CN111349592B - 一种产孢培养基和细菌芽孢的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种细菌芽孢的制备方法。该方法是利用活化培养基和种子培养基培养细菌,接种于产孢培养基,35‑37°C、150‑200 rpm振荡培养20‑24 h,在培养液中加入0.02%(v:v)triton x‑100继续培养40‑60 min,获得大量高纯度芽孢。本发明通过对产孢培养基配方、培养条件及营养体处理的探索,有力解决了常规芽孢制备过程需要时间长,步骤繁琐,芽孢质量不能保障的问题。与本领域已知的方法相比,本发明的芽孢制备方法可在短时间内获得大量高纯度芽孢,且不影响芽孢的形态、萌发率和耐热性基本特性。对开发基于芽孢形式的各种生物制剂,降低生产成本,增加生产效益,确保产品质量具有重要应用价值。

Description

一种产孢培养基和细菌芽孢的制备方法
技术领域
本发明属于芽孢制备技术领域,具体涉及一种细菌芽孢的制备方法。
背景技术
芽孢是某些细菌在生长发育后期,由于环境中营养的缺乏或有害代谢产物的过多积累,使其在细胞内形成一个圆形或者椭圆形、厚壁、含水量极低、抗逆性极强的休眠体。芽孢是整个生物界抗热、抗化学药物、抗辐射等抗逆性最强的生物体之一。研究细菌芽孢有着重要的理论和实践意义,具体表现为:
1.不同细菌的芽孢具有不同的特点,芽孢的有无、形态、大小和着生位置等是细菌分类和鉴定的依据或重要参考。
2.芽孢具有较强的耐热性,将含菌悬浮液进行热处理,杀死所有营养细胞,可以筛选出形成芽孢的细菌种类,有利于提高产芽孢菌种的筛选效率。
3.芽孢对低温、干燥等不良环境有很强的抵抗力,可以保持生命力达数十年之久,在实验室是保存菌种的好材料,有利于菌种的长期保藏。
4.许多产芽孢细菌是强致病菌。例如炭疽芽孢杆菌、肉毒梭菌和破伤风梭菌等,是否能杀灭一些代表菌的芽孢是衡量和制定各种消毒灭菌标准的主要依据。
5.有些产芽孢细菌可伴随产生有用的产物,如苏云金芽孢杆菌在产生芽孢的同时,可以产生一种双锥形的结晶内含物,称为伴孢晶体,这是一种蛋白质毒素,具有高度专一性,可以杀死某些昆虫(特别是鳞翅目)的幼虫,而对其他动物与植物完全没有毒性。因此,它们便成为一种理想的生物杀虫剂,这种杀虫剂的生产,并不需将蛋白质分离出来,只需培养大量细菌,在其形成芽孢并产生晶体时收获、干燥,做成粉剂即可。
6.由于芽孢独特的产生方式,其形成和发育受到严格的遗传调控,所以芽孢成为研究形态发生和遗传控制的理想材料。
开发芽孢快速制备方法,不仅对于研究芽孢形成机理、芽孢抗逆机制具有重要的理论意义,而且对于开发基于芽孢形式的各种生物制剂,如BT杀虫剂,杀菌剂等,降低实验和生产成本、保障农作物和人体健康具有重要的应用价值。
目前已经报道的芽孢制备方法存在的问题是时间长,一般用DSM培养基培养菌体,转接量为1:10 (v:v),需要37 °C处理48 h,从菌株活化到制备出完全成熟的芽孢需要90h-100 h,且往往需要复杂繁琐的操作,如4 °C冷水饥饿过夜处理,反复2-3次,并且要进行差速离心等,增加实验或企业生产过程中的时间和经济成本。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于针对上述现有技术的不足,提供一种产孢培养基和细菌芽孢的制备方法。该方法通过对培养基配方和细菌培养条件的探索,很好的解决了现有方法制备的产孢时间长、操作步骤繁琐、芽孢质量不能保障的问题,提高了生产效益,进而缩减了实验和企业生产成本,促进科学和经济发展。采用该方法制备芽孢所需时间短,约54 h ,芽孢产率高达95%左右,芽孢纯度不小于98%,显微镜观察和芽孢萌发率测试,该方法不影响芽孢形态及耐热性。
