CN105441519B - 基于pET22b基因工程菌株的抗菌蛋白表达、提取和纯化方法 - Google Patents

基于pET22b基因工程菌株的抗菌蛋白表达、提取和纯化方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于pET22b基因工程菌株的抗菌蛋白表达、提取和纯化方法，以基因工程菌株ZSM‑12(pET‑22b‑TasA‑BL21)为对象，建立一种抗菌蛋白高表达方法；并且建立一种蔗糖和溶菌酶同时处理从细胞周质空间提取抗菌蛋白方法以及一种改进的HIS柱纯化抗菌蛋白方法。应用本发明，抗菌蛋白表达率达34.2％，菌体破壁后的抗菌蛋白含量高、杂蛋白少，HIS柱纯化后蛋白纯度为电泳一条带，蛋白含量为67.8mg/l，蛋白收率为90.8％。纯化后的抗菌蛋白具有抑制番茄灰霉病、叶霉病、玉米茎基腐病、小麦赤霉病菌和水稻稻曲病菌生长功能。

Description

基于pET22b基因工程菌株的抗菌蛋白表达、提取和纯化方法
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，涉及一种基于pET22b基因工程菌株的抗菌蛋白表达、提取和纯化方法。
背景技术
pET22b是商品化的原核表达载体，在N端融合一段疏水信号肽，能够将目的蛋白转运到细胞周质空间。由于大肠杆菌周质空间中的蛋白量不到胞内蛋白量的4％，分泌到周质空间，目的蛋白占的比例高，且杂蛋白少，利于目的蛋白分离纯化，然而，由于此载体的蛋白表达量及从细胞周质中高效提取蛋白技术的限制致使该载体的应用较少。
发明内容
本发明的目的之一是以基因工程菌株ZSM-12(pET-22b-TasA-BL21)为对象，建立一种抗菌蛋白高表达方法；目的之二是建立一种蔗糖和溶菌酶同时处理从细胞周质空间提取抗菌蛋白方法，目的之三是建立一种改进的HIS柱纯化抗菌蛋白方法。应用本发明，抗菌蛋白表达率达34.2％，菌体破壁后的抗菌蛋白含量高、杂蛋白少，HIS柱纯化后蛋白纯度为电泳一条带，蛋白含量为67.8mg/l，蛋白收率为90.8％。纯化后的抗菌蛋白具有抑制番茄灰霉病、叶霉病、玉米茎基腐病、小麦赤霉病菌和水稻稻曲病菌生长功能。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
一种基于pET22b基因工程菌株的抗菌蛋白表达、提取和纯化方法，具体实施步骤如下：
一、抗菌蛋白表达
取-70℃冷冻保藏的基因工程菌株ZSM-12(pET-22b-TasA-BL21)划线接种于含氨苄青霉素的LB固体平板上，37℃温箱培养18h，挑较大菌落转接于5ml含氨苄青霉素的LB液体培养液中(氨苄青霉素浓度为50μg/ml)，37℃，170r/min震荡培养18h，然后按2％接种量接种到新鲜100ml含氨苄青霉素的LB液体培养基中(氨苄青霉素浓度为50μg/ml)，30℃170r/min震荡培养至OD600＝1.2-1.8，加入IPTG至0.05-0.1mM，15-20℃震荡培养4h。
二、抗菌蛋白提取
取100ml诱导表达后的菌液4℃5000r/min离心10min，收集菌体，加入10ml蛋白提取液(20mMTris.Cl，2.0mMEDTA，20％蔗糖，溶菌酶50mg/L，pH8.0)，室温5min，10000r/min离心10min，收集沉淀，悬浮于2ml(20mM Tris.Cl，2.0mMEDTA，pH8.0)缓冲液中，即得抗菌蛋白提取液。
三、抗菌蛋白纯化
取1ml Ni-His·Bind悬液至于5ml离心管中，10000r/min离心1min，用1.5-2.0ml无菌去离子水洗涤2次，加入1.5-2.0ml结合缓冲液平衡His柱，加入0.5-1ml蛋白提取液充分混合，室温5-10min，10000rpm/min离心2min，弃上清，用3-4ml结合缓冲液洗涤4次，用3-4ml漂洗缓冲液洗涤4次，每次洗涤后用滤纸吸干残液，去除杂蛋白，用0.5-1ml洗脱液洗脱目的蛋白2次，即得纯化后的抗菌蛋白。
