CN103254539B

CN103254539B - 一种高强度高韧性蛋白质分子印迹杂化凝胶膜及其制备方法

Info

Publication number: CN103254539B
Application number: CN201310141816.1A
Authority: CN
Inventors: 赵孔银; 崔文葵; 魏俊富; 季舒骏; 张方彦
Original assignee: Tianjin Polytechnic University
Current assignee: GUANGZHOU SAILING MEDICINE TECHNOLOGY Co.,Ltd.
Priority date: 2013-04-23
Filing date: 2013-04-23
Publication date: 2015-09-16
Anticipated expiration: 2033-04-23
Also published as: CN103254539A

Abstract

本发明以海藻酸钠为高分子骨架，以水溶性化合物为致孔剂，以丙烯酰胺及其衍生物为功能单体，将功能单体与模板蛋白质一起溶解形成络合物，加入化学交联剂和离子交联剂，引发聚合形成含蛋白质的高强度高韧性的双交联网络水凝胶，洗脱掉致孔剂和蛋白质模板后得到的多孔杂化凝胶膜对模板蛋白质具有较大的吸附量和较好的吸附选择性；可以利用各种环境刺激因素如温度、pH、溶剂性质、离子强度和特殊的化学刺激等改变凝胶的性能，从而调控分子印迹杂化凝胶膜与蛋白质的相互作用。该制备方法工艺简单，成本低，所得产品在蛋白质分离分析、蛋白质控制释放、组织工程等领域有良好的应用前景。

Description

一种高强度高韧性蛋白质分子印迹杂化凝胶膜及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种高强度高韧性蛋白质分子印迹杂化凝胶膜及其制备方法，属于生物材料、复合材料和高分子材料领域。

背景技术

分子印迹是制备对特定目标分子(模板分子)具有特异选择性的聚合物(分子印迹聚合物MIPs)的技术。MIPs具有预定性、识别性和实用性的特点，在固相萃取、免疫分析、生物材料模拟和传感器等方面具有广泛应用前景。近年来小分子印迹技术的研究获得了很大成功，然而对蛋白质等大分子的印迹却遇到了前所未有的挑战【nature material.2010，9(8)：612-614；Biomaterials.2011，32(11)：3008-3020】。蛋白质分子印迹的难度，与蛋白质体积大、结构复杂、构象灵活及其水溶性有关。高交联度MIP不利于蛋白质的传质，低交联材料难以形成确定的孔穴和识别位点；蛋白质结构非常复杂，非特异性结合容易造成识别选择性的降低；聚合反应热或使用的有机物容易引起蛋白质的变性。

高分子凝胶是由高分子三维网络与溶剂组成的多元体系，对环境刺激如温度、pH、电场、溶剂性质、光强度和光波长、压力、离子强度、离子密度和特殊的化学刺激(如糖)等，在宏观(体积)形状上产生巨大变化的聚合物网络。具有大孔网络结构和软湿特性的水凝胶比硬质材料更适于蛋白质的印迹。蛋白质的构象随外界环境的变化而变化。同样，水凝胶的柔软结构也能在外界pH值、离子强度、温度等因素刺激下表现出反复性的溶胀变化。水凝胶的这种刺激响应性可以调节其与蛋白质的特异性结合行为。陈志勇等以N-异丙基丙烯酰胺、丙烯酰胺和4-乙烯吡啶为功能单体，合成了具有可逆刺激响应的过氧化物酶分子印迹纳米水凝胶【J.Mol.Recognit.2008，21(1)：71-77】。庞兴收等以丙烯酰胺、甲基丙烯酸为单体，N，N’-亚甲基双丙烯酰胺为交联剂反相悬浮聚合制备了软湿凝胶微球该微球具有优良的大孔结构，从而方便蛋白质的进出。用卵白蛋白做对比的重结合研究表明，BSA印迹微球的分离因子达到4.71【蛋白质印迹软湿凝胶聚合物微球的研究，[博士学位论文]，天津大学，2005】。但是，水凝胶的柔软性质造成其印迹材料的不专一，导致其印迹效率不高。Byrne M E认为，水凝胶印迹体系有别于普通的聚合物凝胶，其交联度的分布在空间上应该是变化的【Adv.Drug.Deliver.Rev.2002，54(1)：149-161】。这种变化使水凝胶中具有适宜的刚性和有效的局部印迹结构，该凝胶体系的结合动力学和印迹效果都得到提高。Daniel S等指出，减少凝胶的溶胀可减小印迹孔穴的变形，保持其大小、形状和功能团的定位，以获得对模板蛋白更高的亲和力【Polymer.2010，51(3)：665-670】。但是增加交联剂的浓度造成蛋白质传质困难，引入荷电单体又会导致非特异性结合的增加。