为了实现上述技术效果,本发明采用的技术方案是:
一种细菌芽孢制备中应用的产孢培养基,所述的产孢培养基组成为:每1000 mL蒸馏水中加入的酵母粉0.3-0.5 g,蛋白胨0.3-0.5 g,葡萄糖0.8-1 g,K2HPO4 5-7 g,KH2PO44-5 g,MgSO4·7H2O 0.01-0.1 g,NaCl 0.05-0.2 g,CaCl2 0.01-0.05 g,FeSO4 0.0005-0.001 g,调节pH 为7.0-7.5。
优选地,所述的产孢培养基组成为:每1000 mL蒸馏水中加入的酵母粉0.3g,蛋白胨0.4g,葡萄糖0.85g,K2HPO4 5.6g,KH2PO4 4.5g,MgSO4·7H2O 0.08g,NaCl 0.15g,CaCl20.04g,FeSO4 0.0005g,调节pH 为7.2。
一种应用所述的产孢培养基的细菌芽孢的制备方法,包括步骤如下:
(1)、菌种活化:将细菌在活化培养基划线培养;
(2)、菌种培养:挑取单菌落接种于种子培养基,培养至对数期获得种子菌液,菌体浓度为2×107-6×108CFU/mL;
(3)、芽孢产生:种子菌液接种于所述产孢培养基继续培养;
(4)、裂解营养体:在所述产孢培养液中加入triton x-100,裂解其中没有形成芽孢的营养体;
(5)、芽孢收集及保存。
优选地,在所述步骤(1)中,所述的活化培养基组成为:每1000 mL蒸馏水加入酵母粉4-5 g,蛋白胨8-10 g,NaCl 8-10 g,琼脂粉18-20 g,pH7.0-7.5。
优选地,在所述步骤(1)中,所述的活化培养基组成为:每1000 mL蒸馏水加入酵母粉5 g,蛋白胨8.5g,NaCl 9g,琼脂粉18.5g,pH 7.5。
优选地,在所述步骤(1)中,培养温度为28-30 °C,培养时间为12-16 h。
优选地,所述步骤(2)中种子培养基组成为:每1000 mL蒸馏水加入酵母粉4-5 g,蛋白胨8-10 g,NaCl 8-10 g, pH 7.0-7.5。
优选地,所述步骤(2)中培养条件为28-30 °C,150-200 rpm,培养时间为10-12 h。
优选地,所述步骤(3)中培养条件为35-37 °C,150-200 rpm,培养时间为20-24 h。
优选地,所述步骤(4)中的营养体裂解条件为37 °C,150-200 rpm,裂解时间为40-60 min。
现有技术中LB培养基培养对照:Purification of spores on step gradientsof Renografin,in Molecular Biological Methods for Bacillus,pp.391-450,1990
现有技术芽孢制备步骤繁琐,时间较长,包括菌种活化16 h,菌种扩大培养3 h,冷处理20 h,热处理48 h,芽孢制备总时间共需约90 h。具体时间及操作步骤如下:(1)菌株活化,从-80℃冰箱取出甘油保存菌种,LB培养基上划线,37 °C培养16 h。(2)挑取单菌落接种于25 mL DSM培养基中,150 rpm 37 °C培养2-3 h,至OD值在0.45-0.60间。(3)按照1:10比例接种于250 mL DSM培养基内,37 °C、150 rpm 摇菌48 h。(4)10000xg离心10 min,弃掉上清悬浮液。(5)4 °C无菌水悬浮,10000xg离心10 min,重复1次,过夜放置至4 °C冰箱。(6)重复第4步和第5步。(7)加入50% Renografin试剂,10000xg离心30 min,后加入4 °C无菌水7000xg离心10 min。(8)重复第7步3次。(9)无菌水悬浮4 °C保存。
本发明与现有技术相比具有以下优点:
