CN116334036B

CN116334036B - 一种从青枯菌中筛选抗青枯病的胞外核酸酶的方法及遗传改良应用

Info

Publication number: CN116334036B
Application number: CN202211004364.8A
Authority: CN
Inventors: 李博; 杜鑫雅; 于晓; 付艳苹; 姜道宏; 谢甲涛; 程家森
Original assignee: Huazhong Agricultural University
Current assignee: Huazhong Agricultural University
Priority date: 2022-08-22
Filing date: 2022-08-22
Publication date: 2024-04-26
Anticipated expiration: 2042-08-22
Also published as: CN116334036A

Abstract

本发明属于遗传转化技术领域，具体涉及一种从青枯菌中筛选抗青枯病的胞外核酸酶的方法及遗传改良应用。本发明对所述核酸酶进行基因敲除，结果显示敲除后青枯菌的表型发生变化且致病力降低，与野生型菌株的竞争力也减弱。实施例中将RuvC在感病番茄品种MoneyMarker中进行超量表达，转化后的植物可显著提高番茄对青枯病的抵抗能力，有利于番茄抗性品种的选育，并且也在拟南芥和烟草中成功表达，且没有影响作物本身正常生长，具有应用于更多作物抗病育种的潜力。

Description

一种从青枯菌中筛选抗青枯病的胞外核酸酶的方法及遗传改良应用

技术领域

本发明属于遗传转化技术领域，具体涉及一种从青枯菌中筛选抗青枯病的胞外核酸酶的方法及遗传改良应用。

背景技术

番茄青枯病是由茄科雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)引起的细菌性土传病害，是危害农业生产最严重的细菌性病害之一。青枯菌通过植株伤口或是自然孔口从根部侵入，定殖于木质部，入侵维管束，阻碍水分的运输，导致植株萎蔫最终死亡。青枯菌寄主包括番茄、烟草、马铃薯等数百种作物，且青枯菌具备强大的适应能力，为青枯菌的遗传变异提供了适宜的选择压力。

目前关于番茄青枯病的防治研究主要集中在抗病品种选育、农业防治、生物防治、化学防治等方面。生产上主要依靠农药来防治，然而长期用药会增加青枯菌的抗药性，随之加大用量，造成恶性循环，而且化学农药的长期使用对环境和人体健康均不友好。农业防治可以起到较好的预防作用，却不能有效从根本上阻止病势扩大蔓延。近年来科研工作者将对于青枯病生防菌的筛选和防效评估作为工作重点，然而从小区试验到大田试验仍然会受到土壤微生物、温湿度、栽培条件等的影响，导致不同区域防效差异加大。相比之下选育抗病品种是较为经济、安全、可观的策略，寻找抗病相关基因资源是抗青枯病遗传育种的重要方向之一。

发明内容

本发明的目的在于提供一种从青枯菌中筛选抗青枯病的胞外核酸酶的方法及遗传改良应用，筛选得到的胞外核酸酶RuvC来源于青枯菌自身，可以方便、安全、有效的应用于遗传育种，在一定程度上降低抗性品种抗性丧失的概率。

本发明提供了一种从青枯菌中筛选抗青枯病的胞外核酸酶的方法，包括以下步骤：从青枯菌基因组中筛选与胞外类Holliday Junction结构相关的结合蛋白，得核酸酶；

敲除青枯菌基因组中所述核酸酶的基因，当基因敲除菌的表型发生变化且致病力降低，与野生型菌株的竞争力减弱时，所述核酸酶即为所述抗青枯病的胞外核酸酶RuvC。

优选的，所述青枯菌基因组包括青枯菌模式菌株GMI1000基因组。

优选的，所述敲除的方法包括自然转化法。

优选的，筛选得到所述胞外核酸酶RuvC后，还包括将体外纯化的所述胞外核酸酶RuvC与生物膜混合，验证所述胞外核酸酶RuvC对生物膜的抑制作用。

优选的，所述胞外核酸酶RuvC的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明还提供了利用上述方法筛选得到的抗青枯病的胞外核酸酶的编码基因RuvC在构建抗青枯菌物种中的应用。

