CN108721692B - 一种表层包埋细胞的高强度水凝胶的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种表层包埋细胞的高强度水凝胶的制备方法。为避免细胞在聚合过程中受损伤，首先在细胞表面包裹一层磷酸钙外壳。将硅酸钠、丙烯酰胺、交联剂和海藻酸钠溶解于水中得到铸膜液A，将包裹磷酸钙外壳的细胞分散到铸膜液A中得到铸膜液B。用刮膜棒在玻璃板上将混合溶液A刮成膜，然后在膜上面倒入混合溶液B，用刮膜棒刮平。紫外引发丙烯酰胺聚合，经过钙离子水溶液交联，葡萄糖酸‑δ‑内酯水溶液浸泡，葡萄糖酸‑δ‑内酯水解释放出H+，H+与硅酸钙反应，生成表面含介孔硅胶的硅酸钙，同时H+与磷酸钙反应将受保护的细胞释放出来。介孔硅胶与海藻酸钙和聚丙烯酰胺发生氢键作用，提高了水凝胶强度和在生理环境下的稳定性。
Description
技术领域
本发明涉及一种表层包埋细胞的高强度水凝胶的制备方法，属于生物材料和组织工程领域。
背景技术
组织工程的三要素包括种子细胞、基质材料和调节因子。过去组织工程支架通常从材料学的角度设计，而不是从生物学角度考虑如何使植入材料整合重建组织，常因细胞利用率低、支架降解导致的纤维化、排异和炎性反应等因素达不到预期修复效果。天然生物材料来源广泛、无毒、生物相容性和生物可降解性良好，但是其加工提取困难、力学性能不佳，限制了其在组织工程中的应用。人工合成的无机材料化学性质稳定，生物相容性好，但降解速率慢，部分降解产物不易被机体吸收、力学性能差。人工合成的有机高分子材料降解可控，但是材料表面缺乏细胞识别信号，不利于细胞的特异性粘附和特异基因的激活。
水凝胶是一种类似于生命组织的高分子材料，高分子水凝胶是由高分子三维网络与水组成的多元体系，对于环境刺激会在形状上产生巨大变化的聚合物网络。水凝胶与许多组织和细胞外基质非常相似，表现出良好的生物相容性，放入体内不会引发排异反应，同时为营养物质运输和代谢废物的排出提供良好通道。水凝胶可作为永久损伤软组织的替代物，或作为细胞培养基质材料。Chaudhuri等将含有软骨细胞的水凝胶用于替代损伤软骨【Nature Materials，2017，16：1243-1251】。常江教授等制备了可注射的CaAlg/CaSiO3@SiO2复合水凝胶，该水凝胶可以促进大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化【Acta Biomaterialia，2013，9(11)：9107-9117】。但是通常的水凝胶强度较低，限制了其进一步实际应用。
高强度水凝胶的研究近年来取得了重要进展。龚剑萍等提出“双层网络”水凝胶的思想，在形成高交联度的刚性第一层网络的凝胶基础上，其内部合成交联度较低的柔性第二层网络【Advanced Materials.2014，26：436-442】，这种水凝胶在保持高含水量的同时也具有高的强度，但是该双化学网络交联水凝胶制备过程比较复杂。2012年Nature期刊报道锁志刚等人用一步法制备了高弹性高韧性聚丙烯酰胺/海藻酸钙(PAM/CaAlg)双网络水凝胶【Nature，2012，489(7414)：133-136】。此水凝胶具有良好的生物相容性、优良的润滑性和耐磨性，可达到替代软骨组织的要求。Bakarich等用3D打印技术制备了纤维增强的PAM/CaAlg水凝胶人工关节软骨替代物【ACS Applied Materials&Interfaces，2014，6(18)：15998-16006】。周峰等开发了一种具有特殊力学性能的分子工程双交联水凝胶，利用铁离子-羧酸根配位键作为动态交联形式增强水凝胶的机械性能和自修复性能【AdvancedMaterials，2015，27(12)：2054-2059】。但是在生理环境下，上述双网络水凝胶中的交联离子会被释放出来，使凝胶的力学性能迅速下降。
