CN110437324A - 香蕉枯萎病菌转录因子FoRlm1及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种香蕉枯萎病菌转录因子FoRlm1及其应用，所述香蕉枯萎病菌转录因子FoRlm1的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。所述香蕉枯萎病菌转录因子FoRlm1编码区的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。本发明通过对该转录因子FoRlm1进行功能分析，进一步明确了转录因子FoRlm1在调控细胞壁完整性、抗氧化机制、白僵菌素合成、镰孢菌酸合成和菌株致病性等方面的应用，为杀菌剂的设计提供了基因靶标和植物病虫害防治方面提供了理论依据和新的思路。

Description

香蕉枯萎病菌转录因子FoRlm1及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其涉及香蕉枯萎病菌转录因子及其应用。

背景技术

香蕉(Musa spp.)是世界重要的水果之一，也是继水稻、小麦、玉米之后的第四大粮食作物(魏岳荣等2005)。近年来，香蕉枯萎病已成为香蕉种植业的巨大威胁(Hwang&Ko2004；Ploetz 2006)。根据香蕉枯萎病菌(Fusarium oxysporum f.sp.cubense,FOC)对香蕉品种的致病性差异，可分为4个生理小种，其中1号生理小种侵染Gros Michel，2号生理小种侵染hybrid triploid Bluggoe(ABB)，3号生理小种侵染Heliconia spp.，4号小种能侵染几乎所有的香蕉品种，造成的危害最大(Hwang&Ko 2004)。该菌产生的厚垣孢子可在土壤、腐殖质和非寄主植物中存活多至30年，是寄主植物发病的初侵染源，即使轮作也很难根除(Ploetz 2006)；当寄主植物种植时，厚垣孢子受到寄主植物根系代谢物的信号诱导后，则会萌发产生菌丝侵染寄主，从而造成枯萎病发生(Ohara&Tsuge 2004)。

镰孢菌(Fusarium spp.)MAPK信号通路与植物侵染和致病性相关的多个关键元件已被鉴定。丝裂原活化蛋白激酶Fmk1调控番茄枯萎病菌(Fusarium oxysporumf.sp.lycopersici)的侵染特性和致病性(Di Pietro et al.,2001)。激酶MGV1(Saccharomyces cerevisiae Slt2的同源物)与禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum)的雌性发育、异核体形成和植物侵染相关(Hou et al.,2002)。蛋白激酶FgOS-2(S.cerevisiaeHog1的同源物)是调控禾谷镰孢菌(F.graminearum)生长发育的重要因子(Van Thuat etal.,2012)。激酶Pmk1下游的转录因子Mst12(S.cerevisiae Ste12的同源物)是参与调控稻瘟菌(Magnaporthe grisea)侵染的关键元件(Park et al.,2002)。MAPK信号通路下游转录因子番茄枯萎病菌Ste12(Rispail&Di Pietro,2009)和禾谷镰孢菌FgSte12(Gu et al.,2014)已被证明是其重要的致病因子。激酶MGV1下游转录因子Mig1(S.cerevisiae Rlm1的同源物)也参与调控M.grisea的侵入生长(Mehrabi et al.,2008)。然而，尖孢镰刀菌(Fusarium.oxysporum)MAPK信号通路下游转录因子的报道还较少。

F.oxysporum包括许多非致病的和多种可以侵染植物、动物和人类的无性态真菌。在植物病原菌中，超过150个致病型F.oxysporum被记录(Fourie et al.,2011)。据我们所知，在F.oxysporum MAPK信号通路下游，仅转录因子Ste12被鉴定(Di Pietro et al.,2001)。在香蕉枯萎病菌中，尚无MAPK信号通路下游转录因子FoRlm1或其同源基因的报道。鉴于F.oxysporum的多进化源(O'Donnell et al.,1998)，所以比较和鉴定不同F.oxysporum的MAPK信号通路下游转录因子的重要功能，将是非常有意义的。

发明内容

本发明的目的在于提供一种香蕉枯萎病菌转录因子FoRlm1及其在细胞壁完整性、抗氧化机制、白僵菌素合成、镰孢菌酸合成和菌株的致病性方面的应用。

本发明采取的技术方案如下：

本发明提供了一种香蕉枯萎病菌转录因子FoRlm1，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，其编码区的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

