CN110123809A - 5-甲基-二氢苯并呋喃-咪唑盐类化合物在制药中的应用 - Google Patents

5-甲基-二氢苯并呋喃-咪唑盐类化合物在制药中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及5‑甲基‑二氢苯并呋喃‑咪唑盐类化合物在制备PI3K激酶抑制剂，mTOR信号通路抑制剂以及预防和***药物中的应用。本发明中的以3‑(2‑bromobenzyl)‑1‑((2,3‑dihydrobenzofuran‑5‑yl)methyl)‑5,6‑dimethyl‑1H‑benzo[d]imidazol‑3‑ium bromide(B591)为代表的化合物能够靶向PI3K激酶抑制mTOR信号通路，抑制肿瘤的生长。更重要的是，与普通肿瘤细胞相比，B591更加显著地抑制肿瘤干细胞，有效阻止乳腺癌细胞转移及化疗药物紫杉醇治疗后乳腺癌的复发。本发明所述的化合物药理活性强，作用机制明晰，安全低毒，稳定性好，可作为新型药物，保健品和/或膳食添加剂，用于制备抗肿瘤药物，为肿瘤治疗领域提供了新的选择，极具应用价值，也可以作为研究PI3K/Akt/mTOR信号通路的化学工具分子。

Description

5-甲基-二氢苯并呋喃-咪唑盐类化合物在制药中的应用
技术领域
本发明属于医药领域，具体涉及5-甲基-二氢苯并呋喃-咪唑盐类化合物在制备PI3K抑制剂，mTOR信号通路抑制剂以及预防和***药物中的应用。
背景技术
肿瘤是威胁人类健康的重大疾病，肿瘤干细胞是肿瘤发生、转移、耐药和复发的关键根源，是肿瘤治疗失败的根本原因，因此肿瘤治疗新策略是同时杀伤肿瘤细胞和肿瘤干细胞。
PI3K/Akt/mTOR通路是细胞内非常重要的信号转导途径，作为该信号通路中关键的激酶， PI3K的激活主要通过Ras和p110直接结合导致PI3K的活化，PI3K被激活后，在质膜上产生第二信使PIP3，然后PIP3与细胞内含有PH结构域的信号蛋白Akt和PDK1结合，促使PDK1磷酸化 Akt蛋白的Ser308导致Akt的活化。活化的Akt通过磷酸化作用激活mTOR信号通路。mTOR在生物体以mTOR复合物体1(mTORC1)和mTORC2两种复合物的形式存在。S6K1和4E-BPl 是两个研究最广泛的mTORC1的底物，它们是蛋白翻译过程中的关键调节因子。mTORC2复合物能够作为Akt的上游信号分子在Ser473位点对Akt产生磷酸化从而参与细胞骨架蛋白的构建，调节蛋白质合成、细胞存活、增殖与代谢等诸多细胞活动。
PI3K/Akt/mTOR信号通路的失常与肿瘤的发生发展，侵袭和转移密切相关。最近研究表明，PI3K/Akt/mTOR信号通路与肿瘤干细胞的自我更新以及肿瘤抗化疗或放疗密切相关。该信号通路已被确证是一个有效的肿瘤治疗靶点，一些小分子抑制剂，如靶向PI3K催化亚基p110 的wortmannin、LY294002、IC484068和天然来源的PI3K抑制剂鱼藤素(Degurlin)；抑制Akt 激活所必需的丝/苏氨酸激酶PDK的straurosporine、UCN-01和Akt的抑制剂perifosine；以及特异靶向mTOR的抑制剂雷帕霉素及其类似物RAD001、CCI779和AP23573等已经分别进入各期临床研究。然而，这些化合物仍然存在毒副作用大，药动学性质差的缺点，因此，发现新的 PI3K/Akt/mTOR通路抑制剂从而研发出新的抗肿瘤药物十分必要。
迄今为止，结构新颖的5-甲基-二氢苯并呋喃-咪唑盐类化合物作为PI3K激酶抑制剂和 mTOR信号通路抑制剂，及其抗肿瘤和抗肿瘤干细胞活性尚未见报道。
发明内容
本发明目的是提供一种5-甲基-二氢苯并呋喃-咪唑盐类化合物在制备PI3K抑制剂，mTOR 信号通路抑制剂以及预防和***药物中的新用途。
为了实现本发明的上述目的，本发明提供了如下的技术方案：
结构通式Ⅰ和Ⅱ所示的5-甲基-二氢苯并呋喃-咪唑盐类化合物在制备PI3K抑制剂， mTOR信号通路抑制剂以及预防和***药物中的应用，
结构通式(Ⅰ):
当X＝Br时，R1＝苯甲酰甲基，4-甲氧基苯甲酰甲基，4-溴苯甲酰甲基，萘甲酰甲基，2-溴苄基；
