CN103255111B - 绿色荧光蛋白标记的重组猪瘟病毒及其拯救方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了绿色荧光蛋白标记的重组猪瘟病毒及其拯救方法和应用。本发明将绿色荧光蛋白编码基因***到猪瘟病毒感染性克隆N^pro蛋白编码区的第13位与第14位氨基酸之间，通过转染PK-15细胞、传代，拯救出可视化的绿色荧光蛋白标记的重组猪瘟病毒。所述重组猪瘟病毒的生长特性与其亲本病毒一致，感染PK-15细胞后通过荧光显微镜直接可视，用其建立的改进中和试验方法（EGFP-NT）能够借助荧光显微镜直接观察猪瘟病毒的存在与否并确定待检血清中的中和抗体效价，无需额外的免疫荧光试验步骤，其特异性和敏感性与传统的中和免疫荧光试验一致，却更加方便快捷，可替代中和免疫荧光试验方法用于猪瘟血清学检测和流行病学调查。

Description

绿色荧光蛋白标记的重组猪瘟病毒及其拯救方法和应用

技术领域

本发明涉及重组猪瘟病毒，尤其涉及绿色荧光蛋白标记的重组猪瘟病毒及其拯救方法，本发明进一步涉及该绿色荧光蛋白标记重组猪瘟病毒在诊断猪瘟或定量检测血清猪瘟中和抗体效价中的应用，属于猪瘟病毒的诊断或检测领域。

背景技术

猪瘟（classical swine fever，CSF）是由猪瘟病毒（classical swine fevervirus，CSFV）引起的猪的一种以高热和出血为特征的高度接触性传染病，猪瘟的流行能够在全世界范围内引起重大经济损失。CSFV与牛病毒性腹泻病毒（bovine viral diarrhea virus1，BVDV-1）、BVDV-2、边界病病毒（border disease virus，BDV）同属于黄病毒科瘟病毒属成员（Moser C,Stettler P,Tratschin JD,et al.Cytopathogenic and noncytopathogenic RNAreplicons of classical swine fever virus.J.Virol.1999,73:7787-7794.）。CSFV基因组为线状单股正链RNA，长约12.3kb，含有一个大的开放阅读框架（open reading frame，ORF），编码约3900个氨基酸的多聚蛋白。多聚蛋白在病毒和宿主细胞蛋白酶作用下加工形成4种结构蛋白（C、E^rns、E1和E2）和7种非结构蛋白（N^pro、p7、NS2-3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B）（Moser C,Stettler P,Tratschin JD,et al.Cytopathogenic andnoncytopathogenic RNA replicons of classical swine fever virus.J.Virol.1999,73:7787-7794.）。

CSFV反向遗传学技术早在1996年得以建立，利用体外转录的感染性RNA转染SK-6或PK-15细胞产生感染性病毒（Meyers G,Thiel HJ,Rümenapf T.Classical swine fever virus:recovery of infectious viruses fromcDNA constructs and generation of recombinant cytopathogenic defectiveinterfering particles.J.Virol.1996,70:1588-1595.），之后将CSFV的全长感染性克隆转染表达T7RNA聚合酶的SK-6或PK-15细胞系，利用细胞内转录的方式改进了CSFV的反向遗传技术（van Gennip HG,van Rijn PA,Widjojoatmodjo MN,et al.Recovery of infectious classical swine fever virus(CSFV)from full-length genomic cDNA clones by a swine kidney cell lineexpressing bacteriophage T7RNA polymerase.J.Virol.Methods1999,78:117-128.）。最近，本发明人用巨细胞病毒（cytomegalovirus，CMV）启动子控制下的CSFV的全长感染性克隆转染PK-15细胞，利用细胞内的RNA聚合酶Ⅱ启动感染性克隆的转录，成功拯救CSFV，使CSFV的反向遗传技术更加有效方便（Li C,Huang JH,Li YF,et al.Efficient and stablerescue of classical swine fever virus from cloned cDNA using an RNApolymerase II system.Arch.Virol.2012,doi:10.1007/s00705-012-1548-8）。表达细菌氯霉素乙酰转移酶的标记CSFV曾被用于猪瘟病毒的定量研究（Moser C,Tratschin JD,Hofmann MA.A recombinant classical swine fevervirus stably expresses a marker gene.J.Virol.1998,72:5318-5322.）。文献报道猪繁殖与呼吸综合征病毒（porcine reproductive and respiratorysyndrome virus，PRRSV）等多种绿色荧光蛋白标记的病毒得以成功构建（Fang Y,Rowland RRR,Roof M,et al.A full-length cDNA infectious cloneof North American type1porcine reproductive and respiratory syndromevirus:expression of green fluorescent protein in the Nsp2region.J.Virol.2006,80:11447-11455;Fang Y,Christopher-Hennings J,Brown E,et al.Development of genetic markers in the nonstructural protein2region of a UStype1porcine reproductive and respiratory syndrome virus:implications forfuture recombinant marker vaccine development.J.Gen.Virol.2008,89:3086-3096;Kim DY,Calvert JG,Chang KO,et al.Expression andstability of foreign tags inserted into nsp2of porcine reproductive andrespiratory syndrome virus(PRRSV).Virus Res.2007,128:106-114.）。