本发明通过深入研究，还进一步明确了转录因子FoRlm1在以下几个方面的应用：

1、香蕉枯萎病菌转录因子FoRlm1在调控白僵菌素合成基因方面的应用。具体优选为，通过敲除FoRlm1基因后，获得白僵菌素合成基因表达水平下降的突变体。

2、香蕉枯萎病菌转录因子FoRlm1在调控细胞的活性氧降解方面的应用。

3、香蕉枯萎病菌转录因子FoRlm1在调控菌株对刚果红的敏感性方面的应用。

4、香蕉枯萎病菌转录因子FoRlm1在调控镰孢菌酸合成基因方面的应用。具体优选为，通过敲除FoRlm1基因后，获得镰孢菌酸合成基因表达水平下降的突变体。

5、香蕉枯萎病菌转录因子FoRlm1在调控菌株致病性方面的应用。具体优选为，通过敲除FoRlm1基因后，获得致病性减弱的突变体。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明成功获得了香蕉枯萎病菌转录因子FoRlm1，对该转录因子FoRlm1进行功能分析发现，转录因子FoRlm1是和一系列生理特性和毒素合成基因的调控是相关的，包括细胞壁完整性、抗氧化机制、白僵菌素和镰孢菌酸合成。并且，与野生种菌株相比，转录因子FoRlm1的敲除突变体对香蕉植株的致病性减弱。本发明为杀菌剂的设计提供了基因靶标和植物病虫害防治方面提供了理论依据和新的思路。

附图说明

说明书附图及文中的WT代表野生种菌株XJZ2。

图1为香蕉枯萎病菌转录因子FoRlm1的功能结构域和外显子/内含子位置的示意图。

图2为香蕉枯萎病菌FoRlm1与其它病原真菌同源蛋白进化树关系图；用Clustal×2.0进行所有的蛋白序列的比对；使用MEGA 5.2泊松模型方法进行比对后序列的分析。步长值使用1000次步长重复。

图3为FoRlm1基因敲除策略示意图；基因组区域的限制性图谱和基因敲除策略图，短引物的相对位置代表用于基因敲除、转化子鉴定和Southern杂交分析；H：HindIII；E：EcoRV。

图4为突变体ΔFoRlm1的PCR鉴定结果图；(A)用引物对ZJ-F1/ZJ-R1进行扩增；(B)用引物对JC-F/R3进行扩增；(C)用引物对ZJ-F2/ZJ-R2进行扩增。

图5为突变体ΔFoRlm1的Southern blot分析结果图；(A)以对应的基因敲除区的扩增片段为探针；(B)以对应的基因侧翼区的扩增片段为探针。

图6为突变体ΔFoRlm1对H₂O₂过敏感分析结果图；(A)左边的图表示WT和突变体ΔFoRlm1在含有4mM H₂O₂MM平板上28℃培养5d的菌落形态；右图表示生长在含有4mM H₂O₂MM平板上对应的指示菌株的径向生长抑制率；(B)WT和突变体ΔFoRlm1的过氧化物酶的实时定量PCR分析；四个过氧化物酶基因是FOIG_08821、FOIG_07465、FOIG_04532和FOIG_09161；每个处理三次重复；误差线表示标准误。

图7为FoRlm1基因对香蕉枯萎病菌的细胞壁完整性的影响结果图；(A)指示菌株在含有刚果红(40μg/mL)MM平板上，在28℃培养5d的菌落形态；(B)在含有刚果红(40μg/mL)MM平板上的指示菌株的径向生长的抑制率；每个处理三次重复；误差线表示标准误。

图8为突变体ΔFoRlm1几丁质的定量和几丁质合成基因的表达结果图；(A)WT和突变体ΔFoRlm1的几丁质含量；(B)WT和突变体ΔFoRlm1的几丁质合成基因的实时定量PCR分析；每个处理三次重复；误差线表示标准误。

图9为转录因子FoRlm1调控FOC白僵菌素合成基因的转录结果图；用实时定量PCR分析相对于WT的基因表达水平；每个处理三次重复；误差线表示标准误。

图10为转录因子FoRlm1调控FOC镰孢菌酸合成基因簇的转录结果图；用实时定量PCR分析相对于WT的基因表达水平；每个处理三次重复；误差线表示标准误。

图11为突变体ΔFoRlm1的致病性测定结果图；(A)调查指示菌株接种30d后的香蕉苗发病症状；(B)发病率和病情指数表示香蕉苗的发病程度；每个处理三次重复，每个重复10株香蕉苗；误差线表示标准误。

具体实施方式

下面通过具体实施方式结合附图对本发明作进一步详细说明。

本发明实施例所用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

本发明实施例所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。本发明中所用的引物及其用途见表1。

表1 FoRlm1基因敲除和PCR鉴定及实时定量PCR使用的引物

实施例1 FoRlm1基因的克隆

本发明通过同源比对获得FoRlm1基因。为了进一步确认基因的编码区序列，采用Invitrogen的Trizol提取野生菌株XJZ2(李敏慧等，2007)的total RNA，反转录成cDNA，将其作为模板，用引物Rlm1-F/Rlm1-R扩增FoRlm1的基因全长，反应后的PCR产物经纯化克隆后进行测序。

经测序得知FoRlm1基因是一个长2122bp的序列，编码652个氨基酸，含有2个内含子。利用NCBI blastp将FoRlm1氨基酸序列和S.cerevisiae Rlm1的氨基酸序列比对，表明64％的相似性(图1)。结构域分析表明转录因子FoRlm1包含保守的MADS-box结构域(图1)。