优选的，所述构建抗青枯菌物种的方法包括遗传转化。

优选的，所述抗青枯菌物种包括抗青枯菌的植物和微生物。

优选的，所述植物来源于十字花科和茄科。

本发明还提供了一种构建抗青枯菌物种的方法，包括将抗青枯病的胞外核酸酶的编码基因RuvC、表达盒或表达载体转化入目标物种中，构建得到所述抗青枯菌物种；

所述将抗青枯病的胞外核酸酶通过上述方法筛选得到。

有益效果：本发明首先根据青枯菌胞外脱氧核糖核酸(eDNA)的特点从青枯菌基因组中筛选了针对其胞外类Holliday Junction结构的核酸酶；对所述核酸酶进行基因敲除，结果显示敲除后青枯菌的表型发生变化且致病力降低，与野生型菌株的竞争力也减弱，说明筛选得到的抗青枯菌的核酸酶RuvC可能在青枯菌致病过程中发挥一定的功能。实施例中还在体外验证了RuvC的核酸酶活性，发现在体外对生物膜具有降解作用，于是将RuvC在感病番茄品种Money Marker中进行超量表达，转化后的植物具备了一定的抗青枯病能力。结果表明RuvC不仅参与了青枯菌的致病，而且具有抗病育种的应用前景。本发明实施例中，在番茄中超表达RuvC，可显著提高番茄对青枯病的抵抗能力，有利于番茄抗性品种的选育，并且也在拟南芥和烟草中成功表达，且没有影响作物本身正常生长，具有应用于更多作物抗病育种的潜力。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为RuvC的结构预测结果图(AlphaFold structure prediction)；

图2为pBlueScript SK+载体的质粒图谱；

图3为目的基因RuvC敲除结果图，其中A：PCR扩增结果图；B：菌落表型；C：生长曲线；

图4为△ruvc相关生长特性结果图，其中A：△ruvc胞外多糖水平降低；B：△ruvc形成更多生物膜；

图5为△ruvc对番茄感病品种的致病能力检测结果；

图6为△ruvc体外生物膜染色成像与定量分析结果图；

图7为RuvC体外纯化与生物膜处理结果图；

图8为RuvC在感病番茄毛根中超量表达后对植物抗青枯病能力的影响；

图9为EPS解聚酶phiAP1_43、RLS2_66在MoneyMarker毛根中表达后性状；

图10为exDNaseDor51_gp29在毛根中表达后性状；

图11为在GMI1000基因组数据库中检索到的类HollidayJunction结构相关结合蛋白；

图12为植物超量表达载体pCAMBIA2300图谱；

图13为青枯菌基因回补载体pBBR1-MCS-HA图谱。

具体实施方式

本发明所述青枯菌基因组优选包括青枯菌模式菌株GMI1000基因组。本发明利用所述GMI1000基因信息均来自Ralstonia solanacearumsp.(inra.fr)数据库。

本发明所述的与胞外类Holliday Junction结构相关的结合蛋白均来自NCBI或Ralstonia solanacearumsp.(inra.fr)数据库。由于类Holliday Junction结合蛋白包括整合宿主因子(IHF)与组蛋白样蛋白(HU)两个亚家族，分别对两个亚家族的同源基因在上述数据库中进行了检索和比对共得到了六个相关的结合蛋白(图11)。

本发明得到所述核酸酶后，优选敲除所述核酸酶基因，验证所述核酸酶的胞外核酸酶活性，所述敲除优选包括自然转化法。本发明所述自然转化法优选包括设计引物克隆RuvC的上下游片段，up、down长度分别约600bp，PCR扩增后电泳并回收，up、down分别连接在带有Spec抗性片段的pBlueScript SK+载体上，得到pBlueScript SK-up-Spec-dn；转化至MG1061(JM110)，微量提取质粒DNA，双酶切验证正确后，取正确的载体进行质粒中提纯化，中提后的质粒用RuvC-up-FP的酶切位点KpnI大量酶切回收后待用。

本发明所用的植物超量表达载体骨架为pCAMBIA2300(图12)，实验室前期在pCAMBIA2300原始质粒的基础上利用SalI/EcoRI双酶切连接了CaMV 35s promoter：MCS-HA-NOS terminator阅读框，获得了pCAMBIA2300-35s:MCS-HA载体；对于目的基因的克隆首先在pCAMBIA2300-35s:MCS-HA的基础上利用BamHI/StuI对载体进行双酶切线性化，然后通过网站SignaIP 5.0(SignalP-5.0-Services-DTU Health Tech)预测了番茄SlPR1的信号肽序列，将信号肽序列与候选基因RuvC的全长序列连接在线性化的pCAMBIA2300-35s:MCS-HA上构成超量表达载体的pCAMBIA2300-35s:SlPR1-RuvC-HA，利用农杆菌电击转化的方法将构建正确的质粒转入农杆菌中待用，pCAMBIA2300-35s:MCS-HA转入发根农杆菌作为番茄毛根转化的对照。

本发明将上述基因敲除菌与野生型菌株进行表型、致病力以及竞争力对比，如基因敲除菌的表型发生变化且致病力降低，与野生型菌株的竞争力减弱，证明所敲除的基因即为抗青枯病的胞外核酸酶RuvC。

本发明在确定所述胞外核酸酶RuvC后，优选还包括将体外纯化的所述胞外核酸酶RuvC与生物膜混合，验证所述胞外核酸酶RuvC对生物膜的抑制作用。由于RuvC是一种胞外核酸酶，可以通过体外纯化验证其活性，将体外纯化的RuvC蛋白处理生物膜，如果RuvC在体外对生物膜有抑制效果，可以利用其靶向降解生物膜的特性，在番茄等寄主植物中超量表达，验证其表达后的植物是否具有抗青枯病能力。