为了控制和根除猪瘟，血清学调查是必需的手段。酶联免疫吸附试验（enzyme–linked immunosorbent assay，ELISA）、中和免疫荧光试验（neutralization immunofluorescence test，NIFT）和中和过氧化物酶联试验（neutralization peroxidase-linked assay，NPLA）是常用的检测血清中猪瘟抗体的方法。多种ELISA诊断方法已经建立而且其中几种已经商业化，如IDEXX CSFV Antibody Test Kit和IDEXX CSF Sero Ab ELISA。特别是IDEXX CSFV Antibody Test Kit作为一种可靠的血清抗体检测方法已在疫苗评价及猪瘟的血清学调查中得到广泛的应用。但是由于猪瘟抗体与其它瘟病毒（BVDV和BDV）抗体的交叉反应限制了ELISA诊断方法的特异性，ELISA检测阳性或可疑的血清样品常需要通过NIFT或NPLA进一步验证。

猪瘟病毒感染后不引起细胞病变，常用NIFT测定血清中和抗体，NIFT常作为血清学调查和建立新的血清学诊断方法的金标准。NPLA和NIFT是猪瘟诊断可靠敏感的工具，而且利用多个NPLA可以对猪瘟病毒抗体、BVDV和BDV抗体进行鉴别诊断。然而，在病毒培养72h之后，NIFT和NPLA常需要多个步骤：细胞的固定，抗体的孵育，多次洗涤，持续至少2-3h，通常费时、费力。另外，抗体昂贵、抗体标记成本较高，有待改进。如果将EGFP基因引入CSFV的基因组并实现稳定表达，CSFV的检测将有望实现可视化，检测步骤也能有效简化。

发明内容

本发明的目的之一是提供一株绿色荧光蛋白标记的重组猪瘟病毒；

本发明的目的之二是提供一种构建所述绿色荧光蛋白标记的重组猪瘟病毒的方法；

本发明的目的之三是将所述的绿色荧光蛋白标记的重组猪瘟病毒应用于制备诊断或检测猪瘟病毒或定量检测猪瘟中和抗体效价的试剂。

本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：

有文献报道，将细菌氯霉素乙酰转移酶（CAT）***猪瘟病毒N^pro蛋白第4位氨基酸和第5位氨基酸之间可获得标记病毒，且标记基因可以稳定表达（Moser C,Tratschin JD,Hofmann MA.A recombinant classicalswine fever virus stably expresses a marker gene.J.Virol.1998,72:5318-5322.）。本发明人将EGFP基因引入猪瘟病毒N^pro蛋白基因第4位氨基酸和第5位氨基酸之间，只能获得瞬时表达，却未能获得稳定传代的EGFP基因标记的突变猪瘟病毒。本发明人通过大量的实验，意外地发现，将EGFP基因引入猪瘟病毒感染性克隆N^pro蛋白编码区第13位氨基酸和第14位氨基酸之间，所获得的突变体猪瘟病毒能稳定传代并表达外源基因，从而完成了本发明。

