫、吸水垫、保护膜、底板;所述微孔试剂中冻干有链霉素特异性抗体-胶体金标记物;链霉素特异性抗体可为链霉素单克隆抗体或链霉素多克隆抗体;反应膜上包括检测区和质控区;当链霉素特异性抗体为链霉素单克隆抗体时,检测区包被链霉素半抗原-载体蛋白偶联物,质控区包被羊抗鼠抗抗体;当链霉素特异性抗体为链霉素多克隆抗体时,检测区包被链霉素半抗原-载体蛋白偶联物,质控区包被羊抗兔抗抗体。
所述链霉素半抗原-载体蛋白偶联物是由链霉素半抗原与载体蛋白偶联得到,所述载体蛋白可为牛血清白蛋白、卵清白蛋白、甲状腺蛋白、血蓝蛋白、人血清白蛋白。
所述链霉素特异性抗体-胶体金标记物中的链霉素特异性抗体是以链霉素半抗原-载体蛋白偶联物作为免疫原制备获得。
所述保护膜粘贴在样品吸收垫上,为检测端,上面有MAX标记线。
所述检测区位于近于有MAX标记的保护膜的一端,所述质控区位于远离有MAX标记的保护膜的一端。
所述底板可为PVC底板或其他硬质不吸水的材料;所述样品吸收垫可为吸滤纸或滤油纸;所述吸水垫为吸水纸;所述反应膜可为硝酸纤维素膜或醋酸纤维素膜;所述保护膜为PE材质保护膜。
本发明的另一个目的是提供一种制备上述试纸条的方法,其包括步骤:
1)制备冻干有链霉素特异性抗体-胶体金标记物的微孔试剂;
2)制备具有包被链霉素半抗原-载体蛋白偶联物的检测区和包被抗抗体的质控区的反应膜;
3)将2)制备好的反应膜与样品吸收垫、吸水垫、保护膜、底板组装成试纸;
4)将1)和3)制备好的冻干有链霉素特异性抗体-胶体金标记物的微孔试剂和试纸组装成试纸条。
具体地说,步骤包括:
1)将链霉素与乙二胺反应,制备链霉素半抗原;
2)将链霉素半抗原与载体蛋白偶联,制备链霉素半抗原-载体蛋白偶联物;
3)用链霉素半抗原-载体蛋白偶联物免疫小鼠,将小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞通过融合、筛选,得到分泌链霉素单克隆抗体的杂交瘤细胞株或用链霉素半抗原-载体蛋白免疫兔,得到链霉素多克隆抗体;
4)提取小鼠IgG或兔IgG免疫健康山羊,得到羊抗鼠IgG抗体或羊抗兔抗抗体;
5)用柠檬酸三钠与氯金酸反应制备胶体金;
6)将制备的链霉素特异性抗体加入到制备的胶体金中,得到链霉素特异性抗体-胶体金标记物;
7)将链霉素特异性抗体-胶体金标记物冻干在微孔试剂中后,将微孔试剂加上微孔塞;
8)将样品吸收垫用含牛血清白蛋白(牛血清白蛋白在缓冲液中的终浓度为0.5%体积百分含量)、pH为7.2、0.1mol/L磷酸盐缓冲液浸泡2h,37℃下烘干2h;
9)在底板上按顺序粘贴上样品吸收垫、反应膜、吸水垫和保护膜;
10)将制备好的微孔试剂、试纸组装成试纸条,2~8℃条件下保存12个月。
本发明的另一个目的是提供一种应用上述试纸条检测样品中链霉素残留的方法,它包括步骤:
(1)样品前处理方法;
(2)用试纸条进行检测;
(2)分析检测结果。
本发明中用试纸条检测样品时,将待检样品溶液滴加于微孔试剂中,混匀后(牛奶样品需室温孵育5min),将标有MAX标记线端向下,***孵育后的微孔试剂,待检样品液与微孔中的金标抗体结合后一起向反应膜扩散;若待检样品液中链霉素的含量高,则扩散过程中待检样品液中的链霉素可与金标抗体相结合,进而完全封闭金标抗体上链霉素的抗原结合点,阻止金标抗体与反应膜上链霉素半抗原-载体蛋白偶联物结合,检测区不显色,而抗抗体则可与金标抗体结合,质控区显色;若待检样品液中链霉素的含量低或无,则金标抗体上的抗原结合位点不能被封闭,进而金标抗体会与反应膜上链霉素半抗原-载体蛋白偶联结合,检测区显色,同时抗抗体也可与金标抗体结合,质控区显色。如果质控区不显色,则试纸失效。如图4所示。