目前，构建在长期生理环境下具备高强度、高韧性和低溶胀的水凝胶仍存在很大挑战。Sheiko等报道了弱氢键增强的化学交联水凝胶，该水凝胶拉伸强度可达2MPa，断裂能高达9300J/m2【Advanced Materials，2015，27：6899-6905】，但是网络中形成氢键需要pH＝3的酸性条件，限制了其实际应用。刘文广教授等运用氢键自识别机理制备了强度为人体软骨4倍的超分子水凝胶，这种水凝胶在不同pH值的酸碱溶液中都能保持较好的力学性能【Advanced Materials，2015，27(23)：3566-35-7】。柳明珠等将二氧化硅引入PAM/CaAlg水凝胶中，提高了该双网络凝胶的断裂应力和杨氏模量【Chemical Engineering Journal，2014，240(6)：331-337】。Kim等人利用介孔分子筛与聚合物之间存在的范德华力和氢键作用，得到了可在生理溶液中较长时间保持力学性能的PAM/CaAlg杂化水凝胶。2017年Nature期刊报道Tiller等通过酶引发在双网络水凝胶中形成了均匀分散的纳米磷酸钙，使水凝胶的弹性模量达到了440MPa，远高于软骨【Nature，2017，543(7645)：407-410】。
但是由于水凝胶光滑的表面和高的亲水性，细胞在水凝胶表面不易粘附增殖。即使在水凝胶中加入了纤维粘连蛋白促进细胞粘附，也难以控制贴壁细胞的密度。三维培养因细胞包埋过深影响养分和代谢物传输，引起细胞死亡。另外高强度水凝胶在制备过程中的恶劣环境如反应热、单体毒性、聚合过程中的自由基等对细胞造成巨大损伤，目前还很少见到通过聚合反应将细胞固定到水凝胶中的成功例子。为了减小聚合反应对细胞的损伤，唐睿康教授等采用层层自组装方法，在酵母菌表面包裹一层磷酸钙【Angewandte ChemieInternational Edition，2008，47，3560-3564】。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明拟解决的技术问题是二维培养难以控制细胞密度，三维培养因细胞包埋过深引起细胞死亡，生理环境下凝胶强度低，高强度水凝胶在制备过程中的恶劣环境损伤细胞等问题。
本发明解决所述二维培养难以控制细胞密度，三维培养因细胞包埋过深引起细胞死亡，生理环境下凝胶强度低，高强度水凝胶在制备过程中的恶劣环境损伤细胞等问题的技术方案是提供一种表层包埋细胞的高强度水凝胶的制备方法。
本发明提供了一种表层包埋细胞的高强度水凝胶的制备方法。为避免细胞在聚合过程中受损伤，首先在细胞表面包裹一层磷酸钙外壳。将硅酸钠、丙烯酰胺、交联剂和海藻酸钠溶解于水中得到铸膜液A，将包裹磷酸钙外壳的细胞分散到铸膜液A中得到铸膜液B。用刮膜棒在玻璃板上将混合溶液A刮成膜，然后在膜上面倒入混合溶液B，用刮膜棒刮平。紫外引发丙烯酰胺聚合，经过钙离子水溶液交联，葡萄糖酸-δ-内酯水溶液浸泡，葡萄糖酸-δ-内酯水解释放出H+，H+与硅酸钙反应，生成表面含介孔硅胶的硅酸钙，同时H+与磷酸钙反应将受保护的细胞释放出来。介孔硅胶与海藻酸钙和聚丙烯酰胺发生氢键作用，提高了水凝胶强度和在生理环境下的稳定性。
本发明提供了一种表层包埋细胞的高强度水凝胶的制备方法，其特征是包括以下步骤：
a)首先采用层层自助装的方法在细胞表面矿化沉积一层磷酸钙外壳，将细胞保护起来以减小聚合反应过程对细胞的伤害；称取0.05-2g硅酸钠，5-15g丙烯酰胺，0.5-2g海藻酸钠，丙烯酰胺质量百分比0.03％-0.30％的N，N′-亚甲基双丙烯酰胺，一起溶于50-100ml去离子水中，搅拌溶解均匀，得到铸膜液A，然后将包裹磷酸钙外壳的细胞分散于铸膜液A中得到铸膜液B，将铸膜液A放置于无菌容器中备用，含有细胞的铸膜液B现配现用；
b)配制质量百分比为0.5％-50％的可溶性钙盐水溶液，灭菌消毒，置于无菌容器中备用；
