CN103267818B

CN103267818B - 知母药材hplc-elsd指纹图谱的建立方法

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Publication number: CN103267818B
Application number: CN201310177411.3A
Authority: CN
Inventors: 钟可; 王文全; 靳凤云
Original assignee: 钟可
Current assignee: Guiyang College of Traditional Chinese Medicine
Priority date: 2013-05-14
Filing date: 2013-05-14
Publication date: 2014-10-22
Anticipated expiration: 2033-05-14
Also published as: CN103267818A

Abstract

本发明涉及知母药材HPLC-ELSD指纹图谱的建立方法及其标准指纹图谱，所述建立方法包含色谱条件、供试品溶液的制备、对照品溶液的制备，其中色谱条件为：Thermo C₈色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)；流动相：乙腈-0.2%醋酸水溶液梯度洗脱；柱温:20℃；流速:1mL·min^-1；ELSD检测器雾化器流速：2.6L·min^-1；漂移管温度：100℃；进样量：20ul。本发明的优点是方法稳定、重现性好、精密度高，能同时反映知母药材中主要的化学成分皂苷类和双苯吡酮类成分的特征，并能从色谱的整体特征上把握知母药材的质量，可将其作为知母药材质量控制的方法之一。

Description

知母药材HPLC-ELSD指纹图谱的建立方法

技术领域

本发明涉及知母药材指纹图谱的建立方法及其标准指纹图谱，具体涉及知母药材HPLC-ELSD指纹图谱的建立方法及其标准指纹图谱。

背景技术

知母为常用的中药材，来源于百合科植物知母（Anemarrhena asphodeloides Bunge.）的干燥根茎，属于清热药，具有清热泻火，润肠滑燥、止渴除烦等功效。在我国主要分布于河北、山西、内蒙古、辽宁、黑龙江、吉林等省区，在河南、山东和安徽省也有分布。

数10年来，国内外学者已对知母的化学成分进行了广泛深入的研究，发现知母药材中含有甾体皂苷、双苯吡酮类、木脂素类、多糖类、有机酸类及微量元素类成分，其主要成分为甾体皂苷类和双苯吡酮类成分。其中双苯吡酮类中有芒果苷（Mangiferin）和新芒果苷（Neomangiferin），芒果苷也称知母宁，是知母药材中主要的抗炎、抗病毒和抗氧化成分。芒果苷和新芒果苷还有降血糖和改善Ⅱ型糖尿病症状的作用。

现代药理研究发现知母药材中的甾体皂苷都有着重要的药用价值，其中知母皂苷BⅡ（timosaponin BⅡ）和知母皂苷AⅢ（timosaponin AⅢ）具有抗血栓、抗动脉粥样硬化、改善记忆功能障碍和治疗老年性痴呆等作用，在抗癌方面也表现出显著的活性。知母皂苷C（timosaponin C）是知母中含量较高的呋甾皂苷之一，其水解脱糖后可转化生成菝葜皂苷元，具有改善老年痴呆症状和抗氧化、抗辐射的作用。

2010版《中国药典》对知母药材的质量控制仅限于芒果苷和知母皂苷BⅡ的含量测定，不能较全面地反映知母药材的内在质量和反映中医用药所体现的整体疗效，而且2010版《中国药典》中分别采用两种不同的检测器来测定这两种化学成分，测定方法较繁琐。

因此，建立能反映甾体皂苷类和双苯吡酮类这两类成分的知母药材指纹图谱，尤其是可体现芒果苷（Mangiferin）、新芒果苷（Neomangiferin）、知母皂苷BⅡ（timosaponin BⅡ）、知母皂苷AⅢ（timosaponin AⅢ）、知母皂苷C（timosaponin C）等五种成分，以控制和综合分析知母药材的质量已经迫在眉睫。

利用色谱指纹图谱获取全面的中药化学成分特征信息已广泛地应用于中药的质量控制之中，中药色谱指纹图谱是对中药整体性的化学特征的表达和反映。目前，美国食品药品管理局（FDA）、英国草药典、德国药用植物学会、印度草药典、加拿大药用植物学会均接受和收载指纹图谱的质量控制方法，目前指纹图谱已成为国际公认的控制中成药、天然药物质量的最有效的方法。