营养胁迫是细菌产生芽孢的外部环境信号,细菌一般在营养不足的情况下产生芽孢,如细菌生长后期营养耗尽或生长环境中营养严重缺乏,产生大量芽孢以渡过不良环境条件。由于本发明中产孢培养基含有细菌生长所必须的基本营养元素,但碳、氮源又严重不足,仅为细菌正常培养基如LB中含量的十分之一左右,细菌在此培养基中生长由于无法获取充足的营养,这一环境条件诱发细菌芽孢形成相关基因的表达,促使菌体产生大量芽孢。triton x-100是一种非离子型表面活性剂,能溶解脂质使细胞膜通透性增加,有助于细菌及体内芽孢囊裂解,大大缩短芽孢释放这一过程。根据此原理,避免使用冷处理、热处理等耗时且经济成本较高的工艺,本发明芽孢制备步骤简单,菌种活化、获得种子菌液后,只需要接种于产孢培养基继续培养20-24 h,之后加入triton x-100裂解未形成芽孢的营养体即可。
本发明芽孢制备时间.较短,菌种活化12-16 h,菌种培养10-12 h,芽孢产生20-24h,裂解营养体40-60 min,芽孢收集8-10 min,芽孢制备总时间共需43-53 h。
附图说明
图1为芽孢形态显微观察结果;
图2为不同菌株所产芽孢的耐热性测试结果。
具体实施方式
实施例1
将蜡样芽孢杆菌Bacillus cereus (ATCC 14579)划线于活化培养基,培养温度为30 °C,培养时间为12 h。所述活化培养基组成为:酵母粉5 g,蛋白胨10 g,NaCl 10 g,琼脂粉20 g,蒸馏水1000 mL,pH7.2。
挑取单菌落接种于种子培养基,30 °C、150 rpm培养10 h至稳定期获得种子菌液,菌体浓度为5×107CFU/mL。所述种子培养基组成为:酵母粉5 g,蛋白胨10 g,NaCl 10 g,蒸馏水1000 mL,pH7.2。
种子菌液按照1:50(v/v)的比例接种于产孢培养基继续培养,获得大量芽孢。所述的培养条件为35 °C、200 rpm、24 h,所述的产孢培养基组成为:酵母粉0.5 g,蛋白胨0.5g,葡萄糖1 g,K2HPO4 5 g,KH2PO4 5 g,MgSO4·7H2O 0.01 g,NaCl 0.05 g,CaCl2 0.01 g,FeSO4 0.001 g,蒸馏水1000 mL,pH 7.2。
加入triton x-100,使其终浓度为0.02%(v:v),裂解其中没有形成芽孢的营养体。所述的营养体裂解条件为37 °C,200 rpm,裂解时间为40 min。
芽孢收集、干燥及保存。所述的收集条件为将营养体裂解后的产孢培养液7000rpm离心10 min,弃上清。所述的保存条件为4 °C保存。
芽孢形态观察及产率、纯度计算:在加入0.02%的triton x-100裂解营养体25 min时取样进行芽孢染色,制作涂片并干燥固定,先用5%孔雀绿水溶液染色5 min,再用0.5%番红溶液复染2 min,制片干燥后用油镜观察,芽孢呈绿色,细菌呈红色,芽孢形成未释放的为红色杆状菌内含有绿色芽孢。图中颗粒状的为绿色芽孢,杆形为细菌本体,以现有技术的LB培养的菌体作为对照进行芽孢染色和显微观察。可以看出,图1A-B显示该方法处理与LB培养基常规培养下所形成的芽孢形态没有区别。说明该方法不影响蜡样芽孢杆菌Bacillus cereus (ATCC 14579)芽孢的基本形态。
在产孢培养基培养24 h后取样进行芽孢染色,油镜观察取10个视野分别计数计算平均值。芽孢产率=(M1+M3)/(M1+M2+M3) ×100%
其中M1为芽孢数,M2为细菌数,M3为已经形成但未完全释放的芽孢数。
在加入0.02%的triton x-100裂解营养体40 min后取样进行芽孢染色,油镜观察取10个视野分别计数计算平均值。芽孢纯度=N1/(N1+N2+N3) ×100%
