CN103261890B - 人ezh2抑制剂及其应用方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及对人组蛋白甲基转移酶EZH2的野生型和某些突变形式的抑制，所述EZH2是PRC2复合物的催化亚基，所述PRC2复合物催化组蛋白H3上赖氨酸27(H3-K27)的单-至三-甲基化。在一个实施方式中，所述抑制对于所述EZH2的突变形式是选择性的，从而抑制与某些癌症相关的H3-K27的三甲基化。可以使用所述方法来治疗癌症，包括滤泡性淋巴瘤和弥散性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)。本发明还提供用于鉴定EZH2突变形式的小分子选择性抑制剂的方法，以及用于测定对象内对EZH2抑制剂响应性的方法。

Description

人EZH2抑制剂及其应用方法
相关引用
本申请要求2010年9月10日提交的U.S.S.N61/381,684的优先权及权益，其通过引用全文纳入本文。
技术领域
本发明涉及人组蛋白甲基转移酶EZH2的野生型和某些突变形式的抑制，所述EZH2是PRC2复合物的催化亚基，其催化在组蛋白H3上第27位赖氨酸(H3-K27)的单-至三-甲基化，还涉及用于治疗癌症的方法，所述癌症包括滤泡性淋巴瘤和弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)，以及用于测定对象中EZH2抑制剂响应的方法。
背景
在真核细胞中，DNA由组蛋白包装以形成染色质。约150个碱基对的DNA在组蛋白的八聚体(各两个组蛋白2A、2B、3和4)上缠绕两圈以形成核小体——染色质的基本单位。染色质的有序结构变化能引起关联基因转录中的改变。该过程高度受控，因为基因表达模式深度影响基础细胞过程，诸如分化、增殖和凋亡。通过共价修饰组蛋白，最特别是其N端尾部来介导对染色质结构变化(和因而的转录)的控制。这些修饰通常指表观遗传学修饰，因为它们能造成基因表达中的可遗传改变，但不影响所述DNA本身的序列。氨基酸侧链的共价修饰(例如，甲基化、乙酰化、磷酸化和泛素化)是酶促介导的。
通过称为组蛋白甲基转移酶(HMT)的独特酶家族作用来控制向组蛋白上特定氨基酸位点选择性添加甲基基团。具体基因的表达水平受相关的组蛋白位点处一个或多个甲基基团的存在与否影响。位于具体组蛋白位点的甲基基团的特定作用持续至所述甲基基团被组蛋白去甲基化酶移除，或持续至所述修饰的组蛋白通过核小体转换而被取代。以类似的方式，其它酶类能够用其它化学物质修饰DNA和组蛋白，并且其它酶也能移除这些物质来控制基因表达。
必须严格控制转录调节后生化***的协调收集，以使细胞生长和分化最优进行。当这些控制受到负责DNA和组蛋白修饰的酶的异常表达和/或活性扰乱时，产生疾病状态。在人癌症中，例如，越来越多的证据提示，失调的表观遗传酶活性造成与癌症相关的细胞增殖失控，及其它癌症相关表型例如增强的细胞迁移和入侵。除了癌症外，有越来越多的证据显示表观遗传酶在众多其它人疾病中的作用，包括代谢疾病(例如糖尿病)、炎性疾病(例如克罗恩氏病(Crohn’sdisease))、神经变性疾病(例如阿尔茨海默病)和心血管疾病。因此，选择性调节表观遗传酶的异常作用对治疗一定范围的疾病有广泛前景。
组蛋白甲基转移酶EZH2
已知多梳组(PcG)和三胸组(trxG)蛋白是细胞记忆***的部分。Francis等.(2001)NatRevMolCellBiol2:409-21；Simon等.(2002)CurrOpinGenetDev12:210-8。这两组蛋白都涉及保持同源异形框(Hox)基因表达的空间模式，其在胚胎发育早期由瞬时表达的分节基因建立。一般而言，PcG蛋白是保持“关闭状态”的转录抑制子，而trxG蛋白是保持“启动状态”的转录激活子。因为PcG和trxG蛋白的成员包含固有的组蛋白甲基转移酶(HMTase)活性，所以PcG和trxG蛋白可通过核心组蛋白的甲基化来参与细胞记忆。Beisel等.(2002)Nature419:857-62；Cao等.(2002)Science298:1039-43；Czermin等.(2002)Cell111:185-96；Kuzmichev等.(2002)GenesDev16:2893-905；Milne等.(2002)MolCell10:1107-17；Muller等.(2002)Cell111:197-208；Nakamura等.(2002)MolCell10:1119-28。
生化和基因研究提供证据显示果蝇(Drosophila)PcG蛋白在至少两个不同蛋白复合物中起作用，所述蛋白复合物为多梳抑制复合物1(PRC1)和ESC-E(Z)复合物(也称作多梳抑制复合物2(PRC2))，尽管所述复合物的组成可为动态。Otte等.(2003)CurrOpinGenetDev13:448-54.果蝇(Drosophila)中的研究(Czermin等.(同上)；Muller等.(同上))和哺乳动物细胞中的研究(Cao等.(同上)；Kuzmichev等.(同上))证明，ESC-E(Z)/EED-EZH2(即PRC2)复合物具有固有的组蛋白甲基转移酶活性。尽管由不同组分离的复合物组成略有不同，其一般包括EED、EZH2、SUZ12和RbAp48或其果蝇(Drosophila)同源物。然而，仅包括EED、EZH2和SUZ12的重建复合物对组蛋白H3第27位赖氨酸保留组蛋白甲基转移酶活性。美国专利7,563,589(通过引用纳入本文)。在构成PRC2复合物的各种蛋白中，EZH2(Zeste增强子同源物2)是催化亚基。EZH2的催化位点进而存在于SET结构域，所述SET结构域是在若干染色质相关蛋白质(包括三胸组和多梳组的成员)中发现的高度保守序列基序(以Su(var)3–9命名，Zeste增强子，三胸)。SET结构域是除H3-K79甲基转移酶DOT1以外所有已知组蛋白赖氨酸甲基转移酶的特征。
除Hox基因沉默以外，显示PRC-2介导的组蛋白H3-K27甲基化还参与X灭活。Plath等.(2003)Science300:131-5；Silva等.(2003)DevCell4:481-95。募集PRC2复合物至Xi以及随后组蛋白H3-K27上的三甲基化在X灭活的起始阶段出现，并且依赖XistRNA。此外，发现EZH2和其相关组蛋白H3-K27甲基转移酶活性区别标记多能外胚层细胞和分化的滋养外胚层。Erhardt等.(2003)Development130:4235-48)。
与EZH2维持多能外胚层细胞的表观遗传修饰模式的作用一致，Cre介导的EZH2去除引起细胞中组蛋白H3-K27甲基化的缺失。Erhardt等.(同上)。此外，***和乳癌细胞系和组织的研究显示EZH2和SUZ12水平之间的强烈相关性，以及这些癌症的侵袭性(Bracken等.(2003)EMBOJ22:5323-35；Kirmizis等.(2003)MolCancerTher2:113-21；Kleer等.(2003)ProcNatlAcadSciUSA100:11606-11；Varambally等.(2002)Nature419:624-9)，指示RRC2复合物的功能障碍可能引起癌症。
近期，报道EZH2第641位酪氨酸(Y641F、Y641N、Y641S和Y641H)的体细胞突变与滤泡性淋巴瘤(FL)和弥散性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)的生发中心B细胞样(GCB)亚型相关。Morin等.(2010)NatGenet42:181-5。在所有情况中，发现突变EZH2基因的出现是杂合的，并且通过转录组测序在所述突变样品中检测到野生型和突变等位基因的表达。还证明EZH2的所有突变形式都可纳入多蛋白PRC2复合物，但所形成的复合物缺失催化肽底物的H3-K27等价残基甲基化的能力。因此，总结来说，EZH2的Tyr641处的疾病相关变化导致EZH2催化H3-K27甲基化方面的功能缺失。
发明内容
本发明的一个方面涉及调节野生型和突变组蛋白甲基转移酶EZH2的活性，所述EZH2是PRC2复合物的催化亚基，所述PRC2复合物催化组蛋白H3上第27位赖氨酸(H3-K27)单-至三-甲基化。例如，本发明涉及抑制EZH2的某些突变形式的活性。EZH2的突变形式包括用其它氨基酸残基替换野生型EZH2的第641位酪氨酸(Y641，以及Tyr641)。
本发明的另一个方面涉及根据双甲基化的H3-K27me2水平，或优选根据双甲基化的H3-K27me2和三甲基化的H3-K27me3水平来测定患者对EZH2抑制子的响应。例如，有低水平或不可检测水平的双甲基化H3-K27me2的细胞或有低H3-K27me2/me3比例的细胞对EZH2抑制子的抗增殖效果的响应比有典型更高H3-K27me2/me3比例的细胞多许多。
本发明的一个方面是在对象内抑制H3-K27向三甲基化H3-K27转换的方法。所述方法包括以下步骤：向表达EZH2的Y641突变体的对象给予治疗有效量的EZH2抑制剂，其中，所述抑制剂抑制EZH2的组蛋白甲基转移酶活性，从而抑制所述对象中H3-K27向三甲基化H3-K27转换。
在本发明的这个和其它方面，在一个实施方式中，所述抑制剂抑制EZH2的Y641突变体的组蛋白甲基转移酶活性。
在本发明的这个和其它方面，在一个实施方式中，所述抑制剂选择性抑制EZH2的Y641突变体的组蛋白甲基转移酶活性。
在本发明的这个和其它方面，在一个实施方式中，所述EZH2的Y641突变体选自Y641F、Y641H、Y641N和Y641S。
在本发明的这个和其它方面，在一个实施方式中，所述EZH2的抑制剂是S-腺苷-L-高半胱氨酸或是其药学上可接受的盐。
在本发明的这个和其它方面，在一个实施方式中，所述EZH2的抑制剂是化合物75
或其药学上可接受的盐。
本发明的一个方面是在对象内抑制H3-K27向三甲基化H3-K27转换的方法。所述方法包括以下步骤：实行分析以检测来自对象的样品中EZH2的Y641突变体；以及向表达EZH2的Y641突变体的对象给予治疗有效量的EZH2抑制剂，其中，所述抑制剂抑制EZH2的组蛋白甲基转移酶活性，从而抑制所述对象中H3-K27向三甲基化H3-K27转换。
在本发明的方面和其它方面，在一个实施方式中，实行用于检测EZH2的Y641突变体的分析包括检测EZH2的Y641突变体编码核酸的全基因组重测序或目标区域重测序。
在本发明的这个和其它方面，在一个实施方式中，实行用于检测EZH2的Y641突变体的分析包括使所述样品接触抗体，所述抗体特异性结合有EZH2的Y641突变体特点的多肽或其片段。
在本发明的这个和其它方面，在一个实施方式中，实行用于检测EZH2的Y641突变体的分析包括使所述样品在高严谨条件下接触核酸探针，所述核酸探针与编码有EZH2的Y641突变体特点的多肽或其片段的核酸杂交。
本发明的一个方面是抑制H3-K27向三甲基化H3-K27转换的方法。所述方法包括以下步骤：使EZH2的Y641突变体接触含H3-K27的组蛋白底物和有效量的EZH2抑制剂，其中，所述抑制剂抑制EZH2的组蛋白甲基转移酶活性，从而抑制H3-K27向三甲基化H3-K27转换。
本发明的一个方面是鉴定对象为EZH2抑制剂处理的候选者的方法。所述方法包括以下步骤：实行分析以检测来自对象的样品中EZH2的Y641突变体；并鉴定表达EZH2的Y641突变体的对象作为用EZH2抑制剂处理的候选者，其中，所述抑制剂抑制EZH2的组蛋白甲基转移酶活性。
本发明的一个方面是鉴定EZH2的Y641突变体的抑制剂的方法。所述方法包括以下步骤：组合经分离EZH2的Y641突变体和组蛋白底物、甲基基团供体和测试化合物，其中所述组蛋白底物包括选自下组的一种H3-K27形式：未甲基化H3-K27、单甲基化H3-K27、双甲基化H3-K27，及其任意组合；和实行分析以检测所述组蛋白底物内的H3-K27甲基化，从而在所述测试化合物存在下的H3-K27甲基化少于所述测试化合物缺失下的H3-K27甲基化时，鉴定所述测试化合物为EZH2的Y641突变体的抑制剂。
在一个实施方式中，进行实验以检测所述组蛋白底物中的H3-K27甲基化，所述分析包括检测经标记甲基基团的掺入。
在一个实施方式中，所述标记的甲基基团是同位素标记的甲基基团。
在一个实施方式中，实行分析以检测所述组蛋白底物中的H3-K27甲基化，所述分析包括使所述组蛋白底物接触特异性结合三甲基化H3-K27的抗体。
本发明的一个方面是鉴定EZH2的Y641突变体的抑制剂的方法。所述方法包括以下步骤：组合经分离EZH2的Y641突变体和组蛋白底物、甲基基团供体和测试化合物，其中，所述组蛋白底物包含选自下组的一种H3-K27形式：未甲基化H3-K27、单甲基化H3-K27、双甲基化H3-K27及其任意组合；和实行分析以检测所述组蛋白底物中的三甲基化H3-K27的形成，从而在所述测试化合物存在下的三甲基化H3-K27形成少于所述测试化合物缺失下的三甲基化H3-K27形成时，鉴定所述测试化合物为EZH2的Y641突变体的抑制剂。
在一个实施方式中，实行分析以检测组蛋白底物中三甲基化H3-K27的形成，所述分析包括检测经标记甲基基团的掺入。
在一个实施方式中，所述标记的甲基基团是同位素标记的甲基基团。
在一个实施方式中，实行分析以检测组蛋白底物中三甲基化H3-K27的形成，所述分析包括使所述组蛋白底物接触特异性结合三甲基化H3-K27的抗体。
本发明的一个方面是鉴定EZH2的Y641突变体的选择性抑制剂的方法。
所述方法包括以下步骤：组合经分离EZH2的Y641突变体和组蛋白底物、甲基基团供体和测试化合物，其中，所述组蛋白底物包括选自下组的一种H3-K27形式：单甲基化H3-K27、双甲基化H3-K27，以及单甲基化H3-K27和双甲基化H3-K27的组合，从而形成测试混合物；组合经分离野生型EZH2和组蛋白底物、甲基基团供体和测试化合物，其中，所述组蛋白底物包含选自下组的一种H3-K27形式：单甲基化H3-K27、双甲基化H3-K27，以及单甲基化H3-K27和双甲基化H3-K27的组合，从而形成对照混合物；实行分析以检测各测试混合物和对照混合物中组蛋白底物的三甲基化；计算(a)采用EZH2的Y641突变体加测试化合物的三甲基化(M+)对(b)采用EZH2的Y641突变体不加测试化合物的三甲基化(M-)的比例；计算(c)采用野生型EZH2加测试化合物的三甲基化(WT+)对(d)采用野生型EZH2不加测试化合物的三甲基化(WT-)的比例；比较比例(a)/(b)和比例(c)/(d)；当比例(a)/(b)少于比例(c)/(d)时，鉴定所述测试化合物为EZH2的Y641突变体的选择性抑制剂。
本发明的一个方面是治疗癌症的方法。所述方法包括以下步骤：向患有表达EZH2的Y641突变体的癌症的对象给予治疗有效量的EZH2抑制剂，其中，所述抑制剂抑制EZH2的组蛋白甲基转移酶活性，从而治疗所述癌症。
在本发明的这个和其它方面，在一个实施方式中，所述癌症选自滤泡性淋巴瘤和具有生发中心B细胞样(GCB)亚型的弥散性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)。
本发明的一个方面是治疗癌症的方法。所述方法包括以下步骤：向患有表达EZH2的Y641突变体的癌症的对象给予治疗有效量的EZH2抑制剂，其中，所述抑制剂选择性抑制EZH2的Y641突变体的组蛋白甲基转移酶活性，从而治疗所述癌症。
本发明的一个方面是治疗癌症的方法。所述方法包括以下步骤：实行分析以检测样品中EZH2的Y641突变体，所述样品包含来自患癌对象的癌细胞；以及向表达EZH2的Y641突变体的对象给予治疗有效量的EZH2抑制剂，其中，所述抑制剂抑制EZH2的组蛋白甲基转移酶活性，从而治疗所述癌症。