而关于知母药材的指纹图谱的分析方法，目前的研究报道如下：

曾志等（曾志,张艳萍,杨冬晖等.高效液相色谱指纹图谱在中药知母上的应用.中成药.2005,27(10):1120-1124.）公开了7个产地的知母提取物的高效液相色谱方法，其色谱条件为：色谱柱为HypersilODS C₁₈柱（5μm,150mm×4.6mm），流动相为水和甲醇，检测波长270nm,流速为1.0mL·min^-1。确定5个共有峰为10个样品所共有。该图谱的5个共有峰没有用对照品进行指认和鉴定，各峰的分离还有待改进。

蔡玉荣等（蔡玉荣,王世勇,刘乡乡等.知母HPLC指纹图谱研究及相似度评价.湖南中医杂志.2005,21(4)：79-80.）公开了HPLC法知母水提液正丁醇萃取物的指纹图谱,不同产地的14个样品用相似度软件评价其相似性。其色谱条件为：Agilent1100Series系列高效液相色谱仪;色谱柱为Hydrosphere C₁₈柱（5μm,250mm×4.6mm），流动相为乙腈和0.01%磷酸梯度洗脱，流速1ml·min^-1;检测波长236nm;柱温:30℃。其指纹图谱主要有5个特征峰，没有对特征峰进行指认。

以上方法选用HPLC紫外检测器，没有反映知母药材中皂苷类成分的信息，究其原因是：所含的皂苷类成分为甾体皂苷类，没有紫外吸收，用传统的紫外检测器对其进行定性定量分析不适用，而ELSD检测器可以弥补这方面的不足。

张志斐等（张志斐,肖蓉,袁志芳等.河北道地药材知母HPLC-ELSD指纹图谱研究.药物分析杂志.2006,26(11):1569-1573.）公开了河北19个不同来源的知母样品的HPLC-ELSD指纹图谱研究方法，其色谱条件为：Diamonsil^TM C₁₈(200mm×4.6mm，5μm)色谱柱，乙腈（A）-水（B）为流动相，梯度洗脱（0-20min，23%A；25min，31%A；35min，33%A；55min，48%A；60min，48%A；65min，23%A）；ELSD检测器，流速1.0mL/min，柱温30℃。建立了知母HPLC-ELSD指纹图谱共有模式，确定6个共有峰，该指纹图谱只指认了知母皂苷AⅢ成分，没有反映双苯吡酮类成分的信息。

韩丽萍等（韩丽萍,陈行愉,徐爱娟.知母甾体总皂苷的HPLC-ELSD指纹图谱研究,时珍国医国药.2012,23(1):21-23）公开了知母甾体总皂苷的HPLC-ELSD指纹图谱研究，其色谱条件为，Agilent HC-C₁₈(250mm×4.6mm，5μm)色谱柱，甲醇（A）-水（B）为流动相，梯度洗脱；ELSD检测器，流速1.0ml·min^-1，漂移管温度40℃。该图谱标定了15个共有峰，但是确定的有些共有峰的峰高和峰面积太小，与基线几乎重合，分离度还有待改进，并且该指纹图谱只指认了知母皂苷BⅡ成分。

可维等（可维，马春辉，张如隽等，不同来源知母药材HPLC-ELSD指纹图谱的研究，《药物分析杂志》，2008，28（1）：100-103）公开了知母药材的HPLC-ELSD的指纹图谱研究，其中其色谱条件为：Diamonsil^TM C₁₈(200mm×4.6mm，5μm)色谱柱，乙腈（A）-0.5%甲酸水溶液（B）为流动相，梯度洗脱（0-10min，5%A→20%A；10-15min，20%A→23%A，15-25min，23%A，25-50min，23%A→100%A；50-60min100%A），流速0.8mL/min；柱温25℃。ELSD检测器：漂移管温度110℃，雾化气体流速2.6L/min。最终的指纹图谱结果指认了知母皂苷BⅡ、知母皂苷BⅢ、anemarrhenasaponin Ⅰa、schidigera-saponinF2和知母皂苷AⅢ5个色谱峰，确定了8个共有峰，其指纹图谱体现了皂苷类成分的特征，没有反映出知母中另一重要化学成分双苯吡酮类成分的信息。

综上所述的知母指纹图谱的色谱峰分离度还有待改进，样品内各组分应尽可能得到分离。此外,对色谱峰尽可能多地进行鉴定或指认以及在色谱图上明确反映出已知的药效成分，才能作为评价色谱结果的重要考察因素。

