CN103251600B - 2-氨基-4-(3′-氰基-4′-吡咯烷基)苯基嘧啶化合物的抗肿瘤应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了2-氨基-4-（3′-氰基-4′-吡咯烷基）苯基嘧啶化合物的抗肿瘤应用。本发明研究表明，该化合物能够靶向双重抑制TBK1和IKKi，在体外培养的多种肿瘤细胞株中具有较好的抑制增殖潜能，实验证实该2-氨基-4-（3′-氰基-4′-吡咯烷基）苯基嘧啶能下调Cyclin D1、p-AKT、p-CYLD蛋白表达水平，可诱导肿瘤细胞凋亡。动物模型试验显示该化合物显著地抑制的小鼠肿瘤的生长，抑制肿瘤血管生成，无明显毒副作用，具有较好的抗肿瘤作用，能用于开发抗肿瘤药物，应用前景广阔。

Description

2-氨基-4-(3′-氰基-4′-吡咯烷基)苯基嘧啶化合物的抗肿瘤应用

技术领域

本发明属于肿瘤化学物领域，特别是涉及2-氨基-4-（3′-氰基-4′-吡咯烷基）苯基嘧啶化合物的抗肿瘤应用。

背景技术

化疗是癌症临床治疗的重要手段，化疗药物通过直接杀死肿瘤细胞或者抑制肿瘤细胞的***增殖、促进细胞分化来达到治疗效果。探寻积极有效的预防途经及有效的治疗药物显得十分迫切和必要，特别是分子靶向治疗在肿瘤治疗中的应用，寻找有效、特异的抑制手段并探讨其作用机制，不仅有利于预防癌症的发生，还能为临床治疗提供新的途径。

近年来，人们逐渐发现另外两种非经典的IκB激酶（IKKs）——TBK1和IKKi，它们是机体受到病毒感染时启动干扰素信号通路的重要诱导剂，Toll样受体被病毒成分激活后，TBK1和IKKi与TRAF3、TANK组装，进一步在多个丝氨酸和苏氨酸残基位点磷酸化干扰素调节因子（IRF 3，7），IRF-3 和IRF-7 二聚化，入核诱导Ⅰ型干扰素基因等多种抗病毒基因的表达，从而激活先天性免疫途径。除了在抗病毒免疫反应中的角色外，非经典的IKKs还参与到其他信号通路中，例如肿瘤发生等。据报道某些转化细胞中TBK1激酶活性上调并且是这些转化细胞生存所必需的。通过RNAi技术抑制TBK1的表达可以诱导肿瘤细胞的凋亡，然而非肿瘤源性的上皮细胞却不依赖TBK1而生存。有基因组学研究表明IKKi是人乳腺癌的致癌基因，并且在人乳腺癌细胞中抑制IKKi可诱导乳腺癌细胞死亡。因而TBK1和IKKi在肿瘤学领域逐渐引起了人们重视。

本研究发现在同一肿瘤中TBK1和IKKi并非同时高表达或者固有激活状态，抑制其中一个表达会激活另一激酶。因此，由于这种两种激酶之间的重叠效应和代偿功能，单纯抑制TBK1或IKKi均不能有效抑制肿瘤细胞生长，然而当同时抑制这两种激酶这可以有效抑制肿瘤细胞增殖，因而提示了其可能成为***的一个好的靶点。

发明内容

本发明旨在提供一种2-氨基-4-（3′-氰基-4′-吡咯烷基）苯基嘧啶化合物的抗肿瘤用途，为今后开发新型靶向抑制TBK1和IKKi抗肿瘤药物拓展新的思路和方法。

为了达到上述目的，本发明提供的技术方案为：

本发明提供了一种具有抑制TBK1和IKKi的2-氨基-4-（3′-氰基-4′-吡咯烷基）苯基嘧啶化合物，本说明书中，该化合物简称为CMPD，CMPD结构式如下所示，其相关属性如下表所示。