本发明的另一个方面是测定对象内对EZH2抑制剂的响应的方法。在一个实施方式中，所述方法包括从所述对象分离组织样品；检测所述组织样品中H3-K27的双甲基化(me2)水平；比较所述双甲基化(me2)水平和对照双甲基化(me2)水平；以及，当所述双甲基化(me2)水平缺失或低于所述对照双甲基化(me2)水平时，鉴定所述对象响应所述EZH2抑制剂。在一个实施方式中，所述方法还包括检测所述组织样品内H3-K27的三甲基化(me3)水平；比较所述三甲基化(me3)水平和对照三甲基化(me3)水平，并比较所述双甲基化(me2)水平和对照双甲基化(me2)水平；以及，当所述三甲基化(me3)水平等同于或高于所述对照三甲基化(me3)水平并且所述双甲基化(me2)水平缺失或低于所述对照双甲基化(me2)水平时，鉴定所述对象响应所述EZH2抑制剂。在另一个实施方式中，所述方法还包括获得所述组织样品中H3-K27的双甲基化(me2)水平与三甲基化(me3)水平的比例；获得所述对照双甲基化(me2)水平与对照三甲基化(me3)水平的比例；比较所述比例与所述对照比例；以及，在所述比例低于所述对照比例时，鉴定所述对象响应所述EZH2抑制剂。在一个优选实施方式中，所述对象患癌。在一个实施方式中，所述癌症是滤泡性淋巴瘤。或者，所述癌症是弥散性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)。在另一个优选实施方式中，所述对象表达EZH2的Y641突变体。在一个优选实施方式中，所述Y641突变体是Y641F、Y641H、Y641N或Y641S。
本发明的一个方面是选择用于患癌对象的治疗的方法。所述方法包括通过双甲基化H3-K27水平或优选通过双甲基化H3-K27水平和三甲基化H3-K27水平来测定所述对象对EZH2抑制剂的响应；以及在所述对象响应所述EZH2抑制剂时向所述对象提供所述EZH2抑制剂。在一个实施方式中，所述癌症是滤泡性淋巴瘤。或者，所述癌症是弥散性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)。在另一个优选实施方式中，所述对象表达EZH2的Y641突变体。在一个优选实施方式中，所述Y641突变体是Y641F、Y641H、Y641N或Y641S。
本发明的一个方面是化合物75
或其药学上可接受的盐。
本发明的一个方面是某一药物组合物，所述药物组合物包含化合物75
或其药学上可接受的盐。
本发明的一个方面是化合物75
或其药学上可接受的盐在治疗滤泡性淋巴瘤中的应用。
本发明的一个方面是化合物75
或其药学上可接受的盐在治疗弥散性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)中的应用。
除非另外定义，本文中使用的所有技术和科学术语具有本发明所属领域普通技术人员通常所理解的同样含义。在说明书中，单数形式也包含多数形式，除非上下文另有明确说明。虽然在本发明的实施或测试中可以采用类似于或等同于本文所述的那些方法和材料，但是下面描述了合适的方法和材料。本文提到的所有出版物、专利申请、专利或其它参考文献均通过引用纳入。本文引用的文献并非承认是所要求权利的发明的在先技术。在抵触的情况下，以本说明书(包括定义在内)为准。此外，材料、方法和实施例都仅是说明性，并不意在构成限制。
从以下发明详述和所附权利要求书很容易了解本发明的其他特征和优点。
附图说明
图1的两幅图确定B细胞淋巴瘤相关的EZH2突变体是活性组蛋白甲基转移酶。以(A)使用肽(H321-44)为底物的甲基转移反应，和(B)使用禽类核小体为底物的甲基转移反应检测包含野生型和EZH2的多种Y641突变体的PRC2复合物的体外甲基转移酶活性。符号：野生型(·)、Y641F(o)、Y641H(□)、Y641N(■)和Y641S(▲)。CPM是每分钟的计数，指作为3H辐射结果的闪烁计数。
图2的四幅图确定包含突变EZH2的PRC2复合物优先催化组蛋白H3-K27的双甲基化和三甲基化。(A)突变和野生型(WT)复合物对未甲基化肽(空心柱)、单甲基化肽(散点柱)和双甲基化肽(实心柱)的甲基转移酶活性。(B)就包含野生型(ο)、Y641F(·)、Y641H(□)、Y641N(■)和Y641S(▲)的PRC2复合物而言在所有肽甲基化状态中，由K1/2判断的肽底物亲和度相似。应注意所有底物和所有酶形式间的K1/2值变化少于3.5倍。对于底物的任何特定甲基化状态，K1/2值的变化少于2倍。(C)就EZH2的野生型和Y641突变体而言酶转换数(kcat)以相反的方式随底物甲基化状态而变化。就EZH2的野生型(ο)而言kcat随K27甲基化状态增加而降低，但就EZH2的Y641F(·)、Y641H(□)、Y641N(■)和Y641S(▲)突变体而言kcat随K27甲基化状态增加而增加。(D)就EZH2的野生型(ο)而言催化效率(kcat/K1/2)随K27甲基化状态增加而减少，但就EZH2的Y641F(·)、Y641H(□)、Y641N(■)和Y641S(▲)突变体而言(kcat/K1/2)随K27甲基化状态增加而增加。在图B-D中，连接数据点的线不旨在提示任何数学关系，而是仅起到视觉辅助的作用。
图3A的三张图显示就包含不同EZH2突变体的细胞而言H3-K27me3(上图)、H3-K27me2(中图)和H3-K27me1(下图)的预测相对水平。用表1所示的偶联酶稳态速度方程和所述稳态动力学参数来实施模拟。所有值是相对于包含纯合WTEZH2的细胞，假定饱和浓度的胞内SAM，相对于Km，且胞内核小体浓度类似Km。
图3B是对WTEZH2纯合或对所示EZH2Y641突变杂合的淋巴瘤细胞系的H3-K27甲基化状态相对模式的一系列Western印迹分析。从顶至底的图描述用对以下物质特异的抗体探测的结果：总EZH2、H3-K27me3、H3-K27me2、H3-K27me1；总组蛋白H3为加样对照。
图4显示所选提出的导致癌症中组蛋白H3-K27上异常高水平三甲基化的机制。这些机制包括：a)EZH2中Y641突变导致底物优先性变化，优先性从无甲基化组蛋白H3-K27至单甲基化和双甲基化组蛋白H3-K27；b)EZH2过表达；c)UTX内灭活酶功能的突变，导致H3-K27me3的去甲基化降低；以及d)PRC2复合物亚基PHF19/PCL3过表达，引起对特定基因的PRC2复合物的募集增加以及组蛋白H3-K27三甲基化增加。在所有四个模型中，变化导致基因近端启动子区域中异常的组蛋白H3-K27三甲基化，造成癌症中关键基因的转录抑制。
图5的SDS-PAGE胶显示各所述5组分PRC2复合物的表达水平与突变和野生型EZH2相似。
图6的一对表格显示突变和野生型(WT)PRC2复合物表现出对含H3-K27的肽的强底物优先性。针对覆盖全H3和H4的重叠15聚体肽组测试各个酶。以速度(CPM/分钟)测量活性，而报告值代表各反应的两个独立测定的均值。所有复合物中，最有利的肽是H3:16-30。对于该肽，WT复合物的活性比其它任何突变复合物高出6倍。
图7显示S-腺苷-L-高半胱氨酸(SAH)对EZH2WT和EZH2的Y641突变体的抑制效力。X轴显示SAH的log浓度；Y轴显示抑制百分比。
图8显示化合物75对EZH2WT和EZH2的Y641突变体的抑制效力。X轴显示化合物75的log浓度；Y轴显示抑制百分比。
图9显示细胞系组中H3-K27me1、me2和me3的相对水平的Western印迹分析，所述细胞系包括表达WT或Y641突变EZH2的多种DLBCL细胞系。a)从所示细胞系提取组蛋白，通过SDS-PAGE用4-20%的胶分级分离，转至硝化纤维素膜，并用抗组蛋白H3、H3-K27me1、me2或me3的抗体探测。通过从所示细胞系制备全细胞裂解物，如上所述处理并用抗EZH2的抗体探测，来测定EZH2水平。b)从所示细胞系提取组蛋白，并如上所述处理，除了EZH2水平未测定。
图10显示在WT和Y641突变淋巴瘤细胞系组中H3和H3-K27me3水平的免疫细胞化学分析。固定来自所示细胞系的细胞团并石蜡包埋。制作切片并使用抗组蛋白H3或H3-K27me3的抗体通过免疫细胞化学评估H3和H3-K27me3的水平。
图11显示在WT和Y641突变淋巴瘤细胞系组中H3和H3-K27me2水平的免疫细胞化学分析。固定来自所示细胞系的细胞团并石蜡包埋。制作切片并使用抗组蛋白H3或H3-K27me2的抗体通过免疫细胞化学评估H3和H3-K27me2的水平。
图12显示在Y641突变WSU-DLCL2细胞中通过EZH2抑制剂处理对总H3-K27me3水平的抑制作用。用所示浓度的EZH2抑制剂A或B处理WSU-DLCL2细胞4天。在化合物处理后，提取组蛋白，通过SDS-PAGE在4-20%胶上分级分离，转至硝化纤维素膜上，并用抗组蛋白H3或H3-K27me3的抗体探测。
图13显示EZH2抑制剂能够阻断Y641突变WSU-DLCL2细胞增殖，但对非Y641突变OCI-LY19细胞几乎没有影响。在存在递增浓度的EZH2抑制剂A或B情况下孵育细胞11天。纳入载剂处理的(DMSO)细胞作为对照。在GuavaEasyCytePlus仪器中用GuavaViacount分析测定细胞数和活力。细胞每3-4天***，并补充培养基和化合物。
图14显示EZH2(Y641)突变存在和/或高H3-K27me3和低H3-K27me2水平预测对EZH2抑制剂的敏感性。在递增浓度的一种EZH2抑制剂(至多25μM)存在下维持细胞系。处理11天后，用活细胞计数来获得IC90值。对采用根据EZH2突变状态分离的细胞系(A)或根据H3-K27me2和H3-K27me3水平分离的细胞系(B)的结果作图。在两张图中，直线显示来自所示细胞系组的IC90均值。
具体实施方式
染色质结构在基因调节和表观遗传中是重要的。建立和维持染色质高级结构涉及组蛋白的翻译后修饰；例如，对某些核心组蛋白的尾部通过乙酰化、甲基化、磷酸化、核糖基化和/或泛素化修饰。
EZH2是组蛋白甲基转移酶，其是PRC2复合物的催化亚基，催化组蛋白H3上第27位赖氨酸(H3-K27)的单-至三-甲基化。组蛋白H3-K27的三甲基化是抑制位于组蛋白修饰位点近端的特定基因转录的机制。已知所述三甲基化是癌症如***癌中表达变化的癌症标志(参见例如，美国专利申请公开号2003/0175736；其通过引用全文纳入本文)。EZH2属于多梳家族蛋白(PcG)。所述多梳家族蛋白通过靶基因的转录抑制来协助维持细胞特性。Jacobs等.(1999)SeminCellDevBiol10(2):227-35；Jacobs等.(2002)BiochimBiophysActa1602(2):151-61。DNA微阵列鉴定EZH2在激素抵抗性转移性***癌中上调。Dhanasekaran等.(2001)Nature412(6849):822-6；Varambally等.(2002)Nature419(6907):624-9。EZH2在侵袭性乳腺癌中上调，并且是促侵入表型的调节物。Kleer等.(2003)ProcNatlAcadSciUSA100(20):11606-11。永生化的人乳腺上皮细胞系中EZH2过表达促进锚定非依赖性生长和细胞入侵。Kleer等.(同上)。EZH2介导的细胞入侵需要完整SET结构域和组蛋白脱乙酰基酶活性。前期研究提供失控EZH2表达、转录抑制和肿瘤转化之间功能性连接的证据。Varambally等.(同上)；Kleer等.(同上)。
本发明的一个方面涉及抑制EZH2活性，包括EZH2某些突变形式。在一个实施方式中，本发明涉及选择性抑制某些EZH2突变形式的活性。
已报道EZH2的单个氨基酸残基(Tyr641，本文中称作Y641)处的EZH2基因点突变与人B细胞淋巴瘤亚组相关。Morin等.(2010)NatGenet42:181-5。特别地，Morin等报道EZH2的酪氨酸641(Y641F、Y641H、Y641N和Y641S)的体细胞突变与滤泡性淋巴瘤(FL)和弥散性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)的生发中心B细胞样(GCB)亚型相关。发现所述突变等位基因总与疾病细胞中的野生型等位基因(杂合的)相关，并且据报道所述突变消除PRC2复合物使未修饰肽底物甲基化的酶活性。
现在出乎意料地发现，所述野生型(WT)EZH2酶对H3-K27的零甲基化至单甲基化反应显示最强的催化功效(kcat/K)，并对后续(单甲基化至双甲基化，双甲基化至三甲基化)反应显示较弱的催化功效；因而，与此形成鲜明对比的是，所述疾病相关的Y641突变对进行第一次甲基化反应显示非常有限的能力，但就相对于野生型酶的后续反应而言具有增强的催化功效。这些结果指示，疾病的恶性表型利用了H3-K27单甲基化酶(含WTEZH2或EZH1的PRC2)和含突变EXH2的PRC2的联合活性来增加H3-K27向所述三甲基化形式(H3-K27me3)转换。
但是，不旨在由任何一个理论束缚，假设EZH2中Y641突变为苯丙氨酸(F)、组氨酸(H)、天冬酰胺(N)或丝氨酸(S)可以通过影响所述双底物酶三元复合物的活性位点中的氢键构型和/或空间位阻来促进多轮H3-K27甲基化，影响用于去质子化所述反应赖氨酸的合适水通道形成。Zhang等.(2008)ProcNatlAcadSciUSA105:5728-32。由类推至晶体学和分子动力模拟结果得出该推论，所述结果见于相关蛋白赖氨酸甲基转移酶LSMT、Dim-5和SET7/9中的酪氨酸突变。
例如，当重组SET7/9的第245位酪氨酸突变为丙氨酸时观察到底物特异性的改变。Dillon等.(2005)GenomeBiol6:227。Y245A突变SET7/9使未修饰的20残基肽(代表H3-K4周围序列)甲基化的能力降低至WT酶的约20%。Xiao等.(2003)Nature421:652-6。同时，Y245A突变体使H3-K4me1和H3-K4me2肽进一步甲基化的能力相对WT酶有显著提高(分别提高约7倍和5倍)。然而，与本公开关于EZH2的Y641突变相反，SET7/9Y245突变为苯丙氨酸不增强所述肽段的单-双甲基化，也不增强所述肽段的双-三甲基化；反而，SET7/9的Y245F突变对所有肽底物表现出最小催化活性。相似地，所述野生型酶G9a能使H3-K9双甲基化，但无法进行双-三甲基化反应。不过，当G9a的第1067位酪氨酸(类似EZH2的Y641)突变为苯丙氨酸时，所述酶即刻获得使H3-K9三甲基化的能力。Wu,H.等.(2010)PLoSOne5,e8570,doi:10.1371/journal.pone.0008570)。
前期对人EZH2核酸和多肽已有描述。参见例如Chen等.(1996)Genomics38:30-7[746个氨基酸]、Swiss-Prot登录号Q15910[746个氨基酸]、GenBank登录号NM_004456和NP_004447(同种型a[751个氨基酸])以及GenBank登录号NM_152998和NP_694543(同种型b[707个氨基酸])，其各自均通过引用全文纳入本文。
如上所述，确信EZH2的催化位点位于所述蛋白的保守结构域，所述结构域已知是SET结构域。所述EZH2的SET结构域的氨基酸序列由下列跨Swiss-Prot登录号Q15910(SEQIDNO:1)氨基酸残基613-726的部分序列提供：
HLLLAPSDVAGWGIFIKDPVQKNEFISEYCGEIISQDEADRRGKVYDKYMCSFLFNLNNDFVVDATRKGNKIRFANHSVNPNCYAKVMMVNGDHRIGIFAKRAIQTGEELFFDY
(SEQIDNO:6).