发明内容

本发明的目的是解决目前知母药材质量评价和成分分析中不能较全面综合反映和控制知母药材整体质量的问题，从而提供一种知母药材的HPLC-ELSD指纹图谱分析方法，包含色谱条件、供试品溶液的制备、对照品溶液的制备。

本发明提供的知母药材HPLC-ELSD指纹图谱的建立方法，该方法包括供试品溶液的制备、对照品溶液的制备、色谱条件和检测。

优选地，所述色谱条件为：色谱条件：Thermo C₈色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)；流动相：乙腈（A）-0.2%醋酸水(B)溶液梯度洗脱；柱温:20℃；流速:1mL·min^-1；ELSD检测器，雾化器气体（纯空气）流速：2.6L·min^-1；漂移管温度：100℃；进样量：20ul。

所述流动相按照梯度洗脱梯度为：

时间（分钟）	流动相A(%)	流动相B(%)
			0	5	95
5	7	93
			5.01	15	85
15	15	85

15.01	22	78
			36	22	78
36.01	35	65
			43	35	65
43.01	40	60
			51	50	50
51.01	100	0
			60	100	0

具体的，所述建立方法包括以下步骤：

1）供试品溶液的制备：取过四号筛的知母药材粉末约1.0克，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入浓度为50%的乙醇25ml，称定重量；以功率为400W，频率为40kHz超声30min；放冷，再称定重量，用50%乙醇补足减失的重量，摇匀；滤过，取续滤液，0.45um针头微孔过滤器过滤，作为供试品溶液；

2）对照品溶液的制备：分别称取知母皂苷BⅡ、知母皂苷AⅢ、芒果苷、新芒果苷、知母皂苷C适量，加50%乙醇配制成每ml溶液中分别含有知母皂苷BⅡ、知母皂苷AⅢ、芒果苷、新芒果苷、知母皂苷C为0.267mg、0.115mg、0.098mg、0.195mg、0.142mg的混合对照品溶液，摇匀，备用；

3）色谱条件：Thermo C₈色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)；流动相：乙腈（A）-0.2%醋酸水(B)溶液梯度洗脱；柱温:20℃；流速:1mL·min^-1；ELSD检测器，雾化器气体（纯空气）流速：2.6L·min^-1；漂移管温度：100℃；进样量：20ul；

上述方法中：所述流动相按照梯度洗脱梯度为：

时间（分钟）	流动相A(%)	流动相B(%)
			0	5	95
5	7	93
			5.01	15	85
15	15	85
			15.01	22	78
36	22	78
			36.01	35	65
43	35	65

43.01	40	60
			51	50	50
51.01	100	0
			60	100	0

本发明还提供了上述方法建立的知母药材HPLC-ELSD指纹图谱。

所述指纹图谱中有12个共有峰，保留时间分别为：1号峰（4.248min），2号峰（9.82min），3号峰（11.446min），4号峰（19.416min），5号峰（22.212min），6号峰（25.069min），7号峰（32.463min），8号峰（33.855min），9号峰（41.884min），10号峰（47.597min），11号峰（50.726min），12号峰（54.153min）。其中2为新芒果苷；3为芒果苷；7为知母皂苷BⅡ；8为知母皂苷C；12为知母皂苷AⅢ。

所述的12个共有峰中，以知母皂苷BⅡ为内参比峰，峰面积占总峰面积5%的峰相对保留时间的标准偏差RSD小于3%，相对峰面积标准偏差RSD均小于3%。

与现有技术相比，本发明提供的知母药材HPLC-ELSD指纹图谱的建立方法及其标准指纹图谱具有以下优点：

（1）本发明筛选出合适的知母药材化学成分提取方法和HPLC-ELSD色谱条件，对ELSD检测器的各项参数进行了选择，最终确定了最优的参数条件，采用梯度洗脱方法在60min内获得了较好分离效果的特征图谱，确定12个主要特征峰作为共有峰，建立了能够使多数化学成分色谱分离的知母药材HPLC-ELSD指纹图谱方法。

（2）在分析过程中，首次对芒果苷、新芒果苷、知母皂苷BⅡ、知母皂苷AⅢ、知母皂苷C同时进行了指认，克服了在以往的研究报道中知母HPLC指纹图谱中无法反映皂苷类成分的信息的不足以及知母药材HPLC-ELSD指纹图谱中双苯吡酮类成分没有分离和鉴定的缺陷。