当X＝I时，R1＝正丁基；
结构通式(Ⅱ):
当X＝Br，R2＝H，R3＝H时，R1＝苯甲酰甲基，4-甲氧基苯甲酰甲基，4-溴苯甲酰甲基，萘甲酰甲基，2-溴苄基，4-硝基苄基，烯丙基；
当X＝Br，R2＝CH3，R3＝H时，R1＝苯甲酰甲基，4-甲氧基苯甲酰甲基，萘甲酰甲基；
当X＝Br，R2＝H，R3＝CH3时，R1＝苯甲酰甲基，4-甲氧基苯甲酰甲基，4-羟基苯甲酰甲基， 4-溴苯甲酰甲基，萘甲酰甲基，2-溴苄基，4-硝基苄基；
当X＝I，R2＝H，R3＝H，CH3时，R1＝正丁基；
当X＝I，R2＝CH3，R3＝H时，R1＝正丁基。
其中，所述的化合物为3-(2-bromobenzyl)-1-((2,3-dihydrobenzofuran-5-yl)methyl)
-5,6-dimethyl-1H-benzo[d]imidazol-3-ium bromide(B591)。
结构通式Ⅰ和Ⅱ所示的5-甲基-二氢苯并呋喃-咪唑盐类化合物在制备PI3K抑制剂，mTOR 信号通路抑制剂以及预防和***药物中的应用，其中所述化合物B591与ATP竞争结合于PI3K激酶的活性口袋区域，从而抑制PI3Kα，PI3Kβ，PI3Kγ和PI3Kδ的激酶活性，从而抑制肿瘤细胞及肿瘤干细胞。
结构通式Ⅰ和Ⅱ所示的5-甲基-二氢苯并呋喃-咪唑盐类化合物在制备PI3K抑制剂，mTOR 信号通路抑制剂以及预防和***药物中的应用，其中所述化合物B591通过抑制mTORC1 下游经典蛋白S6K和4E-BP1的磷酸化水平，以及mTORC2下游蛋白Akt在S473位的磷酸化，进而抑制肿瘤细胞及肿瘤干细胞的增殖，诱导其凋亡，最终抑制肿瘤细胞及肿瘤干细胞。
结构通式Ⅰ和Ⅱ所示的5-甲基-二氢苯并呋喃-咪唑盐类化合物在制备PI3K抑制剂，mTOR 信号通路抑制剂以及预防和***药物中的应用，其中所述化合物B591抗肿瘤作用是通过靶向PI3K激酶阻断mTOR信号通路，抑制HepG2细胞，MCF-7细胞，MDA-MB-468细胞， MDA-MB-231细胞，SUM-159PT细胞，HCT116细胞，SW480细胞，Lovo细胞，A549细胞， RD细胞，和Jurkat细胞的增殖，阻滞人乳腺癌MDA-MB-231细胞周期于G0/G1期，诱导人横纹肌肉瘤细胞RD的细胞凋亡，抑制荷瘤小鼠肿瘤的生长，并具剂量依赖性。
结构通式Ⅰ和Ⅱ所示的5-甲基-二氢苯并呋喃-咪唑盐类化合物在制备PI3K抑制剂，mTOR 信号通路抑制剂以及预防和***药物中的应用，其中所述化合物B591通过靶向PI3K激酶抑制mTOR信号通路，显著降低微球体的大小与数目，并抑制微球体的自我更新，降低乳腺癌微球体传代能力，诱导微球体细胞的凋亡，降低乳腺癌干细胞标志物及转移相关基因的表达，从而抑制肿瘤形成，增殖，乳腺癌的转移及化疗后的复发。
结构通式Ⅰ和Ⅱ所示的5-甲基-二氢苯并呋喃-咪唑盐类化合物在制备PI3K抑制剂，mTOR 信号通路抑制剂以及预防和***药物中的应用，其中所述的肿瘤为头颈部肿瘤、呼吸***肿瘤、消化***肿瘤、泌尿***肿瘤、骨骼***肿瘤、妇科肿瘤、血液***肿瘤、其他类型肿瘤。
结构通式Ⅰ和Ⅱ所示的5-甲基-二氢苯并呋喃-咪唑盐类化合物在制备PI3K抑制剂，mTOR 信号通路抑制剂以及预防和***药物中的应用，其中所述的头颈部肿瘤为甲状腺癌、鼻咽癌、脑膜癌、听神经瘤、垂体瘤、口腔癌、颅咽管瘤、丘脑和脑干肿瘤、血管源性肿瘤或颅内转移瘤；所述的呼吸***肿瘤为肺癌；所述的消化***肿瘤为肝癌、胃癌、食管癌、大肠癌、直肠癌、结肠癌或胰腺癌；所述的泌尿***肿瘤为肾癌、膀胱癌、***癌或睾丸癌；所述的骨骼***肿瘤为骨癌；所述的妇科肿瘤为乳腺癌、***或卵巢癌；所述的血液***肿瘤为白血病、恶性淋巴瘤或多发性骨髓瘤。
结构通式Ⅰ和Ⅱ所示的5-甲基-二氢苯并呋喃-咪唑盐类化合物在制备PI3K抑制剂，mTOR 信号通路抑制剂以及预防和***药物中的应用，其中所述的其他类型肿瘤为恶性黑色素瘤、神经胶质瘤或皮肤癌。
药物组合物，包含***有效量的权利要求1所述的结构通式Ⅰ和Ⅱ所示的5-甲基-二氢苯并呋喃-咪唑盐类化合物和药学可接受的载体或赋形剂。
