CN103201293A - 评估和鉴定或发展条件活性治疗蛋白的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供发展或选择不良副作用降低的治疗蛋白的方法和所得的蛋白。例如，本发明提供鉴定在一体内环境中比在另一体内环境中表现出更好的活性的条件活性治疗蛋白的体外测定法。所述方法包括以下步骤：a)在期望该活性正常或增强的条件下测试蛋白的活性；b)在期望与正常活性相比活性降低的条件下测试所述蛋白的活性；以及c)将在a)中的活性与b)进行比较，并选择/鉴定与b)相比活性更强的蛋白。选择/鉴定的蛋白即为条件活性蛋白。

Description

评估和鉴定或发展条件活性治疗蛋白的方法
相关申请
本申请要求2010年9月8日提交的Lalitha Kodandapani,Philip LeeSheridan,Harold Michael Shepard,Louis H.Bookbinder以及Gregory I.Frost的美国临时申请序列第61/402,979号的优先权权益，其题目为“METHODSFOR ASSESSING AND IDENTIFYING OR EVOLVING CONDITIONALLYACTIVE THERAPEUTIC PROTEINS AND CONDITIONALLY ACTIVETHERAPEUTIC PROTEINS(评估和鉴定或发展条件活性治疗蛋白的方法和条件活性治疗蛋白)”。
技术领域
本发明提供发展或选择不良副作用降低的治疗蛋白的方法和所得的蛋白。
背景技术
蛋白作为药剂或治疗剂具有治疗广泛多种人类疾病的作用，例如癌症、血友病、贫血以及糖尿病，并且对于许多疾病而言，它们是唯一有效的治疗方案。因此，需要鉴定活性或特性改变或改善的蛋白治疗剂。鉴定或产生此类蛋白是本发明的目的之一。
发明概述
本发明提供鉴定/选择条件活性蛋白的方法。在所述方法中，在期望该活性正常或增强的条件下测试蛋白的活性，并且在期望与正常活性相比活性降低的条件下测试蛋白的活性。可以将在期望该活性正常或增强的条件下的蛋白的活性，与在期望与正常活性相比活性降低的条件下的蛋白的活性进行比较。可以选择和/或鉴定，相比期望与正常活性相比活性降低的条件，在期望该活性正常或增强的条件下活性更大的蛋白。
在所述方法中，与正常活性相比，可以降低期望与正常活性相比活性降低的条件下的蛋白的活性。在所述方法中，除了使蛋白是条件活性的一种条件或多种条件之外，期望该活性正常或增强的条件和期望与正常活性相比活性降低的条件可以是相同的。在本发明的方法中，所测试的活性可以是与蛋白靶标的结合。可以将靶标固定于固相支持物。在本发明的方法中，可以利用免疫测定评估活性。免疫测定包括ELISA免疫测定、异相免疫测定以及均相免疫测定。
在本发明的方法中，期望蛋白活性正常或增强的条件可以模拟疾病微环境，并且期望与正常活性相比活性降低的条件可以模拟健康组织环境。健康组织环境的实例是非肿瘤组织环境，如***环境或健康组织。健康组织的实例是GI道、皮肤、脉管***、血液以及细胞外基质。患病微环境的实例是肿瘤微环境。肿瘤或疾病微环境的pH可以比中性pH低或者比健康组织微环境的pH低。肿瘤或疾病微环境可以包括下述中的一种或多种：血管形成增加、缺氧、pH降低、组织间隙液压增加、标志肿瘤或其他疾病的代谢物或代谢改变。例如，与健康微环境相比，肿瘤或其他疾病微环境的乳酸盐浓度可以升高和/或丙酮酸盐浓度增加。
本发明还提供这样的方法，在所述方法中，与期望与正常活性相比活性降低的条件相比，期望蛋白的活性正常或增强的条件可以包括低于中性的pH和升高的乳酸。
在本发明的方法中，所测试的蛋白可以是治疗蛋白和/或具有在健康组织中表现出不期望的副作用的蛋白。在本发明的方法中，在期望与正常活性相比活性降低的条件下降低蛋白的活性，可以改善或防止不期望的副作用。
在本发明所提供的方法中，可以在存在人血清的情况下，测试蛋白的活性。人血清可以以模拟生理条件的量存在，并且在期望该活性正常或增强的条件下存在的血清的量，可以与在期望与正常活性相比活性降低的条件下存在的血清的量相同。例如，按体积计，可以在存在下述百分比的人血清的情况下实施本发明所提供的方法：至少约或为3%-30%，含3%和30%，或5%-30%，含5%和30%，或5%-25%，含5%和25%，10%-30%，含10%和30%，或15%-30%，含15%和30%，或15%-25%，含15%和25%中的任一浓度的人血清，包括25%或约25%(加减10%)的人血清。
