CN113999822B - 一种重组病毒及其在腮腺炎病毒中和抗体检测中的应用 - Google Patents

一种重组病毒及其在腮腺炎病毒中和抗体检测中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种重组病毒及其在腮腺炎病毒中和抗体检测中的应用，属于生物技术领域。本发明提供了一种重组病毒及使用此重组病毒作为中和用病毒对腮腺炎病毒进行中和抗体检测的方法，所述重组病毒以腮腺炎病毒为活载体表达标记基因；传统的腮腺炎病毒中和抗体检测方法需要7天终判结果，而本发明的中和抗体检测方法仅需要3天，且结果符合度极高；并且，本发明的中和抗体检测方法通过荧光来计算待检样本中抗体的中和效价，可以在高通量荧光检测仪器中使用，数据可以自动电子化保存，同时屏蔽了人为因素在结果判定中的局限。

Description

一种重组病毒及其在腮腺炎病毒中和抗体检测中的应用
技术领域
本发明涉及一种重组病毒及其在腮腺炎病毒中和抗体检测中的应用，属于生物技术领域。
背景技术
流行性腮腺炎是由腮腺炎病毒（Mumps virus，MuV）引起的一种急性呼吸道传染病。其主要临床症状为发热、腮腺非化脓性肿痛；部分病理还会继发无菌性脑膜炎、胰腺炎、***等；症状严重者可导致伤残或者死亡。流行性腮腺炎在我国属于法定管理的丙类传染病。当前，疫苗的预防接种仍然是该病的重要有效的预防和控制手段，而预防后中和抗体的测定是疫苗预防接种后免疫效果判定的重要手段。
中和试验（neutralizationtest）是在体外适当条件下孵育病毒与特异性抗体的混合物，使病毒与抗体相互反应，再将混合物接种到敏感的宿主体内，然后测定残存的病毒感染力的一种方法。中和试验必须在敏感的宿主中进行。目前，可用于中和试验的敏感宿主主要包括敏感动物、鸡胚以及细胞。
其中，以敏感动物作为宿主进行中和试验时，主要观察抗体能否保护易感动物免于死亡、瘫痪，但是，此方法受动物模型影响较大，检测结果不稳定，并且，以敏感动物作为宿主进行中和试验存在操作繁琐，所需时间过长，以及，不利于动物福利的问题；以鸡胚作为宿主进行中和试验时，主要通过观察绒毛***上的痘疮结构来检测病毒或用血凝试验检测鸡胚尿囊液流感病毒的滴度，但是，此方法受鸡胚质量的影响较大，检测结果也不是很稳定，并且，此方法操作也十分繁琐；以细胞作为宿主进行中和试验时，主要观察抗体能否抑制病毒的细胞病变效应（cytopathic effect, CPE）或病毒空斑形成，与以敏感动物和鸡胚作为宿主进行中和试验相比，以细胞作为宿主进行中和试验具有检测结果相对稳定，操作简单，细胞易获得，成本低，以及，减少动物使用等的优势。因此，现阶段，以细胞作为宿主进行中和试验最为常见。
目前，以细胞作为宿主进行中和试验的方法主要有微量细胞病变法、免疫荧光法、可视模式病毒检测法等，而针对腮腺炎病毒最常用以细胞作为宿主进行中和试验的方法为微量细胞病变法，即通过观察细胞病变效应确定中和抗体水平。但是，传统的微量细胞病变法一般需要7~10天，且需要人工判定结果（具体可参见药典三部），存在检测效率低，以及，对实验人员的专业性要求较高的问题。因此，亟需找到周期短且无需人工判定结果的中和试验方法以对腮腺炎病毒进行中和抗体检测。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供了一种重组病毒，所述重组病毒以腮腺炎病毒为活载体表达标记基因。
在本发明的一种实施方式中，所述标记基因为编码荧光蛋白的基因或编码荧光素酶的基因。
在本发明的一种实施方式中，所述荧光蛋白为绿色荧光蛋白；所述绿色荧光蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
在本发明的一种实施方式中，编码所述绿色荧光蛋白的基因的核苷酸序列如SEQID NO.2所示。
在本发明的一种实施方式中，编码荧光蛋白的基因***在腮腺炎病毒基因组的NP片段和P/V片段之间，或者，编码荧光蛋白的基因***在腮腺炎病毒基因组的F片段和SH片段之间。
本发明还提供了一种对腮腺炎病毒进行中和抗体检测的方法，所述方法为使用上述重组病毒作为中和用病毒对腮腺炎病毒进行中和抗体检测。
在本发明的一种实施方式中，所述方法包括如下步骤：
稀释步骤：将待检样本灭活后进行倍比稀释，得到不同稀释度的待检样本；
中和步骤：将上述的重组病毒分别与每个稀释度的待检样本混合后进行中和作用，得到混合液；
感染步骤：将腮腺炎病毒的宿主细胞与混合液混合后进行培养，得到培养液；
计算步骤：观察培养液的荧光情况，并根据荧光情况计算待检样本中抗体的中和效价。
在本发明的一种实施方式中，所述重组病毒与每个稀释度的待检样本的混合比例为25~300 CCID50：50 μL。
在本发明的一种实施方式中，所述宿主细胞与混合液的混合比例为等体积比混合。
在本发明的一种实施方式中，所述中和作用为于37℃下中和作用1 h。
在本发明的一种实施方式中，所述宿主细胞为Vero细胞。
在本发明的一种实施方式中，所述培养为于34℃、5%（v/v）CO2的培养箱中进行培养。
在本发明的一种实施方式中，所述观察为观察培养3天和7天的培养液的荧光情况。
在本发明的一种实施方式中，所述中和效价（LgND50）的计算公式如下：