化合物结构式

2-氨基-4-（3′-氰基-4′-吡咯烷基）苯基嘧啶的相关属性

本发明揭示了化合物CMPD存在通过抑制TBK1和IKKi诱导肿瘤细胞凋亡的机制，并发现了CMPD通过抑制TBK1和IKKi体内抗肿瘤的作用。经本发明研究发现， TBK1和IKKi这两种激酶之间具有重叠效应和代偿功能，单纯抑制TBK1或IKKi均不能有效抑制肿瘤细胞生长，然而当同时抑制这两种激酶这可以有效抑制肿瘤细胞增殖，化合物CMPD则能同时抑制这两种激酶，从而成为新型抗肿瘤药物的治疗靶点。

本发明还通过动物模型验证了化合物CMPD的抗肿瘤疗效，CMPD通过TBK1和IKKi双重抑制能成功抑制舌癌荷瘤裸鼠和***癌FVB小鼠体内肿瘤的生长，且对小鼠机体无明显毒、副作用。该化合物的抗肿瘤作用与抑制AKT活化，下调VEGF表达，抑制肿瘤血管生成有关。本发明为今后进一步开发新型靶向抑制TBK1和IKKi的临床药物奠定基础。

附图说明

图1为本发明实施例1中TBK1和IKKi在多种肿瘤细胞中表达及活化情况。

图2为本发明实施例1中IKKi-siRNA SCC-25细胞和对照组的IKKi, p-TBK1, TBK1的蛋白表达水平。

图3为本发明实施例1中人舌癌细胞SCC-25中siRNA抑制TBK1或/和IKKi之后其细胞增殖水平。（** P<0.01差异具有统计学意义，siRNA干扰效率采用Western blotting验证）。

图4为本发明实施例2中RAW264.7细胞用LPS（1 μg/ml）处理不同时间后IRF-3和p-IRF-3的蛋白表达水平。

图5为本发明实施例2中RAW264.7细胞用不同浓度的CMPD处理1 hr后并用LPS（1 μg/ml）刺激1 hr的IRF-3和p-IRF-3的蛋白表达水平。

图6为本发明实施例3中倒置相差显微镜下CMPD（1.0 μM）处理不同时间长度的SCC-9细胞的细胞形态变化（a：对照；b：24 hr；c：48 hr；d：72 hr）（放大倍率 200×）。

图7为本发明实施例3中SCC-9细胞在CMPD（1.0 μM）处理72 hr后与未处理组对比图（图中红色标记为凋亡细胞，蓝色标记为细胞核）。

图8为本发明实施例3中SCC-9细胞在CMPD（1.0 μM）不同时间处理后相关凋亡蛋白表达水平。

图9为本发明实施例3中SCC-9细胞在不同浓度的CMPD处理24 hr后相关凋亡蛋白表达水平。

图10为本发明实施例3中SCC-9细胞在CMPD（1.0 μM）处理不同时间处理后Cyclin D1蛋白表达水平。

图11为本发明实施例3中SCC-9细胞在不同浓度的CMPD处理30 min后AKT及其磷酸化蛋白（S473，T308）表达。

图12为本发明实施例3中SCC-9细胞在CMPD（1.0 μM）处理1 hr后p-CYLD蛋白表达水平。

图13为本发明实施例4中实验结束时裸鼠外观照片及术中肿瘤解剖照片。

图14为本发明实施例4中CMPD治疗舌癌SCC-9细胞荷瘤裸鼠的肿瘤体积变化和实验结束时肿瘤重量与肿瘤照片（* P<0.05；** P<0.01）。

图15为本发明实施例4中CMPD治疗***癌Myc-CaP细胞荷瘤FVB小鼠的肿瘤体积变化和实验结束时肿瘤重量与肿瘤照片（* P<0.05；** P<0.01）。