本发明首先提供了绿色荧光蛋白标记的重组猪瘟病毒（EGFP-CSFV），包括：猪瘟病毒和绿色荧光蛋白编码基因;其中，绿色荧光蛋白编码基因***到猪瘟病毒感染性克隆N^pro蛋白编码区第13位与第14位氨基酸之间。

本发明将拯救的绿色荧光蛋白标记的重组猪瘟病毒（EGFP-CSFV）提交专利认可的机构保藏，其微生物保藏编号为：CGMCC NO.7219；保藏时间为：2013年2月1日；该重组猪瘟病毒的分类命名为：表达绿色荧光蛋白的重组猪瘟病毒；保藏单位：中国微生物保藏管理委员会普通微生物中心；保藏地址：中国北京朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。

本发明的另外一个目的是提供一种拯救所述绿色荧光蛋白标记的重组猪瘟病毒（EGFP-CSFV）的方法，包括以下步骤：

（1）将绿色荧光蛋白（EGFP）编码基因***到猪瘟病毒N^pro蛋白编码区的第13位与第14位氨基酸之间，获得携带有绿色荧光蛋白编码基因的全长感染性克隆质粒；（2）将携带有绿色荧光蛋白编码基因的全长感染性克隆质粒直接转染PK-15细胞，拯救得到绿色荧光蛋白标记的重组猪瘟病毒。

猪瘟病毒在易感细胞中增殖时一般不引起细胞病变。一般而言，为了拯救猪瘟病毒，转染的细胞需要持续传三代，称其为“盲传”，然后通过免疫学方法检测病毒的存在和滴度。本发明对EGFP-CSFV病毒的拯救过程实现了可视化，即可通过荧光显微镜实时观察病毒的产生和病毒量的变化。有文献报道，将EGFP引入PRRSV的NSP2基因，产生的突变体病毒不稳定（Kim DY,Calvert JG,Chang KO,et al.Expression and stability offoreign tags inserted into nsp2of porcine reproductive and respiratorysyndrome virus(PRRSV).Virus Res.2007,128:106-114.）。然而，本发明将EGFP引入CSFV N^pro蛋白基因（N^pro蛋白13位氨基酸与14位氨基酸之间）中，获得了稳定的突变体病毒。N^pro蛋白具有抑制干扰素产生和自我切割的功能（Rümenapf T,Stark R,Heimann M,et al.N-terminal proteaseof pestiviruses:identification of putative catalytic residues by site-directedmutagenesis.J.Virol.1998,72:2544-2547;Stark R,Meyers G,Rümenapf T,et al.Processing of pestivirus polyprotein:cleavage site between autoproteaseand nucleocapsid protein of classical swine fever virus.J.Virol.1993,67:7088-7095;Wiskerchen M,Belzer SK,Collett MS.Pestivirus geneexpression:the first protein product of the bovine viral diarrhea virus largeopen reading frame,p20,possesses proteolytic activity.J.Virol.1991,65:4508-4514.），而本发明结果表明EGFP的***并不影响病毒的复制。另外，N^pro是非结构蛋白，却能指示病毒的存在或产生，经分析可能是由于猪瘟病毒先产生一个多聚蛋白，然后在病毒或宿主蛋白酶的作用下产生4种结构蛋白和7种非结构蛋白。本发明中，利用荧光显微镜直接观察EGFP-CSFV的EGFP荧光与IFA方法测定的病毒滴度相同；用本发明拯救的EGFP-CSFV代替猪瘟亲本病毒建立的中和试验方法（即EGFP-NT）可以直接检测血清中猪瘟抗体，可以快速准确地测定血清中和效价。

