CN113917139A - 基于重组荧光病毒的血清4型禽腺病毒中和抗体的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于重组荧光病毒的血清4型禽腺病毒中和抗体的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：S1、将待检血清稀释后与10000～20000TCID50/50μL的荧光病毒FAdV‑4‑EGFP混合，恒温孵育1～2h；S2、将孵育好的病毒与血清的混合物接种于LMH细胞中并培养24～36h，然后在荧光显微镜下观察荧光病毒被中和情况。本发明以前期拯救的表达绿色荧光蛋白的重组病毒FAdV‑4‑EGFP为基础，该毒株为高度致弱疫苗候选株，高剂量肌注感染鸡也不发病，与亲本株生长特性相近、生物安全性高、不存在散播强毒的隐患；相比于传统的中和试验，本发明提供的方案最短仅需要感染重组病毒24h后即可观察结果，可实现中和试验结果提前2‑3天，大幅缩短了检测所需时间。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术检测领域，具体涉及一种基于表达绿色荧光蛋白的重组荧光病毒株FAdV-4-EGFP的新型中和抗体检测方法。
背景技术
禽腺病毒(Fowl Adenovirus，FAdV)属于腺病毒科禽腺病毒属，分为5个种(A-E)，12个血清型(1-7，8a，8b，9-11)。近年爆发的由高致病性血清4型禽腺病毒(FAdV-4)感染引起的肝炎-心包积液综合征给国内外养鸡业造成了巨大经济损失。
针对FAdV-4疫情，研究人员已开展疫苗的研发尝试，相应的FAdV-4灭活候选疫苗株已应用于禽群接种。对疫苗引起的机体体液免疫反应的评估是评价疫苗效果的重要指标。基于间接免疫荧光检测的中和试验(Neutralization test，NT)是评价FAdV-4诱导产生的中和抗体的常用方法。
目前研究者已进行了疫苗的研发尝试，灭活疫苗候选株已开展规模的临床试验。在FAdV-4疫苗的研制中，无论是灭活疫苗还是减毒活疫苗，对于引起机体体液免疫反应的评估都是重中之重。目前，FAdV-4中和抗体定量检测的方法主要为中和试验结合间接免疫荧光技术。然此方法通常采用的攻毒株为强毒株，毒力较强，存在潜在的安全隐患；同时操作较复杂，需要严格的实验室条件和熟练的操作人员；而且需要质量好且昂贵的特异性抗FAdV-4的一抗和FITC标记的二抗。有鉴于此，传统的中和抗体测定方法已然阻碍了临床一线大批量FAdV-4中和抗体的检测需求。因此，建立新型安全、经济、快速的FAdV-4中和抗体检测方法是现实需要。
FAdV-4的基因组上存在诸多外源基因***位点，科学家们常把标记基因(如EGFP)或其他病毒的外源基因***其中，以求开发出具有基因标记的重组病毒作为FAdV-4疫苗的候选毒株，用于FAdV-4的免疫防控之中。但截止目前，尚未有将表达标记基因的重组FAdV-4作为中和试验靶病毒来实现高效检测FAdV-4中和抗体水平的报道。
发明内容
针对上述问题，本发明提供了一种血清4型禽腺病毒中和抗体的检测方法，该检测方法特异性强、灵敏度高、安全经济、操作快速简便的基于重组荧光病毒株FAdV-4-EGFP的新型中和抗体检测方法，为快捷高效评价FAdV-4疫苗免疫效果提供技术支撑。
为了实现上述目的，本发明提供一种基于重组荧光病毒的血清4型禽腺病毒中和抗体的检测方法，该检测方法包括如下步骤：
S1、将待检血清稀释后与10000～20000TCID50/50μL的荧光病毒FAdV-4-EGFP混合，恒温孵育1～2h；
S2、将孵育好的病毒与血清的混合物接种于LMH细胞中并培养24～36h，然后在荧光显微镜下观察荧光病毒被中和情况。
上述技术方案中，利用CRISPR-Cas9技术构建表达绿色荧光蛋白的重组弱毒株FAdV-4-EGFP及其致病性、体内外复制特性的测定参见中国专利CN 112877303A《一种EGFP与Fiber-2融合表达的重组血清4型禽腺病毒及其制备方法》。采用FAdV-4-EGFP的Fiber-2蛋白融合表达EGFP，而Fiber-2是FAdV-4的主要表面抗原蛋白之一，易于随时视踪FAdV-4感染过程。
FAdV-4-EGFP病毒可在易感细胞LMH上高滴度增殖，材料容易获取。
本发明采用合适的荧光病毒以及合适的感染量，使得中和试验结果可提前2-3天，大幅缩短了检测所需时间，而且相对于传统使用强毒株的方法，提升了检测的安全性。