***进化分析表明转录因子FoRlm1与F.oxysporum f.sp.cubense热带4号小种54006MADS-box转录因子EXM03441.1、Fusarium verticillioides 7600MADS-box转录因子EWG41694.1、Fusarium oxysporum Fo5176假定蛋白FOXB_09439、Fusarium oxysporumf.sp.radicis-lycopersici 26381MADS-box转录因子EXL58625.1、Fusarium oxysporumf.sp.cubense 1号小种转录因子RLM1ENH69552.1和Fusarium fujikuroi IMI 58289 MADSbox家族RLM1转录因子CCT64703.1处于同一分支。这些结果表明FOC FoRlm1在Fusarium种是高度保守的，但与其它真菌对应的Rlm1同源蛋白的相似性较低，与酵母S.cerevisiae转录因子Rlm1的亲缘关系更远(图2)。

实施例2基因敲除载体的构建

根据FoRlm1基因的全序列，构建了FoRlm1基因敲除载体。

具体步骤：利用引物对F1/R1以XJZ2基因组DNA为模板，扩增含有SpeI-PstI位点的FoRlm1基因上游片段，用引物对F2/R2获得含有XhoI-PstI的FoRlm1下游片段，分别连接到载体pMD18-T，并测序。把PstI(T4DNA polymerase补平)和SpeI酶切后的FoRlm1基因上游片段连接到载体pCT74的ClaI(T4DNA polymerase补平)和SpeI位点上，得到载体pCT74-FoRlm1-up；然后把XhoI-PstI(T4DNA polymerase补平)酶切的下游片段，连接到载体pCT74-FoRlm1-up的XhoI(T4DNA polymerase补平)位点，得到基因敲除载体pCT74-FoRlm1-KO。

实施例3突变体的获得

用限制性内切酶XbaI酶切构建好的敲除载体pCT74-FoRlm1-KO，使其线性化，以XJZ2为受体菌株，进行PEG介导的原生质体同源重组转化。获取转化子的基因组DNA，利用验证引物对F3/R3进行PCR验证，该引物可从敲除突变体ΔFoRlm1中扩增到一条约518bp潮霉素基因特异片段，从野生菌中不能扩增到片段(图3，图4A)。利用验证引物对JC-F/R3进行PCR验证，该引物可从突变体ΔFoRlm1中扩增到一条约2.8kb FoRlm1基因特异片段，而从野生种菌株中不能扩增到片段(图3，图4B)。利用验证引物对ZJ-F1/ZJ-R1进行PCR验证，该引物可从野生种中扩增到一条约755bp FoRlm1基因特异片段，而从敲除突变体ΔFoRlm1中不能扩增到片段(图3,图4C)。从126株转化子中，通过验证引物共鉴定到6株FoRlm1基因敲除突变体。

为了进一步验证这些突变体是否FoRlm1基因被敲除，大量提取了转化子基因组DNA，进行了Southern杂交验证。用引物对ZJ-F1/ZJ-R1扩增的FoRlm1基因本身敲除区为Southern杂交探针，采用Roche公司地高辛DNA标记和检测试剂盒II，用HindIII酶切消化基因组DNA。从结果可以看出，香蕉枯萎病菌野生种菌株XJZ2出现大约8.9kb的条带，而敲除突变体不能检测到任何条带(图5A)。

为了进一步验证这些敲除突变体是否为单拷贝同源置换，用引物对ZJ-F2/ZJ-R2扩增的FoRlm1基因上游片段为Southern杂交探针，采用Roche公司地高辛DNA标记和检测试剂盒II，用EcoRV酶切消化基因组DNA。从结果可以看出，香蕉枯萎病菌野生种菌株XJZ2出现大约2.0kb的条带，而敲除突变体能检测到出现大约11.0kb条带(图5B)。表明ΔFoRlm1为基因FoRlm1位点上的单拷贝同源重组。

实施例4敲除突变体ΔFoRlm1的表型分析

(1)菌落生长形态

在PDA平板上，突变体ΔFoRlm1与野生种菌株XJZ2相比，菌落形态相似，但突变体的气生菌丝有所减少。

(2)生长速率测定

将野生型菌株XJZ2和突变体接种到PDA培养基上培养，结果表明，突变体ΔFoRlm1的生长速率与野生型菌株XJZ2，不存在显著差异(表2)。

(3)菌丝和孢子形态观察

分别将野生种菌株XJZ2，突变体ΔFoRlm1接种到PDA平板上，在28℃培养3d，挑取菌丝在光学显微镜下观察，结果表明，突变体的菌丝和孢子形态和野生种相比，不存在显著差异。

(4)产孢量测定

测定了野生种菌株XJZ2和突变体ΔFoRlm1在28℃PDA平板上的产孢量，结果表明，突变体ΔFoRlm1的产孢量与野生种菌株相比，不存在显著差异(表2)。

(5)YPD液体培养基中菌丝生长量测定

测定了野生种菌株XJZ2和突变体ΔFoRlm1在28℃、YPD液体培养基中、170rpm振荡培养3d后的菌丝干重，结果表明，突变体ΔFoRlm1的菌丝干重与野生种菌株相比，显著减少(表2)。