IDEXX猪瘟抗体ELISA是通过过氧化物酶标记的抗猪瘟病毒E2蛋白中和性单克隆抗体与血清中的中和抗体竞争结合包被抗原而建立的阻断ELISA。根据已有的报道，NPLA检测血清以中和抗体效价≥25作为判定阳性的标准。尽管EGFP-NT和NIFT与IDEXX猪瘟抗体ELISA检测的血清都有很高的符合率，但对于IDEXX猪瘟抗体ELISA检测可疑的样品却被中和试验检测为阳性或阴性，表明中和试验的敏感性高于ELISA，这一结果与Blome等报道的一致（Blome S,Meindl-A,Loeffen W,et al.Assessment of classical swine fever diagnostics and vaccineperformance.Rev.Sci.Tech.2006,25:1025-1038.）。在中和抗体效价的定量分析中，EGFP-NT和NIFT符合率可到达93.8%。所以，用本发明拯救的绿色荧光蛋白标记的重组猪瘟病毒（EGFP-CSFV）所建立的中和试验检测方法（EGFP-NT）可以替代NIFT，省去病毒培养72h后的步骤，大大简化了传统的NIFT检测方法。

现地猪群常常发生混合感染，如CSFV和PCV2、TGEV和PRV、CSFV和PrV、CSFV、PrV和猪链球菌的混合感染。本发明的实验结果表明，CSFV不能被其它病毒的抗体所中和，EGFP-NT对猪瘟抗体的检测是高度特异的。NPLA方法常用来验证ELISA检测为阳性的血清以及鉴别诊断CSFV抗体与其它偶蹄动物瘟病毒抗体。用本发明拯救的绿色荧光蛋白标记的重组猪瘟病毒（EGFP-CSFV）所建立的中和检测方法（EGFP-NT）可以用荧光显微镜直接观察，结果判断方便。在病毒培养72h后，与NPLA和NIFT相比，EGFP-NT不需要额外实验步骤，直接于荧光显微镜下检测CSFV的存在，从而快速确定中和抗体的效价。

复合物捕获阻断ELISA（complex–trapping-blocking ELISA，CTB-ELISA）测定的血清抗体阻断率在NPLA测定的中和抗体效价<100时，变化较大；当中和抗体效价>100时，阻断率稳定在较高水平。本发明用猪瘟免疫和攻毒的血清144份对血清阻断率与中和抗体效价的相关性进行了分析，结果表明，待检猪血清的猪瘟抗体阻断率与其中和抗体效价的对数呈正相关性。实验结果表明，用本发明拯救的绿色荧光蛋白标记的重组猪瘟病毒（EGFP-CSFV）建立的中和试验检测方法（EGFP-NT）是检测血清中和抗体的可靠方法，而且省时省力。

总之，本发明将绿色荧光蛋白（EGFP）编码基因引入猪瘟病毒N^pro蛋白编码区的第13位与第14位氨基酸之间，通过转染、传代，拯救得到绿色荧光蛋白标记的重组猪瘟病毒，通过直接观察EGFP荧光、间接免疫荧光试验（indirect immunofluorescence assay，IFA）和IDEXX猪瘟抗原ELISA检测证实可视化的绿色荧光蛋白标记的重组猪瘟病毒EGFP-CSFV构建成功。该重组病毒感染细胞后通过荧光显微镜直接可视，而且其生长特性与亲本病毒一致。用本发明绿色荧光蛋白标记的重组猪瘟病毒建立的中和试验检测方法（EGFP-NT）可以直接用荧光显微镜观察确定猪瘟病毒的存在以及确定血清中和抗体效价，不需要免疫荧光的操作步骤，比NIFT至少减少2h，检测更加便捷，且可获得与NIFT一致的结果，并能保持传统NT高特异性和高敏感性的优势，因此可替代传统NIFT成为用于猪瘟血清学调查和流行病学调查的更为方便的检测方法。