利用海藻酸钙温和的溶胶-凝胶条件、生物相容性及对离子强度、pH值的可响应性，张风菊等首次以海藻酸盐为大分子单体制备了BSA印迹水凝胶【React.&Funct.Polym.2006，66(7)：712-719】。Edgar P.Herrero采用针管将BSA与海藻酸钠的混合溶液滴加入氯化钙溶液中，制备了包埋BSA的胶囊，用含CaCl₂的Tris缓冲液连续抽提脱除蛋白质，得到BSA印迹胶囊【Ind.Eng.Chem.Res.2010，49(20)：9811-9814】。赵孔银等以CaCl₂交联海藻酸钠和磷酸氢二铵，制备了蛋白质印迹的磷酸/海藻酸钙凝胶微球。杂化组分改变了海藻酸钙凝胶的交联度分布并降低了其溶胀度，印迹效果得到明显改善【React.&Funct.Polym.2008，68(3)：732-741】。但是，仅靠离子交联的水凝胶不耐电解质溶液，与目标蛋白质的重结合量也较低。为增大凝胶的比表面积和对蛋白质的吸附量，同时改善海藻酸钙凝胶的强度，张凤菊等采用石蜡乳液致孔的方法，加入羟乙基纤维素并经戊二醛交联，形成半互穿网络结构，大大提高了海藻酸钙凝胶的机械强度和电解质环境中的稳定性。然而，由于在洗脱石蜡过程中使用了***，破坏了蛋白质和水凝胶基材的结构，造成蛋白质的重结合量较低，印迹效果也不理想。

大多数人造普通水凝胶的机械强度很差，容易变形，并且随着含水量的不同发生溶胀和消溶胀。传统上提高水凝胶强度的方法主要集中在改善水凝胶的交联密度上，但是通过提高交联密度并不能从根本上提高水凝胶的强度，并且还会大大降低水凝胶的柔韧性，使水凝胶变得很脆，并且不利于蛋白质的扩散。

美国哈佛大学的研究人员开发出了高弹性和高韧性的水凝胶，其成分是海藻酸盐和聚丙烯酰胺【Nature，2012，489(7414)：133-136】。这两种物质单独形成的水凝胶弹性和韧性都不大，但如果把它们按一定比例混合起来在水中聚合，会得到一种新型水凝胶。虽然新型水凝胶中约90％是水，但其弹性超强，可以拉伸到原有长度的20倍以上而不断，之后还能够自行恢复原状。它的韧性也很好，把一块这样的水凝胶掰断，需要耗费的能量与掰断一块天然橡胶差不多。该水凝胶还具有较好的生物相容性，但目前还没有将这类水凝胶用于制备蛋白质分子印迹材料的报道。

本发明设计制备一种具有高弹性和高韧性的蛋白质分子印迹杂化凝胶膜，该凝胶膜以海藻酸钠为高分子骨架，以水溶性化合物为致孔剂，以丙烯酰胺及其衍生物为功能单体，将功能单体与模板蛋白质一起溶解形成络合物，加入化学交联剂和离子交联剂，引发聚合形成含蛋白质的高强度高韧性的双交联网络水凝胶，洗脱掉致孔剂和蛋白质模板后得到的多孔杂化凝胶膜对模板蛋白质具有较大的吸附量和较好的吸附选择性；可以利用各种环境刺激因素如温度、pH、溶剂性质、离子强度和特殊的化学刺激等改变凝胶的性能如溶胀度、含水量、表面电位等，从而调控分子印迹杂化凝胶膜与蛋白质的相互作用。

该制备方法工艺简单，成本低，不使用有机溶剂，可得到生物相容性较好的水凝胶材料。本发明产品在蛋白质分离分析、蛋白质控制释放、组织工程等领域有良好的应用前景。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明拟解决的技术问题是蛋白质印迹过程中蛋白质难以扩散、蛋白质印迹水凝胶强度低、水凝胶中印迹孔穴不易保持等问题。