SEQIDNO:6中下划线显示的酪氨酸(Y)残基是Swiss-Prot登录号Q15910(SEQIDNO:1)中的Tyr641(Y641)。
GenBank登录号NP_004447(SEQIDNO:3)的SET结构域跨氨基酸残基618-731，并且和SEQIDNO:6一致。对应于Swiss-Prot登录号Q15910中的Y641，在SEQIDNO:6中标有下划线的酪氨酸残基是GenBank登录号NP_004447(SEQIDNO:3)中的Tyr646(Y646)。
GenBank登录号NP_694543(SEQIDNO:5)的SET结构域跨氨基酸残基574-687，并且和SEQIDNO:6一致。对应于Swiss-Prot登录号Q15910中的Y641，在SEQIDNO:6中标有下划线的酪氨酸残基是GenBank登录号NP_694543(SEQIDNO:5)中的Tyr602(Y602)。
编码GenBank登录号NP_004447的SET结构域的核苷酸序列是
catctattgctggcaccatctgacgtggcaggctgggggatttttatcaaagatcctgtgcagaaaaatgaattcatctcagaatactgtggagagattatttctcaagatgaagctgacagaagagggaaagtgtatgataaatacatgtgcagctttctgttcaacttgaacaatgattttgtggtggatgcaacccgcaagggtaacaaaattcgttttgcaaatcattcggtaaatccaaactgctatgcaaaagttatgatggttaacggtgatcacaggataggtatttttgccaagagagccatccagactggcgaagagctgttttttgattac
(SEQIDNO:7),
其中编码Y641的密码子以下划线显示。
为了本申请目的，应理解人EZH2的氨基酸残基Y641指作为或对应于Swiss-Prot登录号Q15910中Y641的酪氨酸残基。
为了本申请目的，还应理解人EZH2的Y641突变体(等同地，EZH2的Y641突变体)指某一人EZH2，其中对应于野生型人EZH2的Y641的氨基酸残基被酪氨酸以外的氨基酸残基取代。
在一个实施方式中，所述EZH2的Y641突变体的氨基酸序列与野生型人EZH2的氨基酸序列的区别仅在于对应于野生型人EZH2中Y641的单个氨基酸残基被酪氨酸以外的氨基酸残基取代。
在一个实施方式中，所述EZH2的Y641突变体的氨基酸序列与野生型人EZH2的氨基酸序列的区别仅在于对应于野生型人EZH2中Y641的单个氨基酸残基被苯丙氨酸(F)取代。根据该实施方式，所述EZH2的Y641突变体在本文中称为Y641F突变体，或等同地，称为Y641F。
在一个实施方式中，所述EZH2的Y641突变体的氨基酸序列与野生型人EZH2的氨基酸序列的区别仅在于对应于野生型人EZH2中Y641的单个氨基酸残基被组氨酸(H)取代。根据该实施方式，所述EZH2的Y641突变体在本文中称为Y641H突变型，或等同地，称为Y641H。
在一个实施方式中，所述EZH2的Y641突变体的氨基酸序列与野生型人EZH2的氨基酸序列的区别仅在于对应于野生型人EZH2中Y641的单个氨基酸残基被天冬酰胺(N)取代。根据该实施方式，所述EZH2的Y641突变体在本文中称为Y641N突变体，或等同地，称为Y641N。
在一个实施方式中，所述EZH2的Y641突变体的氨基酸序列与野生型人EZH2的氨基酸序列的区别仅在于对应于野生型人EZH2中Y641的单个氨基酸残基被丝氨酸(S)取代。根据该实施方式，所述EZH2的Y641突变体在本文中称为Y641S突变型，或等同地，称为Y641S。
对EZH2中含多种Y641突变的耐受提示指出，空间位阻拥挤的释放可允许更多使用合适排列更大二甲基赖氨酸作为所述双-三甲基化反应底物的二甲基赖氨酸有更多合适的排列。所述蛋白甲基化转移酶SET7/9和G9a的晶体学分析揭示，所述活性位点酪氨酸残基的侧链羟基直接参与和甲基受体赖氨酸中的胺的氢键相互作用，或通过***水分子而间接地参与。虽然所述Y641突变体型的较大活性位点在双和三甲基化方面占优势，但是酪氨酸羟基氢键受体的缺失可能就初始甲基转移至所述赖氨酸的胺而言引起不利的活性位点方向。
表1中总结的数据清楚显示目前人疾病结果的含义(见下)。预计就EZH2杂合的细胞会显示恶性表型，这归因于由野生型酶有效形成H3-K27me1，该祖种向H3-K27有效的后续转换，特别是通过突变酶形式的H3-K27me3。
已报道H3-K27me1的形成并不专一依赖WT-EZH2催化。EZH2和其它PRC2亚基——EED的敲除研究证明，H3-K27me1的形成可由包含EZH2或作为催化亚基的相关蛋白EZH1的PRC2复合物催化。Shen,X.等.(2008)MolCell32:491-502.因此，突变EZH2种类和包含WT-EZH2或WT-EZH1的PRC2复合物之间的催化偶联足以增强H3-K27me2/3形成，并因此产生伴随的恶性表型。因此，数据提示滤泡性淋巴瘤(FL)和具有生发中心B细胞(GCB)亚型的弥散性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)的恶性表型与EZH2突变形式的表达相关，是在H3-K27的三甲基化形式形成方面的总体功能获得的结果。对于数据的这种解释还帮助调和存在癌症相关EZH2或PRC2相关蛋白(例如，PHF19/PCL3)过表达，以及组蛋白H3-K27去甲基化酶UTX的功能缺失基因型。UTX活性缺失在酶学上等同于EZH2功能获得，任一情况下都引起癌细胞中更加稳态水平的三甲基化H3-K27(图4)。
组蛋白H3-K27的单-、双-和三-甲基化状态与转录控制中的不同功能相关。组蛋白H3-K27的单甲基化与准备转录的基因的活性转录相关。Cui等.(2009)CellStemCell4:80-93；Barski(2007)Cell129:823-37。相反，组蛋白H3-K27的三甲基化在组蛋白H3-K4顺式三甲基化时与抑制转录的基因或准备转录的基因相关联。Cui等.(同上)；Kirmizis等.(2007)GenesDev18:1592-1605；Bernstein等.(2006)Cell125:315-26。总而言之，预计癌症中报道的PRC2复合物活性的变化(包括EZH2的Y641突变)造成组蛋白H3-K27的三甲基化状态的增加，并因此造成转录抑制。
本发明的另一个发现是，一般而言，表达EZH2的Y641突变体的细胞比表达WTEZH2的细胞对小分子EZH2抑制剂更敏感。具体来说，表达EZH2的Y641突变体的细胞显示下降的生长、***或增殖，或甚至在用EZH2抑制剂处理后经历凋亡或坏死。与之相反，表达WTEZH2的细胞不响应所述EZH2抑制剂的抗增殖效果(图13和14)。本发明的另一个令人吃惊的发现是，表达WTEZH2的细胞有可能显示与表达Y641EZH2的细胞相似的组蛋白H3-K27甲基化状态，而该甲基化状态也能与对EZH2抑制剂的敏感性关联，无关EZH2的突变状态。一般而言，含Y641突变体的细胞系中的总H3-K27me3水平类似于或高于表达WTEZH2的细胞系；然而，EZH2Y641突变细胞系和某些野生型细胞系(例如Pfeiffer细胞系)中的H3-K27me2水平显著低于其它野生型细胞系(图9、10和11)。因此，Y641突变细胞系和Pfeiffer细胞系中的H3-K27me2/me3信号比相较其它WT细胞系中观察到的低得多。该数据还证明，相对于典型的表达WTEZH2的细胞系，有低H3-K27me2信号和相似或较高H3-K27me3信号的细胞系对小分子EZH2抑制剂更敏感。具体而言，有低H3-K27me2信号和正常或高H3-K27me3信号的细胞在用EZH2抑制剂处理后停止***，或甚至死亡(图9、10、11、13和14)。相反，有较高H3-K27me2/me3信号比的细胞不响应所述EZH2抑制剂的抗增殖效果(图9、10、11、13和14)。本发明提供先前未知和预料之外的结果，通过在患者内使用能用于鉴定哪些患者会响应EZH2抑制剂处理的技术例如western印迹、MS或IHC，鉴定患者肿瘤内EZH2Y641突变，和/或检测相对于对照的低H3-K27me2水平和正常或高H3-K27me3水平。
已表明EZH2和其它蛋白甲基转移酶是就药物开发而言有吸引力的靶标。Copeland等.(2009)NatRevDrugDiscov8:724-32；Copeland等.(2010)CurrOpinChemBiol14(4):505-10；Pollock等.(2010)DrugDiscoveryToday:TherapeuticStrategies6(1):71-9。该数据还提示用于开发FL和GCB淋巴瘤特异性药物的实验策略。由于WT和疾病相关突变体之间的底物识别差异源自过渡态相互反应，选择性模拟所述突变EZH2过渡态超过所述WT酶的小分子抑制剂应证明在含突变细胞中有效阻断H3-K27甲基化。由于对于仅含所述WT酶的任何细胞，目标介导的毒性会是最小，预计该类型的抑制剂会显示高治疗指数。过渡态模拟证明是用于众多疾病区中药物设计的有效策略。参见例如，CopelandR.A.Enzymes:APracticalIntroductiontoStructure,MechanismandDataAnalysis(《酶：实用结构、机制和数据分析入门》)第二版，(威利出版公司(Wiley)，2000).
该结果指出先前期未认识到的，在实施H3-K27单甲基化的酶和用于滤泡性淋巴瘤和弥散性大B细胞淋巴瘤发病机理的某些EZH2突变形式之间酶偶联的令人吃惊的依赖。尽管不意在受任何一种理论束缚，相信所述数据是构成依赖所述正常(WT)酶和疾病相关突变(Y641)酶之间催化活性偶联的人疾病的第一个例子。
本发明的一个方面是用于在对象内抑制H3-K27向三甲基化H3-K27转换的方法。所述抑制可以涉及在对象内抑制未甲基化的H3-K27向单甲基化的H3-K27转换，单甲基化的H3-K27向双甲基化的H3-K27转换，双甲基化的H3-K27向三甲基化的H3-K27转换，或其任意结合，包括例如，单甲基化的H3-K27向双甲基化的H3-K27转换和双甲基化的H3-K27向三甲基化的H3-K27转换。如本文所用，“未甲基化的H3-K27”指不含与第27位赖氨酸氨基基团共价相连的甲基基团的组蛋白H3。如本文所用，“单甲基化的H3-K27”指含一个与第27位赖氨酸氨基基团共价相连的甲基基团的组蛋白H3。单甲基化的H3-K27在本文中也称作H3-K27me1。如本文所用，“双甲基化的H3-K27”指含两个与第27位赖氨酸氨基基团共价相连的甲基基团的组蛋白H3。双甲基化的H3-K27在本文中也称作H3-K27me2。如本文所用，“三甲基化的H3-K27”指含三个与第27位赖氨酸氨基基团共价相连的甲基基团的组蛋白H3。三甲基化的H3-K27在本文中也称作H3-K27me3。
组蛋白H3是长136个氨基酸的蛋白，其序列已知。参见例如，GenBank登录号CAB02546，其内容通过引用纳入本文。如本文进一步公开的，除全长组蛋白H3以外，可使用含有对应于全长组蛋白H3中K27的赖氨酸残基的组蛋白H3肽段作为EZH2(和就EZH2突变形式而言类似)的底物，来评估H3-K27m1向H3-K27m2的转换和H3-K27m2向H3-K27m3的转换。在一个实施方式中，所述肽段对应于组蛋白H3的氨基酸残基21-44。所述肽段具有氨基酸序列LATKAARKSAPATGGVKKPHRYRP(SEQIDNO:13)。
所述方法涉及：向表达EZH2的Y641突变体的对象给予治疗有效量的EZH2抑制剂，其中，所述抑制剂抑制EZH2的组蛋白甲基转移酶活性，从而抑制所述对象中H3-K27向三甲基化H3-K27转换。在一个实施方式中，表达EZH2的Y641突变体的对象指具有可检测量的Y641突变EZH2多肽的对象。在一个实施方式中，表达EZH2的Y641突变体的对象指具有可检测量的Y641突变EZH2多肽编码核酸的对象。
Y641突变EZH2多肽可使用任何合适的方法检测。例如，可以使用特异性结合所述Y641突变EZH2多肽或特异性结合有Y641突变EZH2多肽特点的肽段的抗体检测Y641突变EZH2多肽。有所述Y641突变EZH2多肽特点的肽段可包括例如，SEQIDNO:6中提供的SET结构域，除了由非酪氨酸的氨基酸残基替代Y641。在另一个实施方式中，有所述Y641突变EZH2特点的肽段可包括例如，SEQIDNO:6中提供的SET结构域的10～113个氨基酸片段，除了由非酪氨酸的氨基酸残基替代Y641，前提是所述片段包括对应于Y641的氨基酸残基。预计所述抗体的抗原包括对应于野生型EZH2的Y641的氨基酸残基。认为抗体特异性结合Y641突变EZH2多肽或有Y641突变EZH2多肽特点的肽段，条件是其结合所述突变EZH2多肽或其肽段，但不结合相应的野生型EXH2多肽或其肽段。在一个实施方式中，认为所述抗体特异性结合Y641突变EZH2多肽或有Y641突变EZH2多肽特点的肽段，条件是所述抗体结合所述突变EZH2多肽或其肽段的亲和性比相应野生型EZH2多肽或其肽段高至少约100倍。在一个实施方式中，认为所述抗体特异性结合EZH2多肽的Y641突变体或有EZH2多肽的Y641突变体特点的肽段，条件是所述抗体结合所述突变EZH2多肽或其肽段的亲和性比相应野生型EZH2多肽或其肽段高至少约1000倍。可在例如酶联免疫吸附实验(ELISA)或Western印迹实验中使用所述抗体。
在一个实施方式中，所述抗体是单克隆抗体。可以按照本领域熟知的传统方法准备单克隆抗体。参见例如，和Milstein(1975)Nature256(5517):495-7。
作为另一示例，可以使用质谱(MS)检测Y641突变EZH2多肽，例如电喷雾电离-飞行时间(ESI-TOF)或基体辅助激光解吸/电离-飞行时间(MALDI-TOF)质谱。所述方法是本领域众所周知的。所述分析可涉及鉴定包含感兴趣突变的一个或多个肽段，例如，长12～24个氨基酸的肽，其包含跨对应于野生型EZH2中Y641的氨基酸的序列。
编码Y641突变EZH2多肽或有Y641突变EZH2多肽特点的肽段的核酸可使用任何合适的方法检测。例如编码Y641突变EZH2多肽的核酸可使用合适选定来源的DNA和多聚酶链式反应(PCR)引物依照本领域熟知的方法，用全基因组重测序或目标区域重测序(后者也称为靶向重新测序)来检测。参见例如，Bentley(2006)CurrOpinGenetDev.16:545-52和Li等.(2009)GenomeRes19:1124-32。所述方法通常一般包括以下步骤：基因组DNA纯化、PCR扩增以扩增感兴趣的区域、循环测序、测序反应清除、毛细管电泳和数据分析。用于覆盖感兴趣区域的高质量PCR引物使用计算机模拟引物设计工具来设计。循环测序是一种简单方法，其中热循环仪内连续数轮变性、退火和延伸会产生延伸产物的线性扩增。所述产物通常以鉴定末端核苷酸碱基G、A、T或C的荧光标签终止。
清洗移除可能竞争毛细管电泳注射的未掺入染料终止剂和盐。在毛细管电泳期间，循环测序反应的产物在充满聚合物的毛细管内迁移。带负电的DNA片段在其通过所述毛细管向正电极移动时按尺寸分离。电泳后，数据收集软件创建原始数据的样品文件。使用下游应用软件，运行进一步数据分析以将收集的色彩数据图像转换成相应的核苷酸碱基。替代地或此外，所述方法可包括使用基于微阵列的目标区域基因组DNA捕获和/或测序。用于选择合适PCR引物和进行重测序的试剂盒、试剂和方法市售可得，例如来自应用生物***公司(AppliedBiosystems)、安捷伦(Agilent)和NimbleGen(罗氏诊断公司(RocheDiagnosticsGmbH))。已使用诸如此类的方法来检测JAK2和骨髓增殖白血病基因(MPL)突变，并诊断真性红细胞增多症、原发性血小板增多症和特发性骨髓纤维变性。对于本发明的应用，可选择PCR引物来扩增例如至少相关部分的SEQIDNO:7(上述)。
替代地或此外，编码Y641突变EZH2多肽的核酸可以用Southern印迹依照本领域熟知方法来检测。在一个实施方式中，编码Y641突变EZH2多肽的DNA序列使用高严谨条件下的核酸杂交来检测。选择核酸探针，使其序列与靶核酸序列互补，所述靶核酸序列包括对应于野生型EZH2中Y641的突变氨基酸的密码子。