本发明所述胞外核酸酶RuvC在体外对生物膜具有降解作用，其氨基酸序列优选如SEQ ID NO.1所示，其编码基因的核苷酸序列优选如SEQ ID NO.2所示，预测具有如图1所示的结构。

本发明所述构建抗青枯菌物种的方法优选包括遗传转化，本发明对所述遗传转化的具体方法并没有特殊限定，利用本领域的常规方法进行遗传转化，可得到稳定表达的转基因系即可。

本发明所述抗青枯菌物种优选包括抗青枯菌的植物和微生物，所述植物优选来源于十字花科和茄科，如在本发明实施例中，利用遗传转化的方式，将SEQ ID NO.2所示的RuvC基因转化如番茄、拟南芥和烟草中，转化后的植物具备了一定的抗青枯病能力，且没有影响作物本身正常生长，具有应用于更多作物抗病育种的潜力。

所述将抗青枯病的胞外核酸酶通过上述方法筛选得到。

本发明对所述转化的方法并没有特殊限定，利用本领域的常规方法即可。如在本发明实施例中，采用发根农杆菌介导的番茄毛根转化和农杆菌介导的番茄遗传转化，具体的所述发根农杆菌介导的番茄毛根转化，优选包括以下步骤：

1)选取100颗左右饱满健康的Money Marker种子倒入50mL离心管，用75％酒精洗5min，倒掉酒精，用灭菌水清洗种子3次，再用50％次氯酸钠溶液(84消毒液：蒸馏水＝1:1)清洗种子5min，此过程要在超净工作台中进行；倒掉次氯酸钠溶液，用灭菌水清洗种子3次；将清洗过的种子放置在1/2MS培养基表面，在组培室中培养14d左右，至第一片真叶开始长出。

2)将番茄根部切去，用灭菌枪头蘸取表达了目的基因(pCAMBIA2300-35s:SlPR1-RuvC-HA)的发根农杆菌单菌落，将番茄放回1/2MS平板，并在下胚轴基部盖上一层湿润的滤纸；1-2周后，番茄长出新的毛根，用手术刀切去毛根(此时的毛根为假阳性)，将番茄放回1/2MS平板并在下胚轴基部放置一层湿润的滤纸继续生根。

3)在剪掉第一次生长出的毛根后，将幼苗放置在含有抗生素的斜面固体培养基上(培养基上事先铺上一层滤纸)，并在下胚轴伤口处盖上一层湿润的滤纸，一般14-18天可以看到新根长出，另外，应当选用含有pCAMBIA2300-35s:SlPR1-RuvC-HA载体的农杆菌作为对照。

4)选择斜面培养基上番茄的毛根取样进行WesternBlot检测，将阳性苗移植到营养土中，保湿培养。

本发明实施例中所称农杆菌介导的番茄遗传转化，优选包括以下步骤：

1)播种：选取100颗左右饱满健康的Money Marker种子倒入50mL离心管，用75％酒精洗5min，倒掉酒精，用灭菌水清洗种子3次，再用50％次氯酸钠溶液(84消毒液：蒸馏水＝1:1)清洗种子5min，此过程要在超净工作台中进行；倒掉次氯酸钠溶液，用灭菌水清洗种子3次；将清洗过的种子放置在1/2MS培养基表面，在组培室中培养10d左右，长至两片子叶完全展开。

2)制备外植体：在培养皿里放一片滤纸，用无菌ddH₂O将滤纸润湿，将子叶展开的无菌苗取出后，将子叶叶尖、叶柄切除，切成1片外植体，放至KCMS培养基上(培养基上垫一层滤纸)，暗培养2d。

3)准备菌液：从-80℃挑取含目的基因(2300-35s：SlPR1-RuvC-HA)的农杆菌在Kan+Gen抗性LB平板上划线活化，28℃倒置培养，浸染前一天晚上挑取单菌落于2mLKan+Gen抗性液体LB培养基中28℃、190r/min摇床培养12～16h，然后将200μL菌液加入10mLKan+Gen抗性LB培养基，28℃、190r/min摇床培养6～8h。

4)侵染：将活化的菌液倒入15mL离心管中，25℃、4000r/min离心20min，倒掉上清，加入4mL农杆菌悬浮液悬浮菌体(农杆菌悬浮液务必在超净台中打开)；测量菌液OD₆₀₀值，将菌液稀释至OD₆₀₀＝0.1～0.2；在培养皿中加入30mL悬浮菌液，将所有外植体转移至农杆菌悬浮液中，浸染3～4min，浸染过程中轻轻晃动培养皿；倒掉悬浮液，在干净的培养皿里放一片滤纸，将外植体转移到滤纸上，尽快将菌液吸干；在KCMS培养基上铺一层滤纸，将外植体放置在滤纸上，暗环境共培养2d。