c)在无菌条件下，向步骤a)制备的铸膜液A和铸膜液B中分别加入丙烯酰胺质量百分比0.1％-5％的过硫酸铵，丙烯酰胺质量百分比0.1％-5％的亚硫酸氢钠和丙烯酰胺质量百分比0.01％-2％的四甲基乙二胺，搅拌分散均匀后，立即将铸膜液A倒入干燥清洁的玻璃板上，用厚度为10-1000μm的刮膜棒刮成厚度均匀的液膜，然后尽快在该液膜上面倒入铸膜液B，马上用厚度为100-2000μm的刮膜棒刮平；在N2保护下紫外照射1-20min引发丙烯酰胺聚合，得到化学交联的凝胶膜；
d)在无菌条件下，将步骤c)得到的化学交联的凝胶膜和玻璃板一起浸泡到步骤b)得到的可溶性钙盐水溶液中，浸泡0.1-24h，在浸泡过程中将凝胶膜从玻璃板上揭下来，可溶性钙盐与海藻酸钠反应生成离子交联网络结构的海藻酸钙水凝胶，同时可溶性钙盐与硅酸钠反应在聚丙烯酰胺/海藻酸钙水凝胶中原位生成硅酸钙纳米粒子；
e)在无菌条件下，配制质量百分比浓度为0.1％-10％的葡萄糖酸-δ-内酯水溶液，将步骤d)得到的含硅酸钙的凝胶膜浸泡到葡萄糖酸-δ-内酯水溶液中0.1-12h，葡萄糖酸-δ-内酯水解释放出氢离子，氢离子与硅酸钙反应，在硅酸钙纳米粒子表面形成介孔硅胶结构，同时氢离子与包裹细胞的磷酸钙反应将细胞释放出来，得到一种表层包埋细胞的高强度水凝胶；介孔硅胶与海藻酸钙和聚丙烯酰胺发生氢键相互作用，再加上纳米粒子的增强效应，提高了聚丙烯酰胺/海藻酸钙水凝胶在生理环境下的力学稳定性和抗溶胀性。
本发明所述的可溶性钙盐水溶液为硝酸钙、氯化钙、磷酸二氢钙、硫酸钙水溶液中的任意一种或两种以上混合物；本发明所述的细胞为骨髓间充质干细胞、脐带血干细胞、软骨细胞、成纤细胞、表皮细胞、心肌细胞的任意一种或两种以上混合物。
具体实施方式
下面介绍本发明的具体实施例，但本发明不受实施例的限制。
实施例1.
a)首先采用层层自助装的方法在骨髓间充质干细胞表面矿化沉积一层磷酸钙外壳，将骨髓间充质干细胞保护起来以减小聚合反应过程对骨髓间充质干细胞的伤害；称取0.05g硅酸钠，5g丙烯酰胺，0.5g海藻酸钠，丙烯酰胺质量百分比0.03％的N，N′-亚甲基双丙烯酰胺，一起溶于50ml去离子水中，搅拌溶解均匀，得到铸膜液A，然后将包裹磷酸钙外壳的骨髓间充质干细胞分散于铸膜液A中得到铸膜液B，将铸膜液A放置于无菌容器中备用，含有骨髓间充质干细胞的铸膜液B现配现用；
b)配制质量百分比为0.5％的硝酸钙水溶液，灭菌消毒，置于无菌容器中备用；
c)在无菌条件下，向步骤a)制备的铸膜液A和铸膜液B中分别加入丙烯酰胺质量百分比5％的过硫酸铵，丙烯酰胺质量百分比5％的亚硫酸氢钠和丙烯酰胺质量百分比2％的四甲基乙二胺，搅拌分散均匀后，立即将铸膜液A倒入干燥清洁的玻璃板上，用厚度为10μm的刮膜棒刮成厚度均匀的液膜，然后尽快在该液膜上面倒入铸膜液B，马上用厚度为100μm的刮膜棒刮平；在N2保护下紫外照射1min引发丙烯酰胺聚合，得到化学交联的凝胶膜；
d)在无菌条件下，将步骤c)得到的化学交联的凝胶膜和玻璃板一起浸泡到步骤b)得到的硝酸钙水溶液中，浸泡0.1h，在浸泡过程中将凝胶膜从玻璃板上揭下来，硝酸钙与海藻酸钠反应生成离子交联网络结构的海藻酸钙水凝胶，同时硝酸钙与硅酸钠反应在聚丙烯酰胺/海藻酸钙水凝胶中原位生成硅酸钙纳米粒子；
e)在无菌条件下，配制质量百分比浓度为0.1％的葡萄糖酸-δ-内酯水溶液，将步骤d)得到的含硅酸钙的凝胶膜浸泡到葡萄糖酸-δ-内酯水溶液中0.1h，葡萄糖酸-δ-内酯水解释放出氢离子，氢离子与硅酸钙反应，在硅酸钙纳米粒子表面形成介孔硅胶结构，同时氢离子与包裹骨髓间充质干细胞的磷酸钙反应将骨髓间充质干细胞释放出来，得到一种表层包埋骨髓间充质干细胞的高强度水凝胶；介孔硅胶与海藻酸钙和聚丙烯酰胺发生氢键相互作用，再加上纳米粒子的增强效应，提高了聚丙烯酰胺/海藻酸钙水凝胶在生理环境下的力学稳定性和抗溶胀性。
实施例2.