阳性:当质控区(C)显示出条带,而检测区(T)不显色,判为阳性,用“+”表示。
阴性:当质控区(C)和检测区(T)均显示出条带,判为阴性,用“-”表示。
无效:当质控区(C)不显示条带,试纸失效。
本发明的试纸条具有灵敏度高、特异性强、成本低、操作简单、检测时间短、适合各种单位使用、储存简单、保质期长的优点。其中,采用高特异性的链霉素单克隆抗体,保证了检测结果的可靠性;将金标抗体冻干在微孔试剂中,在检测过程中,能够使金标抗体与待检样品液充分接触,充分反应,从而减少误差,增加整个体系的反应灵敏度。用本发明试纸条检测链霉素的方法,简便、快速、直观、准确、适用范围广、成本低、易推广使用。
附图说明
图1为试纸剖面结构示意图。
图2为试纸俯视图。
图3为微孔试剂图。
图4为试纸检测结果判定图。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明,均为常规方法。
实施例1检测链霉素的试纸条的构成
一、试纸(图1)
所述试纸是由底板、样品吸收垫、反应膜、吸水垫、保护膜组成;
所述样品吸收垫1、反应膜2、吸水垫3和保护膜7依次按顺序粘贴在底板6上,样品吸收垫的末端与反应膜相连,反应膜的末端与吸水垫相连,样品吸收垫的始端与底板的始端对齐,吸水垫的末端与底板的末端对齐;
所述试纸的样品吸收垫端粘贴有保护膜,保护膜7覆盖在样品吸收垫上的检测端,在检测端保护膜上印有MAX字样(图2);
所述反应膜上有检测区4和质控区5,均呈与所述试纸的长相垂直的条带状,检测区位于近于有MAX标记的保护膜的一端,质控区位于远离有MAX标记的保护膜的一端。检测区包被有链霉素半抗原-载体蛋白偶联物(链霉素半抗原-卵清白蛋白的偶联物),质控区包被有羊抗鼠抗抗体;
所述底板为PVC底板;所述样品吸收垫为吸滤纸;所述吸水垫为吸水纸;所述反应膜为硝酸纤维素膜;所述保护膜为PE材质保护膜。
二、微孔试剂(图3)
所述微孔试剂上冻干有链霉素单克隆抗体-胶体金标记物,冻干量0.20~0.25μg/mL;所述微孔试剂具有微孔塞9。
将上述试纸、微孔试剂组装成试纸条,在2~8℃环境中保存,有效期12个月。
实施例2实施例1中所述试纸条的制备方法
一、试纸条的制备
试纸条的制备方法主要包括以下步骤:
1)制备冻干有链霉素单克隆抗体-胶体金标记物的微孔试剂;
2)制备具有包被链霉素半抗原-载体蛋白偶联物的检测区和包被羊抗鼠抗抗体的质控区的反应膜;
3)将2)制备好的反应膜与样品吸收垫、吸水垫、保护膜、底板组装成试纸;
4)将1)和3)制备好的冻干有链霉素单克隆抗体-胶体金标记物的微孔试剂和试纸组装成试纸条。
下面分步详细叙述:
(一)各部件的制备
1.链霉素半抗原-载体蛋白偶联物的合成与鉴定
(1)链霉素半抗原的制备
0.58g链霉素与0.07g乙二胺在50ml甲醇中的混合液,在室温下反应5-10小时,蒸除溶剂,定量得到链霉素半抗原。
(2)免疫原的制备
取链霉素半抗原20mg用2ml水溶解得到溶液I;取3%的戊二醛0.5ml逐滴加入到溶液I中,室温搅拌反应24h,得到溶液II;取牛血清白蛋白(BSA)50mg用4ml水溶解得溶液III;将溶液II缓慢加入溶液III中,室温搅拌反应过夜;加入NaBH430mg还原;用0.02M的PBS透析三天,每天更换透析液三次,得链霉素免疫原。
(3)包被原的制备
取卵清白蛋白(OVA)50mg用4ml水溶解得到溶液I;取碳化二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)各50mg用2ml水溶解完全后加入溶液I中,室温搅拌反应30min,得到溶液II;取链霉素半抗原25mg用3ml水溶解得到溶液III;将溶液II缓慢加入到溶液III中,室温搅拌反应24h,得链霉素包被原。