5)筛选：将外植体转移至2Z培养基上，每培养皿放90～100片，叶片正面朝上，放组培室中培养，每天至少观察两次，7d后外植体会长大，为保证生长空间足够，此时应将部分外植体转移至新的2Z培养基上，并去除褐化外植体，2Z培养基应12～15d更换一次。

6)继代培养：将在2Z培养基上生长良好的外植体(愈伤组织膨大，并长出不定芽)转至0.2Z培养基中，继代培养15d左右；待不定芽生出叶片时，将外植体叶片部分切掉，只留愈伤组织和不定芽，放至新的0.2Z培养基中继续培养15d左右。

7)生根培养：待不定芽生长至2～3cm时，从根基部切下，转移至生根培养基中诱导生根。

8)移栽：待幼苗不定根生长良好时，取出转化苗，清洗根部培养基，移栽到营养土(国产土：蛭石＝1:1)中，盖上盖子保湿1周左右，揭盖后正常管理，每个植株取两片小叶圆片，液氮速冻磨碎后加入50μL2×SDS loading buffer(已加入β-mercaptoethanol和DTT)，95℃金属浴10min，12000r/min离心15min，取上清15μL进行WesternBlot检测蛋白表达，培养有目的蛋白表达的植株进行扩繁。

为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的一种从青枯菌中筛选抗青枯病的胞外核酸酶的方法及遗传改良应用进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。

在本发明实施例中，所用的试材如非特殊说明均为本领域的常见市售产品。

1、植物材料

番茄(Solanum lycopersicum)，主要使用番茄感病品种Money Maker。

2、载体与菌株

番茄转基因植物构建所用的植物表达载体pCAMBIA2300(购买于Abcam)；蛋白纯化用大肠杆菌表达载体pGST-MCS(改造自pGEX，购买于Sigma-Aldrich)；基因敲除载体pBlueScriptSK+(购买于AgilentTechnologies)；基因回补载体pBBR1-MCS-HA(由KennethPeterson实验室构建)；

用于原核表达的BL21(Escherichia coli)、载体构建的MG1061(Escherichiacoli)、烟草、番茄基因表达的GV3101(Agrobacterium tumefaciens)购于武汉市柏维诺&绿日生物科技有限公司，用于番茄毛根基因表达的MSU440(Agrobacterium tumefaciens)来自中国科学院上海植物逆境生物学研究中心Alberto Macho实验室，用于致病力接种和基因敲除的GMI1000(Ralstonia solanacearum)。

3、主要试剂：

Taq、Pfu DNA Polymerase、Pfu Buffer、dNTPs和蛋白酶K等试剂采购于全式金生物技术公司；金牌Mix TSE101采购于擎科生物技术公司，限制性内切酶和T4连接酶采购于纽英伦(NEB)生物技术公司；柱式DNA回收试剂盒采购于上海生工生物工程公司；异丙醇、无水醇、氯仿等无机盐和有机溶剂采购于国药集团有限公司；培养基中的蛋白胨、酪蛋白水解物采购自OXOID公司。HA Western Blot抗体购于Roche公司，货号12013819001，用1×PBST+5％Milk稀释2000倍配制。

4、主要培养基：

CPG培养基：细菌蛋白胨No.210g，酸水解酪蛋白1g，葡萄糖5g，溶于1L ddH₂O，121℃灭菌20min。固体培养基需要另加15g琼脂粉。

BG培养基：色氨酸10g，葡萄糖2.5g，酸水解酪蛋白1g，溶于1L ddH₂O，121℃灭菌20min。固体培养基需要另加15g琼脂粉。

MM培养基：(NH₄)₂SO₄ 0.5g，KH₂PO₄ 3.4g，FeSO₄0 .125mg，1M KOH调节至pH＝7.0，溶于1L ddH₂O，121℃灭菌20min，灭菌后加入20％甘油与5M MgSO₄使用。固体培养基需要另加15g琼脂粉。

SMM半固体培养基：色氨酸0.1g，葡萄糖2.5g、EDTA-2Na 38mg、磷酸盐缓冲液10mL、琼脂3.5g，溶于1L ddH₂O，121℃灭菌20min。其中磷酸盐缓冲液(200mL)：K₂HPO₄ 2.354g、KH₂PO₄，pH调至7.0。

1/2MS培养基：MS Salt 2.15g，MES 0.5g，溶于800mL ddH₂O，用5M KOH调节pH至5.8，蔗糖5.0g，定容至1L。固体培养基需要另加8g琼脂粉。

KCMS培养基(预培养、共培养培养基)：大量元素(20X)50mL，微量元素(200X)5mL，铁盐(200X)5mL，肌醇(20mg/mL)5mL，维生素B1(1mg/mL)1.3mL，2,4-D(1mg/mL)200μL，KH₂PO4(100mg/mL)2mL，KT(1mg/mL)100μL，蔗糖30.0g，调至pH＝5.8，ddH₂O定容至1L，琼脂7.4g，121℃高压灭菌30min。