本发明解决所述蛋白质印迹过程中蛋白质难以扩散、蛋白质印迹水凝胶强度低、水凝胶中印迹孔穴不易保持等问题的技术方案是设计一种高强度高韧性蛋白质分子印迹杂化凝胶膜。

本发明提供了一种高强度高韧性蛋白质分子印迹杂化凝胶膜的制备方法，其特征是包括以下步骤：

a)称取0.005-5g模板蛋白质，5-15g功能单体，0.5-2g海藻酸钠，功能单体质量百分比0.03％-0.15％的化学交联剂，功能单体质量百分比1％-100％的致孔剂，一起溶于50-100ml去离子水中，搅拌溶解均匀，然后加入功能单体质量百分比0-100％的增强剂，搅拌并超声分散均匀后得到铸膜液，放置于0℃-20℃的密闭无菌容器中备用；

b)配制金属离子质量百分比为0.01％-10％的金属盐水溶液，作为离子交联剂；

c)向步骤a)制备的铸膜液中加入功能单体质量百分比0.1％-5％的过硫酸铵，功能单体质量百分比0.1％-5％的亚硫酸氢钠和功能单体质量百分比0.01％-2％的四甲基乙二胺，搅拌分散均匀后，立即将该溶液倒入干燥清洁的玻璃片上，用刮膜棒刮出厚度为10-1000μm的均匀的膜，真空脱气泡，在N₂保护下引发聚合，反应1-24h，得到化学交联的含蛋白质的杂化凝胶膜；

d)将步骤c)得到的化学交联的含蛋白质的杂化凝胶膜用步骤b)得到的离子交联剂浸泡0.5-24h，用去离子水洗去致孔剂，用洗脱溶液洗脱掉模板蛋白质，得到高强度高韧性蛋白质分子印迹杂化凝胶膜。

本发明所述的聚合单体为双丙酮丙烯酰胺、异丙基丙烯酰胺、丙烯酰胺、甲基丙烯酰胺、二甲基丙烯酰胺、2-丙烯酰胺-2-甲基丙磺酸中的任意一种或两种以上混合物；所述的金属盐水溶液为氯化钡、氯化铁、氯化铝、氯化钙、磷酸二氢钙、硫酸钙、硝酸钙、葡萄糖酸钙、磷酸氢钙、乳酸钙水溶液中的任意一种或两种以上混合物；所述的化学交联剂为二乙烯基苯、N，N′-亚甲基双丙烯酰胺、二甲基丙烯酸乙二醇酯、羟甲基三聚氰胺醚化物中的任意一种或两种以上混合物。

本发明所述的增强剂为纳米二氧化硅、纳米二氧化钛、纳米羟基磷灰石、纳米粘土、碳纳米管、石墨烯、氧化石墨烯、羧基化石墨烯、纳米碳酸钙、纳米氧化锌中的任意一种或两种以上混合物。所述的致孔剂为聚乙烯基吡咯烷酮、聚乙二醇、聚丙烯酰胺、聚乙烯醇、聚维酮、明胶、水溶性淀粉中的任意一种或两种以上混合物。

本发明所述的引发聚合方式为自由基引发、紫外光引发、微波辐射引发、高能电子束引发、等离子体引发中的任意一种，所述的模板蛋白质为牛血红蛋白、牛血清白蛋白、卵白蛋白、溶菌酶、细胞色素C、过氧化氢酶、γ球蛋白、胰岛素中的任意一种或两种以上混合物。

本发明所述的洗脱溶液为磷酸盐缓冲溶液、Tris-HCl缓冲溶液、生理盐水、SDS-醋酸缓冲溶液、草酸缓冲溶液、胃蛋白酶水溶液、硼酸缓冲溶液中的任意一种。

本发明制备方法工艺简单，成本低，通过建立双交联网络提高水凝胶的强度和韧性，从而获得较稳定的孔穴结构。通过改变外界环境控制凝胶膜的溶胀和收缩，从而调控膜与蛋白质的相互作用，控制蛋白质的吸附和释放。本发明所得产品在蛋白质分离分析、蛋白质控制释放、组织工程等领域有良好的应用前景。

具体实施方式

下面介绍本发明的具体实施例，但本发明不受实施例的限制。

实施例1.一种牛血红蛋白分子印迹聚异丙基丙烯酰胺/海藻酸钙杂化凝胶膜及其制备方法

a)称取0.005g牛血红蛋白，5g异丙基丙烯酰胺，0.5g海藻酸钠，异丙基丙烯酰胺质量百分比0.15％的二甲基丙烯酸乙二醇酯，异丙基丙烯酰胺质量百分比1％的聚乙烯基吡咯烷酮，一起溶于50ml去离子水中，搅拌溶解均匀，然后加入异丙基丙烯酰胺质量百分比100％的纳米二氧化硅，搅拌并超声分散均匀后得到铸膜液，放置于20℃的密闭无菌容器中备用；