表2香蕉枯萎病菌野生种菌株和突变体的生长量和产孢量的比较

注：^a通过计算培养在28℃PDA平板上5d的指示菌株菌落直径来计算生长率。

^b生长在YPD培养基中培养3d的真菌菌丝的干重。

^c用血球计数板定量在28℃PDA平板上培养5d指示菌株的产孢量。

^d同一纵列的不同字母表示数据的显著差异(P＝0.05)。每个处理三次重复。误差线表示标准误。

实施例5突变体对双氧水的敏感性分析

新鲜获得的野生种菌株XJZ2和敲除突变体ΔFoRlm1的孢子(2μL，10⁸孢子/mL)点接种MM平板和含有过氧化氢H₂O₂(4mM)的MM平板上，MM平板作为对照。通过计算在28℃培养6d的菌落直径，来测试突变体的双氧水的敏感性。如图6A所示，与野生种菌株XJZ2和对应的互补菌株相比，该突变体ΔFoRlm1对4mM的H₂O₂更敏感。实时定量PCR分析表明，与野生种菌株XJZ2相比，这四个过氧化物酶基因FOIG_08821、FOIG_07465、FOIG_04532和FOIG_09161在该突变体ΔFoRlm1中被显著下调(图6B)。这些结果表明转录因子FoRlm1在细胞的活性氧降解方面起着重要的调控作用。众所周知，活性氧的产生是植物防卫反应的一个重要标志。

实施例6突变体细胞壁完整性分析

新鲜获得的野生种菌株XJZ2和敲除突变体ΔFoRlm1的孢子(2μL，10⁸孢子/mL)点接种MM平板和含有刚果红Congo red(CR，40μg/mL)，或者荧光增白剂calcofluor white(CFW，40μg/mL)的MM平板上，MM平板作为对照。通过计算在28℃培养6d的菌落直径，来测试突变体对细胞壁抑制物质刚果红和荧光增白剂的敏感性变化情况。突变体ΔFoRlm1在含有刚果红(40μg/mL)的MM平板上生长加快(图7A)，但在含有荧光增白剂(40μg/mL)的MM平板上的生长率和野生种相似。数据分析表明，如图7B，与野生种菌株相比，该突变体的生长在含有刚果红(40μg/mL)的MM平板上的抑制率降低。这些结果说明敲除突变体ΔFoRlm1对细胞壁抑制物质刚果红的抗性增强。

几丁质是F.oxysporum细胞壁的主要成分(Schoffelmeer et al.,1999)。真菌的细胞壁提取正如前人所描述的一样(Yago et al.,2011)。将收集的菌丝用液氮研磨，然后用加入2mL提取缓冲液(50mM Tris-HCl pH 7.8；2％SDS；0.3M巯基乙醇；1mM EDTA，pH 8.0)并在100℃处理15min，8000rpm离心10min，倒掉上清，收集细胞壁沉淀，并用灭菌的双蒸水洗涤三次，使其完全干燥，用灭菌的双蒸水重新悬浮细胞壁沉淀，然后冻干，并称重。用1mL6M的盐酸溶解5mg细胞壁，100℃，水解至少6h，65℃干燥样品，再用1mL灭菌双蒸水溶解。取100μL溶解的样品，加100μL Solution A(4％乙酰丙酮中含有1.5M Na2CO3)，混匀后在100℃煮20min，然后再加700μL的96％的乙醇，再加入100μL Solution B(30mL浓盐酸，30mL乙醇和1.6g二甲氨基苯甲醛)，在20℃培养1h后，用分光光度计检测样品在520nm处的吸光值。通过估测几丁质酸裂解的葡糖胺的量来计算几丁质的含量。葡糖胺的定量参考纯葡糖胺在0-250μg范围制作的标准曲线(Kapteyn et al.,2000；Selvaggini et al.,2004)。每个处理三次重复。几丁质含量测定表明突变体ΔFoRlm1的几丁质含量少于野生种菌株XJZ2(图8A)。因为几丁质的合成依赖几丁质合成酶的活性，所以开展实时定量PCR分析了7个几丁质合成基因(包括FOIG_07229、FOIG_10825、FOIG_09216、FOIG_00580、FOIG_06735、FOIG_06738和FOIG_06723)的表达水平，正如预测的一样，与野生种菌株相比，这7个几丁质合成基因的表达水平在这个突变体中显著的下降(图8B)。