具体地，步骤S1中，所述待检血清与所述荧光病毒FAdV-4-EGFP按(1～2)：1的比例混合。
上述技术方案中，合适的配比既可以获得良好的检测结果，又能避免材料浪费。
步骤S1中，在37℃下进行恒温孵育。
优选地，步骤S1中，所述荧光病毒FAdV-4-EGFP的使用病毒量为20000TCID50/50μL。
在20000TCID50/50μL/孔的感染量下，EGFP阳性细胞数目更多，更便于观察和避免主观性。
优选地，步骤S2中，所述LMH细胞的细胞密度为75～85％。
上述技术方案中，将状态良好的LMH细胞消化于96孔板上，置于37℃、5％CO2细胞培养箱中培养，至细胞密度为75～85％时进行试验。
优选地，步骤S2中，培养时间为24h。
本发明中，24h和36h时EGFP阳性细胞数目最多，且两时间点观察效果差不多，为了提升检测效率，因此中和试验的判定时间优选为24h。
通过上述技术方案，本发明实现了以下有益效果：
1、本发明以前期拯救的表达绿色荧光蛋白的重组病毒FAdV-4-EGFP为基础，该毒株为高度致弱疫苗候选株，高剂量肌注感染鸡也不发病，与亲本株生长特性相近、生物安全性高、不存在散播强毒的隐患；
2、本发明采用的FAdV-4-EGFP能稳定表达绿色荧光蛋白，特异性荧光主要分布在细胞胞浆，荧光点清晰，亮度高，直接观测病毒发出的荧光，判断效果好，易于识别，可以很好排除假阳性或假阴性结果；
3、相比于传统的中和试验，本发明提供的方案最短仅需要感染重组病毒24h后即可观察结果，可实现中和试验结果提前2-3天，大幅缩短了检测所需时间；另外，本发明无需固定和免疫染色细胞，也节约了昂贵的一抗和FITC标记的二抗的使用，减少了IFA过程的染色步骤，更加快速简便及经济。
附图说明
图1是本发明中和抗体检测方法在不同感染剂量下荧光病毒生长情况示意图；
图2是本发明中和抗体检测方法在不同感染时间下荧光病毒生长情况示意图；
图3是本发明实施例1的检测效果示意图；
图4是本发明实施例1特异性分析示意图；
图5是本发明实施例1检测感染FAdV-4鸡不同时间段中和抗体水平变化(A)及其与传统中和试验的对比(B)示意图；
图6是本发明实施例1对免疫鸡群、攻毒鸡群血清及SPF鸡群的中和抗体水平检测及其与传统中和试验的对比示意图。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
实施例1
1、表达绿色荧光蛋白的重组弱毒株FAdV-4-EGFP的构建与鉴定
利用CRISPR-Cas9技术构建表达绿色荧光蛋白的重组弱毒株FAdV-4-EGFP及其致病性、体内外复制特性的测定参见中国专利CN 112877303 A(说明书第[0030]-[0044]段)。
2、基于FAdV-4-EGFP的新型中和抗体检测方法的建立
a.将状态良好的LMH细胞消化于96孔板上，置于37℃、5％CO2细胞培养箱中培养，待细胞密度至约80％时准备进行试验；
b.将荧光病毒分别稀释至20000TCID50/50μL，分别与1：8预先稀释的阴阳性血清在1.5mL的EP管中按体积比1：1混合，在37℃恒温箱中孵育1h；
c.轻甩掉96孔板的培养上清，将病毒与血清的混合物按不同稀释度分别接种于细胞孔中，每个梯度100μL，做2个重复孔；
d.培养24h后，在荧光显微镜下观察病毒生长情况，并拍照保存。
按优化好的方法对标准阴阳性血清(标准阴性血清为SPF鸡血清，标准阳性血清为抗血清4型禽腺病毒的鸡血清)进行检测，检测效果如图3所示，可见阴阳性血清区分明确，特异性荧光清晰可见，阳性血清的中和抗体滴度易于判定。
效果的判定标准为：某一血清稀释度下2个重复孔中均未观察到特异性荧光，即判定该稀释度下的血清抗体完全保护细胞不受荧光病毒的感染，最大稀释度即为该血清的中和效价，以Log2为底数的对数值表示(下同)。
实施例2
其他条件同实施例1，将荧光病毒感染量更换为1250、2500、5000和10000TCID50/50μL/孔，在荧光显微镜下观察病毒生长情况，并拍照保存。结果如图1所示。从图1可以看出，在10000TCID50/50μL/孔和20000TCID50/50μL/孔的感染量下，EGFP阳性细胞数目更多，更便于观察和避免主观性。
实施例3