在高严谨条件下使序列特异性探针结合待测样品。本文所用的术语“高严格谨条件”指本领域常用的参数。核酸杂交参数可见于汇编所述方法的参考文献，例如，J.Sambrook等编，MolecularCloning:ALaboratoryManual(《分子克隆：实验室手册》),第二版，纽约冷泉港的冷泉港实验室出版社(ColdSpringHarborLaboratoryPress)，1989，或F.M.Ausubel等编，CurrentProtocolsinMolecularBiology(《新编分子生物学实验指南》)，纽约的约翰威立父子出版公司（JohnWiley&Sons,Inc.)。更具体地，本文所用的“高严谨条件”指，例如，在杂交缓冲液(3.5×SSC、0.02%Ficoll、0.02%聚乙烯吡咯烷酮、0.02%牛血清白蛋白(BSA)、2.5mMNaH2PO4(pH7)、0.5%SDS、2mMEDTA)中65°C杂交。SSC是0.15M氯化钠/0.015M柠檬酸钠、pH7；SDS是十二烷基磺酸钠；EDTA是乙二胺四乙酸。杂交后，清洗其上转移了所述DNA的膜，例如，在2×SSC中室温清洗，然后在0.1-0.5×SSC/0.1×SDS中至多68°C清洗。
还能使用其它条件、试剂等，其产生相似程度的严谨性。本领域技术人员熟悉所述条件，因而不在此处给出所述条件。但是应理解，本领域技术人员可以能清楚鉴定本发明EZH2相关核酸的方式操作所述条件(例如，通过使用较低严谨性的条件)，所述EZH2相关核酸特定包括编码EZH2的Y641突变体的核酸。本领域技术人员还熟悉筛选用于表达所述分子的细胞和库的方法，随后可将其常规分离，然后分离相关核酸分子并测序。
向所述对象给予治疗有效量的EZH2抑制剂。本文所用的“EZH2抑制剂”一般指小分子，即分子量小于约1.5千道尔顿(kDa)的分子，其能够干扰EZH2的组蛋白甲基转移酶酶促活性。
在一个实施方式中，所述EZH2抑制剂会抑制野生型EZH2的组蛋白甲基转移酶活性。在一个实施方式中，所述EZH2抑制剂会抑制EZH2的Y641突变体的组蛋白甲基转移酶活性。在一个实施方式中，所述EZH2抑制剂会抑制野生型EZH2的组蛋白甲基转移酶活性和EZH2的Y641突变体的组蛋白甲基转移酶活性。在一个实施方式中，所述EZH2抑制剂选择性抑制EZH2的Y641突变体的组蛋白甲基转移酶活性。
本文公开的EZH2的某些Y641突变体是在将未甲基化的H3-K27转换成H3-K37me1方面相对欠佳的催化剂，不过其出乎预料地在将H3-K27me2转换成H3-K27me3方面是有效催化剂。相反地，野生型EZH2在将未甲基化的H3-K27转换成H3-K27me1方面是相对有效的催化剂，但出乎预料地在将H3-K27me2转换成H3-K27me3方面是无效催化剂。这是重要的，因为H3-K27的单、双和三甲基化状态在转录控制中显示不同功能。例如，H3-K27me1与准备转录的基因的活性转录相关联，而H3-K27me3与转录抑制基因或在H3-K4三甲基化为顺式时准备转录的基因相关联。因此，选择性抑制所述EZH2的Y641突变体的组蛋白甲基转移酶活性会影响H3-K27三甲基化形式生成的选择性抑制，从而有利于H3-K27me1相关转录，而不利于H3-K27相关转录抑制。
当EZH2抑制剂对EZH2的Y641突变体的组蛋白甲基转移酶活性抑制比其对野生型EZH2的组蛋白甲基转移酶活性抑制更有效时，Ezh2的抑制剂“选择性抑制”EZH2的Y641突变体的组蛋白甲基转移酶活性。例如，在一个实施方式中，所述选择性抑制剂对EZH2的Y641突变体的IC50比对野生型EZH2的IC50低至少40%。在一个实施方式中，所述选择性抑制剂对EZH2的Y641突变体的IC50比对野生型EZH2的IC50低至少50%。在一个实施方式中，所述选择性抑制剂对EZH2的Y641突变体的IC50比对野生型EZH2的IC50低至少60%。在一个实施方式中，所述选择性抑制剂对EZH2的Y641突变体的IC50比对野生型EZH2的IC50低至少70%。在一个实施方式中，所述选择性抑制剂对EZH2的Y641突变体的IC50比对野生型EZH2的IC50低至少80%。在一个实施方式中，所述选择性抑制剂对EZH2的Y641突变体的IC50比对野生型EZH2的IC50低至少90%。
在一个实施方式中，所述EZH2的Y641突变体的选择性抑制剂对野生型EZH2基本不起抑制作用。
所述抑制剂抑制H3-K27me2向H3-K27me3的转换。在一个实施方式中，所述抑制剂据称抑制H3-K27的三甲基化。由于H3-K27me1向H3-K27me2的转换先于H3-K27me2向H3-K27me3的转换，抑制H3-K27me1向H3-K27me2转换的抑制剂自然也抑制H3-K27me2向H3-K27me3的转换，即，其抑制H3-K27的三甲基化。也有可能抑制H3-K27me2向H3-K27me3的转换，而不抑制H3-K27me1向H3-K27me2的转换。这种类型的抑制也造成H3-K27三甲基化的抑制，尽管不抑制H3-K27的双甲基化。
在一个实施方式中，所述抑制剂抑制H3-K27me1向H3-K27me2的转换和H3-K27me2向H3-K27me3的转换。所述抑制剂可直接单独抑制H3-K27me1向H3-K27me2的转换。或者，所述抑制剂可直接抑制H3-K27me1向H3-K27me2的转换以及H3-K27me2向H3-K27me3的转换。
所述抑制剂抑制组蛋白甲基酶活性。组蛋白甲基酶活性的抑制可以用任何合适的方法检测。例如，可以组蛋白甲基酶活性速率或组蛋白甲基酶活性的产物形式来测量所述抑制。适用于这些读取的方法包括在下面的实施例中。
所述抑制与合适阴性对照相比是可测的抑制。在一个实施方式中，抑制是与合适阴性对照相比至少10%的抑制。即，用所述抑制剂的酶促活性速率或产物量少于或等于90%的不用所述抑制剂产生的相应速率或量。在多种其它实施方式中，抑制是与合适阴性对照相比至少20%、25%、30%、40%、50%、60%、70%、75%、80%、90%或95%的抑制。在一个实施方式中，抑制是与合适阴性对照相比至少99%的抑制。即，用所述抑制剂的酶促活性速率或产物量少于或等于1%的不用所述抑制剂产生的相应速率或量。
在一个实施方式中，所述抑制剂是S-腺苷-L-高半胱氨酸(SAH)。SAH具有结构式
且从多个供应商市售可得，包括例如，密苏里州圣路易斯的西格玛-艾尔德里奇公司(Sigma-Aldrich)。SAH描述成由S-腺苷甲硫氨酸依赖性甲基转移酶作用的转甲基抑制剂。
在一个实施方式中，所述抑制剂是化合物75
或其药学上可接受的盐。
在某些实施方式中，本发明包括进行分析以检测来自对象的样品中EZH2的Y641突变体的步骤。该类分析如上所述。本文所用的“来自对象的样品”指含有获自或源自对象的细胞或细胞成分的任何合适样品。在一个实施方式中，所述样品包括怀疑表达EZH2的Y641突变体的细胞，例如，癌细胞。在一个实施方式中，所述样品是血液样品。在一个实施方式中，所述样品是活检样品，所述活检样品来自例如淋巴腺组织(例如***)或骨髓。在一个实施方式中，所述样品是活检样品，所述活检样品获自非淋巴腺组织(例如***)或骨髓或者除此以外的组织。例如，在一个实施方式中，所述样品是来自癌(例如由癌细胞构成的肿瘤)的活检物。所述样品中的细胞可以与所述样品的其它成分分离。例如，按照本领域技术人员熟悉的方法，***血单核细胞(PBMC)作为暗黄层可以从已经离心的血液样品分离。
当来自对象的样品的分析结果指示所述样品中存在EZH2的Y641突变体时，称所述对象表达所述EZH2的Y641突变体。实际上，在一个实施方式中，当来自对象的样品的分析结果指示所述样品中存在所述EZH2的Y641突变体时，鉴定所述对象为用EZH2抑制剂处理的候选者，其中，所述抑制剂选择性抑制所述EZH2的Y641突变体的组蛋白甲基转移酶活性。
当来自癌的样品的分析结果指示所述癌中存在EZH2的Y641突变体时，称所述癌表达所述EZH2的Y641突变体。
相似地，当来自患癌对象的包含癌细胞的样品分析结果指示所述样品中存在EZH2的Y641突变体时，称所述对象表达所述EZH2的Y641突变体。
本发明还提供患者对EZH2抑制剂的响应与H3-K27me2水平或优选H3-K27me和H3-K27me3水平间先前未认识到、令人吃惊的相关性。例如，相对于对照具有低H3-K27me2和正常或高me3水平的细胞对EZH2抑制剂的抗增殖作用的响应比具有正常H3-K27me2和me3水平的细胞多得多。
本发明的一个方面是测定对象内对EZH2抑制剂响应的方法。在一个实施方式中，所述方法包括从所述对象分离组织样品；检测所述组织样品中H3-K27的双甲基化(me2)水平；比较所述双甲基化(me2)水平和对照双甲基化(me2)水平；以及，当所述双甲基化(me2)水平缺失或低于所述对照双甲基化(me2)水平时，鉴定所述对象响应所述EZH2抑制剂。在一个实施方式中，所述方法还包括检测所述组织样品内H3-K27的三甲基化(me3)水平；比较所述三甲基化(me3)水平和对照三甲基化(me3)水平，并比较所述双甲基化(me2)水平和对照双甲基化(me2)水平；以及，当所述三甲基化(me3)水平等同于或高于所述对照三甲基化(me3)水平并且所述双甲基化(me2)水平缺失或低于所述对照双甲基化(me2)水平时，鉴定所述对象响应所述EZH2抑制剂。在另一个实施方式中，所述方法还包括获得所述组织样品中H3-K27的双甲基化(me2)水平与三甲基化(me3)水平的比例；获得所述对照双甲基化(me2)水平与对照三甲基化(me3)水平的对照比例；比较所述比例与所述对照比例；以及，在所述比例低于所述对照比例时，鉴定所述对象响应所述EZH2抑制剂。在一个优选实施方式中，所述对象患癌。在一个实施方式中，所述癌症是滤泡性淋巴瘤。或者，所述癌症是弥散性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)。在另一个优选实施方式中，所述对象表达EZH2的Y641突变体。在一个优选实施方式中，所述Y641突变体是Y641F、Y641H、Y641N或Y641S。
双甲基化H3-K27或三甲基化H3-K27的检测可以使用本领域的任何合适方法完成。在一个实施方式中，使用双甲基化H3-K27或三甲基化H3-K27特异性抗体检测甲基化水平。例如，分离的组织经***固定并包埋在石蜡块内以供长期保存。所述蜡块可用于制备切片以进行免疫组化染色或使用抗甲基化H3-K27的抗体来荧光染色。或者，可以从所分离的组织样品准备全细胞裂解物或组蛋白提取物，并后续用于免疫组化染色、western印迹分析或荧光染色。在另一个实施方式中，使用双甲基化H3-K27或三甲基化H3-K27特异性的多肽或适体检测甲基化水平。在另一个实施方式中，所述甲基化水平用质谱(MS)检测。
可以从对照样品建立对照二甲基化H3-K27或对照三甲基化H3-K27，例如，分离自所述对象的相邻非肿瘤组织，或分离自健康对象的健康组织。或者，可以用本领域已知的方法通过病理学家建立所述H3-K27me2或H3-K27me3的对照甲基化水平。
筛选方法
本发明的一个方面是用于鉴定测试化合物作为EZH2的Y641突变体的抑制剂的方法。在一个实施方式中，所述方法包括：使经分离EZH2的Y641突变体联合组蛋白底物、甲基基团供体(例如S-腺苷甲硫氨酸(SAM))和测试化合物，其中所述组蛋白底物包括选自下组的一种H3-K27形式：未甲基化H3-K27、单甲基化H3-K27、双甲基化H3-K27，及其任意组合；以及实行分析以检测所述组蛋白底物内的H3-K27甲基化，从而在所述测试化合物存在下的H3-K27甲基化少于所述测试化合物缺失下的H3-K27甲基化时，鉴定所述测试化合物为EZH2的Y641突变体的抑制剂。检测H3-K27甲基化的分析可选择成测量甲基化速率、甲基化程度或甲基化的速率和程度。
所述EZH2的Y641突变体作为PRC2复合物或其功能性等价物分离。本文所用的术语“分离”指基本与所述复合物天然出现时可一起发现的其它成分分离。化合物能分离而不必定要纯化。在一个实施方式中，EZH2的突变体分离为EZH2的Y641突变体与EED和SUZ12的复合物。在另一个实施方式中，EZH2的突变体分离为EZH2的Y641突变体与EED、SUZ12和RbAp48的复合物。在合适的条件下，PRC2复合物或其功能等价物显示对H3-K27的组蛋白甲基转移酶活性。在一个实施方式中，所述复合物由重组表达的成分多肽构成，例如EZH2、EED、SUZ12，有或没有RbAp48。
分离的EZH2的Y641突变体联合组蛋白底物。组蛋白底物包括可作为EZH2底物的组蛋白多肽或其片段的任何合适来源。在一个实施方式中，所述组蛋白底物包括分离自对象的组蛋白。可以使用任何合适的方法从对象的细胞分离所述组蛋白；所述方法为本领域技术人员熟知，从而在本文中不需进一步说明。参见例如，Fang等.(2004)MethodsEnzymol377:213-26。与下文的实施例一致，在一个实施方式中，所述组蛋白底物以核小体形式提供。与下文的实施例一致，在一个实施方式中，所述组蛋白底物以禽类(鸡)红细胞核小体形式提供。
如此提供的组蛋白底物可包括组蛋白修饰状态的混合物，包括用H3-K27甲基化状态特异性抗体由Western印迹判断的各种H3-K27甲基化状态。在一个实施方式中，所述组蛋白底物可以纯化的全长组蛋白H3形式提供。所述纯化的全长组蛋白H3可以涉及H3-K27甲基化状态的均质制备物形式提供，或者以多种H3-K27甲基化状态的混合物形式提供。可通过装载有合适H3-K27甲基化状态特异性抗体的免疫亲和柱或使用包被合适H3-K27甲基化状态特异性抗体的磁珠进行免疫沉淀来部分制备涉及H3-K27甲基化状态的经分离组蛋白H3的均质制备物。替代地或此外，H3-K27的甲基化状态可鉴定为进行所述分析的一部分。例如，起始材料组蛋白底物可以鉴定为含有50%未甲基化的H3-K27、40%单甲基化的H3-K27、10%双甲基化的H3-K27和0%三甲基化的H3-K27。
在一个实施方式中，所述组蛋白底物包括肽库或包含一种或多种组蛋白H3相关氨基酸序列的合适肽，所述氨基酸序列特定包括涵盖H3-K27的序列。例如，在一个实施方式中，所述组蛋白底物是对应于组蛋白H3氨基酸残基21-44的肽段。所述肽段具有氨基酸序列LATKAARKSAPATGGVKKPHRYRP(SEQIDNO:13)。可以按照本领域熟知的技术通过肽合成来制备所述肽库或肽，且可选地修饰所述肽库或肽，从而掺入任何所需程度的对应于H3-K27的赖氨酸甲基化。如下文的实施例中所述，该肽还能经修饰以纳入用于进行下游分析的标签(例如生物素)在一个实施方式中，所述标签附加在所述一种或多种肽的氨基(N)端。在一个实施方式中，所述标签附加在所述一种或多种肽的羧基(C)端。
H3-K27甲基化特异性抗体可从多个市售来源获得，所述市售来源包括例如，细胞信号转导技术公司(CellSignalingTechnology)(马萨诸塞州丹弗斯市)和ActiveMotif(加利福尼亚州卡尔斯巴德市)。
经分离EZH2的Y641突变体联合测试化合物。本文所用的“测试化合物”指分子量少于约1.5kDa的有机小分子。在一个实施方式中，测试化合物是已知化合物。在一个实施方式中，测试化合物是新化合物。在一个实施方式中，测试化合物可以作为所述化合物的库部分来提供，其中，所述库包括例如，数十、数百、数千或甚至更多化合物。可以在高通量筛选分析中有利地筛选化合物库，例如，使用测试化合物阵列并按照本领域熟知的一般技术进行机器人操作。
在某些实施方式中，测试化合物是SAH的衍生物或化合物75的衍生物。
H3-K27甲基化的检测可以使用任何合适的方法完成。在一个实施方式中，甲基基团供体源包括标记有可检测标签的甲基基团。在一个实施方式中，所述可检测的标签是同位素标签，例如氚。其它类型的标签可包括例如，荧光标签。
对三甲基化H3-K27形成的检测可以使用任何合适的方法完成。例如，对三甲基化H3-K27形成的检测可以使用以下分析完成：如上所述检测标记甲基基团的掺入，可选地联合色谱法或其它方法来根据尺寸分离标记产物，例如，聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)，毛细管电泳(CE)或高压液相色谱(HPLC)。替代地或此外，对三甲基化H3-K27形成的检测可以使用三甲基化H3-K27特异性抗体来完成。