其中N1为芽孢数,N2为细菌数,N3为已经形成但未完全释放的芽孢数。
芽孢耐热性测试:在加入0.02%的triton x-100裂解营养体40 min后离心收集芽孢,用无菌水重悬浮并梯度稀释至10-6倍后分成等量的两份,一份直接涂布平板计数为A;另一份80 °C水浴10 min后再涂布平板计数为B;芽孢萌发率=(B/A)×100%。以现有技术中LB培养获得的芽孢萌发率为对照,每组采用三个平行样本。图2显示该方法获得的芽孢萌发率与对照没有显著性差异,说明该方法不影响蜡样芽孢杆菌Bacillus cereus (ATCC 14579)芽孢的耐热性。
本实施例通过对培养基配方和培养条件的探索,有力的解决了常规方法制备的芽孢所需时间长、过程繁琐的问题,降低了实验和企业生产成本,该方法制备的蜡样芽孢杆菌芽孢共需时间47 h,芽孢产率为98%,芽孢纯度92%,镜检及耐热性实验表明所制备的芽孢形态、耐热性不变。
实施例2
将枯草芽孢杆菌B.subtilisBGSC 168划线于活化培养基,培养温度为28 °C,培养时间为16 h。所述活化培养基组成为:酵母粉4 g,蛋白胨8 g,NaCl 8 g,琼脂粉18 g,蒸馏水1000 mL,pH7.0。
挑取单菌落接种于种子培养基,28 °C、180 rpm培养12 h至稳定期获得种子菌液,菌体浓度为5×108CFU/mL。所述种子培养基组成为:酵母粉4 g,蛋白胨8 g,NaCl 8 g,蒸馏水1000 mL,pH7.0。
种子菌液按照1:50 (v/v) 的比例接种于产孢培养基继续培养,使菌体产生大量芽孢。所述的培养条件为37 °C、150 rpm、20 h,所述的产孢培养基组成为:酵母粉0.4 g,蛋白胨0.3 g,葡萄糖0.8 g,K2HPO4 6 g,KH2PO4 4 g,MgSO4·7H2O 0.05 g,NaCl 0.1 g,CaCl20.03 g,FeSO4 0.0008 g,蒸馏水1000 mL,pH 7.0。
加入triton x-100,使其终浓度为0.02% (v/v),裂解其中没有形成芽孢的营养体。所述的营养体裂解条件为37 °C,200 rpm,裂解时间为50 min。
芽孢收集及保存。所述的收集条件为将营养体裂解后的产孢培养液8000 rpm离心8 min,弃上清。所述的保存条件为4 °C保存。
芽孢形态观察及产率、纯度计算:在加入0.02%的triton x-100裂解营养体30 min时取样进行芽孢染色,制作涂片并干燥固定,先用5%孔雀绿水溶液染色5 min,再用0.5%番红溶液复染2 min,制片干燥后用油镜观察,芽孢呈绿色,细菌呈红色,芽孢形成未释放的为红色杆状菌内含有绿色芽孢。以现有技术中LB培养的菌体作为对照进行芽孢染色和显微观察。颗粒状为芽孢,杆形为细菌本体,图1C-D显示该方法处理与现有技术中对照的LB培养基常规培养下所形成的芽孢形态没有区别。说明该方法不影响枯草芽孢杆菌B.subtilisBGSC168芽孢的基本形态。
在产孢培养基培养20 h后取样进行芽孢染色,油镜观察取10个视野分别计数计算平均值。芽孢产率=(M1+M3)/(M1+M2+M3) ×100%
其中M1为芽孢数,M2为细菌数,M3为已经形成但未完全释放的芽孢数。
在加入0.02%的triton x-100裂解营养体50 min后取样进行芽孢染色,油镜观察取10个视野分别计数计算平均值。芽孢纯度=N1/(N1+N2+N3) ×100%
其中N1为芽孢数,N2为细菌数,N3为已经形成但未完全释放的芽孢数。