2Z培养基(筛选培养基)：大量元素(20X)50mL，微量元素(200X)5mL，铁盐(200X)5mL，有机物(200X)5mL，蔗糖30.0g，调至pH＝5.8，ddH₂O定容至1L，琼脂7.4g，121℃高压灭菌30min，温度冷却至60℃时加入IAA(1mg/mL)100μL，玉米素(1mg/mL)2mL，卡那霉素(100mg/mL)1mL，头孢(300mg/mL)1.2mL。

0.2Z培养基(继代培养基)：大量元素(20X)50mL，微量元素(200X)5mL，铁盐(200X)5mL，有机物(200X)5mL，蔗糖30.0g，调至pH＝5.8，ddH₂O定容至1L，琼脂7.4g，121℃高压灭菌30min，温度冷却至60℃时加入玉米素(1mg/mL)200μL，卡那霉素(100mg/mL)1mL，头孢(300mg/mL)1.2mL。

生根培养基：大量元素(20X)50mL，微量元素(200X)5mL，铁盐(200X)5mL，有机物(200X)5mL，IBA(1mg/mL)2mL，蔗糖30.0g，琼脂7.4g，调至pH＝5.8，ddH₂O定容至1L，121℃高压灭菌30min，温度冷却至60℃时加入卡那霉素(100mg/mL)500μL，头孢(300mg/mL)1.2mL。

5、主要仪器：

电击转化仪(Eppendorf Eporator，德国Eppendorf)，PCR仪(Mastercyclernexus，德国Eppendorf)，离心机(5810R，德国Eppendorf)，震荡培养箱(MQL-61R，旻泉)，植物生长箱(HP1500GS-B，瑞华)，电泳仪(EPS 600，上海天能)，天平(JY5002，上海舜宇恒平)，超净工作台(DL-CJ-2NDI，北京东联哈尔)，水浴锅(XMTD6000，北京长风)，凝胶成像仪(ChemiDocXRS+，美国BIO-RAD)，单反相机(B700，日本尼康)，超微量分光光度计(DS-11，北京倍辉)，酶标仪(SPARK，瑞士TECAN)，紫外可见分光光度计(UV1300，上海美析仪器)，激光共聚焦显微镜(N-STORM,日本Nikon)。

实施例1目的基因RuvC的敲除

设计RuvC(RSc0503)的上下游片段，up、down片段长度均在600bp左右。分别设计up、down片段的上下游引物RuvC-up-FP-KpnI(SEQ ID NO.3，5′-CGGGGTACCAGCAGAACGTGCGCCTG-3′)、RuvC-up-RP-EcoRI(SEQ ID NO.4，5′-CCGGAATTCCAGGCGACAGTCTACGCCT-3′)、RuvC-down-FP-BamHI(SEQ ID NO.5，5′-CGCGGATCCGAGCGCTCCCCAAACG-3′)、RuvC-down-RP-XbaI(SEQ ID NO.6，5′-TGCTCTAGAGCGCGATGATCTCGGAC-3′)进行相应的PCR扩增。PCR反应体系：GMI1000 gDNA 1μL，金牌Mix45 μL，引物各2μL。PCR反应程序：98℃预变性3min；98℃变性30s；55℃退火30s；72℃延伸45s；共35个循环；72℃末次延伸10min；12℃保存10min。

将up、down片段分别连在pBlueScript SK+载体(图2)上，up、down分别采用限制性内切酶分子克隆的思路连于spec抗性片段的两侧，转化至MG1061(JM110)，微量提取质粒DNA，酶切测序验证正确后，取正确的载体进行质粒中提纯化，中提后的质粒用up-FP的酶切位点KpnI大量酶切回收线性化敲除载体。

野生型菌株GMI1000在BG平板上活化，挑取单菌落于液体MM(Minimal Medium)培养基中28℃摇培，培养好后加入线性化敲除载体的回收产物混合，混合后的菌液涂布在0.45μm的微孔滤膜上，28℃培养48h。48h后滤膜上长出了菌脓，用无菌水冲下菌脓涂在spec抗性的BG平板上，长出单菌落后在含有spec的液体BG培养基中传代培养三代，进行菌液PCR验证。PCR鉴定包括以下部分：原基因的全长片段、spec抗性片段、青枯菌鞭毛蛋白Rs-flic。

RuvC的全长序列来自Ralstonia solanacearum sp.(inra.fr)数据库，利用Primer Premier5软件设计了RuvC基因的全长克隆引物RsRuvC-FLFP-SpeI(SEQ ID NO.7，5′-CGGACTAGTATGCGCATCCTCGGCATCG-3′)、RsRuvC-FLRP-StuI(SEQ ID NO.8，5′-AAAAGGCCTGCCGACCAGCCGGCCG-3′)进行PCR反应。PCR反应体系：Ralstonia solanacearumDNA 1μL，10xTaq Buffer 1μL，25mM MgCl₂ 1μL，10mM dNTP 0.1μL，引物各0.1μL，Taq0.1uL。PCR反应程序：95℃预变性3min；95℃变性30s；60℃退火30s；72℃延伸30s；共35个循环；72℃末次延伸10min；12℃保存10min。