其他条件同实施例1，将培养时间更换为12、18、30和36h，在荧光显微镜下观察病毒生长情况，拍照记录，结果如图2所示。从图2可以看出，24～36h时，EGFP阳性细胞数目相对比较多，已经能达到良好的检测效果，相对于传统的中和试验，本发明可节约2～3天的时间，大大提升检测效率。
实施例4性能检测
1、基于FAdV-4-EGFP的新型中和抗体检测方法的特异性分析
采用实施例1的方法分别检测抗Ⅰ群FAdV所有血清型(1-7，8a，8b，9-11)鸡阳性血清及抗新城疫病毒(NDV)、减蛋综合征病毒(EDS)、H9亚型禽流感病毒(H9-AIV)、J亚群禽白血病病毒(ALV-J)、鸡传染性贫血病病毒(CIAV)、传染性鸡气管炎病毒(IBV)鸡阳性血清，并同时设置SPF鸡血清对照。结果显示(如图4所示)，仅FAdV-4阳性血清检出对荧光病毒的中和效应，其它均为阴性，表明该方法特异性较强。
2、基于FAdV-4-EGFP的新型中和抗体检测方法检测感染FAdV-4鸡不同时间段中和抗体水平变化及其与传统中和试验的对比
采用实施例1的中和抗体检测方法(Novel NT)以及传统中和试验(TraditionalNT：参见《A novel monoclonal antibody efficiently blocks the infection ofserotype 4fowl adenovirus by targeting fiber-2》中“Neutralization testing”部分，Wang et al.Vet Res(2018)49:29)分别检测低剂量感染病毒0、7、14、21、28d后的鸡血清(每个时间点5份)。
实验结果(如图5中A图所示)显示，感染FAdV-4可在7d检测到中和抗体，21d时中和抗体达到顶峰，并在28d后开始下降。两种方法所检测的中和抗体水平变化规律一致(如图5中B图所示)，并具有很强的相关性。
3、基于FAdV-4-EGFP的新型中和抗体检测方法的可行性评价
采用实施例1中的中和抗体检测方法对实验室制备的20份FAdV-4攻毒鸡血清、20份高剂量免疫鸡血清和20份SPF鸡血清进行检测，并与传统的中和试验方法进行对比。检测结果(如图6所示)表明，两种方法有较好的线性相关性，而本发明所建立的方法灵敏度明显高于传统方法，因此，可用本发明的方法替代传统方法。
由以上描述可以看出，基于重组荧光病毒FAdV-4-EGFP所构建的中和抗体检测方法可以对临床鸡群的中和抗体水平进行定量分析，所得结果更加客观、灵敏，24h左右即可完成对全部结果的判定。因此，与传统的病毒中和抗体检测试验相比，本发明创制的基于重组荧光病毒的检测FAdV-4中和抗体的方法具有一致性好、特异性强、安全性高、快速简便及高效经济等优点，实现了中和试验结果提前2-3天，解决了传统中和试验繁琐、耗时及低效等问题，展示了很好的临床应用价值。
以上结合实施例详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。
Claims (6)
1.一种基于重组荧光病毒的血清4型禽腺病毒中和抗体的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、将待检血清稀释后与10000～20000TCID50/50μL的荧光病毒FAdV-4-EGFP混合，恒温孵育1～2h；
S2、将孵育好的病毒与血清的混合物接种于LMH细胞中并培养24～36h，然后在荧光显微镜下观察荧光病毒被中和情况。
2.根据权利要求1所述的基于重组荧光病毒的血清4型禽腺病毒中和抗体的检测方法，其特征在于，步骤S1中，所述待检血清与所述荧光病毒FAdV-4-EGFP按(1～2)：1的比例混合。
3.根据权利要求1所述的基于重组荧光病毒的血清4型禽腺病毒中和抗体的检测方法，其特征在于，步骤S1中，在37℃下进行恒温孵育。
4.根据权利要求1所述的基于重组荧光病毒的血清4型禽腺病毒中和抗体的检测方法，其特征在于，步骤S1中，所述荧光病毒FAdV-4-EGFP的病毒感染量为20000TCID50/50μL。
5.根据权利要求1所述的基于重组荧光病毒的血清4型禽腺病毒中和抗体的检测方法，其特征在于，步骤S2中，所述LMH细胞的细胞密度为75～85％。
6.根据权利要求1所述的基于重组荧光病毒的血清4型禽腺病毒中和抗体的检测方法，其特征在于，步骤S2中，培养时间为24h。
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