a)首先采用层层自助装的方法在软骨细胞表面矿化沉积一层磷酸钙外壳，将软骨细胞保护起来以减小聚合反应过程对软骨细胞的伤害；称取2g硅酸钠，15g丙烯酰胺，2g海藻酸钠，丙烯酰胺质量百分比0.30％的N，N′-亚甲基双丙烯酰胺，一起溶于100ml去离子水中，搅拌溶解均匀，得到铸膜液A，然后将包裹磷酸钙外壳的软骨细胞分散于铸膜液A中得到铸膜液B，将铸膜液A放置于无菌容器中备用，含有软骨细胞的铸膜液B现配现用；
b)配制质量百分比为50％的氯化钙水溶液，灭菌消毒，置于无菌容器中备用；
c)在无菌条件下，向步骤a)制备的铸膜液A和铸膜液B中分别加入丙烯酰胺质量百分比0.1％的过硫酸铵，丙烯酰胺质量百分比0.1％-5％的亚硫酸氢钠和丙烯酰胺质量百分比0.01％的四甲基乙二胺，搅拌分散均匀后，立即将铸膜液A倒入干燥清洁的玻璃板上，用厚度为1000μm的刮膜棒刮成厚度均匀的液膜，然后尽快在该液膜上面倒入铸膜液B，马上用厚度为2000μm的刮膜棒刮平；在N2保护下紫外照射20min引发丙烯酰胺聚合，得到化学交联的凝胶膜；
d)在无菌条件下，将步骤c)得到的化学交联的凝胶膜和玻璃板一起浸泡到步骤b)得到的氯化钙水溶液中，浸泡24h，在浸泡过程中将凝胶膜从玻璃板上揭下来，氯化钙与海藻酸钠反应生成离子交联网络结构的海藻酸钙水凝胶，同时氯化钙与硅酸钠反应在聚丙烯酰胺/海藻酸钙水凝胶中原位生成硅酸钙纳米粒子；
e)在无菌条件下，配制质量百分比浓度为10％的葡萄糖酸-δ-内酯水溶液，将步骤d)得到的含硅酸钙的凝胶膜浸泡到葡萄糖酸-δ-内酯水溶液中12h，葡萄糖酸-δ-内酯水解释放出氢离子，氢离子与硅酸钙反应，在硅酸钙纳米粒子表面形成介孔硅胶结构，同时氢离子与包裹软骨细胞的磷酸钙反应将软骨细胞释放出来，得到一种表层包埋软骨细胞的高强度水凝胶；介孔硅胶与海藻酸钙和聚丙烯酰胺发生氢键相互作用，再加上纳米粒子的增强效应，提高了聚丙烯酰胺/海藻酸钙水凝胶在生理环境下的力学稳定性和抗溶胀性。
实施例3.