b)配制钙离子质量百分比为0.01％的硝酸钙水溶液，作为离子交联剂；

c)向步骤a)制备的铸膜液中加入异丙基丙烯酰胺质量百分比5％的过硫酸铵，异丙基丙烯酰胺质量百分比5％的亚硫酸氢钠和异丙基丙烯酰胺质量百分比2％的四甲基乙二胺，搅拌分散均匀后，立即将该溶液倒入干燥清洁的玻璃片上，用刮膜棒刮出厚度为10μm的均匀的膜，真空脱气泡，在N₂保护下紫外光引发聚合，反应24h，得到化学交联的含牛血红蛋白的杂化凝胶膜；

d)将步骤c)得到的化学交联的含牛血红蛋白的杂化凝胶膜用步骤b)得到的离子交联剂浸泡24h，用去离子水洗去聚乙烯基吡咯烷酮，用Tris-HCl缓冲溶液洗脱掉模板蛋白质，得到牛血红蛋白分子印迹聚异丙基丙烯酰胺/海藻酸钙杂化凝胶膜。

实施例2.一种牛血清白蛋白分子印迹聚异丙基丙烯酰胺/海藻酸钙杂化凝胶膜及其制备方法

a)称取5g牛血清白蛋白，15g丙烯酰胺，2g海藻酸钠，丙烯酰胺质量百分比0.03％-0.15％的二乙烯基苯，丙烯酰胺质量百分比100％的聚乙二醇，一起溶于100ml去离子水中，搅拌溶解均匀，然后加入丙烯酰胺质量百分比10％的纳米羟基磷灰石，搅拌并超声分散均匀后得到铸膜液，放置于20℃的密闭无菌容器中备用；

b)配制钙离子质量百分比为10％的氯化钙水溶液，作为离子交联剂；

c)向步骤a)制备的铸膜液中加入丙烯酰胺质量百分比0.1％的过硫酸铵，丙烯酰胺质量百分比0.1％的亚硫酸氢钠和丙烯酰胺质量百分比0.01％的四甲基乙二胺，搅拌分散均匀后，立即将该溶液倒入干燥清洁的玻璃片上，用刮膜棒刮出厚度为1000μm的均匀的膜，真空脱气泡，在N₂保护下紫外光引发聚合，反应1h，得到化学交联的含牛血清白蛋白的杂化凝胶膜；

d)将步骤c)得到的化学交联的含牛血清白蛋白的杂化凝胶膜用步骤b)得到的离子交联剂浸泡0.5-24h，用去离子水洗去聚乙二醇，用磷酸盐缓冲溶液洗脱掉模板蛋白质，得到牛血清白蛋白分子印迹聚异丙基丙烯酰胺/海藻酸钙杂化凝胶膜。

实施例3.一种溶菌酶分子印迹聚双丙酮丙烯酰胺/海藻酸钡杂化凝胶膜及其制备方法

a)称取0.5g溶菌酶，10g双丙酮丙烯酰胺，1g海藻酸钠，双丙酮丙烯酰胺质量百分比0.05％的N，N′-亚甲基双丙烯酰胺，双丙酮丙烯酰胺质量百分比100％的聚乙烯醇，一起溶于80ml去离子水中，搅拌溶解均匀，然后加入双丙酮丙烯酰胺质量百分比5％的纳米粘土，搅拌并超声分散均匀后得到铸膜液，放置于2℃的密闭无菌容器中备用；

b)配制钡离子质量百分比为2％的氯化钡水溶液，作为离子交联剂；

c)向步骤a)制备的铸膜液中加入双丙酮丙烯酰胺质量百分比0.5％的过硫酸铵，双丙酮丙烯酰胺质量百分比0.5％的亚硫酸氢钠和双丙酮丙烯酰胺质量百分比0.05％的四甲基乙二胺，搅拌分散均匀后，立即将该溶液倒入干燥清洁的玻璃片上，用刮膜棒刮出厚度为400μm的均匀的膜，真空脱气泡，在N₂保护下等离子体引发聚合，反应8h，得到化学交联的含溶菌酶的杂化凝胶膜；

d)将步骤c)得到的化学交联的含溶菌酶的杂化凝胶膜用步骤b)得到的离子交联剂浸泡12h，用去离子水洗去聚乙烯醇，用硼酸缓冲溶液洗脱掉模板溶菌酶，得到溶菌酶分子印迹聚双丙酮丙烯酰胺/海藻酸钡杂化凝胶膜。