（3）该指纹图谱特征性较强，主要共有峰达到了较好的基线分离。

（4）供试品的制备简便，方便易行，色谱条件容易实现。

（5）经方法学考察，建立的知母药材HPLC-ELSD指纹图谱方法符合指纹图谱的要求，该方法的稳定性和重现性都比较好。

（6）建立的知母药材HPLC-ELSD指纹图谱更具专属性和代表性，该指纹图谱共有模式图基本能够综合反映知母药材药材整体性的化学成分特征。

（7）适用于知母药材真伪、产地和品质的鉴别和质量控制。

附图说明

图1：知母药材HPLC-ELSD指纹图谱，纵坐标为响应值（单位为毫伏（简写为mV）），横坐标为时间（单位为分钟（简写为min）），其中：2为新芒果苷；3为芒果苷；7为知母皂苷BⅡ；8为知母皂苷C；12为知母皂苷AⅢ。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1：知母药材HPLC-ELSD指纹图谱分析方法的建立

1、仪器、试药与实验材料

安捷伦1100液相色谱仪，配有二元高压溶剂***、自动进样恒温箱样品管理器、柱温箱、ALLTECH2000ES蒸发光散射检测器；台式系列数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。十万分之一电子分析天平（德国Sartorius CP225D）。

知母皂苷BⅡ标准对照品（上海融禾生物科技公司提供，批号：120926含量>98%），知母皂苷AⅢ标准对照品（上海融禾生物科技公司提供，批号：121022含量>98%），芒果苷标准对照品（上海融禾生物科技公司提供，批号：110910含量>98%），新芒果苷标准对照品（上海融禾生物科技公司提供，批号：110920含量>98%）；知母皂苷C为北京中医药大学中药学院中药资源系实验室分离制备，经红外、质谱及核磁鉴定和纯度检查，其含量>98%。乙腈（色谱纯，美国fisher公司），其它试剂均为分析醇，娃哈哈纯净水。

知母药材经中国医学科学院北京协和医学院药用植物研究所王文全教授鉴定为百合科植物知母Anemarrhena asphodeloide Bunge.的根茎。

2、供试品溶液的制备

取知母药材粉末（过四号筛）约1.0克，精密称定。置具塞锥形瓶中，精密加入50％乙醇25ml，称定重量。超声30min（功率400W，频率40kHz）。放冷，再称定重量，用50％乙醇补足减失的重量，摇匀。滤过，取续滤液，0.45um针头微孔过滤器过滤，作为供试品溶液。

3、对照品溶液的制备

分别称取知母皂苷BⅡ、知母皂苷AⅢ、芒果苷、新芒果苷适量，加50%乙醇配制成混合对照品溶液，摇匀，备用。

4、色谱条件

Thermo C₈色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)；流动相：乙腈（A）-0.2%醋酸水(B)溶液梯度洗脱，见表1；柱温：20℃；流速：1mL·min^-1；ELSD检测器雾化器（空气）流速：2.6L·min^-1；漂移管温度:100℃；进样量：20ul。

表1：流动相洗脱梯度

时间（分钟）	流动相A(%)	流动相B(%)
			0	5	95
5	7	93
			5.01	15	85
15	15	85
			15.01	22	78
36	22	78
			36.01	35	65
43	35	65
			43.01	40	60
51	50	50

51.01	100	0
			60	100	0

5、精密度试验

取同一份供试品（河北易县），按照供试品的制备方法和色谱条件连续进样6次，按照2供试品的制备方法和3色谱条件进行检测，以知母皂苷BⅡ峰为内参比峰，计算占总峰面积5%以上峰的相对保留时间和峰面积，结果显示相对保留时间和峰面积的RSD均小于3%，符合指纹图谱技术要求。通过“中药色谱指纹图谱相似度评价***”2010版软件计算6次之间的相似度，色谱指纹图谱与其所得对照指纹图谱的相似度为0.999-1.000。