实施例7转录因子FoRlm1与白僵菌素合成基因的转录相关

白僵菌素是一种具有杀虫活性和诱导哺乳动物细胞程序死亡的环己缩肽毒素。为了更好的理解转录因子FoRlm1对毒素产生的影响，我们在香蕉枯萎病菌基因组鉴定了与F.oxysporum f.sp.lycopersici白僵菌素合成基因相关的三个同源基因，包括FOIG_15793，FOIG_15792和FOIG_15791。FOIG_15793编码一个恩镰孢菌素和白僵菌素合成基因beas的同源基因，FOIG_15792编码一个2-酮异戊酸还原酶基因kivr的同源基因和FOIG_15791编码一个多药转运蛋白abc3的同源基因(Lopez-Berges et al.,2013)。香蕉枯萎病菌白僵菌素合成基因FOIG_15793、FOIG_15792和FOIG_15791编码的氨基酸与F.oxysporumf.sp.lycopersici中对应的氨基酸具有超过94％的相似性。

实时定量PCR结果确定了转录因子FoRlm1在调控白僵菌素合成基因转录方面所起到的作用。接种野生种菌株XJZ2和突变体ΔFoRlm1于PD培养基中，28℃培养2d，然后收集菌丝，提取total RNA；采用Takara SYBR Premix Ex Taq将total RNA反转录成cDNA，开展了实时定量PCR，结果表明Beas、kivr和abc3的基因的表达水平在突变体ΔFoRlm1中显著下降，分别下降了5倍、3倍和2倍(图9)。

实施例8转录因子FoRlm1与镰孢菌酸(fusaric aicd)的合成相关

镰孢菌酸对动物和人类有中低毒性，但对植物有较高毒性，可以引起多种蔬菜的镰孢菌萎焉病、猝倒和根腐病。通过对F.verticillioides镰孢菌酸合成基因(FUB1-FUB5)的blastp比对分析，我们在香蕉枯萎病菌基因组中找到了其对应的同源基因。FOIG_16450(FUB1)编码F.verticillioides PKS的同源基因，它可以催化三个醋酸单位的浓缩去彻底的形成还原型6碳多肽链；FOIG_16452(FUB3)编码F.verticillioides氨基酸激酶的同源基因，它可能在吸收来自于谷氨酰胺和草酰乙酸盐的氮源去形成镰孢菌酸方面起着重要的作用；FOIG_16453(FUB4)编码F.verticillioides的水解酶同源基因和FOIG_16454(FUB5)编码F.verticillioides的乙酰移位酶的同源基因，它是与镰孢菌酸羧酸配基上添加一个甲基产生去甲基醋酸瓜类萎焉醇有关。FUB1-FUB5基因编码的氨基酸与F.verticillioides中对应的氨基酸具有超过94％的相似性。

为确定转录因子FoRlm1和镰孢菌酸合成调控相关。用实时定量PCR分析了5个与镰孢菌酸合成有关基因(FUB1-FUB5)的表达水平，结果表明，5个镰孢菌酸合成基因表达水平在该突变体中显著的下降，分别下降了3倍、3倍、3倍、2倍和4倍(图10)。

实施例9致病性分析

将野生种菌株XJZ2和突变体ΔFoRlm1进行巴西蕉(AAA)沙床苗致病性接种实验。参照李敏慧等(2007)伤根接种法。选取长势一致，具4-5片叶的健康巴西蕉组培沙床苗，用自来水冲洗干净，适当伤根，在浓度为1×10⁵个/mL的孢子悬浮液中浸根接种30-60min，栽于灭菌沙中，分别以野生菌株XJZ2和无菌水作阳性和阴性对照，每菌株接种30株蕉苗。置于网室内，日平均最高温度32℃，最低温度18℃，隔天浇水1次。30d后切开假茎基部观察结果。

为客观的反映突变体的致病能力，接种30d后分别观察假茎的变褐程度，参照(李敏慧等，2007)的分级标准，依据假茎基部横剖面褐化程度把发病级别分为4级，其中1级表示假茎基部无褐色，代表值为0；2级表示假茎基部变褐程度只有针鼻儿大小，代表值为1；3级表示假茎基部变褐程度小于假茎直径的1/2，代表值为2；4级表示假茎基部变褐程度大于1/2，代表值为3。

将敲除突变体ΔFoRlm1和野生种菌株接种香蕉苗进行致病性检测，接种30d后切开假茎基部，结果如图11A，多数敲除突变体的变褐程度明显小于野生种菌株。敲除突变体的病情指数(21.67)和发病率(33.00％)明显小于野生种菌株(分别为71.11和93.00％)(图11B)。这些结果表明转录因子FoRlm1调控香蕉枯萎病菌的致病性。