本发明利用pET22b表达载体和宿主菌E.coli BL21获得的含抗菌蛋白TasA基因的工程菌株ZSM-12(pET-22b-TasA-BL21)，通过改变培养和诱导条件建立一种高表达抗菌蛋白的IPTG低温诱导方法，采用蔗糖和溶菌酶处理建立从细胞周质空间提取抗菌蛋白方法，采用改进的HIS柱纯化技术分离纯化抗菌蛋白。本发明具有如下优点：
1、本发明建立了基于pET22b表达载体的基因工程菌高表达抗菌蛋白的诱导方法，该方法与现有方法有显著区别，即在菌体密度较高时(0D600＝1.2-1.8)加入低浓度IPTG(0.05-0.1mM)在低温条件(15-20℃)下诱导4-6h，蛋白表达率为34.2％；
2、本发明建立了蔗糖和溶菌酶同时处理的从细胞周质空间提取目的蛋白方法，该方法提取的目的蛋白含量高、杂蛋白量少，利于目的蛋白纯化；
3、本发明建立了小量抗菌蛋白纯化技术，操作过程加以改进，增加洗脱体积和次数，使分离纯化的抗菌蛋白纯度较高，为电泳一条带，纯化蛋白收率和蛋白含量较高，分别为90.8％和67.8mg/l。纯化后的抗菌蛋白能够抑制5种植物病原真菌菌丝生长。
4、本发明获得的抗菌蛋白具有抑制番茄灰霉病、叶霉病、玉米茎基腐病、小麦赤霉病菌和水稻稻曲病菌生长功能。
附图说明
图1为基因工程菌株诱导表达后的SDS-PAGE结果，1：诱导后的蛋白样品；2：未诱导蛋白样品；M:蛋白质分子量标准，→为表达蛋白；
图2为不同IPTG浓度诱导后的SDS-PAGE结果，M:蛋白质分子量标准；1：未诱导；2：IPTG浓度0.1mM；3:IPTG浓度0.5mM；4：IPTG浓度0.05mM；
图3为不同温度诱导后的SDS-PAGE电泳图，M:蛋白质分子量标准；1：未诱导；2：20℃；3:15℃；
图4为不同方法提取蛋白的SDS-PAGE结果，1：蔗糖加溶菌酶处理；2、3：未诱导热处理；4：诱导后热处理；
图5为纯化蛋白SDS-PAGE结果，1：未诱导；2：诱导后未纯化；3：HIS柱纯化；M：蛋白分子量标准；
图6为纯化蛋白抑菌效果(玉米茎基腐病菌)；
图7为纯化蛋白抑菌效果(水稻稻曲病菌)；
图8为纯化蛋白抑菌效果(番茄灰霉病菌)；
图9为纯化蛋白抑菌效果(番茄叶霉病菌)；
图10为纯化蛋白抑菌效果(小麦赤霉病菌)。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的技术方案作进一步的说明，但并不局限于此，凡是对本发明技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖在本发明的保护范围中。
具体实施方式一：本实施方式提供了一种基于pET22b基因工程菌株的抗菌蛋白表达方法，具体实施步骤如下：
1、抗菌蛋白基因的表达
取-70℃冷冻保藏的基因工程菌株ZSM-12(pET-22b-TasA-BL21)划线接种于含氨苄青霉素的LB固体平板上，37℃温箱培养18h，挑较大菌落转接于5ml LB液体培养液中(含氨苄青霉素浓度为50μg/ml)，37℃，170r/min震荡培养18h，然后按2％接种量接种到新鲜100ml LB液体培养基中(含氨苄青霉素浓度为50μg/ml)，30℃170r/min震荡培养至OD600＝1.2-1.8，加入IPTG至0.2mM，30℃震荡培养4h，取1ml菌液4℃5000r/min离心10min，收集菌体，加入20μl无菌水和蛋白上样缓冲液，100℃10min，4℃10000r/min离心10min，取上清液进行SDS-PAGE电泳，结果在32kD左右有一条明显蛋白带，含量为15.6％。(图1)。
2、抗菌蛋白基因表达条件的优化
2.1IPTG浓度的优化