为了验证Spec抗性片段是否在青枯菌基因组上正确的位置发生了替换，利用Primer Premier 5软件设计了Spec抗性片段的引物Spec-FP(SEQ ID NO.9，5′-ATGCGAACCACTTCATCC-3′)、Spec-RP(SEQ ID NO.10，5′-GATGTTGCGATACTTCGC-3′)。利用RuvC-up-FP-KpnI和Spec-RP去扩增RuvC-up+Spec片段，PCR反应体系：Ralstoniasolanacearum DNA 1μL，10x Taq Buffer 1μL，25mM MgCl₂ 1μL，10mM dNTP0.1μL，引物各0.1μL，Taq 0.1μL。PCR反应程序：95℃预变性3min；95℃变性30s；56℃退火30s；72℃延伸2min；共35个循环；72℃末次延伸10min；12℃保存10min。

最后为了避免敲除转化子污染，利用青枯菌种特异性引物Rs-flic验证转化子是否为青枯菌。Rs-flic的全长序列来自Ralstonia solanacearum sp.(inra.fr)数据库，利用Primer Premier 5软件设计了Rs-flic的验证引物Rsol-fliC-FP(SEQ ID NO.11，5′-GAACGCCAACGGTGCGAACT-3′)、Rsol-fliC-RP(SEQ ID NO.12，5′-GGCGGCCTTCAGGGAGGTC-3′)进行PCR反应。PCR反应体系：Ralstonia solanacearum DNA 1μL，10x Taq Buffer 1μL，25mM MgCl₂ 1μL，10mM dNTP 0.1μL，引物各0.1μL，Taq 0.1uL。PCR反应程序：95℃预变性3min；95℃变性30s；56℃退火30s；72℃延伸30s；共35个循环；72℃末次延伸10min；12℃保存10min。

PCR结果如图3所示，△ruvc#7、#8无法扩增出和GMI1000相同的条带；成功扩增出了up+spec抗性片段和鞭毛蛋白Rs-flic，说明#7、#8的原始基因片段成功被spec片段替换且不存在菌株污染问题(图3中A)。

将野生型菌株GMI1000和△ruvc#7、#8用无菌水稀释至OD₆₀₀＝10^-6lg(1/trans)，均匀涂在CPG+TTC+spec平板上，28℃培养3～5d，观察细菌平板表型，△ruvc#7、#8的菌落相比GMI1000明显变小且流动性减弱(图3中B)。同时在CPG液体培养基中分别培养原始OD₆₀₀为0.05的GMI1000和△ruvc#7、#8菌液，每种菌株设置至少三个技术重复，每隔5～6h测量OD₆₀₀并绘制生长曲线，结果证明△ruvc的生长速率并未受到影响(图3中C)。

实施例2：△ruvc相关生长特性研究

胞外多糖水平检测：挑取野生型菌株GMI1000和△ruvc#7、#8单菌落，于2mLCPG液体培养基中28℃，190r/min过夜培养14h～16h；调整菌液OD₆₀₀为1，取50μL菌液加入CPG液体培养基至终体积为5mL，28℃，190r/min培养48h；室温下5000r/min离心15min，去除菌体；取100μL上清液与200μL乙酰丙酮-Na₂CO₃溶液混合，加入200μL ddH₂O，95℃金属浴10min，冷却；加入400μL无水乙醇和200μL对二甲氨基苯甲醛溶液，最后加入900μL无水乙醇，震荡混匀，室温静置20min，测定溶液在525nm波长下的吸光度。结果如图4中A所示，△ruvc#7、#8产生EPS的水平均显著降低。

生物膜形成能力检测：离心收集培养好的细菌菌体，用新鲜的CPG培养基重悬，调整OD₆₀₀至0.1，加入细胞培养板中用透气膜密封，28℃静置孵育3d。将培养液沿孔壁吸出，使用100μL无菌ddH₂O清洗孔板2次，晾干。每孔用100μL甲醇固定10min，然后吸出多余的甲醇，室温风干。在室温下用200μL0.1％(W/V)结晶紫染色15～20min，将多余的结晶紫吸出，孔板再用200μL无菌水冲洗。附着的结晶紫溶解在200μL95％乙醇中，37℃30min溶解，使用酶标仪测定590nm的吸光度。