P=(50%-低于50%死亡率)/（高于50%死亡率-低于50%死亡率）；
LgND50=Lg(低于50%死亡率的稀释度)+P*稀释倍数的对数。
本发明还提供了上述重组病毒或上述方法在腮腺炎病毒中和抗体检测中的应用。
本发明技术方案，具有如下优点：
本发明提供了一种重组病毒及使用此重组病毒作为中和用病毒对腮腺炎病毒进行中和抗体检测的方法，所述重组病毒以腮腺炎病毒为活载体表达标记基因；传统的腮腺炎病毒中和抗体检测方法需要7天终判结果，而本发明的中和抗体检测方法仅需要3天，且结果符合度极高；并且，本发明的中和抗体检测方法通过荧光来计算待检样本中抗体的中和效价，可以在高通量荧光检测仪器中使用，数据可以自动电子化保存，同时屏蔽了人为因素在结果判定中的局限。
进一步地，编码荧光蛋白的基因***在腮腺炎病毒基因组的F片段和SH片段之间；外源基因的***可能会影响腮腺炎病毒的生长，而本发明通过此特定的***位点，获得了和亲本病毒在生长动力学上没有差异的重组病毒，使用此重组病毒作为中和用病毒对腮腺炎病毒进行中和抗体检测的检测结果更为准确。
附图说明
图1：重组病毒基因组架构模式。
图2：重组病毒pAC-rMuV-eGFP（N-P）在Vero细胞中的EGFP表达结果。
图3：重组病毒pAC-rMuV-eGFP（F-SH）在Vero细胞中的EGFP表达结果。
图4：不同重组病毒的多步生长曲线。
图5：重组病毒rMuV-EGFP（F-SH）作为中和用病毒的三天中和抗体滴度和七天中和抗体滴度。
图6：基于小鼠血清样本的重组病毒rMuV-EGFP（F-SH）和rMuV作为中和用病毒的中和抗体结果对比。
图7：基于恒河猴血清样本的重组病毒rMuV-EGFP（F-SH）和rMuV作为中和用病毒的中和抗体结果对比。
具体实施方式
提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，并不局限于所述最佳实施方式，不对本发明的内容和保护范围构成限制，任何人在本发明的启示下或是将本发明与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的产品，均落在本发明的保护范围之内。
下述实施例中未注明具体实验步骤或条件者，按照本领域内的文献所描述的常规实验步骤的操作或条件即可进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。
下述实施例中涉及的缓冲液如下：
PBS缓冲液：先称取8.0g NaCl、0.2g KCl、1.44g Na2HPO4、0.24g KH2PO4溶于800mL蒸馏水中，然后用HCl调节pH至7.4，最后加蒸馏水定容至1L，即得0.01M、pH 7.4的PBS缓冲液。
实施例1：一种重组病毒
本实施例提供了一种重组病毒，所述重组病毒以腮腺炎病毒毒株QS-F（保藏编号为CCTCC No:V201948，记载于公开号为CN111019910A的专利申请文本中）为活载体表达编码绿色荧光蛋白的基因（氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示、核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示），其中，编码绿色荧光蛋白的基因***在腮腺炎病毒基因组的NP片段和P/V片段之间（重组病毒基因组架构模式见图1）。
所述重组病毒的制备方法包括如下步骤：
1、pAC-rMuV-eGFP（N-P）全长克隆的构建
合成DNA片段F1、F2；使用限制性内切酶PmlI和NaeI（购自Takara公司）对重组质粒pAC-MuV（记载于公开号为CN111019910A的专利申请文本中）进行酶切，得到线性化的重组质粒pAC-MuV；将F1、F2和线性化的重组质粒pAC-MuV进行同源重组，得到pAC-rMuV-eGFP（N-P）全长克隆（使用的扩增引物见表1）。
2、病毒拯救
将BSR细胞（购自中检院）以8*105个的接种量接种于含有2000 μL/孔 DMEM培养基（购自Gibco公司）的六孔板中，于37℃下培养24 h后，选择细胞汇合度80~90%的细胞孔用于病毒拯救；将7 μg pAC-rMuV-eGFP（N-P）全长克隆、1.5 μg辅助质粒pcDNA3.1-N（记载于公开号为CN111019910A的专利申请文本中）、0.2 μg pcDNA3.1-P（记载于公开号为CN111019910A的专利申请文本中）和1.0 μg pcDNA3.1-L（记载于公开号为CN111019910A的专利申请文本中）与400 μL DMEM培养基混合，得到混合液1；将12 μL LipofectamineTM2000转染试剂（购自Invitrogen公司）与400 μL DMEM培养基混合，得到混合液2；将混合液1和混合液2混合后，于室温（25℃）下孵育20 min，得到质粒转染试剂混合物；用PBS缓冲液洗涤病毒拯救细胞孔中的BSR细胞3次，洗涤结束后，将质粒转染试剂混合物以700 μL/孔的添加量加入病毒拯救细胞孔中，于37℃孵育6 h，孵育结束后，用PBS缓冲液洗涤病毒拯救细胞孔中的BSR细胞3次，洗涤结束后，将病毒拯救细胞孔中的质粒转染试剂混合物更换为含2%（v/v）胎牛血清（购自Gibco公司）、1%（v/v）青霉素-链霉素双抗（购自Gibco公司）的DMEM培养基，于34℃培养4 d，培养结束后，将Vero细胞以转染细胞：Vero细胞=1：1的数量比添加至病毒拯救细胞孔中，于37℃继续培养10 d，直至细胞出现明显的融合病灶。使用荧光显微镜观察病毒拯救细胞孔中的绿色荧光，观察结果见图2。