如所述的药物组合物为片剂、胶囊剂、水性混悬剂、油性混悬剂、可分散的粉剂、颗粒剂、锭剂、乳剂、糖浆剂、乳膏剂、软膏剂、栓剂或注射剂。
所述的本发明的用于预防和***的药学组合中可以接受的载体是指药学领域常规的药物载体，例如：稀释剂如水等；赋形剂剂如淀粉、蔗糖等，粘合剂如纤维素衍生物、藻酸盐、明胶等；湿润剂如甘油；崩解剂如琼脂、碳酸钙、碳酸氢钙等；吸收剂如季铵化合物；表面活性剂如十六烷醇；吸附载体如高岭土等；润滑剂如滑石粉、硬脂酸钙、镁等。另外还可以在组合物中加入其它辅剂如香味剂、甜味剂等。
本发明所述的药物组合物能制成片剂、胶囊剂、水性混悬剂、油性混悬剂、可分散的粉剂、颗粒剂、锭剂、乳剂、糖浆剂、乳膏剂、软膏剂、栓剂或注射剂。本发明药物组合物的各种剂型可以按照药学领域中熟知的方法进行制备。这些药用制剂中可以含有与载体组合的例如0.05％～90％重量活性成分，更常见约 15％～60％之间的活性成分。本发明化合物剂量可以是0.005～5000mg/kg/天，也可根据疾病严重程度或剂型的不同使用剂量超出此剂量范围。
与现有技术相比，本发明所具备的优益效果如下：
本发明结构新颖的5-甲基-二氢苯并呋喃-咪唑盐类化合物可用于制备不同于现有临床研究化合物特点的新颖的PI3K抑制剂，mTOR信号通路抑制剂和预防和***药物。本发明首次证明B591是新颖的ATP竞争性PI3K抑制剂，B591能显著抑制mTORC1下游经典蛋白 S6K和4E-BP1的磷酸化水平以及mTORC2下游Akt蛋白在S473位的磷酸化水平，而且B591 能够克服mTORC1抑制诱导的Akt及ERK的反馈激活；能显著抑制人乳腺癌MDA-MB-231，SUM-159PT和MDA-MB-468细胞、人肝癌HepG2、人乳腺癌MCF-7细胞、人结肠癌HCT116 细胞、人结肠癌SW480细胞、人结肠癌Lovo细胞、人肺癌A549细胞、人横纹肌肉瘤RD 细胞和急性T细胞白血病Jurkat的增殖，并呈现剂量依赖性；能显著阻滞人乳腺癌 MDA-MB-231细胞周期于G0/G1期，并呈现剂量依赖性；能显著诱导人横纹肌肉瘤细胞RD 的细胞凋亡，并呈现剂量依赖性；能显著抑制荷瘤小鼠肿瘤的生长。更重要的是与临床抗肿瘤化疗药物相比，B591更加倾向于抑制肿瘤干细胞的增殖，诱导肿瘤干细胞的凋亡。B591 在体外抑制肿瘤微球体的形成，降低肿瘤干细胞标志物，肿瘤干细胞自我更新标志物，肿瘤转移相关基因及PI3K下游底物的磷酸化从而在体内外抑制肿瘤干细胞，而且对荷瘤小鼠的体重没有明显的影响。此外，B591能够在体内抑制乳腺癌的转移及紫杉醇诱导的肿瘤复发说明 B591为肿瘤患者提供了新的治疗药物，具有剂量适中，费用适中，用药方便，疗效显著，毒副作用小等优点。
附图说明：
图1A显示B591的化学结构；
图1B显示B591对PI3K激酶活性的影响；
图1C显示B591对PIP3/PIP2的影响；
图1D显示在不同ATP浓度下ATP对PI3Kβ的影响；
图2显示B591对不同肿瘤细胞的mTORC1和mTORC2信号通路的影响；
图3显示B591对mTORC1抑制导致的Akt及ERK的反馈激活的影响；
图4显示为B591对不同肿瘤细胞增殖的影响；
图5显示B591对人乳腺癌MDA-MB-231细胞周期调控的影响；
图6显示B591对人横纹肌肉瘤RD细胞凋亡的影响；
图7显示裸鼠肿瘤体积与给药天数的关系图；
图8A显示B591和紫杉醇对肿瘤细胞与肿瘤干细胞增殖的影响；
图8B显示B591和紫杉醇对肿瘤细胞与肿瘤干细胞凋亡的影响；
图8C显示B591和紫杉醇对肿瘤干细胞标志物的影响；
图8D显示B591和紫杉醇对肿瘤细胞微球体形成的影响；
图9A显示B591对肿瘤微球体形成的影响；
图9B显示B591对微球体细胞内肿瘤干细胞标志物，肿瘤干细胞自我更新标志物，肿瘤转移相关基因及PI3K下游底物磷酸化的影响；
图10A显示裸鼠体重与给药天数的关系图；
图10B显示裸鼠肿瘤体积与给药天数的关系图；
图10C显示B591对肿瘤组织内肿瘤干细胞标志物，肿瘤干细胞自我更新标志物，肿瘤转移相关基因及PI3K下游底物磷酸化的影响；
图10D显示B591对肿瘤形成能力的影响；