测定结果如图4中B所示，敲除RuvC后菌株在体外反而形成了更多生物膜。

实施例3：△ruvc对番茄感病品种的致病能力检测

对实施例1获得的△ruvc敲除突变体，进行△ruvc的基因回补，以pBBR1-MCS-HA载体(图13)为骨架，克隆RuvC自身启动子和全长序列，RuvC的启动子及全长序列来自Ralstonia solanacearum sp.(inra.fr)数据库，利用Primer Premier 5软件设计了RuvCPromoter+gene的引物RsRuvCpro_FP：(SEQ ID NO.13，5′-TAAAGGGAACAAAAGCTGAGGCGCAGAACGCGGGC-3′)、RsRuvC-HA-RP(SEQ ID NO.14，5′-TGGAACGTCGTATGGGTAGCCGACCAGCCGGCCG-3′)，PCR反应体系：GMI1000 gDNA 1μL，金牌Mix45μL，引物各2μL。PCR反应程序：98℃预变性3min；98℃变性30s；55℃退火30s；72℃延伸1min；共35个循环；72℃末次延伸10min；12℃保存10min。利用同源重组的方式将PCR反应获得的片段重组在pBBR1-MCS-HA载体上，同源重组体系：pBBR1-MCS-HA载体1μL、RuvC Promoter+gene片段3μL、5x CE II Buffer 2μL、Exnase II 1μL、ddH₂O 3μL。将构建成功的pBBR1-pro:RuvC-HA质粒电击转化转入△ruvc-7青枯菌感受态细胞，将电击转化后的细胞涂布在BG+抗生素+TTC的平板上筛选，3～5d后长出成熟的青枯菌单菌落，挑取单菌落活化后，Western Blot检测，利用HA抗体成功检测到了回补菌株中RuvC的蛋白表达(图5中A)，说明RuvC成功做到了互补。

自然灌根接种：挑取野生型菌株GMI1000和△ruvc#7、#8单菌落于2mL CPG液体培养基中28℃，190r/min摇床培养14～16h；取300μL菌液加入到30mLCPG液体培养基中28℃，190r/min扩大培养10～12h；将菌液收入50mL离心管中，4000r/min离心去上清，加等体积无菌水重悬菌体，测OD₆₀₀值，并加水稀释至OD₆₀₀值为0.1；选取生长4周的植株进行接种，沿土表根部灌入15ml青枯菌菌液，每种菌株接种6～8个重复。将接种后的植株放置于28℃，RH99％，12h光照/12h黑暗的光照培养箱中保湿培养，每日观察植物发病情况(图5中B)。

根据植株叶片萎蔫程度分为5个发病等级：0级，无萎蔫症状；1级，1％～25％叶片萎蔫；2级，26％～50％叶片萎蔫；3级，51％～75％叶片萎蔫；4级，76％～100％叶片萎蔫，计算并记录发病率和病情指数(图5中C和D)，接种后5d，取茎部样本进行细菌生长量的计数，结果显示△ruvc-7接种后的细菌生长量显著低于野生型GMI1000，而回补菌株接种的植物内部细菌生长量于GMI1000没有显著差异(图5中E)。

其中N0，N1，N2，N3，N4表示发病等级分别为0，1，2，3，4的植株数。

敲除突变体适应性接种：将△ruvc#7、#8菌液与野生型菌株GMI1000菌液等量混合，稀释至OD₆₀₀为0.01；选取生长4周的的植株剪去第1片真叶，沿伤口处进行叶柄接种，每株植物的叶柄接种2μL的混合菌液；3d后分离茎部的青枯菌，稀释涂布在CPG平板上，统计每种菌落的数量与每种菌株占细菌生长总数的百分比，△ruvc#7、#8在植株中的细菌生长均显著低于GMI1000，意味着△ruvc的适应性更弱，竞争力下降(图5中F)。

实施例4：△ruvc体外生物膜染色成像与定量分析

在细胞培养玻片中培养野生型菌株GMI1000和△ruvc#7、#8生物膜，28℃培养3d，每24h更换一次培养基，生物膜成熟后去除多余的培养基，用核酸荧光染料LIVE/DEADBaclight^TM Bacterial Viability Kit染色，封片后置于激光共聚焦显微镜下观察。将获得后的图像用COMSTAT软件进行分析，得到生物膜生物量、覆盖率、平均厚度、平均扩散距离等指标，比较野生型菌株GMI1000生物膜与△ruvc#7、#8生物膜在共聚焦显微镜下的表型和各项指标的差异。

结果如图6所示，△ruvc#7、#8都形成了更厚的生物膜(图6中A)，通过定量分析发现虽然△ruvc的生物量与GMI1000相比差异较小(图6中B)，但是△ruvc#7、#8覆盖面积(图6中C)和平均厚度分布(图6中D)均显著高于GMI1000。