以上内容是结合具体的实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换。

序列表

<110> 琼台师范学院

<120> 香蕉枯萎病菌转录因子FoRlm1 及其应用

<160> 55

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 652

<212> PRT

<213> Fusarium oxysporum

<400> 1

Met Gly Arg Arg Lys Ile Glu Ile Lys Ala Ile Lys Asp Asp Arg Asn

1 5 10 15

Arg Ser Val Thr Phe Leu Lys Arg Lys Gly Gly Leu Phe Lys Lys Ala

20 25 30

His Glu Leu Ser Val Leu Cys Ser Val Asp Val Ala Val Phe Ile Phe

35 40 45

Gly Asn Asn Lys Lys Leu Tyr Glu Tyr Ser Ser Thr Asp Met Arg Glu

50 55 60

Leu Ile His Arg Tyr Gln Tyr His Gly Gly Pro Ser Glu His Lys Gly

65 70 75 80

Pro Ser Asp Phe Asn Gly Gly Asn Asp Asp Asp Glu Asp Glu Glu Asn

85 90 95

Asp Gly Thr Pro Pro His Gly Pro Glu Val Val Glu Asn Gln Met Met

100 105 110

Pro Pro His Ala Tyr Gly Gln His Gln Pro Pro Phe Pro Gln Ile Arg

115 120 125

His His Thr Pro Ser Ala Ser Pro Pro Ile Gly Asn Gly Gly Pro Phe

130 135 140

Gln Ala His Pro Gly His Pro Ile Gln Arg Gln His Thr Pro Gln Pro

145 150 155 160

Ser Ile Gly Ser Arg Pro Ala Ser Arg Thr Asp Met Arg Arg Met Gly

165 170 175

Pro Gly Met Val Gln Pro Pro Pro Pro Ala Gly Pro Pro His Pro Gly

180 185 190

Met Asn Tyr Met Pro Asn Pro Pro Ile Tyr Asn Ser Pro His Pro Pro

195 200 205

Gly Leu Ile Pro Gln His Gly Pro His Ser Gln Tyr Ala Tyr His Gln

210 215 220

Gln Pro Ser His Met Gln Gln Pro Gly Pro Tyr Met Asp Asp Arg Arg

225 230 235 240

Ser Pro Met Pro Ser Pro Met Pro Pro Ala Tyr Thr Ser Gln Pro Pro

245 250 255

Ser Gln Pro Ile Gln Ala Pro Val Arg Pro Thr Pro Ser Pro Gln Pro

260 265 270

Pro Gln Gln Gln Leu Pro Pro Asn Met Ser Gln Met Ser Pro Pro Pro

275 280 285

Pro Gln Pro Glu Arg Arg Leu His Asp Pro Pro Pro Pro Pro Pro Val

290 295 300

Glu Pro Lys Thr Glu Pro Gln Glu Arg Pro Gln Pro Pro Leu Leu Asn

305 310 315 320

Thr Asp Ser Ala Ile Lys Lys Leu Pro Gln Arg Lys Ser His Ser Ile

325 330 335

Phe Thr Pro Ile Glu Glu Asn Arg Ser Ile Leu Ser Gln His Leu Ala

340 345 350

Ser Phe Thr Ser Glu Ser Asn Lys Ser Glu Ser Ala Ala Ala Ala Ala

355 360 365

Ala Ala Asn Ala Ala Asn Ala Ala Asn Arg Ser Gln Ser Val Asp Val

370 375 380

Ala Ala Leu Asn Arg Ala Ala Asp Gly Pro Lys Ser Ser Pro His Leu

385 390 395 400

Pro Gln Arg Ala Ser Thr Gln Thr Asp Glu Lys Ser Arg Thr Val Ser

405 410 415

Leu Ser Ser Ile Pro Glu Thr Thr Leu Thr Pro Pro Ser Arg Ser Asn

420 425 430

Ser Ala Lys Ala Gly Gly Pro Gly Gly Ala Arg Pro Arg Gly Pro Arg

435 440 445

Leu Thr Val Gln Ile Pro Asp Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly Ser Ala