芽孢耐热性测试:在加入0.02%的triton x-100裂解营养体40 min后离心收集芽孢,用无菌水重悬浮并梯度稀释至10-6倍后分成等量的两份,一份直接涂布平板计数为A;另一份80 °C水浴10 min后再涂布平板计数为B;芽孢萌发率=(B/A)×100%。以LB培养或得的芽孢萌发率为对照,每组采用三个平行样本。图2显示该方法获得的芽孢萌发率与对照没有显著性差异,说明该方法不影响枯草芽孢杆菌B.subtilisBGSC168芽孢的耐热性。
本实施例通过对培养基配方和培养条件的探索,有力的解决了常规方法制备的芽孢所需时间长、过程繁琐,芽孢纯度不高的问题,降低了实验和企业生产成本,该方法制备的枯草芽孢杆菌芽孢共需时间49 h,芽孢产率为93%,芽孢纯度100%,镜检及耐热性实验表明所制备的芽孢形态、耐热性不变。
实施例3
将蜡样芽孢杆菌B. cereus 0-9(保藏号为CCTCC No.M209041)划线于活化培养基,培养温度为29 °C,培养时间为14 h。所述活化培养基组成为:酵母粉4.5 g,蛋白胨9 g,NaCl 9 g,琼脂粉19 g,蒸馏水1000 mL,pH7.5。
挑取单菌落接种于种子培养基,29 °C、200 rpm培养11 h至稳定期获得种子菌液,菌体浓度为5×107CFU/mL。所述种子培养基组成为:酵母粉4.5 g,蛋白胨9 g,NaCl 9 g,蒸馏水1000 mL,pH7.5。
种子菌液按照1:50(v/v)的比例接种于产孢培养基继续培养,获得大量芽孢。所述的培养条件为36 °C、180 rpm、22 h,所述的产孢培养基组成为:酵母粉0.3 g,蛋白胨0.4g,葡萄糖0.9 g,K2HPO4 7 g,KH2PO4 4.5 g,MgSO4·7H2O 0.1 g,NaCl 0.15 g,CaCl2 0.05g,FeSO4 0.0005 g,蒸馏水1000 mL,pH 7.5。
加入triton x-100,使其终浓度为0.02% (v/v),裂解其中没有形成芽孢的营养体。所述的营养体裂解条件为37 °C,200 rpm,裂解时间为45 min。
芽孢收集及保存。所述的收集条件为将营养体裂解后的产孢培养液7000 rpm离心10 min,弃上清。所述的保存条件为4°C保存。
芽孢形态观察及产率、纯度计算:在加入0.02%的triton x-100裂解营养体20 min时取样进行芽孢染色,制作涂片并干燥固定,先用5%孔雀绿水溶液染色5 min,再用0.5%番红溶液复染2 min,制片干燥后用油镜观察,芽孢呈绿色,细菌呈红色,芽孢形成未释放的为红色杆状菌内含有绿色芽孢。以现有技术LB培养的菌体作为对照进行芽孢染色和显微观察。颗粒状为芽孢,杆形为细菌本体,图1E-F显示该方法处理与LB培养基常规培养下所形成的芽孢形态没有区别。说明该方法不影响蜡样芽孢杆菌0-9芽孢的基本形态。
在产孢培养基培养22 h后取样进行芽孢染色,油镜观察取10个视野分别计数计算平均值。芽孢产率=(M1+M3)/(M1+M2+M3) ×100%
其中M1为芽孢数,M2为细菌数,M3为已经形成但未完全释放的芽孢数。
在加入0.02%的triton x-100裂解营养体50 min后取样进行芽孢染色,油镜观察取10个视野分别计数计算平均值。芽孢纯度=N1/(N1+N2+N3) ×100%
其中N1为芽孢数,N2为细菌数,N3为已经形成但未完全释放的芽孢数。
芽孢耐热性测试:在加入0.02%的triton x-100裂解营养体40 min后离心收集芽孢,用无菌水重悬浮并梯度稀释至10-6倍后分成等量的两份,一份直接涂布平板计数为A;另一份80 °C水浴10 min后再涂布平板计数为B;芽孢萌发率=(B/A)×100%。以LB培养或得的芽孢萌发率为对照,每组采用三个平行样本。图2显示该方法获得的芽孢萌发率与对照没有显著性差异,说明该方法不影响蜡样芽孢杆菌B. cereus 0-9芽孢的耐热性。