图16为本发明实施例4中免疫组织化学检测VEGF和p-AKT在对照组及实验组裸鼠肿瘤组织中的表达（放大倍率400×）。

图17为本发明实施例4中裸鼠肿瘤组织RT-PCR检测VEGF基因表达水平（n=3）。

图18为本发明实施例4中裸鼠肿瘤组织Western blotting检测p-AKT蛋白表达水平（n=3）。

具体实施方式

实施例1、TBK1和IKKi在肿瘤细胞增殖中的重要作用

选取十种肿瘤细胞株，包括舌癌细胞株（SCC-9, SCC-15, SCC-25）、***癌细胞株（PC3, DU145, LNCaP, Myc-CaP）、乳腺癌细胞株（MCF-7, MDA-MB-231, T-47D）常规培养后提取蛋白，Western blotting测定其TBK1、P-TBK1、IKKi、P-IKKi的蛋白含量，β-actin为内参（图1）。

结果发现TBK1和IKKi在肿瘤细胞中均有表达，IKKi的磷酸化水平在各种肿瘤细胞中均可见表达，但TBK1的磷酸化水平在不同肿瘤细胞中表达不一致，甚至在舌癌细胞株（SCC-9, SCC-15, SCC-25）中难以检测到p-TBK1表达。但是当在SCC-25细胞中采用siRNA技术抑制其IKKi表达（图2），Western blotting结果发现IKKi-siRNA处理的 SCC-25中的TBK1的表达强于对照组SCC-25细胞，同时其P-TBK1的表达也明显增强。因此说明TBK1和IKKi在肿瘤细胞中表达及活化，单纯抑制IKKi可引起TBK1代偿激活。

进而对舌癌细胞SCC-25采用siRNA抑制TBK1或/和IKKi可以获得con-siRNA, TBK1-siRNA, IKKi-siRNA及TBK1&IKKi-siRNA SCC-25四组，常规培养5天，分别在第0，1，3，5天进行细胞计数，绘制成折线图（图3）。TBK1-siRNA, IKKi-siRNA SCC-25两组细胞的增殖水平相对于对照组略有下降，但他们三组之间差异并无统计学意义（P>0.05），但当SCC-25的TBK1和IKKi均被抑制后其增殖水平大幅度被抑制，与其余三组之间差异具有统计学意义（P<0.01）。这说明siRNA技术单独抑制TBK1或者IKKi的表达不能有效抑制舌癌细胞增殖，当同时抑制其两者表达则能有效抑制舌癌细胞的增殖。

因此实施例表明，TBK1和IKKi在肿瘤细胞中高表达并活化，同时抑制它们可有效抑制肿瘤细胞的增殖，表明TBK1和IKKi可成为新型抗肿瘤药物的分子靶点。

实施例2、CMPD对TBK1和IKKi的抑制能力和体外抗肿瘤活性评价实验

TBK1和IKKi在免疫应答中主要源于其激活后可以磷酸化IFN调节因子3和7 （IRF-3/IRF-7），在RAW264.7细胞中LPS可激活TBK1和IKKi磷酸化IRF-3，因而TBK1和IKKi活性的抑制情况能在RAW264.7细胞中通过Western blotting检测。如果这两种激酶的活性被阻断，IRF-3的磷酸化水平将会降低或消失，p-IRF-3条带就可间接体现化合物对这两种激酶的抑制能力。

图4显示在LPS（本说明书中LPS是指脂多糖）作用下，p-IRF-3表达逐渐增强，在1 hr最高，之后降低，在4 hr时难以检测到。获得了p-IRF-3最佳检测条件为LPS刺激1 hr。因而对RAW264.7细胞用不同浓度的CMPD处理1 hr后并用LPS（1 μg/ml）刺激1 hr，Western blotting检测各组IRF-3和p-IRF-3的蛋白表达水平来分析其TBK1和IKKi的抑制能力（图5），在不同浓度CMPD作用下均能下调IRF-3的磷酸化水平，在0.5 μM作用下就能有效地降低IRF-3的磷酸化水平，而在1.0 μM时几乎无法检测到p-IRF-3，故可认为该化合物具有相对较好的TBK1和IKKi的抑制能力。