在本发明所提供的方法中，可以在期望该活性正常或增强的条件下和在期望与正常活性相比活性降低的条件下测试多种蛋白的活性。在这个具体方法中，可以在两种条件下测试每种蛋白，并且可以选择在期望该活性正常或增强的条件下比在期望与正常活性相比活性降低的条件下活性更大的任何蛋白。在一些实例中，活性高于预定量或比。例如，活性增强至少5%、10%、15%、20%、25%、35%、50%、100%、2倍、5倍、10倍、20倍或更多。
在本发明所提供的方法中，靶蛋白可以是受体或其结合配体的一部分。靶蛋白的实例是受体，所述受体是肿瘤抗原。例如，靶蛋白Her受体家族的成员，或靶蛋白是EGFR受体或其细胞外结构域。在本发明所提供的方法中，活性受到测试的蛋白(受试蛋白)可以是***或其他疾病的治疗蛋白。在一些实例中，治疗蛋白是抗体、酶、激素、细胞因子或其活性部分，并且在本发明中提及抗体指抗体或其抗原结合片段。在本发明所提供的方法的其他实例中，蛋白可以是治疗蛋白的修饰变体。治疗蛋白的实例是靶受体的配体。在本发明所提供的方法的一些实例中，蛋白含有多聚化结构域，诸如，例如，含有Fc结构域或修饰的Fc结构域的多聚化结构域。在实例性方法中，治疗蛋白是抗体、酶、激素或细胞因子。例如，治疗蛋白是抗体。
在本发明所提供的方法中，在所述方法中受到测试的蛋白可以是选自表5(即本说明书中列举了示例性抗肿瘤抗体的表)所列那些抗肿瘤抗体的抗体。在一些实例中，抗肿瘤抗体在健康组织中表现出不期望的副作用。例如，所述抗体是在健康组织中表现出不期望的副作用的抗EGFR抗体或抗CTLA4抗体。
在本发明所提供的方法的其他实例中，蛋白可以是治疗蛋白的修饰变体。修饰变体可以含有氨基酸取代、***和/或缺失。在一些实例中，测试了变体的集合。在一些实例中，每种变体与野生型或非修饰蛋白和所有其他变体的不同之处在于一个氨基酸。在其他实例中，每种变体含有2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或更多个不同于非修饰的或野生型蛋白的氨基酸。在本发明所提供的方法中，在变体的集合中，在每一改变的位置处的氨基酸，被除了最初氨基酸之外的多达1-19种氨基酸取代。在其他实例中，组氨酸是取代氨基酸，或蛋白中的氨基酸被非碱性或不带电荷的氨基酸取代。可以单独测试每一变异蛋白。例如，可以以高通量模式或自动化方法测试每一变异蛋白。
在本发明所提供的方法中，所选的蛋白可以是条件活性的，从而使得其与在非肿瘤环境中相比，在肿瘤或其他疾病微环境中的活性更强。可以将本发明所提供的方法重复多次，其中在每一次重复中，测试所选的一种或多种蛋白的其他变体，由此使治疗蛋白发展为表现出毒性降低或不良副作用降低。在本发明所提供的方法中，可以通过由含有编码变异蛋白的核酸分子的载体表达，产生所述变异蛋白。
在本发明所提供的方法的一些实例中，所测试的蛋白是在CDR中含有一个或多个氨基酸取代的变异抗体。在具体实例中，沿着蛋白或其所选部分的长度，用多达19种其他氨基酸逐一取代每一氨基酸。在其他实例中，蛋白是抗体，并且所选部分是CDR。
在一实例中，治疗蛋白是抗EGFR抗体，并且降低的不良副作用是与抗体的***暴露相关的降低的皮肤毒性。在本发明所提供的方法的一些实例中，肿瘤或其他疾病微环境的pH约为或为5.8-6.8，并且含5.8和6.8。在其他实例中，所选的蛋白是在这样的肿瘤微环境中优先结合EGFR的抗EGFR抗体，即与正常生理pH7.3-7.4和低于12mM的正常乳酸盐浓度相比，所述所述微环境pH降低为5.8-6.8，并且乳酸盐浓度约为12-20mM。
本发明提供用于鉴定条件活性蛋白的方法，其中所述方法通过以下方式实施：使涂覆了EGFR或EGFR ECD的固相支持物与pH约为7.3-7.4、含有1mM乳酸和约25%人血清的缓冲液接触；使第二副本支持物与pH约为6、含有12-20mM如16.6mM乳酸和约25%人血清的缓冲液接触；用相应的缓冲液(pH6.0或pH7.4)洗涤所述支持物；在具有乳酸和人血清的pH7.4的缓冲液中或在具有乳酸和人血清的pH6.0的缓冲液中将抗EGFR标记的如FLAG标记的标准品结合于相应的支持物；以及通过在相应的缓冲液中添加山羊抗Tag酶如辣根过氧化物酶(HRP)和酶底物，检测抗EGFR与EGFR的结合，以检测或定量抗EGFR与每一支持物的结合。
本发明还提供利用本发明所提供的任何方法选择/鉴定或发展的治疗蛋白。本发明还提供与非修饰的抗体相比表现出降低的皮肤毒性的变异抗肿瘤抗体。本发明还提供与Erbitux相比表现出降低的皮肤毒性的抗EGFR抗体。