a)首先采用层层自助装的方法在成纤细胞表面矿化沉积一层磷酸钙外壳，将成纤细胞保护起来以减小聚合反应过程对成纤细胞的伤害；称取1g硅酸钠，10g丙烯酰胺，1g海藻酸钠，丙烯酰胺质量百分比0.10％的N，N′-亚甲基双丙烯酰胺，一起溶于60ml去离子水中，搅拌溶解均匀，得到铸膜液A，然后将包裹磷酸钙外壳的成纤细胞分散于铸膜液A中得到铸膜液B，将铸膜液A放置于无菌容器中备用，含有成纤细胞的铸膜液B现配现用；
b)配制质量百分比为10％的磷酸二氢钙水溶液，灭菌消毒，置于无菌容器中备用；
c)在无菌条件下，向步骤a)制备的铸膜液A和铸膜液B中分别加入丙烯酰胺质量百分比1％的过硫酸铵，丙烯酰胺质量百分比1％的亚硫酸氢钠和丙烯酰胺质量百分比1％的四甲基乙二胺，搅拌分散均匀后，立即将铸膜液A倒入干燥清洁的玻璃板上，用厚度为400μm的刮膜棒刮成厚度均匀的液膜，然后尽快在该液膜上面倒入铸膜液B，马上用厚度为500μm的刮膜棒刮平；在N2保护下紫外照射10min引发丙烯酰胺聚合，得到化学交联的凝胶膜；
d)在无菌条件下，将步骤c)得到的化学交联的凝胶膜和玻璃板一起浸泡到步骤b)得到的磷酸二氢钙水溶液中，浸泡8h，在浸泡过程中将凝胶膜从玻璃板上揭下来，磷酸二氢钙与海藻酸钠反应生成离子交联网络结构的海藻酸钙水凝胶，同时磷酸二氢钙与硅酸钠反应在聚丙烯酰胺/海藻酸钙水凝胶中原位生成硅酸钙纳米粒子；
e)在无菌条件下，配制质量百分比浓度为2％的葡萄糖酸-δ-内酯水溶液，将步骤d)得到的含硅酸钙的凝胶膜浸泡到葡萄糖酸-δ-内酯水溶液中8h，葡萄糖酸-δ-内酯水解释放出氢离子，氢离子与硅酸钙反应，在硅酸钙纳米粒子表面形成介孔硅胶结构，同时氢离子与包裹成纤细胞的磷酸钙反应将成纤细胞释放出来，得到一种表层包埋成纤细胞的高强度水凝胶；介孔硅胶与海藻酸钙和聚丙烯酰胺发生氢键相互作用，再加上纳米粒子的增强效应，提高了聚丙烯酰胺/海藻酸钙水凝胶在生理环境下的力学稳定性和抗溶胀性。
实施例4.
a)首先采用层层自助装的方法在表皮细胞表面矿化沉积一层磷酸钙外壳，将表皮细胞保护起来以减小聚合反应过程对表皮细胞的伤害；称取1.5g硅酸钠，6g丙烯酰胺，1.5g海藻酸钠，丙烯酰胺质量百分比0.15％的N，N′-亚甲基双丙烯酰胺，一起溶于80ml去离子水中，搅拌溶解均匀，得到铸膜液A，然后将包裹磷酸钙外壳的表皮细胞分散于铸膜液A中得到铸膜液B，将铸膜液A放置于无菌容器中备用，含有表皮细胞的铸膜液B现配现用；
b)配制质量百分比为1.0％的硫酸钙水溶液，灭菌消毒，置于无菌容器中备用；
c)在无菌条件下，向步骤a)制备的铸膜液A和铸膜液B中分别加入丙烯酰胺质量百分比0.5％的过硫酸铵，丙烯酰胺质量百分比0.5％的亚硫酸氢钠和丙烯酰胺质量百分比0.2％的四甲基乙二胺，搅拌分散均匀后，立即将铸膜液A倒入干燥清洁的玻璃板上，用厚度为200μm的刮膜棒刮成厚度均匀的液膜，然后尽快在该液膜上面倒入铸膜液B，马上用厚度为300μm的刮膜棒刮平；在N2保护下紫外照射1-20min引发丙烯酰胺聚合，得到化学交联的凝胶膜；
d)在无菌条件下，将步骤c)得到的化学交联的凝胶膜和玻璃板一起浸泡到步骤b)得到的硫酸钙水溶液中，浸泡0.1-24h，在浸泡过程中将凝胶膜从玻璃板上揭下来，硫酸钙与海藻酸钠反应生成离子交联网络结构的海藻酸钙水凝胶，同时硫酸钙与硅酸钠反应在聚丙烯酰胺/海藻酸钙水凝胶中原位生成硅酸钙纳米粒子；