实施例5：RuvC体外纯化与生物膜处理

将RuvC全长基因连接于GST标签载体，酶切测序验证成功后将质粒转入大肠杆菌BL21，先进行少量诱导表达，留下成功诱导表达的大肠杆菌菌株。将成功少量诱导的菌液在LB液体培养基中扩大培养，37°培养至OD₆₀₀＝0.92，加入终浓度为0.25mM的IPTG，低温诱导；诱导结束后超声破碎至菌液变澄清，菌液破碎结束离心保留上清液用GSTbeads低温吸附，吸附结束后用1×GST Solution Buffer洗脱，共洗脱了两次，第一次洗脱的浓度为14.2mg/mL，第二次洗脱后的浓度为3.3mg/mL(图7中A)。

将洗脱后的蛋白分别用0.25mg/ml、0.5mg/ml、1mg/ml、2mg/ml的终浓度去处理细胞孔板中培养的青枯菌生物膜，37℃孵育处理，处理结束后除去多余的培养物质，结晶紫法测定生物膜含量(图7中B)，当添加了0.5mg/ml的RuvC蛋白后生物膜含量便显著降低(图7中C)。

实施例6：RuvC在感病番茄毛根中超量表达后对植物抗青枯病能力的影响

在1/2MS无菌平板上播种番茄感病品种Money Marker，竖直培养12～14d，至刚开始冒出真叶时，沿着下部茎部横向切断番茄幼苗，用横切面蘸取能够成功表达RuvC基因的发根农杆菌(MSU440)单菌落，蘸取后置于1/2MS平板生长第一代毛根，6～7d后新根长出，此时多为假阳性，切去第一代的毛根转为抗性1/2MS平板继续生根，第二代毛根长出后移至Jiffypot营养土中，取适量根部进行WesternBlot检测蛋白表达(图8中A)，取有正确表达的阳性植株进行培养，培养至番茄四片真叶长出后接种OD₆₀₀稀释到0.01的GMI1000新鲜菌液，每日统计观察发病情况(图8中B)与病情指数(图8中C)，接种后5d取番茄茎部样品，稀释涂布在CPG平板上进行细菌计数，2～3d后统计细菌生长情况，接种结果显示超量表达RuvC的植物接种GMI1000后，病情指数显著低于GMI1000，存活率明显提高(图8中D)，植物体内的细菌生长量也显著减少(图8中E)。

对比例1

利用与实施例6相同的方法，将几种EPS解聚酶、exDNases分别在感病番茄品种Money Marker毛根中进行超量表达，取检测到正确蛋白表达的植株进行移栽、培养后接种GMI1000，观察发病情况。

结果显示，EPS解聚酶phiAP1_43、RLS2_66在Money Marker毛根中表达后(图9中A)，发病程度与GMI1000相比没有显著差异(图9中B)，转化后的番茄发病病情指数没有降低，甚至在接种后期超过了GMI1000(图9中C)，接种后5d统计番茄茎部的细菌生长量也没有显著差异(图9中D)。

exDNaseDor51_gp29在毛根中表达后也没有明显的抗青枯病表型，exDNase RusA的发病有减弱的趋势(图10中B)，通过统计平均病情指数发现oxRusA的病情指数略低于GMI1000，oxDor51_gp29病情指数与GMI1000没有显著差异(图10中C)，接种后5d统计番茄茎部的细菌生长量发现无论是Dor51_gp29还是RusA，细菌生长量与GMI1000相比都没有降低(图10中D)。说明exDNase Dor51_gp29在番茄毛根中表达后没有抗青枯病的效果，RusA虽然有微弱的抗青枯病趋势，但是效果不如RuvC显著。

尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

Claims

1.一种从青枯菌中筛选抗青枯病的胞外核酸酶的方法，其特征在于，包括以下步骤：从青枯菌基因组中筛选与胞外类Holliday Junction结构相关的结合蛋白，得核酸酶；

敲除青枯菌基因组中所述核酸酶的基因，当基因敲除菌的表型发生变化且致病力降低，与野生型菌株的竞争力减弱时，所述核酸酶即为所述抗青枯病的胞外核酸酶RuvC，所述胞外核酸酶RuvC的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述青枯菌基因组包括青枯菌模式菌株GMI1000基因组。

3.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述敲除的方法包括自然转化法。

4.根据权利要求1所述方法，其特征在于，筛选得到所述胞外核酸酶RuvC后，还包括将体外纯化的所述胞外核酸酶RuvC与生物膜混合，验证所述胞外核酸酶RuvC对生物膜的抑制作用。

5.利用权利要求1～4任一项所述方法筛选得到的抗青枯病的胞外核酸酶的编码基因RuvC在构建抗青枯菌番茄中的应用。

6.根据权利要求5所述应用，其特征在于，所述构建抗青枯菌番茄的方法包括遗传转化。

7.一种构建抗青枯菌番茄的方法，其特征在于，包括将抗青枯病的胞外核酸酶的编码基因RuvC、表达盒或表达载体转化入目标物种中，构建得到所述抗青枯菌番茄；

所述将抗青枯病的胞外核酸酶通过权利要求1～4任一项所述方法筛选得到。