(4)链霉素半抗原-载体蛋白偶联物的鉴定
将载体蛋白、链霉素半抗原、链霉素半抗原-载体蛋白偶联物用pH7.4的PBS配成0.5mg/mL的溶液,以0.01mol/LpH7.4PBS调零,用紫外分光光度计在波长200~800nm范围内扫描,得到载体蛋白、链霉素半抗原、链霉素半抗原-载体蛋白偶联物的吸收曲线。三者出现不同的吸收曲线,表明链霉素半抗原与载体蛋白偶联成功。
2.链霉素单克隆抗体的制备
(1)动物免疫
将步骤1得到的免疫原注入Balb/c小鼠体内,免疫剂量为150μg/只,使其产生抗血清。
(2)细胞融合和克隆化
取免疫Balb/c小鼠脾细胞,按8∶1(数量配比)比例与SP2/0骨髓瘤细胞融合,筛选得到稳定分泌链霉素单克隆抗体的链霉素单克隆杂交瘤细胞株。
(3)细胞冻存和复苏
将杂交瘤细胞用冻存液制成5×106个/ml的细胞悬液,在液氮中长期保存。复苏时取出冻存管,立即放入37℃水浴中速融,离心去除冻存液后,移入培养瓶内培养。
(4)单克隆抗体的制备与纯化
增量培养法:将杂交瘤细胞置于细胞培养基中,在37℃条件下进行培养,用辛酸-饱和硫酸铵法将得到的培养液进行纯化,得到单克隆抗体,-20℃保存。
所述细胞培养基为向RPMI1640培养基中添加小牛血清和碳酸氢钠,使小牛血清在细胞培养基中的终浓度为20%(质量百分含量),使碳酸氢钠在细胞培养基中的终浓度为0.2%(质量百分含量);所述细胞培养基的pH为7.4。
3.羊抗鼠抗抗体的制备
以羊作为免疫动物,以鼠源抗体为免疫原对无病原体羊进行免疫,得到羊抗鼠抗抗体。
4.链霉素单克隆抗体-胶体金标记物的制备
(1)胶体金的制备
用双蒸去离子水将1%氯金酸稀释成0.01%(质量百分含量),取100ml置于锥形瓶中,用恒温电磁搅拌器加热至沸腾,在持续高温、持续搅拌下加入2.5ml1%柠檬酸三钠,继续匀速搅拌加热至溶液呈透亮的红色时停止,冷却至室温后用去离子水恢复到原体积,4℃保存。制备好的胶体金外观纯净、透亮、无沉淀和漂浮物。
(2)链霉素单克隆抗体-胶体金标记物的制备
在磁力搅拌下,用0.2mol/L碳酸钾调胶体金的pH值至7.2,按每毫升胶体金溶液中加入10~50μg抗体的标准向胶体金溶液中加入上述链霉素单克隆抗体,继续搅拌混匀10min,加入10%牛血清白蛋白(BSA)使其在胶体金溶液中的终浓度为1%(体积百分含量),静置10min。12000rpm,4℃离心40min,弃上清液,沉淀用复溶缓冲液洗涤两次,用体积为初始胶体金体积1/10的复溶缓冲液将沉淀重悬,置4℃备用。
复溶缓冲液:含牛血清白蛋白(BSA)0.2%~0.5%(体积百分含量)、吐温-800.05%~0.2%(质量百分含量)、pH7.2的0.02mol/L磷酸盐缓冲液。
5.将链霉素单克隆抗体-胶体金标记物冻干到微孔试剂上
向微孔试剂微孔板中加入100μl链霉素单克隆抗体-胶体金标记物,放入冷冻干燥机中,在冷阱温度为-50℃条件下,预冻3h后,再真空干燥15h,即可取出,得到冻干有链霉素单克隆抗体-胶体金标记物的微孔试剂,密封保存。链霉素单克隆抗体-胶体金标记物冻干量0.20~0.25μg/mL。
6.样品吸收垫的制备
将样品吸收垫置于含牛血清白蛋白(牛血清白蛋白在缓冲液中的终浓度为0.5%(体积百分含量))、pH7.2、0.1mol/L磷酸盐缓冲液中浸泡2h,37℃烘2h备用。
7.反应膜的制备