图11显示B591对肿瘤转移的影响；
图12A显示肿瘤复发实验中裸鼠体重与给药天数的关系图；
图12B显示肿瘤复发实验中裸鼠肿瘤体积与给药天数的关系图；
图13显示结构通式Ⅰ和Ⅱ所示的5-甲基-二氢苯并呋喃-咪唑盐类化合物。
具体实施方式：
下面结合附图，用本发明的实施例来进一步说明本发明的实质性内容，但并不以此来限定本发明。
实施例1：
结构通式Ⅰ和Ⅱ所示的5-甲基-二氢苯并呋喃-咪唑盐类化合物的制备：
以2,3-二氢苯并呋喃为原料，进行Vilsmeier反应，合成5-甲酰基-二氢苯并呋喃，将其在醇溶液中用硼氢化钠还原为5-甲醇基-二氢苯并呋喃，再转换为甲磺酸酯，接着与咪唑或取代苯并咪唑等在溶剂中回流反应合成5-甲基-二氢苯并呋喃-咪唑，在此基础上与卤代物反应合成5- 甲基-二氢苯并呋喃-咪唑盐类化合物。
实施例2：
B591是PI3K激酶抑制剂。
1.实验方法：使用PI3K活性检测试剂盒(购自Echelon)，按照操作说明书检测B591(结构式见图 1A)对于PI3K激酶活性的影响。分别采用PIP2 Mass ELISA和PIP3 Mass ELISA试剂盒(购自Echelon) 检测B591对于HCT116细胞内PIP2及PIP3生成的影响。
2.实验结果：B591可以抑制PI3Kα，PI3Kβ，PI3Kγ和PI3Kδ的活性，IC50分别为：PI3Kα＝1.30±0.27μmol/L；PI3Kβ＝0.36±0.13μmol/L；PI3Kγ＝0.11±0.07μmol/L；PI3Kδ＝ 1.58±0.16μmol/L(图1B)。B591也显著抑制了PIP3/PIP2的比例，说明PIP2向PIP3的转化明显减少，进一步证明B591直接靶向PI3K(图1C)。另外，随着ATP浓度的升高，B591的激酶抑制活性降低，说明 B591是ATP竞争性PI3K抑制剂(图1D)。说明本发明公开的B591是新颖的ATP竞争性PI3K抑制剂。
实施例3：
B591显著抑制不同肿瘤细胞的mTORC1和mTORC2信号通路。
1.细胞株：人肺癌A549细胞、人结肠癌HCT116细胞、人横纹肌肉瘤RD细胞和人乳腺癌MDA-MB-468 细胞均购自中国科学院上海细胞库。细胞置于37℃、5％CO2的培养箱中常规培养，其中A549、HCT116和 RD细胞培养在含10％胎牛血清的RPMI-1640培养液中；MDA-MB-468细胞培养在含10％胎牛血清的DMEM 培养液中。
2.实验方法：取对数生长期A549，HCT116，RD以及MDA-MB-468细胞悬液接种于6孔板。待细胞贴壁后吸除原培养液，实验组每孔分别加入不同浓度的B591，对照组加等量的不含B591的培养液，处理收集细胞，提取细胞总蛋白，经SDS-PAGE凝胶电泳，分别用特异性抗体检测p-Akt(T308)、p-S6K1、p-4E-BP1、 p-AKT(S473)、p-GSK3β、GSK3β和β-actin。
3.实验结果：B591显著抑制mTORC1下游经典蛋白S6K和4E-BP1的磷酸化水平以及mTORC2下游Akt 蛋白在S473位的磷酸化水平(图2)，说明本发明公开的B591同时抑制多种肿瘤细胞内的mTORC1和mTORC2 信号通路。
实施例4：
B591能够克服mTORC1抑制导致的Akt及ERK的反馈激活。
1.实验方法：取对数生长期RD以及MDA-MB-231细胞接种于6孔板。培养24h，待细胞贴壁后吸除原培养液，实验组每孔分别加入10μΜB591，对照组加等量的不含B591的培养液。然后收集细胞，提取细胞总蛋白，经SDS-PAGE凝胶电泳，分别用特异性抗体检测p-Akt(T308)、p-AKT(S473)、Akt1、p-ERK、ERK2和β-actin等。与现有mTOR信号通路抑制剂PI103和Rapamycin的对比实验是待细胞贴壁后，实验组分别加入1μM、5μM、10μM的B591，1μM PI103和100ng/ml的Rapamycin处理收集细胞，提取总蛋白，经SDS-PAGE凝胶电泳，检测相关蛋白。