结果表明：仪器精密度良好。

6、稳定性试验

取同一份供试品（河北易县）溶液，分别在0h，2h，4h，8h，12h，24h共6个时间点，按照供试品的制备方法和色谱条件进行检测，以知母皂苷BⅡ峰为内参比峰，计算占总峰面积5%以上峰的相对保留时间和峰面积，结果表明，占总峰面积5%以上峰的相对峰面积和保留时间的RSD均小于3%；通过“中药色谱指纹图谱相似度评价***”2010版软件计算相似度，色谱指纹图谱与其所得对照指纹图谱的相似度在0.999～1.000。

结果表明：知母药材在24小时内稳定。

7、重复性试验

取同一供试品（河北易县）6份，按照3.3.2供试品的制备方法和3.3.3项下色谱条件进行检测，以知母皂苷BⅡ峰为内参比峰，计算占总峰面积5%以上峰的相对保留时间和峰面积。

结果表明，占总峰面积5%以上峰的相对峰面积和保留时间的RSD均小于3%。通过“中药色谱指纹图谱相似度评价***”2010版软件计算6份供试品溶液的相似度，色谱指纹图谱与其所得对照指纹图谱的相似度为1.000。

8、知母药材指纹图谱的建立

根据上述液相色谱条件，分别精密吸取对照品溶液及供试品溶液（河北易县）各20ul，注入液相色谱仪，记录60min内的色谱峰，色谱图见图1。

图1结果显示：同时以对照品的图谱进行比对，确认了2号峰为新芒果苷，3号峰为芒果苷，7号峰为知母皂苷BⅡ，8号峰为知母皂苷C，12号峰为知母皂苷AⅢ。

按上述确定的供试品制备方法进行样品分析，将15个不同批次的知母药材供试品的HPLC-ELSD色谱图，通过“中药色谱指纹图谱相似度评价***”2010版软件，将峰面积较大、分离度较好的色谱峰进行标定，确定12个主要特征峰作为共有峰，保留时间分别为1号（4.248min），2号（9.82min），3号（11.446min），4号（19.416min），5号（22.212min），6号（25.069min），7号（32.463min），8号（41.884min），9号（47.597min），10号（50.726min），11号（53.302min），12号（54.153min）。

根据15个不同批次的知母药材供试品的HPLC-ELSD色谱图，对照指纹图谱生成法，通过“中药色谱指纹图谱相似度评价***”2010版软件，计算各药材样品的HPLC-ELSD图谱与生成对照指纹图谱之间的相似度，结果见表2。

表2：15批知母药材药材HPLC-ELSD指纹图谱相似度

由表2知母药材HPLC-ELSD指纹图谱相似度可知：15个不同批次的知母药材HPLC-ELSD指纹图谱的相似度>0.97以上。

实验结果表明：知母药材整体性的化学成分特征相似。

虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims

1.知母药材HPLC-ELSD指纹图谱的建立方法，包含色谱条件、供试品溶液的制备、对照品溶液的制备，其特征在于，该方法包括以下步骤：

供试品溶液的制备：取过四号筛的知母药材粉末约1.0克，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入浓度为50％的乙醇25ml，称定重量；以功率为400W，频率为40kHz超声30min；放冷，再称定重量，用50％乙醇补足减失的重量，摇匀；滤过，取续滤液，0.45um针头微孔过滤器过滤，作为供试品溶液；

对照品溶液的制备：分别称取知母皂苷BⅡ、知母皂苷AⅢ、芒果苷、新芒果苷、知母皂苷C适量，加50％乙醇配制成每ml溶液中分别含有知母皂苷BⅡ、知母皂苷AⅢ、芒果苷、新芒果苷、知母皂苷C为0.267mg、0.115mg、0.098mg、0.195mg、0.142mg的混合对照品溶液，摇匀，备用；

色谱条件为：Thermo C₈色谱柱4.6mm×250mm，5μm；流动相：乙腈-0.2％醋酸水溶液梯度洗脱；柱温:20℃；流速:1mL·min^-1；ELSD检测器雾化器流速：2.6L·min^-1；漂移管温度：100℃；进样量：20μL；流动相按照梯度洗脱梯度变化为：

时间：分钟乙腈：％醋酸水：％ 0 5 95 5 7 93 5.01 15 85 15 15 85 15.01 22 78 36 22 78 36.01 35 65 43 35 65 43.01 40 60 51 50 50 51.01 100 0 60 100 0

测定：分别精密吸取供试品溶液和对照品溶液注入液相色谱仪，测定所有供试品。