附图说明

图1  绿色荧光蛋白标记的重组猪瘟病毒EGFP-CSFV的可视化观察；A：荧光显微镜观察；B：透射显微镜明场观察。

图2  绿色荧光蛋白标记的重组猪瘟病毒EGFP-CSFV的荧光显微镜直接观察和免疫荧光试验检测结果。

图3  EGFP基因在绿色荧光蛋白标记的重组猪瘟病毒EGFP-CSFV基因组中的稳定性分析。

图4  绿色荧光蛋白标记的重组猪瘟病毒EGFP-CSFV的一步生长曲线分析。

图5  EGFP-NT检测中和抗体效价与IDEXX猪瘟抗体ELISA检测血清阻断率的关系。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

1实验材料

1.1细胞和病毒

PK-15细胞和猪瘟病毒强毒石门株（Shimen，以下称为wt-CSFV）均由本发明人实验室保存，分别用含8%胎牛血清和2%胎牛血清（无BVDV和支原体）的Dulbecco’s Modified Eagles Medium（DMEM）培养于37℃、5%CO₂培养箱。

1.2血清

血清样品来自本实验室经腺病毒/甲病毒复制子嵌合载体猪瘟疫苗或猪瘟兔化弱毒株免疫随后用猪瘟强毒石门株攻毒的实验猪（Sun Y,TianDY,Li S,et al.Comprehensive evaluation of theadenovirus/alphavirus-replicon chimeric vector-based vaccine rAdV-SFV-E2against classical swine fever.Vaccine2013,31:538-544；Sun Y,Liu DF,Wang YF,et al.Generation and efficacy evaluation of a recombinantadenovirus expressing the E2protein of classical swine fever virus.Res.Vet.Sci.2010,88:77-82.）；现地待检猪血清，包括猪伪狂犬病病毒（pseudorabiesvirus，PrV）阳性血清、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）阳性血清、PrV和CSFV双阳性血清、PRRSV和CSFV双阳性血清，均由本发明人实验室保存，猪传染性胃肠炎病毒（porcine transmissible gastroenteritisvirus，TGEV）阳性血清由冯力研究员馈赠。

实施例1  绿色荧光蛋白标记的重组猪瘟病毒（EGFP-CSFV）的构建

1.1全长感染性克隆质粒pEGFP-CSFV的构建

以CSFV石门株全长感染性克隆pBRCISM（Li C,Huang JH,Li YF,et al.Efficient and stable rescue of classical swine fever virus from clonedcDNA using an RNA polymerase II system.Arch.Virol.2012,doi:10.1007/s00705-012-1548-548）为基础构建全长感染性克隆质粒pEGFP-CSFV。将EGFP基因通过融合PCR技术***到猪瘟病毒N^pro的第13位与第14位氨基酸之间，所用引物如下：

N^pro-412eGFP-1S:CACCTCGAGATGCTATGTGG(SEQ ID No.1)；

N^pro-412eGFP-1R:CTCGCCCTTGCTCACCATGTTTGTTTTGTATAAAAGTTC(SEQ ID No.2)；

N^pro-412eGFP-2S:AACTTTTATACAAAACAAACATGGTGAGCAAGGGCGAGGAG(SEQ ID No.3)；

N^pro-412eGFP-2R:CCCATTGGTTTTTGTTTCTTGTACAGCTCGTCCATG(SEQID No.4)；

N^pro-412eGFP-3S:GACGAGCTGTACAAGAAACAAAAACCAATGGGAGTG(SEQ ID No.5)；

N^pro-412eGFP-3R:AACTCTAGAGGGGCCCTATGG（SEQ ID No.6）。

PCR产物通过限制性内切酶XhoI和XbaI克隆至pBRCISM-5′(Li C,Huang JH,Li YF,et al.Efficient and stable rescue of classical swine fevervirus from cloned cDNA using an RNA polymerase II system.Arch.Virol.2012)，形成pBRCISM-5′EGFP。将pBRCISM-5′EGFP的SalI和BamHI片段***pBRCISM-3′中，获得全长感染性克隆质粒pEGFP-CSFV。