按上述方法活化菌体，按2％接种量接种到新鲜100ml LB液体培养基中(含氨苄浓度为50μg/m)，30℃170r/min震荡培养至OD600＝1.2-1.8，加入IPTG至0.05，0.1mM和0.5mM，30℃震荡培养4h，取1ml菌液按上述方法制备蛋白样品进行SDS-PAGE电泳，结果在32kD左右有一条明显蛋白带，IPTG浓度对目的蛋白含量有影响，低浓度IPTG(0.05和0.1mM)处理组目的蛋白条带粗且量，表达率高，分别为18.9％和17.4％，高浓度IPTG处理组目的蛋白表达率低，为9.8％(图2)。
2.2诱导温度的优化
按上述方法活化菌体，按2％接种量接种到新鲜100ml LB液体培养基中(含氨苄浓度为50μg/ml)，30℃170r/min震荡培养至OD600＝1.2-1.8，加入IPTG至0.05mM，15℃和20℃震荡培养4h，取1ml菌液按上述方法制备蛋白样品进行SDS-PAGE电泳，结果在32kD左右有一条明显蛋白条带，温度对目的蛋白含量有影响，15℃诱导处理目的蛋白条带粗且量，用凝胶成像***(Biomaging Systems，USA)的LabWorks软件测定目的蛋白的含量为34.2％，20℃诱导处理目的蛋白含量为31.8％(图3)。
具体实施方式二：本实施方式提供了一种基于pET22b基因工程菌株的抗菌蛋白提取方法，具体实施步骤如下：
取100ml诱导表达后的菌液4℃5000r/min离心10min，收集菌体，加入10ml蛋白提取液(20mMTris.Cl 2.0mMEDTA，20％蔗糖，溶菌酶50mg/L，pH8.0)，室温5min，10000r/min离心10min，收集沉淀，悬浮于2ml(20mM Tris.Cl，2.0mMEDTA PH8.0)缓冲液中，取10μl进行SDS-PAGE电泳，在32kD左右有一条明显蛋白条带，与加热处理组比较，杂蛋白条带减少且含量降低，目的蛋白浓度较高，用蛋白定量试剂盒测得蛋白总量为218.1mg/l，用凝胶成像***(Biomaging Systems，USA)的LabWorks软件测定目的蛋白占34.2％，目的蛋白含量为74.6mg/l(图4)。
具体实施方式三：本实施方式提供了一种基于pET22b基因工程菌株的抗菌蛋白分离纯化方法，具体实施步骤如下：
取500ml诱导表达后的菌液按上述方法提取出抗菌蛋白粗提物之后，用His-Binding-resin柱分离纯化抗菌蛋白。取1ml Ni-His·Bind悬液至于5ml离心管中,10000r/min离心1min，用1.5ml无菌去离子水洗涤2次，加入1.5ml结合缓冲液平衡His柱，加入1ml蛋白提取液充分混合，室温5-10min，10000rpm/min离心2min，弃上清，用3ml结合缓冲液洗涤4次，用3ml漂洗缓冲液洗涤4次，每次洗涤后用滤纸吸干残液，去除杂蛋白，用1ml洗脱液目的蛋白2次，取10μl进行SDS-PAGE电泳，结果在32KD处有唯一一条蛋白带，用蛋白定量试剂盒测得纯化蛋白含量为67.8mg/L，蛋白收率为90.8％(图5)。
具体实施方式四：本实施方式提供了一种基于pET22b基因工程菌株的抗菌蛋白抑菌活性测试方法，具体实施步骤如下：
采用纸片法测定纯化后抗菌蛋白的抑菌活性，以番茄灰霉病菌、叶霉病菌、水稻稻曲病菌、玉米茎基腐病菌、小麦赤霉病菌为指示菌，先接种病原菌于PDA平板上，28℃培养2-3d，在菌落边缘放置无菌滤纸片，在滤纸片上加入10μl蛋白溶液，无菌PBS缓冲液做对照，28℃培养2-3d，观察有无抑菌带，结果表明，该抗菌蛋白能够抑制5种植物病原真菌菌丝生长(图6-10)。

Claims (10)

1.一种基于pET22b基因工程菌株的抗菌蛋白表达方法，其特征在于所述抗菌蛋白表达方法步骤如下：
取-70℃冷冻保藏的基因工程菌株pET-22b-TasA-BL21划线接种于含氨苄青霉素的LB固体平板上，37℃温箱培养18h，挑较大菌落转接于5ml含氨苄青霉素的LB液体培养液中，37℃，170r/min震荡培养18h，然后按2％接种量接种到100ml含氨苄青霉素的LB液体培养基中，30℃170r/min震荡培养至OD600＝1.2-1.8，加入IPTG至0.05-0.1mM，15-20℃震荡培养4h。