2.实验结果：B591能够时间及剂量依赖地克服mTORC1抑制导致的Akt及ERK的反馈激活，而现有mTOR信号通路抑制剂Rapamycin显著引起Akt及ERK的反馈激活，而且与PI103相比B591能够更加有效地克服Akt及ERK的反馈激活(图3)，说明本发明公开的B591能够有效克服由于mTORC1抑制而导致的Akt及ERK的反馈激活。
实施例5：
B591显著抑制不同肿瘤细胞的增殖。
1.细胞株：人乳腺癌MDA-MB-231细胞来源于路易斯安那州立大学黄世乐教授实验室；人乳腺癌 SUM-159PT细胞购自Asterand；人肝癌HepG2、人乳腺癌MCF-7细胞、人乳腺癌MDA-MB-468细胞、人结肠癌HCT116细胞、人结肠癌SW480细胞、人结肠癌Lovo细胞、人肺癌A549细胞、人横纹肌肉瘤RD细胞和急性T细胞白血病Jurkat细胞均购自中国科学院上海细胞库。细胞置于37℃、5％CO2的培养箱中常规培养，其中HepG2、HCT116、A549、RD和Jurkat细胞培养在含10％胎牛血清的RPMI-1640培养液中；MCF-7、 MDA-MB-468、MDA-MB-231和SW480细胞培养在含10％胎牛血清的DMEM培养液中；Lovo细胞培养在含10％胎牛血清的F12-K培养液中；SUM-159PT细胞培养在含5％胎牛血清，5μg/ml胰岛素和1μg/ml的Ham's F12培养液中。
2.实验方法：取对数生长期的细胞悬液接种于96孔板。细胞贴壁后吸除原培养液，实验组每孔分别加入0.064μΜ、0.32μΜ、1.6μΜ、8μΜ和40μΜ的B591，对照组加等量的不含B591的培养液，处理细胞48小时，MTS方法检测细胞存活率，并计算IC50值。
3.实验结果：B591能够显著抑制所测试肿瘤细胞的增殖，IC50为1.11μΜ～6.17μΜ，并呈现剂量依赖性(图4)。
实施例6：
B591阻滞MDA-MB-231细胞周期于G0/G1期。
1.实验方法：取对数生长期MDA-MB-231细胞，以培养液制成1×105/ml细胞悬液接种于6 孔板。培养24h，待细胞贴壁后吸除原培养液，实验组每孔分别加入1.25μΜ、2.5μΜ和5μΜ的B591，对照组加等量的不含B591的培养液。处理结束时，胰酶消化并离心收集细胞，碘化丙啶(Propidium Iodide,PI，Sigma公司)染色，用流式细胞仪检测细胞周期。
2.实验结果：B591能够显著阻滞人结肠癌细胞周期于G0/G1期，并呈现剂量依赖性(图5)。
实施例7：
B591显著诱导RD细胞凋亡。
1.实验方法：取对数生长期RD细胞，以培养液制成1×105/ml细胞悬液接种于6孔板。培养24h，待细胞贴壁后吸除原培养液，实验组每孔分别加入B591，对照组加等量的不含B591 的培养液。48h后，胰酶消化并离心收集细胞，Annexin-V-FITC和PI(BD Biosciences)染色，用流式细胞仪检测分析细胞凋亡率(图6)。
2.实验结果：B591能够显著诱导人横纹肌肉瘤细胞RD的细胞凋亡，并呈现剂量依赖性(图 6)。
实施例8：
B591抑制人结肠癌HCT116细胞，人横纹肌肉瘤RD细胞和人乳腺癌MDA-MB-468细胞裸鼠移植瘤的生长。
1.实验方法：将人结肠癌HCT116细胞，人横纹肌肉瘤RD细胞和人乳腺癌MDA-MB-468 细胞皮下注射到4周龄雌性BALB/c裸小鼠(北京维通利华实验动物技术有限公司)右前肢腋下，待肿瘤长到100mm3时，腹腔注射B591，对照组注射等量溶剂，HCT116裸鼠移植瘤组每2 天测量肿瘤体积的变化，RD和MDA-MB-468裸鼠移植瘤组每3天测量肿瘤体积的变化，同时监测小鼠的体重变化。
2.实验结果：与对照组相比，B591显著抑制了荷瘤小鼠肿瘤的生长，而且具有剂量依赖性(图7)。说明本发明公开的mTOR抑制剂B591能够显著抑制荷瘤小鼠肿瘤的生长。
实施例9：
B591选择性杀伤肿瘤干细胞。
1.细胞株：人乳腺癌MDA-MB-231细胞来源于路易斯安那州立大学黄世乐教授实验室；人乳腺癌SUM-159PT细胞购自Asterand。