1.2绿色荧光蛋白标记的重组猪瘟病毒（EGFP-CSFV）的拯救及鉴定

将纯化的质粒pEGFP-CSFV2μg转染长满单层的PK-15细胞之后进行三次细胞传代（每2天进行一次传代）至***（F4）（细胞培养过程中可随时用荧光显微镜直接进行病毒产生的实时观察），冻融一次收获病毒。按照RNeasy Mini Kit说明书提取病毒RNA，用DNase I处理后反转录为cDNA，以此为模板PCR扩增EGFP及NS5B基因，用荧光定量PCR检测病毒基因拷贝数。通过测序验证PCR产物是否存在突变。用E2特异性单克隆抗体6E10（Peng WP,Hou Q,Xia ZH,et al.Identification of aconserved linear B-cell epitope at the N-terminus of the E2glycoprotein ofClassical swine fever virus by phage-displayed random peptide library.VirusRes.2008,135:267-272.）进行IFA检测，证实EGFP-CSFV E2蛋白的表达，同时用IDEXX猪瘟抗原检测试剂盒检测EGFP-CSFV E^rns蛋白的表达。

荧光显微镜下观察发现F1和F2代只见少数几个发荧光的细胞，F3代可见几个发荧光的细胞团，到F4代整瓶细胞布满荧光团（图1），表明已获得绿色荧光蛋白标记的重组猪瘟病毒（EGFP-CSFV）。

用IDEXX猪瘟抗原检测试剂盒检测EGFP-CSFV F4代病毒的OD₄₅₀值为1.168，阳性对照0.703，阴性对照0.085，样品>0.385判为阳性，因此IDEXX猪瘟抗原检测结果判为阳性。IFA检测EGFP-CSFV抗原与猪瘟抗体6E10特异性反应，与亲本病毒结果一致。直接观察EGFP-CSFV感染的细胞，其荧光更特异，相比IFA的荧光无任何背景（图2）。用荧光定量PCR检测EGFP-CSFV的RNA可以达到每微升6.82×10⁶拷贝数，通过RT-PCR可以成功扩增到猪瘟病毒NS5B基因和EGFP基因。

实验例  2    EGFP基因在绿色荧光蛋白标记的重组猪瘟病毒（EGFP-CSFV）基因组中的稳定性分析实验

将实施例1所拯救的绿色荧光蛋白标记的重组猪瘟病毒（EGFP-CSFV）F4代继续细胞传代至F8代，每代病毒传至下一代之前观察EGFP荧光。收获F4、F5、F6、F7、F8代病毒液，用IDEXX猪瘟抗原试剂盒检测病毒抗原，同时提取病毒RNA，用RT-PCR检测EGFP基因是否稳定存在。将各代次的病毒液接种于96孔培养板培养的PK-15细胞，48h后先观察EGFP特异荧光，之后用冷无水乙醇固定细胞，用猪瘟单克隆抗体和TRITC或FITC标记的抗鼠二抗进行IFA检测。

EGFP-CSFV感染的细胞从F4传代到F8，每代均可观察到荧光。用IDEXX猪瘟抗原检测试剂盒检测F4-F8病毒，每代病毒均呈阳性；IFA检测F4-F8病毒可见特异性荧光团；通过RT-PCR可以从EGFP-CSFV病毒RNA中特异性地扩增出EGFP基因，但未从亲本病毒基因中扩增到EGFP基因（图3）。这些结果表明：EGFP-CSFV可以持续传代，EGFP基因也可以稳定存在于猪瘟病毒的基因组且能正确表达。

实验例3  绿色荧光蛋白标记的重组猪瘟病毒（EGFP-CSFV）的一步生长曲线测定

将实施例1所拯救的绿色荧光蛋白标记的重组猪瘟病毒EGFP-CSFV和亲本病毒wt-CSFV以感染复数（MOI）为1的剂量接种长至单层的PK-15细胞，感作2h，用PBS洗涤后加入维持液，37℃培养。分别在感染后24、36、48、60和72h收获病毒，将病毒液作连续10倍稀释，分别接种于长至单层的PK-15细胞，感染2h后换2%维持液，48h后直接观察EGFP荧光，之后用IFA检测，应用Reed-Muench方法计算其TCID₅₀，绘制病毒生长曲线。