检测单甲基化H3-K27向双甲基化H3-K27的转换可以使用任何合适的方法完成。在一个实施方式中，使用单甲基化H3-K27和双甲基化H3-k27特异性抗体来测量所述转换。例如，可以使用合适的单甲基化H3-K27和双甲基化H3-K27特异性抗体来测定单甲基化H3-K27和双甲基化H3-K27的起始量或浓度。在酶、底物、甲基基团供体和测试化合物组合后，使用合适的单甲基化H3-K27和双甲基化H3-K27特异性抗体测定单甲基化H3-K27和双甲基化H3-K27的所得量或浓度。然后，可以比较单甲基化H3-K27和双甲基化H3-K27的起始和所得量或浓度。替代地或此外，然后，可以将单甲基化H3-K27和双甲基化H3-K27的起始和所得量或浓度与阴性对照的相应量或浓度作比较。阴性对照反应能平行运行或作为历史对照，所述分析中不包括测试试剂。可选从所述实验反应的相应结果减去所述对照反应的结果，其先于上述比较或与上述比较联用。
由于H3-K27的双甲基化形式能在同一试验中进一步甲基化，单甲基化H3-K27的量或浓度减少可能不显现为直接对应于双甲基化H3-K27的增加。然而，在这种情况下，可以推测单甲基化H3-K27的量或浓度减少本身反映了单甲基化H3-K27向双甲基化H3-K27的转换。
检测双甲基化H3-K27向三甲基化H3-K27的转换可以使用任何合适的方法来完成。在一个实施方式中，使用双甲基化H3-K27和三甲基化H3-k27特异性抗体来测量所述转换。例如，可以使用合适的双甲基化H3-K27和三甲基化H3-K27特异性抗体来测定双甲基化H3-K27和三甲基化H3-K27的起始量或浓度。在酶、底物和测试化合物组合后，使用合适的双甲基化H3-K27和三甲基化H3-K27特异性抗体测定双甲基化H3-K27和三甲基化H3-K27的所得量或浓度。然后，可以比较双甲基化H3-K27和三甲基化H3-K27的起始和所得量或浓度。替代地或此外，随后可将双甲基化H3-K27和三甲基化H3-K27的起始和所得量或浓度与阴性对照的相应量或浓度作比较。阴性对照反应能平行运行或作为历史对照，所述分析中不包括测试试剂。可选从所述实验反应的相应结果减去所述对照反应的结果，其先于上述比较或与上述所做比较联用。
采用测试化合物的H3-K27甲基化少于不用所述测试化合物的H3-K27甲基化时，鉴定所述测试试剂为EZH2的Y641突变体的抑制剂。在一个实施方式中，当测试化合物存在下的三甲基化H3-K27形成少于不存在所述测试化合物时的三甲基化H3-K27形成时，鉴定所述测试试剂为EZH2的Y641突变体的抑制剂。
本发明的一个方面是用于鉴定EZH2的Y641突变体的选择性抑制剂的方法。在一个实施方式中，所述方法包括：组合经分离EZH2的Y641突变体与组蛋白底物、甲基基团供体(例如，SAM)和测试化合物，其中，所述组蛋白底物包括选自下组的一种H3-K27形式：单甲基化H3-K27、双甲基化H3-K27，以及单甲基化H3-K27和双甲基化H3-K27的组合，从而形成测试混合物；组合分离的野生型EZH2与组蛋白底物、甲基基团供体(例如，SAM)和测试化合物，其中，所述组蛋白底物包含选自下组的一种H3-K27形式：单甲基化H3-K27、双甲基化H3-K27，以及单甲基化H3-K27和双甲基化H3-K27的组合，从而形成对照混合物；实行分析以检测各测试混合物和对照混合物中组蛋白底物的三甲基化；计算(a)采用EZH2的Y641突变体加测试化合物(M+)的三甲基化对(b)采用EZH2的Y641突变体不加测试化合物(M-)的三甲基化的比例；计算(c)采用野生型EZH2加测试化合物(WT+)的三甲基化对(d)采用野生型EZH2不加测试化合物(WT-)的三甲基化的比例；比较比例(a)/(b)和比例(c)/(d)；当比例(a)/(b)小于比例(c)/(d)时，鉴定所述测试化合物为EZH2的Y641突变体的选择性抑制剂。在一个实施方式中，所述方法还包括就所述测试混合物之一或两者和所述对照混合物考虑阴性对照而没有测试化合物。
药物组合物
一种或多种EZH2拮抗剂可单独或以药物组合物形式向人患者给予，其中所述EZH2拮抗剂与合适的运载体或一种或多种赋形剂以治疗或改善本文所述疾病或病症的剂量混合。这些EZH2拮抗剂的混合物还能作为简单混合物或合适配制的药物组合物给予所述患者。例如，本发明的一方面涉及药物组合物，所述药物组合物包含治疗有效剂量的EZH2拮抗剂或其药学上可接受的盐、水合物、对映体或立体异构体；以及药学上可接受的稀释液或运载体。
EZH2拮抗剂的配制和给药技术可参见本领域普通技术人员的熟知参考文献，例如Remington的“TheScienceandPracticeofPharmacy(《药物科学与实践》),”第21版，LippincottWilliams&Wilkins2005。
合适的给药途径可以包括，例如口腔、直肠或肠内注射；胃肠外递送，包括静脉内、肌肉内、腹膜内、皮下或髓内注射，以及鞘内、直接心室内或眼内注射；局部递送，包括滴眼剂和透皮剂；以及鼻内和其它跨黏膜递送。
或者，可以局部而不是***方式对个体给予EZH2拮抗剂，例如，通过将所述EZH2拮抗剂直接注射进入水肿位点，所述EZH2拮抗剂通常是长效或持续释放制剂。
在一个实施方式中，通过直接注射入肿瘤或***来给予EZH2拮抗剂。
此外，可以通过靶向药物递送***例如在包被有癌细胞特异性抗体的脂质体内，给予EZH2拮抗剂。
可制造本发明的药物组合物，例如，通过常规的混合、溶解、造粒、制造糖衣丸、水飞、乳化、封装、包封或冻干工艺。
因此，可以使用一种或多种生理上可接受的运载体以传统方式配制根据本发明使用的药物组合物，所述运载体包含有利于加工所述活性EZH2拮抗剂成为药学上可用制品的赋形剂和助剂。适当的制剂依赖于所选的给药途径。
就注射而言，本发明的试剂可配制在水溶液中，优选生理相容性缓冲液，如汉克斯(Hank’s)溶液、林格(Ringer’s)溶液或生理盐水缓冲液。就经粘膜给药而言，在适合待渗透屏障的制剂中采用渗透剂。本领域通常已知此类渗透剂。
对于口腔给药，通过组合所述活性EZH2拮抗剂与本领域熟知的药学上可接受运载体可以容易地配制所述EZH2拮抗剂。此类载体使本发明的EZH2拮抗剂能配制为片剂、丸剂、糖衣丸、胶囊、液体、凝胶剂、糖浆、浆液、混悬剂等，以供治疗患者口服摄取。可通过以下方法获得口服用途的药物制剂：组合所述活性EZH2拮抗剂与固体赋形剂，任选研磨所得混合物，需要时在加入合适的辅助剂后加工颗粒混合物以获得片剂或糖衣丸芯。合适的赋形剂包括填充剂如糖，包括乳糖、蔗糖、甘露醇或山梨醇；纤维素制剂例如玉米淀粉、小麦淀粉、水稻淀粉、马铃薯淀粉、明胶、黄蓍胶、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠和/或聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。如果需要，可加入崩解剂，例如交联聚乙烯吡咯烷酮、琼脂、或藻酸或其盐如藻酸钠。糖衣丸芯具有合适包衣。出于此目的，可使用浓缩糖溶液，其可选地含有***胶、滑石粉、聚乙烯吡咯烷酮、卡波姆凝胶、聚乙二醇和/或二氧化钛、漆溶液和合适的有机溶剂或溶剂混合物。可将染料或颜料加入片剂或糖衣丸包衣中，用于标识或表征活性EZH2拮抗剂剂量的不同组合。
可口服使用的药物制剂包括明胶制成的推入式(push-fit)胶囊，以及明胶和增塑剂(如甘油或山梨糖醇)制成的密封胶囊。推入式胶囊可含有活性成分，该活性成分可与填充剂如乳糖、粘合剂如淀粉、和/或润滑剂如滑石粉或硬脂酸镁以及任选的稳定剂混合。在软胶囊中，活性EZH2拮抗剂可溶解或悬浮于合适液体如脂肪油、液体石蜡或液体聚乙二醇中。此外，可加入稳定剂。
就含服给药而言，该组合物可采用常规方式配制的片剂或锭剂形式。
就吸入给药而言，使用合适推进剂(如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其它合适的气体)从加压包装或喷雾器中以气溶胶喷雾形式方便地递送根据本发明使用的EZH2拮抗剂。在加压气溶胶的情况下，可通过提供阀门递送计量用量，来确定剂量单位。用于吸入或吹入器的胶囊和药筒(例如，明胶)可配制成含有EZH2拮抗剂和合适粉末基料如乳糖或淀粉的粉末混合物。
可以配制通过注射，如推注或连续输注进行胃肠外给药的EZH2拮抗剂。用于注射的制剂可以单位剂型存在，例如装在安瓿或多剂量容器中，添加有防腐剂。该组合物可采用诸如油性或水性载剂中悬浮剂、溶液剂或乳剂的形式，可含有配方试剂，如助悬剂、稳定剂和/或分散剂。
用于肠胃外给药的药物制剂包括水溶性形式的活性EZH2拮抗剂的水溶液。此外，活性EZH2拮抗剂的悬液可制备为合适的油性注射悬液。合适的亲脂性溶剂或载剂包括脂肪油如芝麻油，或合成脂肪酸酯如油酸乙酯或甘油三酯，或脂质体。水性注射悬液可包含增加悬液粘度的物质，如羧甲基纤维素钠、山梨糖醇或右旋糖苷。悬液可选还包含合适的稳定剂或增加EZH2拮抗剂溶解度以制备高浓缩溶液的试剂。
或者，活性成分可以是使用合适的载剂如无菌无热原水前用于重建的粉末形式。
所述EZH2拮抗剂也可配制成直肠组合物，例如栓剂或滞留灌肠剂，例如含有常规栓剂基料，如可可油或其他甘油酯。
除了前述制剂外，所述EZH2拮抗剂也可配制成长效制剂。这种长效制剂可通过植入(例如，皮下或肌肉内或肌肉内注射)给药。因此，例如，所述EZH2拮抗剂也可用合适的聚合物材料或疏水材料(例如，溶于可接受油的乳剂)或离子交换树脂配制，或者配制成微溶性衍生物(例如，微溶性盐)。
或者，可以使用用于疏水药物EZH2拮抗剂的其它递送***。脂质体和乳剂是用于疏水药物的递送载剂或运载体的例子。还可以使用某些有机溶剂例如二甲亚砜。另外，可以使用持续释放***例如包含所述治疗剂的固体疏水聚合物的半透性基质来递送所述EZH2拮抗剂。许多持续释放材料已建立并且为本领域技术人员熟知。持续释放胶囊根据其化学性质，可释放所述EZH2拮抗剂数周，至多超过100天。取决于所述治疗性试剂的化学性质和生物稳定性，可以使用其它蛋白稳定策略。
药物组合物还能包括合适的固体或凝胶相运载体或赋形剂。这些运载体或赋形剂的例子包括但不限于：碳酸钙，磷酸钙，各种糖，淀粉，纤维素衍生物，明胶，和聚合物如聚乙二醇。
治疗方法
本文提供治疗或预防病症和疾病的方法，所述病症和疾病的进程可通过调节组蛋白或其它蛋白的甲基化状态来影响，其中，所述甲基化状态至少部分由EZH2活性介导。所述组蛋白甲基化状态的调节能进而影响由甲基化激活的靶基因和/或由甲基化抑制的靶基因的表达水平。
例如，本发明的一个方面涉及用于治疗癌症的方法。所述方法包括以下步骤：向患有表达EZH2的Y641突变体的癌症的对象给予治疗有效量的EZH2抑制剂，其中，所述抑制剂抑制EZH2的组蛋白甲基转移酶活性，从而治疗所述癌症。在一个实施方式中，所述抑制剂抑制EZH2的Y641突变体的组蛋白甲基转移酶活性。在一个实施方式中，所述抑制剂选择性抑制EZH2的Y641突变体的组蛋白甲基转移酶活性。在一个实施方式中，所述癌症是滤泡性淋巴瘤。在一个实施方式中，所述癌症是弥散性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)。
本发明的一个方面涉及用于治疗癌症的方法。所述方法包括以下步骤：实行分析以检测样品中EZH2的Y641突变体，所述样品包含来自患癌对象的癌细胞；以及向表达EZH2的Y641突变体的对象给予治疗有效量的EZH2抑制剂，其中，所述抑制剂抑制EZH2的组蛋白甲基转移酶活性，从而治疗所述癌症。在一个实施方式中，所述抑制剂抑制EZH2的Y641突变体的组蛋白甲基转移酶活性。在一个实施方式中，所述抑制剂选择性抑制EZH2的Y641突变体的组蛋白甲基转移酶活性。在一个实施方式中，所述癌症是滤泡性淋巴瘤。在一个实施方式中，所述癌症是弥散性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)。
诸如癌症和神经疾病的疾病能通过给予蛋白(例如组蛋白)甲基化调节剂来治疗，所述调节剂例如组蛋白甲基转移酶调节剂或组蛋白去甲基化酶活性调节剂。已报道组蛋白甲基化涉及癌症中某些基因的异常表达和非神经元细胞中神经元基因的沉默。本文所述的调节剂能用于治疗所述疾病，即，抑制受影响细胞中的组蛋白甲基化。
已发现增加的组蛋白甲基化与某些癌症相关联，至少基于这个事实，用于在对象内治疗癌症的方法包括向需要的对象给予治疗有效量的化合物，所述化合物抑制甲基化或恢复其甲基化水平到大致对应正常细胞中的水平。在一个实施方式中，用于在对象内治疗癌症的方法包括向需要的对象给予治疗有效量的化合物，所述化合物抑制未甲基化H3-K27向单甲基化H3-K27(H3-K27me1)转换。在一个实施方式中，用于在对象内治疗癌症的方法包括向需要的对象给予治疗有效量的化合物，所述化合物抑制单甲基化H3-K27(H3-K27me1)向双甲基化H3-K27(H3-K27me2)转换。在一个实施方式中，用于在对象内治疗癌症的方法包括向需要的对象给予治疗有效量的化合物，所述化合物抑制H3-K27me2向三甲基化H3-K27(H3-K27me3)转换。在一个实施方式中，用于在对象内治疗癌症的方法包括向需要的对象给予治疗有效量的化合物，所述化合物抑制H3-K27me1向H3-K27me2的转换以及H3-K27me2向H30K27me3的转换。重要的是要注意疾病特异性甲基化增加能在关键基因座中的染色质处出现，而组蛋白或蛋白质的甲基化在细胞水平没有全面增加。例如，针对全组蛋白或蛋白的低甲基化背景，可能在关键疾病相关基因处出现异常高甲基化。
通常可以使用甲基化调节剂来调节细胞增殖。例如，在一些情况下，可以采用减少甲基化的试剂来降低过度增殖，而采用增加甲基化的试剂来促进不足的增殖。因此，可治疗的疾病包括过度增殖疾病，例如良性细胞生长和恶性细胞生长(癌症)。
可治疗的示例性癌症包括淋巴瘤，包括滤泡性淋巴瘤(FL)和弥散性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)。
其它癌症包括急性淋巴细胞白血病、急性髓细胞白血病、肾上腺皮质癌、艾滋病相关癌症、艾滋病相关淋巴瘤、***癌、(儿童小脑)星形细胞瘤、(儿童脑)星形细胞瘤、基底细胞癌(参见皮肤癌(非黑色素瘤))、肝外胆管癌、膀胱癌、(骨肉瘤/恶性纤维组织细胞瘤)骨癌、脑干胶质瘤、脑瘤、(小脑星形细胞瘤)脑瘤、(大脑星形细胞瘤/恶性胶质瘤)脑瘤、(脑室膜瘤)脑瘤、(成神经管细胞瘤)脑瘤、(幕上原始神经外胚层肿瘤)脑瘤、(视觉通路和下丘脑胶质瘤)脑瘤、乳腺癌、支气管腺瘤/类癌瘤、伯基特氏淋巴瘤、类癌瘤、(胃肠)类癌瘤、未知原发癌、(原发)中枢神经***淋巴瘤、小脑星形细胞瘤、子***、儿童癌症、慢性淋巴细胞白血病、慢性髓细胞性白血病、(毛细胞)慢性髓细胞性白血病、慢性骨髓/外骨髓增殖性疾病、结肠癌、结肠直肠癌、皮肤T淋巴细胞瘤(参见蕈样肉芽肿和塞扎里(Sezary)综合症)、子宫内膜癌、食道癌、尤文氏(Ewing’s)家族肿瘤、肝外胆管癌、(眼内黑色素瘤)眼癌、(成视网膜细胞瘤)眼癌、胆囊癌、胃部(胃)癌、胃肠道类癌瘤、(颅外)生殖细胞瘤、(性腺外)生殖细胞瘤、(卵巢)生殖细胞瘤、妊娠性滋养层细胞瘤、神经胶质瘤、(儿童脑干)神经胶质瘤、(儿童脑星形细胞瘤)神经胶质瘤、(儿童视觉通路和下丘脑)神经胶质瘤、多毛细胞白血病、头颈癌、(成人(原发))肝细胞(肝)癌、(儿童(原发))肝细胞(肝)癌、霍奇金(Hodgkin’s)淋巴瘤、孕期霍奇金(Hodgkin’s)淋巴瘤、下咽癌、下丘脑和视神经胶质瘤、眼内黑色素瘤、胰岛细胞癌(内分泌胰腺)、卡波济(Kaposi’s)肉瘤、肾(肾细胞)癌、肾癌、喉癌、血癌、唇和口腔癌、(成人(原发))肝癌、(儿童(原发))肝癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、(中枢神经***原发)淋巴瘤、(瓦氏(Waldenstrom’s))巨球蛋白血症、骨/骨肉瘤恶性纤维组织细胞瘤、成神经管细胞瘤、(恶性)黑色素瘤、梅克尔(Merkel)细胞癌、间皮瘤、成人恶性间皮瘤、隐匿原发转移性鳞状***、多发性内分泌肿瘤综合症、多发性骨髓瘤、多发性骨髓瘤/浆细胞恶性蕈样肉芽肿、骨髓增生异常综合症、骨髓增生异常/骨髓增生性疾病、成人急性髓细胞白血病、儿童急性髓细胞白血病、慢性骨髓增生性疾病、鼻腔和鼻旁窦癌、鼻咽癌、成神经细胞瘤、非霍奇金(Hodgkin’s)淋巴瘤、孕期非霍奇金(Hodgkin’s)淋巴瘤、口腔癌、(唇和口咽癌)口腔癌、骨肉瘤/骨恶性纤维组织细胞瘤、卵巢癌、卵巢上皮性癌、卵巢低恶性潜能瘤、胰腺癌、胰岛细胞胰腺癌、鼻旁窦和鼻腔癌、甲状旁腺癌、***癌、嗜铬细胞瘤、松果体母细胞瘤和幕上原发神经外胚层瘤、垂体瘤、浆细胞恶性瘤和多发性骨髓瘤、胸膜肺母细胞瘤、妊娠和乳癌、***癌、直肠癌、(遗传性)眼癌、横纹肌肉瘤、唾液腺癌、(尤文氏(Ewing’s)肿瘤家族)肉瘤、软组织肉瘤、子宫肉瘤、塞扎里(Sezary)综合症、皮肤癌、皮肤癌(非黑色素瘤)、小肠癌、软组织肉瘤、鳞状细胞癌(参见皮肤癌(非黑色素瘤))、转移性隐匿原发鳞状***、胃(胃部)癌、睾丸癌、胸腺瘤、胸腺瘤和胸腺癌、甲状腺癌、肾盂和输尿管移行细胞癌、妊娠期滋养叶瘤、未知原发位置的癌、儿童罕见癌症、尿道癌、子宫内膜子宫癌、子宫肉瘤、***癌、视觉通路和下丘脑胶质瘤、外阴癌、瓦氏(Waldenstrom’s)巨球蛋白血症、维尔姆斯(Wilms’)瘤，以及女性癌症。