在各种肿瘤细胞株中分别使用梯度浓度的CPMD作用72 hr，等浓度的DMSO（本说明书中，DMSO是指二甲基亚砜）设为对照，MTT法检测细胞增殖状态。根据以上MTT结果可以计算出IC50值（IC50值是指能抑制细胞增殖50%的药物浓度值）。一般而言，IC50越低，化合物的抗肿瘤作用越强。化合物CMPD在所选的肿瘤细胞株具有较好的抑制增殖作用，表现为其IC50较低，都在微摩尔数量级（0.584-1.872 μM），如表1所示，表现出较高的抗肿瘤细胞增殖活性。

表1  化合物CMPD对各种肿瘤细胞体外增殖的IC50

肿瘤细胞株	IC50 (μM)
		SCC-9	0.800
SCC-15	0.645
		SCC-25	0.678
PC3	0.667
		DU145	0.584
LNCaP	0.584
		Myc-CaP	0.601
MCF-7	0.899
		MDA-MB-231	1.872
T-47D	0.876

因此实施例2表明，CMPD这种TBK1和IKKi双重抑制化合物具有较好的药学属性，可作为新型抗肿瘤药物的候选化合物，其对所选择的肿瘤细胞均具有明显抑制增殖的作用。

实施例3、CMPD促进肿瘤细胞凋亡及机制研究

对SCC-9细胞用CMPD（1.0 μM）进行处理，对处理前、处理后24 hr、处理后48 hr和处理后72hr进行镜下观察并拍照（图6），处理前的SCC-9细胞贴壁生长，细胞形态呈多边形或卵圆形，分布均匀，细胞伸展互相连接。作用24 hr后，部分细胞间连接断裂，细胞形态规则性降低，有梭形的和类似不太规整的三角形；作用48 hr后，贴壁细胞间出现宽的裂隙，部分细胞细胞变圆，体积缩小，轮廓模糊不清晰，部分细胞胞膜呈小泡状膨出，部分细胞脱落悬浮；作用72 hr后，细胞脱落悬浮的更多，贴壁细胞稀少，细胞不规则，大小不一，甚至裂解成碎片。该现象表明，随着作用时间延长，CMPD诱导了舌癌细胞SCC-9的凋亡。

进一步使用ApopTag 原位凋亡检测试剂盒对SCC-9细胞常规培养72 hr和用化合物CMPD（1.0 μM）对SCC-9细胞处理72 hr这两组细胞进行检测（图7）。每组图片有三张图，第一张（DAPI）中蓝色部分为定位细胞核，即所有细胞；第二张（ApoTag）中红色部分定位发生凋亡的细胞；第三张（Merge）是由第一张和第二张合并而成，可同时观察到所有细胞和发生凋亡的细胞。因此，图中对照组凋亡细胞的比例明显低于CMPD处理组；另一方面，单纯观察DAPI染色的照片可发现CMPD处理组的蓝色部分不像对照组呈现椭圆形，而是不规则的、片状分布，这意味着CMPD处理后细胞核的DNA出现了片段化，蓝色部分数量也较对照组少，这说明了CMPD处理后细胞增殖速率也小于对照组。这也验证了前面细胞形态学观察及上章节细胞增殖实验所得的结果，再次说明CMPD可以促进舌癌细胞凋亡，抑制了其增殖。

分别用CMPD（1.0 μM）梯度时间处理SCC-9细胞（图8），及使用梯度浓度的CMPD对 SCC-9细胞处理24 hr（图9），Western blotting检测相关的Caspase家族蛋白及PARP活化情况。结果显示在同一CMPD浓度下随着处理时间的增长，Cleaved Caspase-9、Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-7及Cleaved PARP蛋白表达水平逐渐增强；在同一处理时间随着CMPD浓度的增高，其凋亡相关蛋白表达水平呈同样的变化趋势。说明CMPD诱导舌癌细胞凋亡，呈时间和剂量依赖性。

用CMPD（1.0 μM）对舌癌SCC-9细胞进行梯度时间处理，Western blotting检测Cyclin D1蛋白的表达（图10），结果显示随着CMPD的作用时间增长，Cyclin D1表达下降。