2.根据权利要求1所述的基于pET22b基因工程菌株的抗菌蛋白表达方法，其特征在于所述氨苄青霉素浓度为50μg/ml。
3.一种基于pET22b基因工程菌株的抗菌蛋白提取方法，其特征在于所述抗菌蛋白提取方法步骤如下：
(1)抗菌蛋白表达：取-70℃冷冻保藏的基因工程菌株pET-22b-TasA-BL21划线接种于含氨苄青霉素的LB固体平板上，37℃温箱培养18h，挑较大菌落转接于5ml含氨苄青霉素的LB液体培养液中，37℃，170r/min震荡培养18h，然后按2％接种量接种到100ml含氨苄青霉素的LB液体培养基中，30℃170r/min震荡培养至OD600＝1.2-1.8，加入IPTG至0.05-0.1mM，15-20℃震荡培养4h；
(2)抗菌蛋白提取：取100ml诱导表达后的菌液4℃5000r/min离心10min，收集菌体，加入10ml蛋白提取液，室温5min，10000r/min离心10min，收集沉淀，悬浮于2ml缓冲液中，即得抗菌蛋白提取液。
4.根据权利要求3所述的基于pET22b基因工程菌株的抗菌蛋白提取方法，其特征在于所述氨苄青霉素浓度为50μg/ml。
5.根据权利要求3所述的基于pET22b基因工程菌株的抗菌蛋白提取方法，其特征在于所述蛋白提取液的成分为：20mMTris.Cl，2.0mMEDTA，20％蔗糖，溶菌酶50mg/L，pH8.0。
6.根据权利要求3所述的基于pET22b基因工程菌株的抗菌蛋白提取方法，其特征在于所述缓冲液的成分为：20mM Tris.Cl，2.0mMEDTA，pH8.0。
7.一种基于pET22b基因工程菌株的抗菌蛋白分离纯化方法，其特征在于所述抗菌蛋白纯化方法步骤如下：
(1)抗菌蛋白表达：取-70℃冷冻保藏的基因工程菌株pET-22b-TasA-BL21划线接种于含氨苄青霉素的LB固体平板上，37℃温箱培养18h，挑较大菌落转接于5ml含氨苄青霉素的LB液体培养液中，37℃，170r/min震荡培养18h，然后按2％接种量接种到100ml含氨苄青霉素的LB液体培养基中，30℃170r/min震荡培养至OD600＝1.2-1.8，加入IPTG至0.05-0.1mM，15-20℃震荡培养4h；
(2)抗菌蛋白提取：取100ml诱导表达后的菌液4℃5000r/min离心10min，收集菌体，加入10ml蛋白提取液，室温5min，10000r/min离心10min，收集沉淀，悬浮于2ml缓冲液中，即得抗菌蛋白提取液；
(3)抗菌蛋白纯化
取1ml Ni-His·Bind悬液至于5ml离心管中，10000r/min离心1min，用1.5-2.0ml无菌去离子水洗涤2次，加入1.5-2.0ml结合缓冲液平衡His柱，加入0.5-1ml蛋白提取液充分混合，室温5-10min，10000rpm/min离心2min，弃上清，用3-4ml结合缓冲液洗涤4次，用3-4ml漂洗缓冲液洗涤4次，每次洗涤后用滤纸吸干残液，去除杂蛋白，用0.5-1ml洗脱液洗脱目的蛋白2次，即得纯化后的抗菌蛋白。
8.根据权利要求7所述的基于pET22b基因工程菌株的抗菌蛋白分离纯化方法，其特征在于所述氨苄青霉素浓度为50μg/ml。
9.根据权利要求7所述的基于pET22b基因工程菌株的抗菌蛋白分离纯化方法，其特征在于所述蛋白提取液的成分为：20mMTris.Cl，2.0mMEDTA，20％蔗糖，溶菌酶50mg/L，pH8.0。
10.根据权利要求7所述的基于pET22b基因工程菌株的抗菌蛋白分离纯化方法，其特征在于所述缓冲液的成分为：20mM Tris.Cl，2.0mMEDTA，pH8.0。
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