其中由EZH2介导的表观遗传甲基化起作用的任何其它疾病，可以使用本文所述的化合物和方法成为可治疗的或可预防的疾病。
例如，可治疗的神经疾病包括癫痫、精神***症、双向障碍或其它心理上和/或精神障碍、神经病、骨骼肌萎缩和神经变性疾病，例如，神经变性疾病。示例性的神经变性疾病包括：老年痴呆症、肌肉萎缩性一侧硬化(ALS)和帕金森病。另一类神经变性疾病包括至少部分由多聚谷氨酰胺聚集引起的疾病。该类疾病包括：亨廷顿氏(Huntington’s)病、脊髓延髓性肌萎缩(SBMA或肯尼迪氏(Kennedy’s)病)、齿状核红核苍白球丘脑下核萎缩(DRPLA)、1型脊髓小脑性共济失调(SCA1)、2型脊髓小脑性共济失调(SCA2)、马查多-约瑟夫(Machado-Joseph)病(MJD；SCA3)、6型脊髓小脑性共济失调(SCA6)、7型脊髓小脑性共济失调(SCA7)和12型脊髓小脑性共济失调(SCA12)。
本文还提供选择用于治疗患癌对象的方法。所述方法包括通过双甲基化H3-K27水平，优选通过双甲基化H3-K27水平和三甲基化H3-K27水平来测定所述对象对EZH2抑制剂的响应；以及在所述对象响应所述EZH2抑制剂时向所述对象提供所述EZH2抑制剂。在一个实施方式中，所述癌症是滤泡性淋巴瘤。或者，所述癌症是弥散性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)。在另一个优选实施方式中，所述对象表达EZH2的Y641突变体。在一个优选实施方式中，所述Y641突变型是Y641F、Y641H、Y641N或Y641S。
联合治疗
本发明的一个方面中，EZH2拮抗剂或其药学上可接受的盐能与其它治疗剂联用来治疗疾病例如癌症和/或神经疾病。例如，所述其它试剂可以是本领域已知用于治疗由本发明化合物所治疗疾病或病症的治疗剂。所述其它试剂还可以是为所述治疗组合物提供有益属性的试剂(例如，影响所述组合物粘性的试剂)。
本发明考虑的联合治疗包括，例如以单一药剂的形式给予本发明的化合物或其药学上可接受的盐和一种或多种其他试剂，以及以分开药剂的形式给予本发明的化合物或其药学上可接受的盐和一种或多种其他试剂。换言之，共给予应意味着向对象给予至少两种试剂，以提供两种试剂组合的有益作用。例如，可以同时或在一段时间内依序给予所述试剂。
以下列出的试剂是用于说明目的，而非意在限定。作为本发明一部分的所述组合可以是本发明的化合物和选自以下列表至少一种其他试剂的组合。所述组合还可以包括多于一种其他试剂，例如，两种或三种其他试剂，条件是所述组合使所形成的组合物能够行使其预期功能。
例如，本发明的一个方面涉及EZH2拮抗剂与其它试剂在治疗癌症和/或神经疾病中的应用。在一个实施方式中，其他试剂是抗癌剂，所述抗癌剂是影响组蛋白修饰的化合物，例如HDAC抑制剂。在某些实施方式中，其他抗癌剂选自化疗剂(例如2CdA、5-FU、6-巯基嘌呤、6-TG、AbraxaneTM、放线菌素D、 全反式视黄酸、氨甲蝶呤、Ara-C、阿扎胞苷（Azacitadine）、BCNU、 氯法拉滨(Clofarabine)、ClolarTM、盐酸柔红霉素、 磷酸依托泊苷、 六甲三聚氰胺、 伊沙匹隆(ixabepilone)、左旋天门冬酰胺酶(L-asparaginase)、脂质体Ara-C、L-PAM、Lysodren、光辉霉素(mithracin)、丝裂霉素C、 尼洛替尼(nilotinib)、氮芥、 有卡氯芥植入的prolifeprospan20、 TESPA、 VidazaTM、硫酸醛基长春碱、VM26、和生物制剂(诸如α干扰素、卡介苗、 厄洛替尼(Erlotinib)、白细胞介素-2、来那度胺(lenalidomide)、 TarcevaTM、 和皮质类固醇、(诸如地塞美松磷酸钠、和激素疗法(诸如 PlenaxisTM和以及放射性药剂(诸如 和钐SM-153)。
剂量
本文所用的“治疗有效量”或“治疗有效剂量”是完全或部分抑制所述病症发展或至少部分减轻一种或多种病症症状的EZH2拮抗剂或两种或更多所述化合物组合的量。治疗有效量还可以是预防上有效的量。治疗有效的量取决于患者的体型和年龄、待治疗病症、所述病症的严重性和寻求的结果。在一个实施方式中，治疗有效剂量指引起患者内症状改善的EZH2拮抗剂的量。对于给定的患者，治疗有效量可以由本领域技术人员已知的方法决定。
EZH2的毒性和治疗效力可以通过标准药学程序在细胞培养物或实验动物内测定，例如，用于测定最大耐受剂量(MTD)和ED50(引起50%最大响应的有效剂量)。毒性和疗效间的剂量比是治疗指数，可表示为MTD和ED50之比。获自这些细胞培养实验和动物研究的数据可用于配制一定范围的剂量以用于人体。还可以通过检测EZH2拮抗剂对患病或替代组织的酶抑药效标志物(例如，组蛋白甲基化或靶基因表达)的影响来指导剂量。可以使用细胞培养或动物实验来测定药效标志物变化所需剂量和治疗效力所需剂量之间的关系，可在细胞培养或动物实验或早期临床试验中予以测定。这类EZH2拮抗剂的剂量优选处于包括ED50在内的循环浓度范围内，毒性很小或无毒性。该剂量可根据所用剂型和所用给药途径在此范围内变化。精确制剂，给药途径和剂量可以由单独医师根据患者病症而选择。在危重症治疗中，可能需要使用急性推注或近似MTD的输注给药以获得快速响应。
可以根据个体调整剂量和时间间隔，从而提供充足的活性部分血浆水平以维持所述甲基转移酶调节效果或所需时段的最小有效浓度(MEC)以达到治疗功效。所述MEC随各EZH2拮抗剂而不同，但可由体外数据和动物实验来估计。达到所述MEC必需的剂量将取决于个体特点和给药途径。然而，可以使用高压液相色谱(HPLC)分析或生物测定来检测血浆浓度。
还可使用MEC值来确定剂量间隔。在某些实施方式中，应采用方案使给予的EZH2拮抗剂的血浆水平在10～90%的所述时间保持在MEC之上直至达到所需的症状改善，所述时间优选为30～90%，最优选50～90%。在其它实施方式中，MEC血浆水平将维持不同的时间量。在局部给药或选择性摄取的情况下，药物的局部有效浓度可能与血浆浓度无关。
本领域技术人员可以从众多给药方案中选择，而给予的EZH2拮抗剂的量当然取决于接受治疗的患者、所述对象的体重、病痛的严重度、给药的方式和处方医师的判断。
化合物和药物组合物
本发明的多个方面涉及根据本发明方法使用的化合物。本文中称这些化合物为“EZH2抑制剂”，和等同的“EZH2拮抗剂”。所述化合物可以作为化合物本身或所述化合物的药学上可接受盐或药物组合物的形式呈现。
所述化合物具体包括化合物75
及其药学上可接受的盐。
本发明还包括某一药物组合物，所述药物组合物包含化合物75
或其药学上可接受的盐。
EZH2拮抗剂和可选的其它治疗剂可以其本身(纯)或以药学上可接受盐的形式给药。应用于医学时，所述盐应是药学上可接受的，但是可以方便地使用非药学上可接受的盐来制备其在药学上可接受的盐。
根据本发明使用的化合物可以有药学上相容性抗衡离子的盐形式提供(即，药学上可接受的盐)。“药学上可接受的盐”指的是任何非毒性盐，所述盐给予受体后能直接或间接地提供本发明所用的化合物或化合物的前药。“药学上可接受的抗衡离子”指盐的离子部分，所述离子部分在给予对象后从盐释放出时无毒。药学上相容性盐可以用多种酸形成，所述酸包括但不限于盐酸、硫酸、乙酸、乳酸、酒石酸、苹果酸和琥珀酸。在水或其它质子溶剂中盐比其对应的游离碱形式更易于溶解。本发明包括所述盐的应用。
药学上可接受的酸加成盐包括那些由无机酸例如盐酸和氢溴酸形成的盐，以及那些由有机酸例如马来酸形成的盐。例如，常用于形成药学上可接受盐的酸包括无机酸例如二硫化氢酸、盐酸、氢溴酸、氢碘酸、硫酸和磷酸，以及有机酸例如对甲苯磺酸、水杨酸、酒石酸、双酒石酸、抗坏血酸、马来酸、苯磺酸、富马酸、葡萄糖酸、葡萄糖醛酸、蚁酸、谷氨酸、甲磺酸、乙磺酸、苯磺酸、乳酸、草酸、对溴苯磺酸、碳酸、琥珀酸、柠檬酸、苯甲酸和乙酸，以及相关的无机酸和有机酸。因此，这种药学上可接受的盐包括硫酸盐、焦硫酸盐、硫酸氢盐、亚硫酸盐、重亚硫酸盐、磷酸盐、磷酸一氢盐、磷酸二氢盐、偏磷酸盐、焦磷酸盐、氯化物、溴化物、碘化物、醋酸盐、丙酸盐、癸酸盐、辛酸盐、丙烯酸盐、甲酸盐、异丁酸盐、癸酸盐、庚酸盐、丙炔酸盐、草酸盐、丙二酸盐、琥珀酸盐、辛二酸盐、癸二酸盐、延胡索酸盐、马来酸盐、1,4-丁炔二酸盐、1,6-己炔二酸盐、安息香酸盐、氯苯甲酸盐、苯甲酸甲盐、二硝基苯甲酸盐、羟苯酸盐、甲氧基苯酸盐、邻苯二甲酸盐、对苯二酸盐、磺酸盐、二甲苯磺酸盐、苯乙酸盐、苯丙酸盐、苯丁酸盐、柠檬酸盐、乳酸盐、β-羟基丁酸盐、羟乙酸盐、马来酸盐、酒石酸盐、甲磺酸盐、丙磺酸盐、1-萘磺酸盐、2-萘磺酸盐、扁桃酸盐等。
用于和酸性官能团形成药学上可接受盐的合适碱基包括但不限于，碱金属例如钠、钾和锂的氢氧化物；碱土金属例如钙和镁的氢氧化物；其它金属例如铝和锌的氢氧化物；氨和有机胺，例如未取代或羟基取代的单烷基胺、双烷基胺或三烷基胺；二环己基胺；三丁胺；吡啶；N-甲基,N-乙胺；二乙胺；三乙胺；单-、双-或三-(2-羟基低级烷基胺)，例如单-、双-或三-(2-羟乙基)胺、2-羟基叔丁胺，或三-(羟甲基)甲胺、N,N-二烷基-N-(羟烷基)-胺，例如N,N-二甲基-N-(2-羟乙基)胺或三-(2-羟乙基)胺；N-甲基-D-葡糖胺；以及氨基酸例如精氨酸、赖氨酸等。
根据本发明使用的某些化合物及其盐可以多于一种晶体形式存在(例如，多晶形物)；本发明包括所述各晶体形式及其混合物的应用。
根据本发明使用的某些化合物可包含一个或多个手性中心，并以不同的可选光学活性形式存在。当根据本发明使用的化合物包含一个手性中心时，所述化合物以两种对映体形式存在，且本发明包括使用两种对映体及对映体的混合物例如其外消旋混合物。通过本领域技术人员已知的方法可以拆分所述对映体：例如，拆分对映体可以通过形成可分离的非对映体的盐(例如通过结晶)；形成可分离的非对映体的衍生物或复合物(例如通过结晶、气液或液相色谱)；使一种对映体与对映体特异性试剂选择性反应(例如通过酶促酯化)；或在手性环境下采用气液或液相色谱，例如，在手性支持物上(例如含结合手性配体的硅)或在手性试剂存在下。当所需对映体通过上述分离方法之一转换成另一种化学实体时，可以使用其它步骤来释放所需的纯化对映体。或者，特定的对映体可以采用光学活性试剂、基质、催化剂或溶剂通过非对称合成来合成，或通过非对称转化将一种对映体转变成另一种对映体。
当根据本发明使用的化合物包含多于一种手性中心时，其可以非对映体形式存在。所述非对映体结构的化合物可以通过本领域技术人员已知的方法分离(例如，色谱或结晶)，而单独对映体可以如上所述分离。本发明包括根据本发明使用的多种非对映体化合物及其混合物的应用。根据本发明使用的化合物可以不同互变异构形式或以不同几何异构体形式存在，本发明包括根据本发明使用的化合物的各个互变异构体和/或几何异构体及其混合物的应用。根据本发明使用的化合物可以两性离子形式存在。本发明包括根据本发明使用的化合物的各个两性离子形式及其混合物的应用。
试剂盒
如果需要，可将EZH2拮抗剂装入试剂盒(例如包装或分配装置)中，所述试剂盒可包含一个或多个含有所述EZH2拮抗剂的单位剂型。例如，该包装可包括金属或塑料薄片，如泡罩包装。所述包装或分配装置可附有给药说明书。还可以制备配制在相容性药物运载体内的包含本发明EZH2拮抗剂的组合物，放置在合适的容器内，并就治疗所示病症进行标记。还可以提供使用说明书。
本文还提供包含检测所述甲基化H3-K27的多种甲基化检测试剂的试剂盒。例如，所述试剂盒包括单甲基化H3-K27、双甲基化H3-K27和三甲基化H3-K27检测试剂。所述检测试剂是例如抗体或其片段、多肽或适体。所述试剂盒可以在单独容器内包含适体或抗体，对照制剂(阳性和/或阴性)，和/或可检测的标签例如荧光素、绿色荧光蛋白、罗丹明、花青染料、Alexa染料、荧光素酶、放射性标记等等。完成所述试验的说明书(如书面、磁带、VCR、CD-ROM等)包含在试剂盒中。所述分析可以采用例如本领域已知的以下形式：Western印迹分析、免疫组化(IHC)、免疫荧光(IF)和质谱(MS)。
定义
方便起见，将说明书、实施例和所附权利要求中使用的特定术语收集在此。本发明所定义和使用的所有定义都替代所定义术语在词典中的定义、通过引用纳入的参考文献中的定义、和/或一般含义。
本发明使用冠词“一个”和“一种”表示一种或一种以上的(即至少一个)冠词受词。例如，“一个元件”表示一种元件或者一种以上的元件。
本说明书中和权利要求中所用的短语“和/或”应理解为指相关联的所述元件“之一或两者”，即，在一些情况中存在关联性而在其它情况中无关联的元件。采用“和/或”列出的多种元件应以同一种方式构建，即“一种或多种”所述元件因而相关联。除了由所述“和/或”短句特定鉴定的元件以外，其它元件可选存在，不论是否与那些特定鉴定的元件相关。因此，作为一个非限定性例子，提及“A和/或B”，当与开放式语句例如“包括”联用时可以在一个实施方式中仅指A(可选地包括除了B以外的元件)；而在其它实施方式中仅指B(可选地包括除了A以外的元件)；而在另一实施方式中既指A又指B(可选地包括其它元件)；等等。
如本文所用，本说明书和权利要求中的“或”应理解为与如上定义的“和/或”有相同的含意。例如，当在一个列表中隔离项目时，“或”或者“和/或”应解释为包括性，即，包括至少一个，但也包括多于一个的一些元件或元件列表，以及可选的额外未列出项目。仅清楚指示相反的术语例如“其中仅一个”或“确定的一个”，或当在权利要求中使用时，“由……组成”指包含一些元件或元件列表中确定的一个元件。一般而言，当其之前有排他性术语时，例如“任一”、“其中之一”、“仅其中之一”或“明确的其中之一”，本文中所用的术语“或”应仅解释为指示专一的选择(即，“一个或另一个但非两者”)。“基本由……组成”用于权利要求中时，应具有其在专利法领域中使用的普通含意。
如本文所用，本说明书和权利要求中参照一种或多种元件列表的短语“至少一种”应理解为指选自所述元件列表中任何一种或多种元件的至少一种元件，但不必包括所述元件列表中特定列出的每个元件中的至少一种，且不排除所述元件列表中的任何元件组合。该定义也允许除了短语“至少一种”所指的所述元件列表中特定鉴定的元件以外，元件可选存在，不论是否与特定鉴确的那些元件相关。因此，作为非限定性示例，“A和B中的至少一种”(或，等同于“A或B中的至少一种”或等同于“A和/或B中的至少一种”)在一种实施方式中可以指至少一种，可选包括多于一种的A，无B存在(并可选地包括B以外的元件)；在其它实施方式中指至少一种，可选地包括多于一种的B，无A存在(并可选地包括A以外的其它元件)；在另一实施方式中，指至少一种，可选包括多于一种的A，以及至少一种，可选地包括多于一种的B(并可选地包括其它元件)；等等。
还应理解，除非清楚表明相反，在本文要求权利的包括多于一个步骤或行动的任何方法中，所述方法的步骤或行动的顺序不必限定是如该方法描述的步骤或行为的顺序。
在权利要求以及上述说明书中，所有连接词例如“包含”、“包括”、“带有”、“具有”、“含有”、“涉及”、“保持”、“由……构成”等应被理解为是开放式的，即，指包括但不限于。如美国专利局的专利审查程序手册，2111.03部分所列举，仅连接词“由……组成”和“基本由……组成”分别应是封闭或半封闭的连接词。
所述术语“共给予”和“共同给予”指同时共同给予(同时给予两种或更多治疗剂)，和不同时间给予(在与给予一种或多种额外治疗剂不同的时间给予一种或多种治疗剂)，条件是所述治疗剂在所述患者内同时有一些程度的呈现。