实施例4.一种胰岛素分子印迹聚甲基丙烯酰胺/海藻酸钙杂化凝胶膜及其制备方法

a)称取1g胰岛素，8g甲基丙烯酰胺，1.5g海藻酸钠，甲基丙烯酰胺质量百分比0.05％的羟甲基三聚氰胺醚，甲基丙烯酰胺质量百分比50％的聚维酮，一起溶于70ml去离子水中，搅拌溶解均匀，然后加入甲基丙烯酰胺质量百分比30％的增强剂，搅拌并超声分散均匀后得到铸膜液，放置于4℃的密闭无菌容器中备用；

b)配制钙离子质量百分比为5％的氯化钙水溶液，作为离子交联剂；

c)向步骤a)制备的铸膜液中加入甲基丙烯酰胺质量百分比0.1％的过硫酸铵，甲基丙烯酰胺质量百分比0.1％的亚硫酸氢钠和甲基丙烯酰胺质量百分比0.08％的四甲基乙二胺，搅拌分散均匀后，立即将该溶液倒入干燥清洁的玻璃片上，用刮膜棒刮出厚度为500μm的均匀的膜，真空脱气泡，在N₂保护下微波辐射引发聚合，反应8h，得到化学交联的含胰岛素的杂化凝胶膜；

d)将步骤c)得到的化学交联的含胰岛素的杂化凝胶膜用步骤b)得到的离子交联剂浸泡0.5-24h，用去离子水洗去聚维酮，用草酸缓冲溶液洗脱掉模板胰岛素，得到胰岛素分子印迹聚甲基丙烯酰胺/海藻酸钙杂化凝胶膜。

Claims

1.一种高强度高韧性蛋白质分子印迹杂化凝胶膜的制备方法，其特征是包括以下步骤：

a)称取0.005-5g牛血红蛋白，5-15g异丙基丙烯酰胺，0.5-2g海藻酸钠，异丙基丙烯酰胺质量百分比0.03％-0.15％的二甲基丙烯酸乙二醇酯，异丙基丙烯酰胺质量百分比1％-100％的致孔剂，一起溶于50-100ml去离子水中，搅拌溶解均匀，然后加入异丙基丙烯酰胺质量百分比0-100％的增强剂，搅拌并超声分散均匀后得到铸膜液，放置于0℃-20℃的密闭无菌容器中备用；

c)向步骤a)制备的铸膜液中加入异丙基丙烯酰胺质量百分比0.1％-5％的过硫酸铵，异丙基丙烯酰胺质量百分比0.1％-5％的亚硫酸氢钠和异丙基丙烯酰胺质量百分比0.01％-2％的四甲基乙二胺，搅拌分散均匀后，立即将该溶液倒入干燥清洁的玻璃片上，用刮膜棒刮出厚度为10-1000μm的均匀的膜，真空脱气泡，在N₂保护下引发自由基聚合，反应1-24h，得到化学交联的含蛋白质的杂化凝胶膜；

d)将步骤c)得到的化学交联的含蛋白质的杂化凝胶膜用步骤b)得到的离子交联剂浸泡0.5-24h，用去离子水洗去致孔剂，用洗脱溶液洗脱掉模板蛋白质牛血红蛋白，得到高强度高韧性蛋白质分子印迹杂化凝胶膜。

2.如权利要求1所述的一种高强度高韧性蛋白质分子印迹杂化凝胶膜的制备方法，其特征是所述的金属盐水溶液为氯化钡、氯化铁、氯化铝、氯化钙、磷酸二氢钙、硝酸钙、葡萄糖酸钙、磷酸氢钙、乳酸钙水溶液中的任意一种或两种以上混合物。

3.如权利要求1所述的一种高强度高韧性蛋白质分子印迹杂化凝胶膜的制备方法，其特征是所述的增强剂为纳米二氧化硅、纳米二氧化钛、纳米羟基磷灰石、纳米粘土、碳纳米管、石墨烯、氧化石墨烯、羧基化石墨烯、纳米碳酸钙、纳米氧化锌中的任意一种或两种以上混合物。

4.如权利要求1所述的一种高强度高韧性蛋白质分子印迹杂化凝胶膜的制备方法，其特征是所述的致孔剂为聚乙烯基吡咯烷酮、聚乙二醇、聚异丙基丙烯酰胺、聚乙烯醇、明胶、水溶性淀粉中的任意一种或两种以上混合物。

5.如权利要求1所述的一种高强度高韧性蛋白质分子印迹杂化凝胶膜的制备方法，其特征是所述的洗脱溶液为磷酸盐缓冲溶液、Tris-HCl缓冲溶液、生理盐水、SDS-醋酸缓冲溶液、草酸缓冲溶液、胃蛋白酶水溶液、硼酸缓冲溶液中的任意一种。