e)在无菌条件下，配制质量百分比浓度为0.1％-10％的葡萄糖酸-δ-内酯水溶液，将步骤d)得到的含硅酸钙的凝胶膜浸泡到葡萄糖酸-δ-内酯水溶液中0.1-12h，葡萄糖酸-δ-内酯水解释放出氢离子，氢离子与硅酸钙反应，在硅酸钙纳米粒子表面形成介孔硅胶结构，同时氢离子与包裹表皮细胞的磷酸钙反应将表皮细胞释放出来，得到一种表层包埋表皮细胞的高强度水凝胶；介孔硅胶与海藻酸钙和聚丙烯酰胺发生氢键相互作用，再加上纳米粒子的增强效应，提高了聚丙烯酰胺/海藻酸钙水凝胶在生理环境下的力学稳定性和抗溶胀性。
Claims (3)
1.一种表层包埋细胞的高强度水凝胶的制备方法，其特征是包括以下步骤：
a)首先采用层层自组装的方法在细胞表面矿化沉积一层磷酸钙外壳，将细胞保护起来以减小聚合反应过程对细胞的伤害；称取0.05-2g硅酸钠，5-15g丙烯酰胺，0.5-2g海藻酸钠，丙烯酰胺质量百分比0.03％-0.30％的N，N′-亚甲基双丙烯酰胺，一起溶于50-100ml去离子水中，搅拌溶解均匀，得到铸膜液A，然后将包裹磷酸钙外壳的细胞分散于铸膜液A中得到铸膜液B，将铸膜液A放置于无菌容器中备用，含有细胞的铸膜液B现配现用；
b)配制质量百分比为0.5％-50％的可溶性钙盐水溶液，灭菌消毒，置于无菌容器中备用；
c)在无菌条件下，向步骤a)制备的铸膜液A和铸膜液B中分别加入丙烯酰胺质量百分比0.1％-5％的过硫酸铵，丙烯酰胺质量百分比0.1％-5％的亚硫酸氢钠和丙烯酰胺质量百分比0.01％-2％的四甲基乙二胺，搅拌分散均匀后，立即将铸膜液A倒入干燥清洁的玻璃板上，用厚度为10-1000μm的刮膜棒刮成厚度均匀的液膜，然后尽快在该液膜上面倒入铸膜液B，马上用厚度为100-2000μm的刮膜棒刮平；在N2保护下紫外照射1-20min引发丙烯酰胺聚合，得到化学交联的凝胶膜；
d)在无菌条件下，将步骤c)得到的化学交联的凝胶膜和玻璃板一起浸泡到步骤b)得到的可溶性钙盐水溶液中，浸泡0.1-24h，在浸泡过程中将凝胶膜从玻璃板上揭下来，可溶性钙盐与海藻酸钠反应生成离子交联网络结构的海藻酸钙水凝胶，同时可溶性钙盐与硅酸钠反应在聚丙烯酰胺/海藻酸钙水凝胶中原位生成硅酸钙纳米粒子；
e)在无菌条件下，配制质量百分比浓度为0.1％-10％的葡萄糖酸-δ-内酯水溶液，将步骤d)得到的含硅酸钙的凝胶膜浸泡到葡萄糖酸-δ-内酯水溶液中0.1-12h，葡萄糖酸-δ-内酯水解释放出氢离子，氢离子与硅酸钙反应，在硅酸钙纳米粒子表面形成介孔硅胶结构，同时氢离子与包裹细胞的磷酸钙反应将细胞释放出来，得到一种表层包埋细胞的高强度水凝胶；介孔硅胶与海藻酸钙和聚丙烯酰胺发生氢键相互作用，再加上纳米粒子的增强效应，提高了聚丙烯酰胺/海藻酸钙水凝胶在生理环境下的力学稳定性和抗溶胀性。
2.如权利要求1所述的一种表层包埋细胞的高强度水凝胶的制备方法，其特征是所述的可溶性钙盐为硝酸钙、氯化钙、磷酸二氢钙、硫酸钙的任意一种或两种以上混合物。
3.如权利要求1所述的一种表层包埋细胞的高强度水凝胶的制备方法，其特征是所述的细胞为骨髓间充质干细胞、脐带血干细胞、软骨细胞、表皮细胞、心肌细胞的任意一种或两种以上混合物。
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