由图2可知，绿色荧光蛋白能够在细胞中正常表达，即表达GFP的重组病毒pAC-rMuV-eGFP（N-P）构建成功。
表1 扩增引物
Figure 742025DEST_PATH_IMAGE001
实施例2：一种重组病毒
本实施例提供了一种重组病毒，所述重组病毒以腮腺炎病毒毒株QS-F（保藏编号为CCTCC No:V201948，记载于公开号为CN111019910的专利申请文本中）为活载体表达编码绿色荧光蛋白的基因（氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示、核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示），其中，编码绿色荧光蛋白的基因***在腮腺炎病毒基因组的F片段和SH片段之间（重组病毒基因组架构模式见图1）。
所述重组病毒的制备方法包括如下步骤：
1、pAC-rMuV-eGFP（F-SH）全长克隆的构建
合成DNA片段F3、F4、F5；以F3和F4为模板，F3-GFP-F、F4-GFP-R为引物，进行融合PCR，得到片段F3+F4；使用限制性内切酶Xma I和Sap I（购自Takara公司）对重组质粒pAC-MuV（记载于公开号为CN111019910A的专利申请文本中）进行酶切，得到线性化的重组质粒pAC-MuV；将F3+F4、F5和线性化的重组质粒pAC-MuV进行同源重组，得到pAC-rMuV-eGFP（F-SH）全长克隆（使用的扩增引物见表2）。
2、病毒拯救
将BSR细胞（购自中检院）以8*105个的接种量接种于含有2000 μL/孔 DMEM培养基（购自Gibco公司）的六孔板中，于37℃下培养24 h后，选择细胞汇合度80~90%的细胞孔用于病毒拯救；将7 μg pAC-rMuV-eGFP（F-SH）全长克隆、1.5 μg辅助质粒pcDNA3.1-N（记载于公开号为CN111019910A的专利申请文本中）、0.2 μg pcDNA3.1-P（记载于公开号为CN111019910A的专利申请文本中）和1.0 μg pcDNA3.1-L（记载于公开号为CN111019910A的专利申请文本中）与400 μL DMEM培养基混合，得到混合液1；将12 μL LipofectamineTM2000转染试剂（购自Invitrogen公司）与400 μL DMEM培养基混合，得到混合液2；将混合液1和混合液2混合后，于室温（25℃）下孵育20 min，得到质粒转染试剂混合物；用PBS缓冲液洗涤病毒拯救细胞孔中的BSR细胞3次，洗涤结束后，将质粒转染试剂混合物以700 μL/孔的添加量加入病毒拯救细胞孔中，于37℃孵育6 h，孵育结束后，用PBS缓冲液洗涤病毒拯救细胞孔中的BSR细胞3次，洗涤结束后，将病毒拯救细胞孔中的质粒转染试剂混合物更换为含2%（v/v）胎牛血清（购自Gibco公司）、1%（v/v）青霉素-链霉素双抗（购自Gibco公司）的DMEM培养基，于34℃培养4 d，培养结束后，将Vero细胞以转染细胞：Vero细胞=1：1的数量比添加至病毒拯救细胞孔中，于37℃继续培养10 d，直至细胞出现明显的融合病灶。使用荧光显微镜观察病毒拯救细胞孔中的绿色荧光，观察结果见图3。
由图3可知，绿色荧光蛋白能够在细胞中正常表达，即表达GFP的重组病毒pAC-rMuV-eGFP（F-SH）构建成功。
表2 扩增引物
Figure 336955DEST_PATH_IMAGE002
实验例1：重组病毒的性能生长验证
将Vero细胞（购自ATCC）以8*105个的接种量提前铺板至含有2000 μL/孔 DMEM培养基（购自Gibco公司）的六孔板中，于37℃下培养至细胞长满单层；培养结束后，以亲本病毒rMuV（即腮腺炎病毒毒株QS-F）为对照，将重组病毒pAC-rMuV-eGFP（N-P）和重组病毒pAC-rMuV-eGFP（F-SH）以0.01MOI的接种量分别接种至长成单层的Vero细胞中，于37℃下吸附感染1h后，用移液枪吸去DMEM培养基，并在六孔板中以2000 μL/孔的添加量加入含2%（v/v）胎牛血清的细胞维持液（所述细胞维持液为购自Gibco公司的DMEM培养基），于34℃下进行培养，分别于接种病毒1d、2d、3d、4d、5d收集培养上清，进行病毒滴度测定（病毒滴度测定方法参见药典三部），并绘制多步生长曲线，分析不同重组病毒在生长动力学上是否存在差异，分析结果如图4所示。
由图4可知，重组病毒rMuV-EGFP（F-SH）和亲本病毒rMuV在生长动力学上没有差异，rMuV-EGFP（N-P）的复制能力略弱于rMuV-EGFP（F-SH）和rMuV。
实验例2：中和试验判定结果时间的确认