本文所用的术语“治疗”指缓解疾病、紊乱或病症的至少一种症状。术语包括向对象给药和/或应用一种或多种本文所述化合物以提供病症的管理或治疗。用于本公开目的的“治疗”可以但不必须提供治愈方法；相反，“治疗”可以是病症管理的形式。当本文所述的化合物用于处理不需要的增殖细胞(包括癌)时，“治疗”包括部分或完全破坏所述不需要的增殖细胞而对正常细胞的破坏影响最小。不需要的快速增殖细胞(包括癌细胞)的所需治疗机制在细胞水平上是凋亡。
本文所用的术语“预防”包括共同预防或减缓临床上显著疾病发展的开始或在风险个体中减缓临床上显著疾病阶段的开始。这包括对有疾病发展风险的个人的预防性治疗。
本文所用的出于治疗目的的术语“对象”包括任何诊断有疾病、有疾病症状或有发展疾病风险的人对象。对预防方法而言，所述对象是任何人对象。用于预防目的的说明，对象可以是有风险或遗传上倾向于患有表征为不需要、快速细胞增殖的疾病(例如癌)的人对象。所述对象可能因接触致癌剂、遗传上倾向于患有表征为不需要、快速细胞增殖等的疾病而面临风险。
除非另有指示，可以使用标准方法来生成重组和合成多肽、融合蛋白、抗体或其抗原结合片段，操纵核酸序列，生成转化细胞等。此类技术是本领域技术人员已知的。参见例如Sambrook等，MolecularCloning:ALaboratoryManual(《分子克隆：实验室手册》)，第三版，（纽约冷泉港(ColdSpringHarbor)，2001)；F.M.Ausubel等，CurrentProtocolsinMolecularBiology(《新编分子生物学实验指南》)，（纽约的格林出版联合公司和约翰威立父子出版公司(GreenPublishingAssociates，Inc.andJohnWiley&Sons,Inc.))。
所述术语“EZH2多肽”包括所述全长多肽的功能片段和任一前述具有基本相似或基本相同氨基酸序列(至少约75%、80%、85%、90%、95%、98%或更高氨基酸序列相似性或相同性)的功能等同物，其中所述功能片段或功能等同物保留天然多肽的一种或多种功能性质。
“功能性”指所述多肽(或核酸)在天然多肽(或核酸)的一种或多种生物性质方面具有相同或基本相似的活性，例如天然多肽(或核酸)的至少约50%、75%、85%、90%、95%或98%或更多活性。
所述术语“调节”(和语法等价物)指活性增加或减少。在特定的实施方式中，所述术语“增加”或“增强”(和语法等价物)指提高至少约25%、50%、75%、2倍、3倍、5倍、10倍、15倍、20倍或更多。在特定的实施方式中，所述术语“下降”或“减少”(和语法等价物)指减弱至少约25%、40%、50%、60%、75%、80%、85%、90%、95%、98%或更多。在一些实施方式中，所示活性、底物或其它参数不可检测。特定提供EZH2拮抗剂。所述术语“药效标记物”指药物响应的分子标记物，其可在接受该药的患者内测得。所述标记物应是所述药物靶标调节的直接量度，并且能够显示响应剂量的量变。EZH2拮抗剂的可能药效标记物可以是疾病或替代组织中组蛋白H3-K27甲基化的水平。
本文所用的术语“响应”与术语“响应的”、“敏感”和“敏感性”可互换，指给予EZH抑制剂时显示治疗响应的对象，如对象的肿瘤细胞或肿瘤组织经历细胞凋亡和/或坏死，和/或显示减少的生长、***或增殖。
所述术语“对照”或“参照”指在分离自所述对象的相邻非肿瘤组织中、在来自健康对象的健康组织中检测到的，或由病理学家以本领域标准方法建立的甲基化水平(例如，单甲基化水平、双甲基化水平或三甲基化水平)。
“样品”指获自所述对象的任何生物样品，所述对象包括但不限于细胞、组织样品和体液(包括但不限于黏液、血液、血浆、血清、尿液、唾液和***)。
实施例
现已总体描述了本发明，参考以下实施例更易于理解本发明，这些实施例只是用于说明本发明的某些方面与实施方式，而非意在限制本发明。
实施例1——重组五组分PRC2复合物
野生型EZH2(GenBank登录号NM_004456)或Tyr641突变体与野生型AEBP2(GenBank登录号NM_153207)、EED(GenBank登录号NM_003797)、SUZ12(GenBank登录号NM_015355)和RbAp48(GenBank登录号NM_005610)在秋粘虫(Spodopterafrugiperda)(Sf9)细胞中使用杆状病毒表达***共表达。使用所述EED上的N末端FLAG标签来纯化来自细胞裂解液(BPS生物科学公司(BPSBioscience)，目录号51004)的活性PRC2复合物。PRC2最终制品的纯度由SDS-PAGE用考马斯蓝染色评定。
实施例2——H3、H4肽组
由各15个氨基酸的44个肽组成的库通过21世纪生化公司(21stCenturyBiochemicals)(美国马萨诸塞州马尔伯勒)合成。该肽组包含人组蛋白H3和H4的所有氨基酸，在连续的肽序列间有5个残基重叠。各肽的N末端附加生物素，其C末端以酰胺呈现。通过液相色谱/质谱光谱分析确定纯度(>95%)和特性。
为研究H3-K27甲基化状态对酶活性的依赖性，用呈现未甲基化、单甲基化、双甲基化或三甲基化侧链胺的赖氨酸27合成具有来自残基21-44的人H3(H3:21-44)的氨基酸序列的肽。这些肽购自NEP公司(NewEnglandPeptide)(美国马萨诸塞州加德纳)，所述各肽的C末端附加生物素。
实施例3——细胞中H3-K27甲基化状态的评价
细胞系OCI-LY19(ACC528)、KARPAS-422(ACC32)和WSU-DLCL2(ACC575)获自DSMZ。细胞系DB(CRL-2289)和SU-DHL2(CRL-2959)获自ATCC。OCI-LY19、WSU-DLCL2和DB细胞系在含10%FBS的RPMI-1640中生长，KARPAS-422和SU-DHL2细胞系在添加20%FBS的RPMI-1640中生长。细胞生长至1.5-2×106细胞/mL的密度，通过以264×g离心收获1×107个细胞，在冰冷PBS中清洗并通过重悬于10×沉淀体积的RIPA裂解缓冲液来裂解，所述RIPA裂解缓冲液包含50mMTris-HCl、150mMNaCl、0.25%DOC、1%NP-40和1mMEDTA(密理博公司(Millipore)#20-188)，添加0.1%SDS和蛋白酶抑制剂片(罗氏公司(Roche)#1836153)。通过两轮设置3的101秒突释用MisonixXL-2000对裂解液超声波处理，以确保组蛋白的有效提取，然后使用台式离心机在4°C以14,000rpm离心10分钟以澄清。由BCA实验(皮尔斯公司(Pierce))测定蛋白浓度。4微克的各裂解液在Tris-甘氨酸胶（英杰公司(Invitrogen)）上分离，转移至PVDF并在Odyssey封闭缓冲液中用以下抗体探测：小鼠抗-EZH2(CST3147；1:2000稀释)、兔抗-H3-K27me3(CST9733；1:10000稀释)、兔抗-H3-K27me2(CST9755；1:5000稀释)、兔抗-H3-K27me1(ActiveMotif39377；1:5000稀释)以及小鼠抗-总H3(CST3638；1:20000稀释)。在一抗孵育后，用IRDye800CW驴抗小鼠IgG(LiCOR#926-32212)或AlexaFluor680山羊抗兔IgG(英杰公司(Invitrogen)#A-21076)二抗探测，并用LiCOROdyssey***成像。
实施例4——酶学
如上所述，先前已推断出Tyr641处的疾病相关变化造成涉及EZH2催化H3-K27甲基化的功能缺失。然而，难以解释归因于酶杂合性的H3-K27甲基化速率的假定性减少是恶性表型的基础，特别是根据先前指示EZH2过表达、对应H3-K27脱甲基酶UTX的功能缺失突变或PRC2成分(例如PHF19/PCL3)过表达的数据涉及H3-K27三甲基化的增加，所述数据都导致特定人癌中的恶性表型。Morin等.(2010)NatGenet42:181-5；Martinez-Garcia等.(2010)NatGenet42:100-1；Bracken等(2003)EMBOJ22:5323-35；Kleer等(2003)ProcNatlAcadSciUSA100:11606-11；Varambally等.(2002)Nature419:624-9；Simon等.(2008)MutatRes647:21-9；vanHaaften等.(2009)NatGenet41:521-3；Wang等.(2004)Gene343:69-78；Cao等.(2008)MolCellBiol28:1862-72；andSarma等.(2008)MolCellBiol28:2718-31)。因此，更细致地探究这些突变的酶学。用人EZH2的WT和Tyr641突变形式制备重组PRC2复合物(参见上述实施例1；Cao等(2004)MolCell15:57-67)。先测试等浓度的(标称8nM，基于蛋白定量)各复合物催化3H-甲基从经标记S-腺蛋氨酸(SAM)转移至具有H3-K27(H3:21-44)周围氨基酸序列的未修饰肽或天然禽类红细胞寡聚核小体的能力。如先前所报道(Morin等(2010)NatGenet42:181-5)，发现WT型酶显示转移甲基至该未甲基化肽底物的强活性，但是突变酶均不显示显著的甲基转移酶活性(图1A)。与先前报道的数据和图1A中的数据相反，发现所有突变EZH2构建体对禽类核小体底物是活性甲基转移酶(图1B)。分离自禽类天然来源的核小体代表组蛋白修饰的混合状态，包括H3-K27甲基化的各种状态，所述甲基化使用H3-K27甲基化特异性抗体由Western印迹判断。就突变PRC2复合物对肽和核小体底物的不协调活性有若干种可能的解释。一种可能是：所述酶活位点远端的底物识别位点(即，外位点)是底物结合与转换的重要决定因素；这些位点会参与核小体上的互补识别元件，而这在小肽底物上不可用。然而，在大肠杆菌表达时，重组人组蛋白H3作为WT和突变PRC2复合物的底物进行测试，所得活性模式与使用所述肽底物所见的相同；即，所述WT酶显示对所述H3底物有强甲基转移酶活性，所述Y641F突变体显示7%的WT复合物活性，而所有其它突变体显示≤1%的WT复合物活性。因此，外位点参与似乎不可能解释现有结果。所述核小体呈现作为可能甲基化位点的许多H3-K27外赖氨酸残基，所述残基不会出现在所述小肽底物中。因此，另一个可能性是，Y641的突变改变了EZH2的底物特异性，造成H3-K27以外的赖氨酸残基甲基化。这种可能性在小肽底物和重组H3蛋白底物上的突变活性之间不能给出极佳的一致性。
当针对显示组蛋白H3和组蛋白H4所有可能赖氨酸(K)残基的肽底物组测试WT和突变PRC2复合物的酶活性时，解决了resolve现有结果和那些先前所报道结果之间明显的不协调(参见上述实施例2)。所有酶形式仅对包含残基H3-K27等同物的肽显示显著活性。然而，所述突变体的特定活性相对于WT按以下顺序大幅降低：WT>>Y641F>Y641S～Y641H>Y641N，再次与先前报道的发现一致。
实施例5——酶学
为了进一步理解这些突变体的酶活性，并调和对肽底物和核小体底物的活性之间的显著差异，研究所述酶形式催化H3:21-44肽环境下多种H3-K27甲基化状态进一步甲基化的能力。如上所述，发现所有突变酶相对于WT酶是未修饰H3-K27肽甲基化的缺陷型催化剂。然而，显然发现所有突变酶在催化单甲基化特别是双甲基化H3-K27肽的进一步甲基化上优于WT酶(图2)。因此，所述数据提示WT酶在催化零-至单-甲基化反应中最有效。突变酶在催化该初始步骤中有缺陷，但在引起从单甲基至双甲基和三甲基H3-K27的后续步骤的催化中比WT酶更有效。
通过稳态酶动力学探究WT和突变EZH2的差异底物特异性的起源。如表1所总结，由核小体的Km和肽底物的K1/2相似值证明，所述突变对基态底物识别影响最小。在所有情况中，所述肽底物显示S形结合性质；因此，产生半最大速度的肽浓度在本文中以K1/2报告，以替代更常见的米氏常数Km。Copeland(2005)EvaluationofEnzymeInhibitorsinDrugDiscovery:AGuidetoMedicinalChemistsandPharmacologists《药物开发中的酶抑制剂评价：药物化学家和药理学家指南》，威利出版公司(Wiley)。同样地，SAMKm在所述酶形式中显示最小变化，范围从208±50到304±64nM。相反，由用于不同底物的酶之间kcat值差异证明，底物利用上的差异在过渡态识别中似乎有其起源(表1)。结果显示，由比率kcat/K定量的催化效率(其中K是Km或K1/2，取决于底物特性；同上)在用于不同H3-K27甲基化状态的WT和突变酶之间不同。
表1.由包含EZH2野生型或Y641突变体的PRC2催化的甲基化反应的稳态动力学参数。
a活性过低无法检测。
实施例6——酶学
表1中所列的稳态动力学参数能计算相对于WT酶杂合细胞，就不同突变EZH2形式而言杂合细胞的不同H3-K27甲基化状态的期望水平。为实施这些模拟，做了多种简化设想：(1)稳态酶动力学与细胞环境内PRC2催化的H3-K27甲基化相关，并且在细胞生长的同一时间点进行所有测量；(2)突变和WT酶在杂合细胞中以相等水平表达，并且所有细胞中的总EZH2水平相等；(3)细胞SAM浓度，相对于其Km是饱和的，且在细胞间不改变；(4)细胞核小体浓度与其Km相似，且同样地在细胞间不改变；(5)EZH1催化的H3-K27甲基化不显著，且在细胞间恒定；和(6)任何H3-K27脱甲基酶活性在细胞间也恒定。
利用这些适当的设想，就H3-K27me3(顶图)、H3-K27me2(中图)和H3-K27me1(底图)的相对水平得到图3A所示的预测。从这些模拟形成清晰模式。所有携带突变的细胞的H3-K27me3水平相对于WT细胞都有所增加，其范围从Y641H突变体增加30%至Y641N突变体增加>400%。与此同时，所有突变体的H3-K27me2水平下降至<50%WT的水平，而所有突变体的H3-K27me1水平相对于WT降低约一半。
然后，通过Western印迹检测B细胞淋巴瘤细胞系中H3-K27甲基化状态的相对水平(图3B)，已知B细胞淋巴瘤细胞系对于WTEZH2(OCI-LY19)是纯合的，而对于EZH2Y641N(DB，KARPAS422和SU-DHL-6)或EZH2Y641F(WSU-DLCL2)而言是杂合的。图3B所示的相对H3-K27甲基化状态模式与基于体外稳态动力学参数的模拟结果有极佳的一致性，尽管与所述模拟中使用的假设和使用非生理肽替代物作为底物无关。
因此，在所有含Y641突变体的细胞中都观察到相对于WT增加的H3-K27me3，在所有含Y641突变体的细胞中都观察到相对于WT减少的H3-K27me2，而在所述四种突变细胞系的至少两种细胞系中观察到减少的H3-K27me1。WT和KARPAS422及SU-DHL-6细胞中几乎相当的H3-K27me1水平可以反映WT和突变EZH2的不同表达水平，EZH1的不同贡献，或未计入所述模拟的其它因素。然而，H3-K27甲基化状态的预测和实验模式之间的一致性显著，并且支持以下观点：WT与突变EZH2之间的酶偶联引起H3-K27me3增加，因此产生就这些突变体而言杂合的恶性细胞表型。
实施例7——PRC2甲基转移酶活性的体外实验
肽底物的flashplate实验。
对于EZH2的WT和Y641突变体的最初比较，含未甲基化K27、单甲基化K27(密理博公司(Millipore))或双甲基化K27(密理博公司)的生物素化组蛋白H3:21-44肽(NEP公司(NewEnglandPeptide))以800nM浓度与1,700nMS-腺苷甲硫氨酸-Cl(SAM)和300nM氚标记SAM(帕金埃尔默公司(PerkinElmer))组合。然后，向溶于实验缓冲液(20mMBICINE、1mMDTT、0.002%吐温20、0.005%牛皮明胶(BSG)，pH7.6)的PRC2添加所述底物组合。使反应推进所示时间间隔，然后由添加过量冷SAM(终浓度600μM)淬灭。转移淬灭火的反应混合物至抗生蛋白链霉亲和菌素包被的闪盘(Flashplate)(帕金埃尔默公司(PerkinElmer)，目录号SMP410)，使其结合1小时，然后在TopCountNXTHTS闪烁发光计数器上检测。各时间点代表六个单独反应的平均值。在除了肽或SAM浓度变化而，其它底物都处于饱和条件的同一反应条件下测定稳态动力学参数。速度作为以不同底物浓度的函数功能作图，数据拟合至米氏(Michaelis-Menten)方程的未转化形式或S型动力学方程的未转化形式来计算K和kcat的值。拟合参数的标准误差列于表1，并用于建立图2中图B和图C所示的误差线。根据误差传递的标准方法计算kcat/K相关误差(表1)；kcat/K的分数误差测定如下：