450 455 460

Arg Thr Ala Glu Ser Asn Ser Pro Arg Val Ala Thr Glu Thr Thr Thr

465 470 475 480

Gln Ala Pro Gln Arg His Asn Ser Gln Ser Ser Leu Val Leu Pro Pro

485 490 495

Pro Ser Pro Ser Ala Ser Ala Ile Leu Ser Ala Gly Ala Thr Gly Pro

500 505 510

Pro Asn Pro Phe Ala Arg Pro Pro Pro Gln Gln Asn Met Asn Gly Asp

515 520 525

Thr Pro Val Ser Ala Leu Pro Ser Arg Phe Leu Thr Asn Glu Leu Leu

530 535 540

Pro Ser Pro Ser Ser Phe Tyr Pro Asp Trp Asn Phe Arg Gly Gly Asp

545 550 555 560

Ser Asn Thr Leu Pro Ser Pro Leu Asn Phe Ala Thr Pro Val Val Gly

565 570 575

Ser Gly Pro Ser Phe Leu Arg Asp Asp Leu Asn Thr Thr Pro Asn Ala

580 585 590

Asn Ser Asn Ala Phe Lys Asp Arg Asp Pro Leu Pro Asn Ala Asn Gly

595 600 605

Ser Ser Gly Gln Asn Leu Asn Val Ala Pro Ser Asn Ser Thr Ala Thr

610 615 620

Lys Arg Lys Thr Pro Glu Pro Gly Ala Thr Thr Gln Ser Asp Thr Ala

625 630 635 640

Glu Glu Ser Glu Pro Lys Arg Leu Lys Val Asp Glu

645 650

<210> 2

<211> 2122

<212> DNA/RNA

<213> Fusarium oxysporum

<400> 2

atgggacgaa gaaagattga gattaaggcg atcaaagatg acaggaatcg ctctgtgtaa 60

gtaaacccca ggaacggcta caaatcacca gaccttgggg tcttcaagtt cgcgactaac 120

tggcgcacaa agcaccttcc tgaaacgcaa aggcggtctt ttcaagaagg ctcatgagct 180

ttccgtcctt tgctccgtcg atgtcgccgt cttcattttc ggtaacaaca agaaacttta 240

cgaatattcg tcaacggata tgcgagagct tatccaccga tatcaatatg tgagtcccac 300

ttctggaggt ggtcgcaacg cctctgaaca caggctgcga ctacgacgcg ctgtattatt 360

tgctaataga taatagcatg gcggtcccag tgaacacaaa ggtccttccg acttcaacgg 420

tggaaacgat gatgacgagg atgaggagaa cgacggcacc cctccccatg gtcctgaagt 480

tgtcgagaac cagatgatgc ctccccatgc ttacggacaa catcaacctc ctttcccaca 540

gattcggcat catacacctt cagcatcacc acctattggc aatggcggtc cattccaagc 600

gcatcctggt catcctatcc agcgacaaca tactccgcaa ccatcgatcg gctcacgacc 660

ggcatctcga acggatatgc gccgcatggg tcccggcatg gtccagcctc cacctccggc 720

cggccctccg catcccggaa tgaattacat gcccaacccg cctatctaca actcgcctca 780

tcctcccggt ctaatacctc aacatggtcc tcattctcaa tatgcttatc atcaacagcc 840

tagccacatg cagcaaccag gaccgtacat ggatgaccgc aggtccccga tgccctctcc 900

gatgcctccc gcttacactt cgcaaccgcc gtcacaacca atccaagctc ctgttcgtcc 960

aacgccatcg cctcaaccac ctcaacaaca gcttcctcca aacatgtcac aaatgtcacc 1020

tccgccgccc cagcctgaac gtcgacttca tgatcctccg ccaccgcctc ccgtggaacc 1080

caagacggaa ccacaagaac gccctcagcc gccattactg aacacggaca gtgccattaa 1140

gaagctacct caaagaaaat ctcacagtat cttcactccc atcgaagaga accggtctat 1200

tttgtcccag catctggcat cttttacttc cgagtcgaac aaatcagagt ctgctgctgc 1260

cgctgccgct gctaatgctg caaacgccgc caaccgttca caatcagttg atgtggctgc 1320

actgaaccgg gccgcggatg ggcccaaatc atcaccccat ttgccacagc gtgccagtac 1380

tcagaccgat gaaaagtctc gaacggtatc gctgtcgtca ataccagaaa ccactttgac 1440

tccgccttcg cgttctaaca gtgcaaaggc cggcggtccc ggaggagctc gacctcgtgg 1500

ccctcgctta acggtgcaga ttccggatgg cggatctgaa ggcggcggta gcgcacgaac 1560

ggcagagtca aactcgccgc gggttgccac agaaactaca acgcaggcgc cccagcgcca 1620

caactctcag tcatcacttg tgcttcctcc tccctctccg tctgcgtcag caatattgtc 1680

cgcaggtgct actggtccgc caaatccttt tgcccggccg cctcctcagc agaatatgaa 1740

tggtgatact cctgtctctg ccttgccatc acgtttcttg acaaatgaac tccttccgag 1800

cccaagtagc ttctatcccg attggaactt ccggggaggt gacagtaaca cactaccaag 1860

tccgctgaac tttgcaacgc cagttgtcgg ttcaggccct agtttcctca gagatgacct 1920

gaatacgaca ccaaatgcaa actcaaacgc tttcaaggac agagatcctc tgcctaatgc 1980

caatgggagc tcaggtcaaa acttgaatgt agctccaagc aattctactg caacgaaacg 2040

aaagactcct gagccaggag ccacaacgca gagcgatact gcggaggagt cagaaccaaa 2100

gcggttgaag gtggacgagt aa 2122

<210> 3

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atgggacgaa gaaagattga g 21

<210> 4

<211> 20

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ttactcgtcc accttcaacc 20

<210> 5

<211> 29

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

aaaactagtc gtgaagagac ttggagttg 29

<210> 6

<211> 29

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

aaactgcagt tgtgcagttc aagttggag 29

<210> 7

<211> 29

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

aaactcgagg cctatctaca actcgcctc 29

<210> 8

<211> 29

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

aaactgcagg ctgcctcaaa acaagagac 29

<210> 9

<211> 20

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

gagttgcttt agcctcgttt 20

<210> 10

<211> 20

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

gcaagacctg cctgaaaccg 20

<210> 11

<211> 20

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

ggtcaagacc aatgcggagc 20

<210> 12

<211> 20

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

catgggacga agaaagattg 20

<210> 13

<211> 20

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

gggcatgtaa ttcattccgg 20

<210> 14

<211> 20

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

cactgtccaa gttccatccc 20

<210> 15

<211> 20