2.实验方法：将MDA-MB-231细胞和SUM-159PT细胞在无血清的DMEM-F12培养液(添加10ng/ml b-FGF，20ng/ml的EGF，5μg/ml的胰岛素，1μg/ml的氢化可的松，1×B27，1×2-β-巯基乙醇，0.5％的甲基纤维素)中培养14天。将正常贴壁培养的MDA-MB-231细胞和 SUM-159PT细胞消化接种于96孔培养板，24h后，将微球体消化接种于低黏附的96孔培养板，实验组加入B591和紫杉醇(购自Selleck)，对照组加入不含药物的培养液，48h后胰酶消化，采用细胞计数仪统计各个处理组的细胞数目并进行标准化。细胞凋亡实验是将正常贴壁培养的细胞和微球体细胞分别接种于正常及低黏附的6孔培养板，分别加入B591和紫杉醇，对照组加入不含药物的培养液，48h后，胰酶消化并离心收集细胞，Annexin-V-PE和7-ADD(BDBiosciences)染色，用流式细胞仪检测分析细胞凋亡率。肿瘤干细胞标志物检测实验是将对数生长期的MDA-MB-231细胞和SUM-159PT细胞消化接种于6孔细胞培养板，实验组分别加入B591和紫杉醇，对照组加入不含药物的培养液，48h后将培养液更换为无药物培养液，继续培养96h后收集细胞，提取细胞总蛋白，经SDS-PAGE凝胶电泳，分别用特异性抗体检测BMI-1、ALDH1、Oct-4、CD44和β-actin)。微球体形成实验是将对数生长期的MDA-MB-231 细胞和SUM-159PT细胞消化接种于低黏附的96孔细胞培养板，然后实验组分别加入B591和紫杉醇，对照组加入不含药物的培养液，处理48h后进行消化和二代微球体培养，10天后统计各个处理组微球体数量并在显微镜下拍照。
3.实验结果：在细胞增殖(图8A)和细胞凋亡(图8B)实验中，B591更加倾向于杀伤肿瘤干细胞，而紫杉醇对于普通肿瘤细胞杀伤作用更明显。B591对于肿瘤干细胞标志物BMI-1、ALDH1、Oct-4和CD44有明显的下调作用，而紫杉醇增加了肿瘤干细胞BMI-1、ALDH1、Oct-4和CD44的表达(图8C)。在微球体形成实验中，与对照组相比紫杉醇处理组微球体数量明显增多，说明紫杉醇能够富集肿瘤干细胞，而与对照组相比B591处理组微球体数量显著减少(图8D)，说明B591选择性杀伤肿瘤干细胞。以上结果说明常规临床化疗药物紫杉醇富集肿瘤干细胞，与紫杉醇相比，B591选择性杀伤肿瘤干细胞。
实施例10：
B591体外抑制肿瘤干细胞。
1.实验方法：将对数生长期的MCF-7细胞，MDA-MB-231细胞和SUM-159PT细胞消化接种于低黏附的96孔细胞培养板，然后实验组分别加入不同浓度的B591，对照组加入不含药物的培养液，处理5天后进行消化，进行二代微球体培养，再次培养5天后进行三代微球体培养，二代微球体和三代微球体培养过程中无B591处理，统计各个处理组微球体数量并进行标准化)。肿瘤干细胞标志蛋白、肿瘤转移相关蛋白及PI3K下游底物的检测实验是将SUM-159PT 微球体细胞消化接种于低黏附的6孔细胞培养板，实验组加入B591，对照组加入不含药物的培养液，24h后收集细胞，提取细胞总蛋白，经SDS-PAGE凝胶电泳，分别用特异性抗体检测相关蛋白。
2.实验结果：与对照组相比，B591处理显著降低了MCF-7细胞，MDA-MB-231细胞和SUM-159PT细胞的微球体形成能力，而且在后续无药物处理的第二代和第三代微球体培养过程中微球体数量也明显减少(图9A)，说明B591抑制了肿瘤干细胞的自我更新。WesternBlot 结果表明B591剂量依赖地降低了肿瘤干细胞标志物ALDH1，CD44，肿瘤干细胞自我更新标志物BMI-1,SOX-2,Oct-4和Nanog，以及肿瘤转移相关基因Vimentin,N-cadherin和Twist1的表达，而且PI3K下游底物S6K1,S6和4E-BP1的磷酸化说明也显著下降(图9)。说明B591体外抑制肿瘤干细胞。
实施例11：
B591体内抑制肿瘤干细胞。
1.实验方法：将处于对数生长期的MDA-MB-231细胞注入NOD/SCID小鼠(北京维通利华实验动物技术有限公司)乳腺脂肪垫，待肿瘤长到50mm3时，腹腔注射B591，持续注射14天，对照组注射等量溶剂，每两天测量小鼠体重和肿瘤体积图。实验结束后将小鼠处死取出肿瘤组织并消化为单个细胞，进行后续的肿瘤形成能力及Western Blot实验。肿瘤形成能力实验是将肿瘤组织消化获得的单个细胞注入NOD/SCID小鼠乳腺脂肪垫，观察肿瘤的生长情况。