&mu; k cat K = ( &mu;k cat k cat ) 2 + ( &mu;K K ) 2 - - - ( 1 )
其中，μkcat是kcat的标准误差，而μK是K的标准误差。
使用寡聚核小体的滤板实验
如上所述纯化鸡红血球寡聚核小体。Fang等.(2004)MethodsEnzymol377:213-26.使核小体组合SAM与经氚标记SAM的混合物，并添加至实验缓冲液(20mMBICINE、100mMKCl、1mMDTT、0.002%吐温20、0.005%BSG，pH7.6)中的PRC2。如上所述运行反应并淬灭。将淬灭的反应混合物转移至玻璃纤维滤板(密理博公司(Millipore)，目录号MSFBN6B)，用10%的三氯乙酸清洗三次并干燥。添加MicroscintZero(30μL)，然后在TopCount闪烁发光计数器上检测氚掺入。在除了核小体或SAM浓度变化而其它底物都处于饱和条件的同一反应条件下测定稳态参数。速度作为不同底物浓度的函数作图，并拟合至米氏(Michaelis-Menten)方程的未转化形式，以得到如上所述的Km和kcat值。
实施例8——化合物75的制备
A.化合物37的制备
向9-((3aR,4R,6R,6aR)-6-(氨甲基)-2,2-二甲基四氢呋喃[3,4-d][1,3]二氧代-4-yl)-9H-嘌呤-6-胺（Townsend,A.P.等(2009)Org.Let.11:2976-2979）(3.05g，9.96mmol)的DCE(250mL)溶液添加(9H-芴-9-基)甲基(2-氧代乙基)氨基甲酸酯(2.8g，9.96mmol)和NaB(OAc)3H(2.96g，13.95mmol)，在室温搅拌所述混合物4h。在pH8～9时添加K2CO3溶液。添加DCM，用Na2SO4干燥有机层，用SGC(DCM:MeOH=30:1)浓缩并纯化，以获得37(2.9g，产量：50.9%)。
B.化合物65的制备
向37(2.9g，5.08mmol)的DCE(250mL)溶液添加(S)-苄基2-((叔丁氧基羰基)胺)-4-氧代丁酸酯(1.56g，5.08mmol)和NaB(OAc)3H(1.51g，7.11mmol)，在室温下搅拌所述混合物4h。在pH8～9时添加K2CO3溶液。添加DCM，用Na2SO4干燥有机层，用SGC(DCM:MeOH=100:1)浓缩并纯化，以获得65(2.8g，产量：63.9%)。
C.化合物75的制备
步骤1．向溶于DCM(10mL)的化合物65B(2.2g，2.55mmol)溶液添加Et2NH(1.1g，15.3mmol)，在室温下搅拌所述混合物4h。浓缩该混合物以获得粗制品72(2.2g)。
步骤2.向溶于MeOH(4mL)的72(167mg，0.26mmol)搅拌溶液添加2-(4-氯苯基)乙醛(40mg，0.26mmol)，并在室温下搅拌20min。然后，添加Na(OAc)3BH(83mg，0.39mmol)和HOAc(0.4mL)并搅拌过夜。添加NaHCO3(水溶液)并用DCM(25mL×3)提取，用盐水洗涤，用Na2SO4干燥并浓缩。通过制备性TLC(DCM/MeOH=10:1)纯化该粗制产物以提供白色粉末73(30mg，产量：14%)。LC/MS(m/z):779.7[M+1]+。
步骤3.溶于MeOH(2mL)的化合物73(30mg，0.038mmol)和10%Pd/C(15mg)混合物在H2下室温搅拌过夜。过滤所述混合物，浓缩所述滤液以获得粗制产物。通过制备性TLC(DCM/MeOH=8:1)纯化该粗制产物以提供白色粉末的74(20mg，产量：69%)。LC/MS(m/z):689.7[M+1]+。
步骤4．溶于90%TFA(1mL)的化合物74(20mg，0.028mmol)溶液在室温搅拌1h，并浓缩为固体形式以去除TFA，无需纯化即获得无色油状化合物75(TFA盐)。LC/MS(m/z):549.7[M+1]+。
实施例9——SAH对EZH2野生型和Y641突变体的抑制
S-腺苷-L-高半胱氨酸(SAH)在DMSO中连续稀释3倍(10个点)，并取1μL接种于384孔微量滴定板内。阳性对照(100%抑制标准)是100μM终浓度的SAH，而阴性对照(0%抑制标准)含有1μLDMSO。然后，使SAH和每孔40μL的EZH2野生型和突变体(8nM)在pH7.6的实验缓冲液(20mMBICINE、100mMKCl、1mMDTT、0.002%吐温20、0.005%BSG)中孵育30分钟。每孔添加10μL底物混合物，所述混合物在pH7.6的实验缓冲液中含有150nM的S-腺苷甲硫氨酸-Cl(SAM)、100nM氚标记的SAM和150nM生物素化的寡聚核小体。转移淬灭的酶反应至链霉亲和素包被的Flashplate(帕金埃尔默公司(PerkinElmer)，目录号SMP410)，使其结合1小时，在TopCountNXTHTS(帕金埃尔默公司)上检测。
结果示于图7。IC50值示于表2。
表2.SAH对WTEZH2和EZH2的Y641突变体的抑制。
WT Y641H Y641S Y641N Y641F
IC50,μM 0.467 0.263 0.283 0.380 4.80
实施例10——化合物75对EZH2野生型和Y641突变体的抑制
化合物75在DMSO中连续稀释3倍(10个点)，并取1μL接种于384孔微量滴定板内。阳性对照(100%抑制标准)是100μM终浓度的SAH，而阴性对照(0%抑制标准)含有1μLDMSO。然后，使化合物75和每孔40μL的EZH2野生型和突变体(8nM)在pH7.6的实验缓冲液(20mMBICINE、100mMKCl、1mMDTT、0.002%吐温20、0.005%BSG)中孵育30分钟。每孔添加10μL添加底物混合物，所述混合物在pH7.6的实验缓冲液中含有150nM的S-腺苷甲硫氨酸-Cl(SAM)、100nM氚标记的SAM和150nM生物素化的寡聚核小体。转移淬灭的酶反应至链霉亲和素包被的Flashplate(帕金埃尔默公司(PerkinElmer)，目录号SMP410)，使其结合1小时，在TopCountNXTHTS(帕金埃尔默公司)上检测。
结果示于图8。IC50值示于表3。
表3.化合物75对WTEZH2和EZH2的Y641突变体的抑制。
WT Y641S Y641N Y641F Y641H
IC50,μM 8.95 2.50 4.10 7.18 7.56
实施例11——H3-K27me2/me3比率预测对EZH2抑制剂的敏感性
就EZH2(Y641)突变杂合的肿瘤细胞系显示H3-K27me3水平增加，认为H3-K27的甲基化状态在肿瘤发生中是重要的。评价作为EZH2的WT型或就EZH2(Y641)突变杂合的一组细胞系中H3-K27的单(H3-K27me1)、双(H3-K27me2)或三(H3-K27me3)甲基化形式的水平。所用的细胞系列于表4。主要细胞系是B细胞淋巴瘤细胞系，但是也包括两种黑色素瘤细胞系。IGR1是最近发现包含EZH2中Y641N突变的黑色素瘤细胞系，而包括A375细胞作为WTEZH2黑色素瘤对照细胞系。图9A和B显示分离自该细胞系组的组蛋白的western印迹分析结果，采用识别H3-K27me1、H3-K27me2或H3-K27me3的抗体。一般而言，含有Y641突变的细胞系中总H3-K27me3水平高于仅表达WTEZH2的细胞系。Farage细胞和Pfeiffer细胞是两个例外，其中H3-K27me3水平与WT细胞系相似。更惊人的是相对于野生型细胞系，EZH2Y641突变细胞系中的H3-K27me2水平显著较低。在提取自Y641突变细胞系的组蛋白western印迹中没有或几乎没有观察到H3-K27me2信号，而在WT细胞系中使用相同抗体观察到的信号比使用H3-K27me3特异性抗体观察到的信号更强。总而言之，在WT细胞系中，使用H3-K27me2抗体的western印迹信号高于使用H3-K27me3抗体观察到的信号，而在Y641突变细胞系中却与之相反。因此，Y641细胞系中的H3-K27me3/me2信号比高于WT细胞系中观察到的信号比。其一个例外是Pfeiffer细胞系，所述细胞系不包含Y641EZH2突变，但具有高H3-K27me3信号，没有或几乎没有H3-K27me2信号。因此，Pfeiffer细胞的H3-K27me3/me2比率与Y641突变细胞系相似。
还可以通过质谱(MS)来检测H3-K27甲基化状态，MS是一种不依赖抗体试剂的独立方法。MS分析显示，Y641突变细胞系和Pfeiffer细胞系中的H3-K27me3水平高于其它WT细胞系，而H3-K27me2水平却与之相反。在Y641突变细胞系和普费弗(Pfeiffer)细胞系中，H3-K27me3水平高于H3-K27me2水平，而在其它WT细胞系中却与之相反。这些结果与在图9A和B中由western印迹分析观察到的那些结果一致。
还通过免疫细胞化学，使用H3-K27me2或H3-K27me3的抗体测定H3-K27甲基化状态的差异。该免疫组化实验用于在***固定石蜡包埋的患者肿瘤组织样品中检测与Y641突变EZH2相关的异常H3-K27me2/3比率。将一组五种WT和五种Y641突变淋巴瘤细胞系团块固定并包埋在石蜡块中，并用抗H3-K27me2或H3-K27me3抗体染色。由于所有细胞都应包含核组蛋白H3，包括针对组蛋白H3的抗体作为阳性对照。图10显示所有细胞系中的细胞就H3-K27me3和H3染色而言100%呈阳性。在这些条件下，在WT和Y641突变细胞系之间的H3-K27me3染色强度上没有观察到明显差异。这可以反映生色免疫细胞化学染色相比于其它检测方法的有限动力学范围。然而，如图11所示，可以清楚地将细胞系分为那些就H3-K27me2染色呈阳性或呈阴性的细胞系。所有WT细胞系（除了Pfeiffer细胞）都是H3-K27me2染色呈阳性，而所有T641突变细胞系和Pfeiffer细胞显示不被H3-K27me2抗体染色。这些结果与通过western和MS分析所得的那些结果一致。
不希望受理论限制，与获得功能HZH2(Y641)突变相关的H3-K27me3水平增加可使含EZH2突变的细胞对小分子EZH2抑制剂更加敏感。为了评价在EZH2Y641突变缺失情况下Pfeiffer细胞中观察到的H3-K27me3水平增加和/或H3-K27me2水平减少是否也与对EZH2抑制剂的敏感度相关联，测试在生化实验中显示有效抑制EZH2的两种化合物，IC50分别是85和16nM。用任一化合物处理WSU-DLCL2细胞导致抑制总体H3-K27me3水平，确证其进入细胞和抑制细胞EZH2甲基转移酶活性的能力(图12)。
在增殖实验中评价一组WT和Y641突变细胞系对各化合物的敏感性。因为EZH2抑制剂的抗增殖活性需要数日才能显现，在11天增殖实验中评价化合物。图13显示用所述测试化合物处理的WT(OCI-LY19)或Y641突变(WSU-DLCL2)细胞系的代表性生长曲线。两种化合物都显示对WSU-DLCL2细胞的抗增殖活性，但对OCI-LY19细胞几乎没有活性。抑制剂A相比抑制剂B是更有力的WSU-DLCL2增殖抑制剂，这与生化实验中抑制剂A是EZH2的较强抑制剂一致。增殖实验在一组WT和Y641突变淋巴瘤细胞系中进行，使用抑制剂B，得到第11天的IC90值。图14A显示由EZH2Y641状态分组的淋巴瘤细胞系的IC90值。总体来看，Y641突变细胞系相对于WT细胞系显示对EZH2抑制剂的敏感性增加，尽管RL和SUDHL4细胞的敏感性显著低于其它突变细胞系。Pfeiffer细胞是个例外，由于它们是WT型，但对IC90在低或亚纳摩尔范围内的两种化合物的抗增殖作用高度敏感。Pfeiffer细胞显示高H3-K27me3和低H3-K27me2水平，因此根据高H3-K27me3和低H3-K27me2对细胞系分组能良好区分EZH2抑制剂敏感性，如图14B中的抑制剂B所示。因此，高H3-K27me3和低H3-K27me2水平可以用于预测对EZH2抑制剂的敏感性，不依赖于对突变状态的认知。在Pfeiffer细胞中观察到的异常甲基化比率通过依赖EZH2活性的独立机制发生。
这些结果显示，通过在患者内使用技术例如western印迹、MS或IHC，在患者肿瘤中鉴定EZH2Y641突变和/或检测检测H3-K27me2相对于H3-K27me3的低水平可以用于鉴定哪些患者会响应EZH2抑制剂治疗。
表4.本研究中使用的细胞系。
等同形式
尽管已经描述并举例说明了本发明的一些实施方式，但是本领域的普通技术人员可以很容易地了解用来实施所述功能和/或得到所述结果和/或得到本文所述一种或多种优点的各种其它方式和/或结构，这些变化和/或改良都各自包括在本发明的范围内。更一般地,本领域的技术人员易理解，本文所述的所有参数、尺度、材料和结构都仅仅是示例性的，实际的参数、尺度、材料和/或结构将取决于本发明所教导的内容将要使用的一种或多种具体应用。本领域技术人员应了解或能够确定仅采用常规实验即可获得本文所述的本发明具体实施方式的许多等同形式。因此，应当理解，以上实施方式仅仅是示例性的，包括在所附权利要求书及其等价内容范围之内，可以通过本发明具体描述和要求以外的方式实施本发明。本发明涉及本文所述的各种独立的特征、体系、制品、材料、试剂盒和/或方法。另外，所述特征、体系、制品、材料、试剂盒和/或方法如果互不矛盾，则其中两种或更多种的任意组合都包括在本发明的范围之内。

Claims (15)

1.EZH2抑制剂在制备药物中的用途，所述药物用于治疗表达EZH2多肽的Y641突变体的对象，所述对象患有淋巴瘤或有风险罹患淋巴瘤。
2.如权利要求1所述的用途，其中通过在来自对象的样品中检测EZH2多肽的Y641突变体来鉴定所述表达EZH2多肽的Y641突变体的对象。
3.一种或多种检测试剂在制备试剂盒中的用途，
所述试剂能在来自对象的样品中存在EZH2多肽的Y641突变体时检测该突变体，所述试剂盒用于确定所述对象是否是采用EZH2抑制剂治疗的候选者，所述对象患有淋巴瘤或有风险罹患淋巴瘤，并且EZH2多肽的Y641突变的存在表明所述对象是采用EZH2抑制剂治疗的候选者。
4.如权利要求2或3所述的用途，其特征在于，所述Y641突变体选自Y641F、Y641H、Y641N和Y641S。
5.如权利要求3所述的用途，其特征在于，所述一种或多种检测试剂选自：
a.能与所述EZH2多肽的Y641突变体特征性的多肽或其片段特异性结合的抗体；或
b.能与所述EZH2多肽的Y641突变体特征性的多肽或其片段的编码核酸杂交的核酸探针。
6.如权利要求5所述的用途，其特征在于，所述核酸包含至少部分SEQIDNO:7。
7.如权利要求5所述的用途，其特征在于，所述EZH2多肽的Y641突变体具有选自Y641F、Y641H、Y641N和Y641S的突变。
8.如权利要求1-3中任一项所述的用途，其特征在于，所述淋巴瘤选自：滤泡性淋巴瘤(FL)和弥散性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)的生发中心B细胞样亚型。
9.如权利要求1-3中任一项所述的用途，其特征在于，所述淋巴瘤是非霍奇金淋巴瘤。
10.如权利要求1-3中任一项所述的用途，其特征在于，所述EZH2抑制剂
a.抑制H3-K27的三甲基化，
b.抑制EZH2的Y641突变体的组蛋白甲基转移酶活性，和/或
c.抑制野生型EZH2的组蛋白甲基转移酶活性。
11.如权利要求10所述的用途，其特征在于，所述EZH2抑制剂是小分子。
12.如权利要求2或3所述的用途，其特征在于，所述EZH2多肽的Y641突变体的检测通过以下实施：
a.全基因组重测序，或
b.检测编码所述EZH2多肽的Y641突变体的核酸的目标区域重测序。
13.如权利要求12所述的用途，其特征在于，所述目标区域重测序包括用至少一种PCR引物来扩增至少部分核酸。
14.如权利要求13所述的用途，其特征在于，所述核酸包括至少部分SEQIDNO:7。
15.如权利要求12所述的用途，其特征在于，所述EZH2多肽的Y641突变体具有选自Y641F、Y641H、Y641N和Y641S的突变。
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