测定结果表明，实施例1所拯救的EGFP-CSFV与亲本病毒具有相似的生长特性，在感染后72h，病毒滴度均可达到10^6.5TCID₅₀/mL（图4），这说明EGFP***猪瘟病毒N^pro的第13位与第14位氨基酸之间不影响猪瘟病毒的生长。另外，直接观测EGFP与IFA测定的EGFP-CSFV的滴度是一致的，表明可视化猪瘟病毒EGFP-CSFV可以替代亲本病毒直接确定其病毒滴度。

实验例4  基于EGFP-CSFV的中和试验（EGFP-NT）与传统中和试验（NIFT）的对比实验

将实验免疫或攻毒的猪瘟抗体阴性血清88份和现地阴性血清30份（共118份）（IDEXX猪瘟抗体检测试剂盒确定抗体阻断率≤30%），实验免疫或攻毒的猪瘟抗体阳性血清74份和22份现地阳性血清（共96份）（IDEXX猪瘟抗体检测试剂盒确定抗体阻断率≥40%），同时分别进行EGFP-NT和NIFT。

检测前将待检血清样品56℃灭活30min。中和试验在96孔板上进行。血清样品按1:4、1:8、1:16、1:32、1:64、1:128、1:256、1:512稀释，与100TCID₅₀（EGFP-CSFV或wt-CSFV）混合，然后37℃孵育1h。将血清-病毒混合物加入单层的96孔板细胞中，培养1h，然后再培养72h。对于EGFP-CSFV，病毒直接在荧光显微镜下（Nikon TE200，Japan）观察，然后确定血清中和效价。对于wt-CSFV，细胞洗涤3遍，然后用冷无水乙醇固定20min，固定的细胞风干后，与E2单克隆抗体HQ0637℃孵育1h，洗涤3遍，然后用FITC荧光标记的羊抗鼠IgG（Sigma–Aldrich，St.Louis，USA）37℃孵育45min，用PBS洗3遍后，用90%丙三醇覆盖细胞，于荧光显微镜下观察。血清中和效价以中和50%病毒生长的最高血清稀释度的倒数表示。每次中和试验都设阴、阳性血清对照，中和试验结束后对病毒滴度进行复测。

定性分析结果：用本发明拯救的绿色荧光蛋白标记的重组猪瘟病毒（EGFP-CSFV）所建立的中和试验检测方法EGFP-NT和传统的NIFT检测118份阴性血清中全为阴性，中和抗体效价<25；96份阳性血清检测89份为阳性，其中71份血清中和抗体效价介于40-512之间，18份中和抗体效价>512，7份IDEXX猪瘟抗体试剂盒检测阳性的血清被中和试验检测为阴性，EGFP-NT和NIFT符合率为100%(214/214),与IDEXX猪瘟抗体检测试剂盒符合率为96.7%（207/214）（表1）。

定量分析结果：EGFP-NT和NIFT检测88份阴性血清其中具有相同中和抗体效价的87份，检测的74份阳性血清中65份具有相同的中和抗体效价，符合率为93.8%（152/162）。EGFP-NT和NIFT检测现地血清的中和抗体效价符合率为96.2%（50/52）（表2）。本实验对11份抗体阻断率30%-40%的可疑样品进行单独分析，其中9份为阳性，2份为阴性。

以上结果表明：用本发明拯救的绿色荧光蛋白标记的重组猪瘟病毒（EGFP-CSFV）所建立的中和试验检测方法EGFP-NT与传统的NIFT结果基本一致，且二者都比ELISA更敏感。