本实施例通过对培养基配方和培养条件的探索,有力的解决了常规方法制备的芽孢所需时间长、过程繁琐的问题,降低了实验和企业生产成本,该方法制备的蜡样芽孢杆菌芽孢共需时间48 h,芽孢产率为95%,芽孢纯度99%,镜检及耐热性实验表明所制备的芽孢形态、耐热性不变。
以上所述,仅是本发明的较佳实施例,并非对本发明做任何限制,凡是根据发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效替换,均仍属于本发明技术方案的保护范围内。

Claims (10)

1.一种细菌芽孢制备中应用的产孢培养基,其特征在于,所述的产孢培养基组成为:每1000 mL蒸馏水中加入的酵母粉0.3-0.5 g,蛋白胨0.3-0.5 g,葡萄糖0.8-1 g,K2HPO4 5-7g,KH2PO4 4-5 g,MgSO4·7H2O 0.01-0.1 g,NaCl 0.05-0.2 g,CaCl2 0.01-0.05 g,FeSO40.0005-0.001 g,调节pH 为7.0-7.5。
2.如权利要求1中的一种细菌芽孢制备中应用的产孢培养基,其特征在于,所述的产孢培养基组成为:每1000 mL蒸馏水中加入的酵母粉0.3g,蛋白胨0.4g,葡萄糖0.85g,K2HPO4 5.6g,KH2PO4 4.5g,MgSO4·7H2O 0.08g,NaCl 0.15g,CaCl2 0.04g,FeSO4 0.0005g,调节pH为7.2。
3.一种应用权利要求1中所述的产孢培养基的细菌芽孢的制备方法,其特征在于,包括步骤如下:
(1)、菌种活化:将细菌在活化培养基划线培养;所述细菌为蜡样芽孢杆菌B. cereus0-9,保藏号为CCTCC No.M209041或蜡样芽孢杆菌Bacillus cereus ,保藏号为ATCC14579;
(2)、菌种培养:挑取单菌落接种于种子培养基,培养至对数期获得种子菌液,菌体浓度为2×107-6×108CFU/mL;
(3)、芽孢产生:种子菌液接种于所述产孢培养基继续培养;
(4)、裂解营养体:在所述产孢培养液中加入triton x-100,裂解其中没有形成芽孢的营养体;
(5)、芽孢收集及保存。
4.如权利要求3所述的细菌芽孢的制备方法,其特征在于,在所述步骤(1)中,所述的活化培养基组成为:每1000 mL蒸馏水加入酵母粉4-5 g,蛋白胨8-10 g,NaCl 8-10 g,琼脂粉18-20 g,pH7.0-7.5。
5.如权利要求3所述的细菌芽孢的制备方法,其特征在于,在所述步骤(1)中,所述的活化培养基组成为:每1000 mL蒸馏水加入酵母粉5 g,蛋白胨8.5g,NaCl 9g,琼脂粉18.5g,pH7.5。
6.如权利要求3所述的细菌芽孢的制备方法,其特征在于,在所述步骤(1)中,培养温度为28-30 °C,培养时间为12-16 h。
7.如权利要求3所述的细菌芽孢的制备方法,其特征在于,所述步骤(2)中种子培养基组成为:每1000 mL蒸馏水加入酵母粉4-5 g,蛋白胨8-10 g,NaCl 8-10 g, pH 7.0-7.5。
8.如权利要求3所述的细菌芽孢的制备方法,其特征在于,所述步骤(2)中培养条件为28-30 °C,150-200 rpm,培养时间为10-12 h。
9.如权利要求3所述的细菌芽孢的制备方法,其特征在于,所述步骤(3)中
培养条件为35-37 °C,150-200 rpm,培养时间为20-24 h。
10.如权利要求3所述的细菌芽孢的制备方法,其特征在于,所述步骤(4)中的营养体裂解条件为37 °C,150-200 rpm,裂解时间为40-60 min。
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