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

gaagcgaagg tggtttggct 20

<210> 16

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

gttggacttg gggttgatgg g 21

<210> 17

<211> 23

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

caagcgtggt attctcactc tgc 23

<210> 18

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

ttgctctttg ggagggattt t 21

<210> 19

<211> 24

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

gaacagtttc ttaccgcctt tacc 24

<210> 20

<211> 20

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

ggaaatgccc agtgaacagc 20

<210> 21

<211> 23

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

ccgatacagc cataccaagg ata 23

<210> 22

<211> 22

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

tgtcgtcagt gatggtcgtt cc 22

<210> 23

<211> 24

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

tgagtctgcg tggtgtattc gtaa 24

<210> 24

<211> 23

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

cgctcgttct cattctttca gtt 23

<210> 25

<211> 23

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

cttgtttcgt ttcctacggt cag 23

<210> 26

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 26

accgttcctc cgatgcgtta c 21

<210> 27

<211> 24

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 27

gcaatccgtt ctcagtgtca atac 24

<210> 28

<211> 20

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 28

catcccaggt gccacagact 20

<210> 29

<211> 20

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 29

ctgacagcgg gtggagtttc 20

<210> 30

<211> 20

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 30

agttgtggcc gaatgagatg 20

<210> 31

<211> 24

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 31

gttgatttgt cacgacttgg taga 24

<210> 32

<211> 24

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 32

actcagtatg gtttcaccca ggtc 24

<210> 33

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 33

cgaggttggc tttcgtgcta t 21

<210> 34

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 34

gtgaggacga cggcaagata a 21

<210> 35

<211> 22

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 35

tgaccaaggg ctgaagatga ct 22

<210> 36

<211> 20

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 36

ataccgtgcc caagagcgtg 20

<210> 37

<211> 19

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 37

gaaccgagcc cgtgaaatg 19

<210> 38

<211> 22

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 38

cgctttcctg gtcctaagat tg 22

<210> 39

<211> 19

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 39

tgtccataac gcccaaccc 19

<210> 40

<211> 20

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 40

catcaacagt cccgccagtg 20

<210> 41

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 41

cggagtttgc gagcgaagat a 21

<210> 42

<211> 20

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 42

ccacagcact gccgaaaatg 20

<210> 43

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 43

tgacgaagaa gccgtgagac a 21

<210> 44

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 44

gcaaagcaaa ggacaaaatg g 21

<210> 45

<211> 20

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 45

gcagcagcct cgtggaagaa 20

<210> 46

<211> 20

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 46

cgagaagccc cagacaccat 20

<210> 47

<211> 20

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 47

tccccaagcc caactacagc 20

<210> 48

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 48

tgctacatcg ccctcaccaa c 21

<210> 49

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 49

cacaagcgta ggctgctcaa t 21

<210> 50

<211> 24

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 50

agtcactcgt tctttcggtc tagg 24

<210> 51

<211> 22

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 51

gcaggagttc ggttgatggt at 22

<210> 52

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 52

aagcggtgtt gtggcaatat g 21

<210> 53

<211> 20

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 53

aggtcctttc ctgagcgtcc 20

<210> 54

<211> 22

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 54

cagagtgttt ccagtggtcg tg 22

<210> 55

<211> 20

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 55

taacctccgc cattcgtcag 20

Claims (10)

1.香蕉枯萎病菌转录因子FoRlm1，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

2.根据权利要求1所述的香蕉枯萎病菌转录因子FoRlm1，其特征在于，其编码区的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

3.权利要求1或2所述的香蕉枯萎病菌转录因子FoRlm1在调控白僵菌素合成基因方面的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，通过敲除FoRlm1基因后，获得白僵菌素合成基因表达水平下降的突变体。

5.权利要求1或2所述的香蕉枯萎病菌转录因子FoRlm1在调控细胞的活性氧降解方面的应用。

6.权利要求1或2所述的香蕉枯萎病菌转录因子FoRlm1在调控菌株对刚果红的敏感性方面的应用。

7.权利要求1或2所述的香蕉枯萎病菌转录因子FoRlm1在调控镰孢菌酸合成基因方面的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，通过敲除FoRlm1基因后，获得镰孢菌酸合成基因表达水平下降的突变体。

9.权利要求1或2所述的香蕉枯萎病菌转录因子FoRlm1在调控菌株致病性方面的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，通过敲除FoRlm1基因后，获得致病性减弱的突变体。