表1  多种血清诊断方法检测猪瘟特异性抗体的符合率分析

表2  EGFP-NT和NIFT检测中和抗体效价符合率分析

性：中和抗体效价≥25；阴性：中和抗体效价＜25。

实验例5  EGFP-NT的特异性分析实验

取PrV阳性血清、PRRSV阳性血清、PrV和CSFV双阳性血清、PRRSV和CSFV双阳性血清，TGEV和CSFV双阳性血清各3份，用EGFP-NT和NIFT平行检测，计算二者符合率。

PrV抗体阳性血清和PRRSV抗体阳性血清各3份，经EGFP-NT和NIFT检测，效价均<4，而3份CSFV和PrV抗体阳性血清，中和抗体效价>512，3份CSFV和PRRSV抗体阳性血清中和抗体效价分别为96、128、256。3份CSFV和TGEV抗体阳性血清，猪瘟特异性抗体效价为384、512、>512。结果表明，用本发明拯救的绿色荧光蛋白标记的重组猪瘟病毒（EGFP-CSFV）建立的中和试验检测方法EGFP-NT与传统NIFT的特异性一致（表3）。

表3  EGFP-NT和NIFT检测不同猪血清中猪瘟中和抗体的比较

实验例6  EGFP-NT检测中和抗体效价与IDEXX猪瘟抗体ELISA检测血清阻断率的关系

将144份猪瘟疫苗免疫攻毒猪血清对应的中和抗体效价和抗体阻断率进行相关性分析，结果显示，待检猪血清的猪瘟抗体阻断率与其中和抗体效价的对数（LnND₅₀）呈正相关性（图5）。

<110>  中国农业科学院哈尔滨兽医研究所

 

<120>  绿色荧光蛋白标记的重组猪瘟病毒及其拯救方法和应用

 

<130>  DQXL_0028

 

<160>  6    

 

<170>  PatentIn version 3.5

 

<210>  1

<211>  20

<212>  DNA

<213>  artifical sequence

 

<400>  1

cacctcgaga tgctatgtgg                                                   20

 

 

<210>  2

<211>  39

<212>  DNA

<213>  artifical sequence

 

<400>  2

ctcgcccttg ctcaccatgt ttgttttgta taaaagttc                              39

 

 

<210>  3

<211>  41

<212>  DNA

<213>  artifical sequence

 

 

<400>  3

aacttttata caaaacaaac atggtgagca agggcgagga g                           41

 

 

<210>  4

<211>  36

<212>  DNA

<213>  artifical sequence

 

 

<400>  4

cccattggtt tttgtttctt gtacagctcg tccatg                                 36

 

 

<210>  5

<211>  36

<212>  DNA

<213>  artifical sequence

 

 

<400>  5

gacgagctgt acaagaaaca aaaaccaatg ggagtg                                 36

 

 

<210>  6

<211>  21

<212>  DNA

<213>  artifical sequence

 

 

<400>  6

aactctagag gggccctatg g                                                 21

Claims (5)

1.一株绿色荧光蛋白标记的重组猪瘟病毒，其特征在于：其微生物保藏编号为：CGMCC NO.7219。

2.一种拯救权利要求1所述绿色荧光蛋白标记的重组猪瘟病毒的方法，包括以下步骤：

(1)将绿色荧光蛋白编码基因***到猪瘟病毒N^pro蛋白编码区的第13位与第14位氨基酸之间，获得携带有绿色荧光蛋白编码基因的全长感染性克隆质粒；

(2)将携带有绿色荧光蛋白编码基因的全长感染性克隆质粒转染PK-15细胞，拯救出绿色荧光蛋白标记的重组猪瘟病毒。

3.按照权利要求2所述的方法，其特征在于：将携带有绿色荧光蛋白编码基因的全长感染性克隆质粒直接转染PK-15细胞。

4.权利要求1所述绿色荧光蛋白标记的重组猪瘟病毒在制备诊断猪瘟的试剂中的用途。

5.权利要求1所述绿色荧光蛋白标记的重组猪瘟病毒在制备定量检测猪瘟中和抗体效价的试剂中的用途。