选择30份小鼠血清（小鼠血清由上海青赛生物科技有限公司提供，血清提取所用小鼠为购自北京维通利华实验动物技术有限公司的Balb/c、16~18g、雌性小鼠），采用微量病毒中和的方法，使用实施例2中的重组病毒rMuV-EGFP（F-SH）作为中和用病毒，通过观察绿色荧光来确定判定中和结果的最佳时间，具体过程如下：
将待检血清于56℃灭活30 min后，用含2%（v/v）胎牛血清的DMEM作为血清稀释液（（购自Gibco公司）进行2倍倍比稀释至1：128，得到不同稀释度的血清；取50 μL每个稀释度的血清与50 μL重组病毒rMuV-EGFP（F-SH）（含100 CCID50）混合后，于37℃下中和作用1 h，得到混合液；将Vero细胞以2*104个的接种量接种至混合液中后，于34℃、5%（v/v）CO2的培养箱中进行培养，分别在培养3天和7天于荧光显微镜下观察绿色荧光情况。按照Reed/Muench法计算血清抗体的中和效价（Reed/Muench法可参见药典三部）。将结果进行统计分析，分析结果见图5。
中和效价（LgND50）的计算公式如下：
P=(50%-低于50%死亡率)/（高于50%死亡率-低于50%死亡率）；
LgND50=Lg(低于50%死亡率的稀释度)+P*稀释倍数的对数。
由图5可知，在第3天或者第7天对结果进行观察和确认，30个检测样本中，只有1个样本的中和结果有些许偏差，但在合理误差范围内，其R2能够达到0.998，具有高度一致性，故可以在实验的第3天通过观察绿色荧光对中和结果进行最终判定。
实验例3：中和试验效果的确认
选择37份小鼠血清样本和25份恒河猴血清样本（其中，小鼠血清由上海青赛生物科技有限公司提供，血清提取所用小鼠为购自北京维通利华实验动物技术有限公司的Balb/c、16~18g、雌性小鼠，恒河猴血清由广东省实验动物监测所（广州科学城-春盛药物评价中心）提供），采用微量病毒中和的方法，分别使用实施例2中的重组病毒rMuV-EGFP（F-SH）和亲本病毒rMuV作为中和用病毒，通过观察绿色荧光和细胞病变的方法对结果进行确认（微量细胞病变法具体可参见药典三部），具体过程如下：
将待检血清于56℃灭活30 min后，用含2%（v/v）胎牛血清的DMEM作为血清稀释液（（购自Gibco公司）进行2倍倍比稀释至1：128，得到不同稀释度的血清；取50 μL每个稀释度的血清与50 μL重组病毒rMuV-EGFP（F-SH）（含100 CCID50）混合后，于37℃下中和作用1 h，得到混合液；将Vero细胞以2*104个的接种量接种至混合液中后，于34℃、5%（v/v）CO2的培养箱中进行培养，分别在培养3天和7天于荧光显微镜下观察绿色荧光情况。按照Reed/Muench法计算血清抗体的中和效价（Reed/Muench法可参见药典三部）。将结果进行统计分析，分析结果见图6~7。
中和效价（LgND50）的计算公式如下：
P=(50%-低于50%死亡率)/（高于50%死亡率-低于50%死亡率）；
LgND50=Lg(低于50%死亡率的稀释度)+P*稀释倍数的对数。
由图6~7可知，与传统方法相比，荧光病毒法检测的小鼠血清样本结果中有35份与传统方法检测的中和抗体结果一致，符合率为94.59%；荧光病毒法检测的恒河猴血清样本结果中有23份与传统方法检测的中和抗体结果一致，符合率为92%。两种方法检测差异的样本的数据差异极小，说明，荧光病毒法完全可以替代传统的腮腺炎病毒中和抗体检测方法。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
序列表
<110> 北京赛尔富森生物科技有限公司
<120> 一种重组病毒及其在腮腺炎病毒中和抗体检测中的应用
<160> 13
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 239
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 1
Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu
1 5 10 15
Val Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly
20 25 30
Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile
35 40 45
Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr
50 55 60
Leu Thr Tyr Gly Val Gln Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys
65 70 75 80
Gln His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu
85 90 95
Arg Thr Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu
100 105 110
Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly
115 120 125
Ile Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr
130 135 140
Asn Tyr Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Met Ala Asp Lys Gln Lys Asn
145 150 155 160
Gly Ile Lys Val Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu Asp Gly Ser
165 170 175
Val Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly
180 185 190
Pro Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Ala Leu
195 200 205
Ser Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe
210 215 220
Val Thr Ala Ala Gly Ile Thr Leu Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys
225 230 235
<210> 2
<211> 720
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
atggtgagca agggcgagga gctgttcacc ggggtggtgc ccatcctggt cgagctggac 60
ggcgacgtaa acggccacaa gttcagcgtg tccggcgagg gcgagggcga tgccacctac 120
ggcaagctga ccctgaagtt catctgcacc accggcaagc tgcccgtgcc ctggcccacc 180
ctcgtgacca ccctgaccta cggcgtgcag tgcttcagcc gctaccccga ccacatgaag 240
cagcacgact tcttcaagtc cgccatgccc gaaggctacg tccaggagcg caccatcttc 300
ttcaaggacg acggcaacta caagacccgc gccgaggtga agttcgaggg cgacaccctg 360
gtgaaccgca tcgagctgaa gggcatcgac ttcaaggagg acggcaacat cctggggcac 420
aagctggagt acaactacaa cagccacaac gtctatatca tggccgacaa gcagaagaac 480
ggcatcaagg tgaacttcaa gatccgccac aacatcgagg acggcagcgt gcagctcgcc 540
gaccactacc agcagaacac ccccatcggc gacggccccg tgctgctgcc cgacaaccac 600
tacctgagca cccagtccgc cctgagcaaa gaccccaacg agaagcgcga tcacatggtc 660
ctgctggagt tcgtgaccgc cgccgggatc actctcggca tggacgagct gtacaagtaa 720
<210> 3
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 3
acagacaaat gcacgtgcga tagcgg 26
<210> 4
<211> 37
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 4
tttctagcta gctgccggca tagtgcaacg gcagggt 37
<210> 5
<211> 105
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 5
tcctaacatt gtgattcatt ctgcattgag aaaagattta gaaaaaaacc aaattaagaa 60
tgaatctcct ggggtcgtaa cgtctcgtga ccctgccgtt gcact 105
<210> 6
<211> 111
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 6
catggacgag ctgtacaagt aaattactga catggtcaga ctacacccaa atgcaattac 60
cccaggacaa tctagccaca gctaactgcc caaatccact acattccatc c 111
<210> 7
<211> 128
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 7