包被过程:用磷酸缓冲液将链霉素半抗原-卵清白蛋白偶联物稀释到10mg/mL,用Isoflow点膜仪将其包被于硝酸纤维素膜上的检测区(T),包被量为1.0μg/cm2;用0.01mol/L、pH7.4的磷酸盐缓冲液将羊抗鼠IgG抗体稀释到200μg/mL,用Isoflow点膜仪将其包被于硝酸纤维素膜上的质控区(C),包被量为1.0μg/cm2。将包被好的反应膜置于37℃条件下干燥2h,备用。
(二)各部件的组装
1.试纸的组装
将所述样品吸收垫、反应膜、吸水垫、保护膜依次按顺序粘贴在所述底板上;样品吸收垫的末端与反应膜的始端相连,反应膜的末端与吸水垫的始端相连,样品吸收垫的始端与底板的始端对齐,吸水垫的末端与底板的末端对齐;在组装好的试纸样品吸收垫上粘贴保护膜,保护膜上印有MAX标记线。
2.试纸条的组装
将上述步骤1得到的试纸与微孔试剂组装成试纸条,在2~8℃的环境中贮存,有效期12个月。
实施例3样品中链霉素的检测
1.样品前处理
检测蜂蜜样品时需要先对蜂蜜样品进行前处理:
准确称取0.5g蜂蜜到4ml离心管中,加入1.5ml0.2mol/L磷酸盐缓冲液,涡动1min,混匀待检。(注意:1.对无结晶的蜂蜜需搅拌均匀后进行称量;2.如有结晶蜂蜜,置于不高于60℃水浴中温热,等蜂蜜全部融化后搅拌均匀,冷却至室温后进行称量。)
2.用试纸条检测样品
检测牛奶样品
从原包装中取出所需数目的微孔试剂和试纸,并做好标记;吸取待检牛奶样品,用微量移液器移取200μl于微孔中,缓慢抽吸且充分与微孔中试剂混匀,室温(20℃-25℃)孵育5min;将印有“MAX”线端朝下***微孔中,使之充分浸入溶液中;室温(20℃-25℃)孵育5min后,取出试纸,判定结果。
检测蜂蜜样品
从原包装中取出所需数目的微孔试剂和试纸,并做好标记;吸取待检蜂蜜提取液,用微量移液器移取100μl于微孔中,缓慢抽吸且充分与微孔中试剂混匀;将印有“MAX”线端朝下***微孔中,使之充分浸入溶液中;室温(20C-25℃)孵育5~10min后,取出试纸,根据示意图判定结果。
3.检测结果分析
阳性:当质控区(C)显示出条带,检测区(T)不显色,判为阳性,用“+”表示,如图4(a);阴性:当质控区(C)和检测区(T)均显示出条带,判为阴性,用“-”表示,如图4(b);无效:当质控区(C)不显示条带,试纸失效,如图4(c)和(d)所示。
实施例4试纸条技术参数的确定
1.检测限试验
向空白蜂蜜样品中分别添加链霉素、双氢链霉素标准品(购自Sigma公司)至终浓度为0、10、20、40μg/kg,用试纸条进行蜂蜜样品检测,结果为:当链霉素、双氢链霉素标准品浓度为0、10μg/kg时,试纸上显示出肉眼可见的两条红色线条,呈阴性;当链霉素、双氢链霉素标准品浓度为20、40μg/kg时,试纸质控区显色,但检测区不显色,呈阳性,表明本试纸条对蜂蜜样品链霉素、双氢链霉素检测限20μg/kg。
向空白牛奶样品中分别添加链霉素、双氢链霉素标准品至终浓度为0、40、80、160μg/L,用试纸条进行牛奶样品检测,结果为:当链霉素、双氢链霉素标准品浓度为0、40μg/L时,试纸显示出肉眼可见的两条红色线条,呈阴性;当链霉素、双氢链霉素标准品浓度为80、160μg/L时,试纸质控区显色,但检测区不显色,呈阳性,表明本试纸条对牛奶样品链霉素、双氢链霉素检测限80μg/L。
2.假阳性率、假阴性率试验
取已知链霉素含量大于20μg/kg的蜂蜜阳性样品20份和链霉素含量小于20μg/kg的蜂蜜阴性样品20份,以及已知链霉素含量大于80μg/L的牛奶阳性样品和20份链霉素含量小于80μg/L的牛奶阴性样品20份,用3个批次生产的试纸条分别进行检测,结果见表1、表2。
表1检测阳性样品结果
结果表明:用3个批次生产的试纸条检测阳性蜂蜜样品时,结果全为阳性,可知阳性样本符合率为100%,假阴性率为0。检测20份阴性蜂蜜样品时,结果全为阴性,可知阴性符合率为100%,假阳性率为0。