2.实验结果：与对照组相比，小鼠体重无明显变化(图10A)，而B591处理后剂量依赖地抑制MDA-MB-231细胞裸鼠移植瘤的增殖(图10)。Western Blot结果显示，与对照组相比 B591处理组肿瘤组织内肿瘤干细胞标志物(ALDH1，CD44)，肿瘤干细胞自我更新标志物BMI-1,(SOX-2,Oct-4和Nanog)，以及PI3K下游底物S6K1,S6和4E-BP1的磷酸化显著下降(图10C)。肿瘤形成能力实验结果显示，B591处理组显著抑制二代肿瘤的起始，说明B591体内显著抑制肿瘤干细胞(图10D)。
实施例12：
B591抑制乳腺癌转移。
1.实验方法：将购自中国科学院上海细胞库处于对数生长期的4T1细胞注入NOD/SCID 小鼠(北京维通利华实验动物技术有限公司)乳腺脂肪垫，待肿瘤长到100mm3时，腹腔注射 B591，持续注射60天，对照组注射等量溶剂，实验结束后将小鼠处死取出肺，记录肺部肿瘤结节数。
2.实验结果：与对照组相比，B591显著抑制了小鼠乳腺癌细胞4T1的肺转移，说明本发明公开的mTOR抑制剂B591能够显著抑制乳腺癌转移(图11)。
实施例13：
B591抑制乳腺癌复发。
1.实验方法：将处于对数生长期的SUM-159PT细胞皮下注射到4周龄雌性BALB/c裸小鼠(北京维通利华实验动物技术有限公司)右前肢腋下，待肿瘤长到50mm3时，将裸鼠随机分为四组，分别为紫杉醇组(4mg/kg/d)、B591组(10mg/kg/d)、紫杉醇(4mg/kg/d)和 B591(10mg/kg/d)共处理组，以及对照组。药物处理两周后停止给药，继续观察3周检测肿瘤复发情况，每两天记录裸鼠体重及肿瘤体积。
2.实验结果：与对照组相比，小鼠体重无明显差别(图12A)，给药组均观察到明显的肿瘤生长抑制，而在停药后紫杉醇组肿瘤发生复发，而紫杉醇和B591共处理组的肿瘤复发显著被抑制(图12)，说明本发明公开的mTOR抑制剂B591能够显著抑制乳腺癌复发。
实施例14：
片剂：将B591或实施例1制得的化合物10mg，加入乳糖180mg，淀粉55mg等辅料混合均匀，并用水将其润湿后制成颗粒并干燥，再加入硬脂酸镁5mg混匀后压片，每片约重250mg。
实施例15：
安瓿剂：将B591或实施例1制得的化合物2mg，氯化钠10mg，溶解于适量的注射用水中，过滤所得溶液，在无菌条件下装入安瓿瓶中。
实施例16：
注射用冻干剂：将B591或实施例1制得的化合物10mg，碳酸氢钠2mg，甘露醇252mg。
制备方法：将碳酸氢钠、甘露醇，加注射用水溶解，加活性碳吸附30min除热原，过滤除去活性碳，在滤液中加入化合物或其盐，超声处理使溶解，用1N盐酸调节PH为5.0-7.0，微孔滤膜滤过，加注射用水，分装，冷冻干燥，上塞，轧盖，即得。
实施例17：
胶囊剂：将将B591或实施例1制得的化合物10mg，乳糖187mg，硬脂酸镁3mg；制备方法：将化合物或其盐与助溶剂混和，过筛，均匀混合，把得到的混合物装入硬明胶胶囊，每个胶囊重200mg，活性成分含量为10mg。

Claims (10)

1.结构通式Ⅰ和Ⅱ所示的5-甲基-二氢苯并呋喃-咪唑盐类化合物在制备PI3K抑制剂，mTOR信号通路抑制剂以及预防和***药物中的应用，
结构通式(Ⅰ):
当X＝Br时，R1＝苯甲酰甲基，4-甲氧基苯甲酰甲基，4-溴苯甲酰甲基，萘甲酰甲基，2-溴苄基；
当X＝I时，R1＝正丁基；
结构通式(Ⅱ):
当X＝Br，R2＝H，R3＝H时，R1＝苯甲酰甲基，4-甲氧基苯甲酰甲基，4-溴苯甲酰甲基，萘甲酰甲基，2-溴苄基，4-硝基苄基，烯丙基；
当X＝Br，R2＝CH3，R3＝H时，R1＝苯甲酰甲基，4-甲氧基苯甲酰甲基，萘甲酰甲基；
当X＝Br，R2＝H，R3＝CH3时，R1＝苯甲酰甲基，4-甲氧基苯甲酰甲基，4-羟基苯甲酰甲基，4-溴苯甲酰甲基，萘甲酰甲基，2-溴苄基，4-硝基苄基；
当X＝I，R2＝H，R3＝H，CH3时，R1＝正丁基；