aaatccacta cattccatcc atatttagtc tttaagaaaa aaggcgcgcc gagttaagaa 60
tgaatctcct ggggtcgtaa cgtctcgtgg ccctgccgtt gcactatgcc ggcaatccac 120
cctccctt 128
<210> 8
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 8
ccccaaataa tggactttgc acccgggggc tacccattga ta 42
<210> 9
<211> 52
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 9
cggtgaacag ctcctcgccc ttgctcacca tggcttgccc ggaaagaaac ac 52
<210> 10
<211> 52
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 10
gtgtttcttt ccgggcaagc catggtgagc aagggcgagg agctgttcac cg 52
<210> 11
<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 11
agtctgacca tgtcagtaat ttacttgtac agctcgtcca t 41
<210> 12
<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 12
atggacgagc tgtacaagta aattactgac atggtcagac t 41
<210> 13
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 13
catctaaata cagtgtaggc tcttcaccgg agctgaatg 39

Claims (13)

1.一种重组病毒，其特征在于，所述重组病毒以腮腺炎病毒为活载体表达编码荧光蛋白的基因；所述腮腺炎病毒的保藏编号为CCTCC No:V201948；所述编码荧光蛋白的基因***在腮腺炎病毒基因组的F片段和SH片段之间。
2.如权利要求1所述的重组病毒，其特征在于，所述荧光蛋白为绿色荧光蛋白；所述绿色荧光蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
3.如权利要求2所述的重组病毒，其特征在于，编码所述绿色荧光蛋白的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
4.一种对腮腺炎病毒进行中和抗体检测的方法，所述方法非疾病的诊断和治疗目的，其特征在于，所述方法为使用权利要求1~3任一项所述的重组病毒作为中和用病毒对腮腺炎病毒进行中和抗体检测。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
稀释步骤：将待检样本灭活后进行倍比稀释，得到不同稀释度的待检样本；
中和步骤：将权利要求1~3任一项所述的重组病毒分别与每个稀释度的待检样本混合后进行中和作用，得到混合液；
感染步骤：将腮腺炎病毒的宿主细胞与混合液混合后进行培养，得到培养液；
计算步骤：观察培养液的荧光情况，并根据荧光情况计算待检样本中抗体的中和效价。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述重组病毒与每个稀释度的待检样本的混合比例为25~300 CCID50：50 μL。
7.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述宿主细胞与混合液的混合比例为等体积比混合。
8.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述中和作用为于37℃下中和作用1 h。
9.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述宿主细胞为Vero细胞。
10.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述培养为于34℃、5%（v/v）CO2的培养箱中进行培养。
11.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述观察为观察培养3天的培养液的荧光情况。
12.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述中和效价LgND50的计算公式如下：
P=(50%-低于50%死亡率)/（高于50%死亡率-低于50%死亡率）；
LgND50=Lg(低于50%死亡率的稀释度)+P*稀释倍数的对数。
13.权利要求1~3任一项所述的重组病毒或权利要求4~12任一项所述的方法在腮腺炎病毒中和抗体检测中的非疾病的诊断和治疗目的的应用。
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