用梯度浓度的CMPD作用SCC-9 30 min，Western blotting检测AKT及其磷酸化蛋白的表达情况（图11），结果显示随着CMPD浓度增高，AKT的两个位点的磷酸化水平下降，呈剂量依赖性，表明这种TBK1和IKKi双重抑制化合物能够抑制AKT的活化。

用CMPD（1.0 μM）处理舌癌SCC-9细胞1 hr，Western blotting检测p-CYLD蛋白的表达（图12），结果显示CMPD处理后其p-CYLD表达均有降低。

因此本实例证实，CMPD具有双重抑制TBK1和IKKi功能，可诱导舌癌细胞凋亡，并呈现时间和剂量依赖性，其机制与下调舌癌细胞Cyclin D1、p-AKT、p-CYLD的蛋白表达有关。

实施例4、CMPD在肿瘤动物模型的体内实验研究

基于化合物CMPD具有双重抑制TBK1和IKKi体外抗肿瘤细胞增殖能力，采用荷瘤小鼠模型验证其抗肿瘤增殖的能力。

肿瘤细胞株采用舌癌细胞SCC-9，购于美国模式培养物集存库（American type culture collection，ATCC）和***癌细胞系Myc-CaP，从一种c-Myc转基因***癌小鼠中分离出来，其能在具有免疫力的FVB小鼠体内生长出肿瘤。

舌癌动物实验选用BALB/C先天性细胞免疫缺陷Nu/Nu裸小鼠15只，雌性，8周龄，体重22-24 g，SPF（Special pathogen free）级。Myc-CaP***癌动物实验采用12只FVB小鼠。所有动物抵达后在无菌独立送风隔离笼具空气层流净化室内饲养，保持恒温（26-28℃），恒湿（相对湿度40%-60%），12 hr明暗切换。饲料、饮水、垫料均经灭菌处理后使用。实验、饲养过程均达到SPF条件。

（一）用CMPD治疗舌癌SCC-9细胞荷瘤裸鼠。

（1）收集准备细胞

选取对数生长期SCC-9细胞，消化、离心收集细胞，PBS洗涤2次，显微镜下计数，并加入适量Matrigel，调整细胞终浓度为 2.0×107/ml细胞悬液备用（冰上操作，保持低温）。

（2）接种动物

裸鼠抵达接收后，为了让裸鼠适应新的环境，调节好状态，先在动物中心饲养观察l周左右，记录裸鼠的生活及身体状况。等待裸鼠饮食、活动正常并且无激惹征后进行实验。在超净工作台内，常规消毒裸鼠左侧颈背部皮肤，用l ml无菌注射器精确抽取细胞悬液0.5 ml（即含有SCC-9细胞1×107个）注入裸鼠左侧颈背部皮下，穿刺点距注射部位约1 cm。接种后将裸鼠送回原饲养笼，观察并记录裸鼠的饮食、精神及排便情况。

（3）分组与治疗

接种24 hr后，将15只裸鼠随机分为2组，对照组5只，实验组10只。治疗组每日（相同时间点）向裸鼠腹腔注射CMPD溶液，剂量为100 mg/kg体重（如一只20 mg的裸鼠需2 mg化合物，即注射200 ul 化合物CMPD溶液（1 mg/100 ul）即可），连续治疗34天，对照组（与实验组同时间点）注射生理盐水作为对照（一只20 mg的裸鼠直接注射200 ul 生理盐水），两组裸鼠同时结束治疗。

（二）用CMPD治疗***癌Myc-CaP细胞荷瘤FVB小鼠

（1）收集准备细胞

选取对数生长期Myc-CaP细胞，消化、离心收集细胞，PBS洗涤2次，显微镜下计数，并加入适量Matrigel，调整细胞终浓度为 6.0×106/ml细胞悬液备用（冰上操作，保持低温）。