当X＝I，R2＝CH3，R3＝H时，R1＝正丁基；
其中，所述的化合物为3-(2-bromobenzyl)-1-((2,3-dihydrobenzofuran-5-yl)methyl)-5,6-dimethyl-1H-benzo[d]imidazol-3-ium bromide(B591)。
2.如权利要求1所述的结构通式Ⅰ和Ⅱ所示的5-甲基-二氢苯并呋喃-咪唑盐类化合物在制备PI3K激酶抑制剂，mTOR信号通路抑制剂以及预防和***药物中的应用，其特征在于所述化合物B591与ATP竞争结合于PI3K激酶的活性口袋区域，抑制PI3Kα，PI3Kβ，PI3Kγ和PI3Kδ的激酶活性，从而抑制肿瘤细胞及肿瘤干细胞。
3.如权利要求1所述的结构通式Ⅰ和Ⅱ所示的5-甲基-二氢苯并呋喃-咪唑盐类化合物在制备PI3K激酶抑制剂，mTOR信号通路抑制剂以及预防和***药物中的应用，其特征在于所述化合物B591通过抑制mTORC1下游经典蛋白S6K和4E-BP1的磷酸化水平，以及mTORC2下游蛋白Akt在S473位的磷酸化，进而抑制肿瘤细胞及肿瘤干细胞的增殖，诱导其凋亡，最终抑制肿瘤细胞及肿瘤干细胞。
4.如权利要求1所述的结构通式Ⅰ和Ⅱ所示的5-甲基-二氢苯并呋喃-咪唑盐类化合物在制备PI3K激酶抑制剂，mTOR信号通路抑制剂以及预防和***药物中的应用，其特征在于所述B591抗肿瘤作用是通过靶向PI3K激酶阻断mTOR信号通路，抑制HepG2细胞，MCF-7细胞，MDA-MB-468细胞，MDA-MB-231细胞，SUM-159PT细胞，HCT116细胞，SW480细胞，Lovo细胞，A549细胞，RD细胞，和Jurkat细胞的增殖，阻滞人乳腺癌MDA-MB-231细胞周期于G0/G1期，诱导人横纹肌肉瘤细胞RD的细胞凋亡，抑制荷瘤小鼠肿瘤的生长，并具剂量依赖性。
5.如权利要求1所述的结构通式Ⅰ和Ⅱ所示的5-甲基-二氢苯并呋喃-咪唑盐类化合物在制备PI3K激酶抑制剂，mTOR信号通路抑制剂以及预防和***药物中的应用，其特征在于所述化合物B591通过靶向PI3K抑制mTOR信号通路，显著降低微球体的大小与数目，并抑制微球体的自我更新，降低乳腺癌微球体传代能力，诱导微球体细胞的凋亡，降低乳腺癌干细胞标志物及转移相关基因的表达，从而抑制肿瘤形成，增殖，乳腺癌的转移及化疗后的复发。
6.如权利要求1所述的结构通式Ⅰ和Ⅱ所示的5-甲基-二氢苯并呋喃-咪唑盐类化合物在制备PI3K激酶抑制剂，mTOR信号通路抑制剂以及预防和***药物中的应用，其特征在于所述的肿瘤为头颈部肿瘤、呼吸***肿瘤、消化***肿瘤、泌尿***肿瘤、骨骼***肿瘤、妇科肿瘤、血液***肿瘤、其他类型肿瘤。
7.如权利要求1所述的结构通式Ⅰ和Ⅱ所示的5-甲基-二氢苯并呋喃-咪唑盐类化合物在制备PI3K激酶抑制剂，mTOR信号通路抑制剂以及预防和***药物中的应用，其特征在于其中所述的头颈部肿瘤为甲状腺癌、鼻咽癌、脑膜癌、听神经瘤、垂体瘤、口腔癌、颅咽管瘤、丘脑和脑干肿瘤、血管源性肿瘤或颅内转移瘤；所述的呼吸***肿瘤为肺癌；所述的消化***肿瘤为肝癌、胃癌、食管癌、大肠癌、直肠癌、结肠癌或胰腺癌；所述的泌尿***肿瘤为肾癌、膀胱癌、***癌或睾丸癌；所述的骨骼***肿瘤为骨癌；所述的妇科肿瘤为乳腺癌、***或卵巢癌；所述的血液***肿瘤为白血病、恶性淋巴瘤或多发性骨髓瘤。
8.如权利要求1所述的结构通式Ⅰ和Ⅱ所示的5-甲基-二氢苯并呋喃-咪唑盐类化合物在制备PI3K激酶抑制剂，mTOR信号通路抑制剂以及预防和***药物中的应用，其特征在于其中所述的其他类型肿瘤为恶性黑色素瘤、神经胶质瘤或皮肤癌。
9.药物组合物，包含***有效量的权利要求1所述的结构通式Ⅰ和Ⅱ所示的5-甲基-二氢苯并呋喃-咪唑盐类化合物和药学上可接受的载体或赋形剂。
10.如权利要求9所述的药物组合物，其特征在于其中所述的药物组合物为片剂、胶囊剂、水性混悬剂、油性混悬剂、可分散的粉剂、颗粒剂、锭剂、乳剂、糖浆剂、乳膏剂、软膏剂、栓剂或注射剂。
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