用3个批次生产的试纸条检测阳性牛奶样品时,结果全为阳性,可知阳性样本符合率为100%,假阴性率为0。检测20份阴性牛奶样品时,结果全为阴性,可知阴性符合率为100%,假阳性率为0。本发明的检测链霉素试纸条可以对蜂蜜和牛奶样品中链霉素残留进行快速检测。
3.特异性试验
特异性常用交叉反应率表示,是指抗体与结构不同的抗原决定簇发生结合的能力。将样品中常检的其他药物(三聚氰胺、磺胺类、氟喹诺酮类、氯霉素、大环内酯类、四环素类药物)用pH7.2、0.2mol/L的磷酸盐缓冲液进行稀释,用实施例1中所述的试纸条进行检测。结果显示,用该试纸条检测500μg/L三聚氰胺、磺胺类、氟喹诺酮类、氯霉素、大环内酯类、四环素类药物时,试纸条质控区和检测区均显色,说明本试纸条对这些药物无交叉反应。
Claims (6)
1.一种检测链霉素和双氢链霉素的试纸条,其特征在于包括微孔试剂和试纸,所述试纸包括反应膜、样品吸收垫、吸水垫、保护膜、底板,所述反应膜上有检测区和质控区,检测区的包被原为链霉素半抗原-载体蛋白偶联物,质控区包被有抗抗体,所述微孔试剂中冻干有链霉素特异性抗体-胶体金标记物,所述链霉素半抗原是0.58g链霉素与0.07g乙二胺在50ml甲醇中形成的混合液,在室温下反应5-10小时,蒸除溶剂,定量得到的链霉素半抗原;所述包被原是取卵清白蛋白50mg用4ml水溶解得到溶液I,取碳化二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺各50mg用2ml水溶解完全后加入溶液I中,室温搅拌反应30min,得到溶液II,取链霉素半抗原25mg用3ml水溶解得到溶液III,将溶液II缓慢加入到溶液III中,室温搅拌反应24h,得链霉素包被原;所述链霉素特异性抗体-胶体金标记物中的链霉素特异性抗体是以链霉素半抗原-载体蛋白偶联物作为免疫原制备获得,所述链霉素特异性抗体为链霉素单克隆抗体或链霉素多克隆抗体;所述免疫原是取所述定量得到的链霉素半抗原20mg用2ml水溶解得到溶液I,取3%的戊二醛0.5ml逐滴加入到溶液I中,室温搅拌反应24h,得到溶液II,取牛血清白蛋白(BSA)50mg用4ml水溶解得溶液III,将溶液II缓慢加入溶液III中,室温搅拌反应过夜,加入NaBH430mg还原,用0.02M的PBS透析三天,每天更换透析液三次,得到链霉素免疫原。
2.如权利要求1所述的试纸条,其特征在于所述试纸由样品吸收垫、反应膜、吸水垫、保护膜依次粘贴在底板上组成,所述微孔试剂上具有微孔塞。
3.如权利要求1所述的试纸条,其特征在于所述保护膜粘贴在样品吸收垫上,为检测端,上面有MAX标记线。
4.如权利要求1所述的试纸条,其特征在于所述保护膜具有MAX标记,检测区位于靠近有MAX标记的保护膜的一端,所述质控区位于远离有MAX标记的保护膜的一端。
5.一种制备权利要求1-4任一项所述试纸条的方法,其包括步骤:
1)制备冻干有链霉素特异性抗体-胶体金标记物的微孔试剂,将微孔试剂加上微孔塞;
2)制备具有包被链霉素半抗原-载体蛋白偶联物的检测区和包被抗抗体的质控区的反应膜;
3)将2)制备好的反应膜与样品吸收垫、吸水垫、保护膜、底板组装成试纸;
4)将1)和3)制备好的冻干有链霉素特异性抗体-胶体金标记物的微孔试剂和试纸组装成试纸条。
6.一种检测样品中链霉素残留的方法,其包括步骤:
1)用权利要求1-5任一项所述的试纸条进行检测;
2)分析检测结果。
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