（2）接种动物

饲养条件如上述，在超净工作台内，常规消毒FVB左侧颈背部皮肤，用l ml无菌注射器精确抽取细胞悬液0.5 ml（即含有Myc-CaP细胞3.0×106个）注入小鼠左侧颈背部皮下，穿刺点距注射部位约1 cm。接种后将小鼠送回原饲养笼，观察并记录小鼠的饮食、精神及排便情况。

（3）分组与治疗

接种24 hr后，将12只FVB小鼠随机分为2组，实验组6只，对照组6只。治疗组每日（相同时间点）向小鼠腹腔注射CMPD溶液，剂量为100 mg/kg体重，连续治疗18天，对照组（与实验组同时间点）注射生理盐水作为对照（一只20 mg的裸鼠直接注射200 ul 生理盐水），两组FVB小鼠同时结束治疗。

疗效评估

常规饲养，每天观察小鼠的饮食、活动，每三天测小鼠体重，并用游标卡尺测量肿瘤的长径（L），短径（W），并记录。其肿瘤体积计算方法见下面公式：瘤体积（V）=瘤长径（L）×瘤短径的平方（W2）/2。

动物实验结果

两组肿瘤细胞接种于小鼠后，其注射部位出现小凸起，为瘤结节，呈不太规则的圆形，有的表面不平坦。对照组肿瘤呈生长较快，以最初注射部位为中心，逐渐向周围浸润，体积渐次增大，触之质地较硬。少数肿瘤中心出现坏死，凹陷或结痂现象；实验组肿瘤生长缓慢，体积小于对照组。实验过程中随着化合物腹腔注射时间增长，其对实验组肿瘤生长的抑制效果逐渐明显。

实验结束时处死全部小鼠，解剖分离出肿瘤，术中可见对照组肿瘤周围有较多血管长入，瘤体色泽红润；而实验组肿瘤周围血管细小、稀疏，瘤体颜色偏淡（图13）。全部肿瘤的图片见图14和图15，对照组肿瘤明显大于实验组，说明实验组中肿瘤的生长在CMPD的干预下受到抑制。

CMPD毒性评价：在实验开始和结束时参与实验的小鼠体重均未见明显差异。治疗过程中，小鼠精神状态佳，生长发育、饮食活动均未见明显异常，表明CMPD无明显毒、副作用。

对新鲜的裸鼠肿瘤组织进行冰冻切片，并进行免疫组织化学，采集图像见图16。VEGF（本说明书中VEGF是指血管内皮生长因子）主要在胞浆中表达，阳性颗粒呈棕黄色，其中对照组中呈强表达，实验组中呈弱表达。P-AKT则在细胞核和胞浆中均有表达，其中对照组中细胞核和胞浆中均呈强表达，实验组中细胞核和胞浆中呈弱表达（图16）。表明了CMPD治疗裸鼠舌癌可下调其VEGF及p-AKT。

RT-PCR检测裸鼠肿瘤组织中VEGF的基因表达水平（图17），结果显示VEGF的基因表达水平在CMPD处理的实验组中明显下调，该结果与前面的免疫组化分析结果一致。

Western blotting检测裸鼠肿瘤组织p-AKT的蛋白质表达水平（图18），结果显示p-AKT的蛋白表达水平在CMPD处理的实验组中明显下调，Western blotting分析结果与前面的免疫组化分析结果一致。

因此本实例证实，CMPD这种TBK1和IKKi双重抑制化合物能成功抑制舌癌荷瘤裸鼠和***癌FVB小鼠体内肿瘤的生长，且对小鼠机体无明显毒、副作用。CMPD的抗肿瘤作用与抑制AKT活化，下调VEGF表达，抑制肿瘤血管生成有关。

Claims (2)

1.2-氨基-4-（3′-氰基-4′-吡咯烷基）苯基嘧啶化合物在制备抗舌癌药物中的应用，所述化合物的结构式为：

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2.2-氨基-4-（3′-氰基-4′-吡咯烷基）苯基嘧啶化合物在制备抗***癌药物中的应用，所述化合物的结构式为：

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