本发明提供用于鉴定/选择***且在低pH下比在中性pH更具有活性的治疗蛋白。在所述方法中，在包括低pH的条件下测试所述蛋白的活性，且在包括中性pH的条件下测试所述蛋白的活性。可以将在包括低pH的条件下的所述蛋白的活性，与在包括中性pH的条件下的所述蛋白的活性进行比较。可以选择和/或鉴定在低pH下比在高pH下更具有活性的蛋白。低pH可以是小于7.4的任何pH，例如介于或约介于5.8-6.8之间。中性pH也可以是介于或介于约7.2-7.6之间的任何pH，如7.4。
在所述方法中，包括低pH的条件可以包括选自乳酸盐浓度增加、丙酮酸盐浓度增加以及缺氧的一种或多种条件。例如，包括低pH的条件可以包括选自以下的增加的乳酸盐浓度：10mM至20mM的乳酸或15mM至18mM的乳酸；或至少约或16mM、16.5mM或17mM的乳酸。在所述方法中，包括中性pH的条件可以包括选自以下的乳酸盐浓度：0.5-5mM或0.2mM至4mM的乳酸；或0.5、1、2、3、4或5mM的乳酸，或为或约为0.5、1、2、3、4或5mM的乳酸。
本发明还提供用于鉴定鉴定/选择在肿瘤微环境中比在非肿瘤微环境中更具有活性的治疗蛋白。在所述方法中，在存在于期望该活性的肿瘤微环境而不是非肿瘤环境中的条件下测试所述蛋白，并且在存在于非肿瘤微环境中的条件下测试所述蛋白的活性。可以将在存在于肿瘤微环境中的条件下的蛋白活性，与存在于非肿瘤微环境中的条件下的蛋白活性进行比较。可以选择和/或鉴定与在存在于非肿瘤微环境中的条件下相比，在存在于肿瘤微环境中的条件下活性更强的蛋白，从而鉴定在肿瘤微环境中比在非肿瘤微环境中更具有活性的蛋白。非肿瘤微环境可以是***微环境和/或健康组织，如胃肠(GI)道、皮肤、脉管***、血液或细胞外基质。
除了存在于肿瘤微环境中而不存在于非肿瘤微环境中的一种或多种条件之外，可以在相同的条件下测试在包括低pH的条件下和在包括中性pH的条件下的蛋白活性。存在于肿瘤微环境中的条件的实例包括诸如血管形成增加、缺氧、pH降低、乳酸盐浓度增加、丙酮酸盐浓度增加、组织间隙液压增加以及标志肿瘤的的代谢物或代谢改变的一种或多种特性。
存在于肿瘤微环境中的条件可以包括比中性pH低的pH或比非肿瘤微环境的pH低的pH。例如，存在于肿瘤微环境中的条件可以是低于7.4的pH。在一些实例中，肿瘤的pH约为或为5.8-6.8，含5.8和6.8，并且存在于肿瘤微环境中的条件是pH介于或约介于5.8-6.8之间。存在于肿瘤微环境中的条件可以包括与存在于非肿瘤微环境中的条件相比升高的乳酸盐浓度和/或增加的丙酮酸盐浓度。
存在于期望该活性的肿瘤微环境而不是非肿瘤环境中的、测试蛋白的条件可以包括比中性pH低的pH和与包括存在于非肿瘤微环境中的条件的、测试蛋白的条件相比升高的乳酸浓度。例如，比中性pH低的pH可以介于5.8-6.8之间，含5.8和6.8，或5.8-6.5之间，含5.8和6.5。存在于期望该活性的肿瘤微环境而不是非肿瘤环境中的、测试蛋白的条件可以包括选自以下的增加的乳酸盐浓度：10mM至20mM的乳酸或15mM至18mM的乳酸；或至少约或是16mM、16.5mM或17mM的乳酸。存在于非肿瘤微环境中的、测试蛋白的条件可以包括选自以下的乳酸盐浓度：0.5-5mM或0.2mM-4mM的乳酸；或0.5、1、2、3、4或5mM的乳酸，或约0.5、1、2、3、4或5mM的乳酸。在所述方法的一些实例中，所述蛋白是***的治疗蛋白。在一些实例中，治疗蛋白是抗体、酶、激素、细胞因子或其活性部分。在本文中提到本发明的抗体，包括抗体或其抗原结合片段。在一些实例中，所述治疗蛋白是靶受体的配体和/或抗肿瘤抗体。
用于本发明所提供的方法中的抗肿瘤抗体包括西妥昔单抗(Cetuximab
Figure BDA00003151467300061
曲妥珠单抗(Trastuzumab
Figure BDA00003151467300062
利妥昔单抗(Rituximab
Figure BDA00003151467300063
Figure BDA00003151467300064
贝伐单抗(Bevacizumab
Figure BDA00003151467300065
阿仑单抗(Alemtuzumab帕尼单抗(Panitumumab
Figure BDA00003151467300067
雷珠单抗(Ranibizumab
Figure BDA00003151467300068
Ibritumomab、替伊莫单抗(Ibritumomab tiuxetan)托西莫单抗(Tositumomab)、碘I131托西莫单抗
Figure BDA000031514673000610
卡妥索单抗(Catumaxomab
Figure BDA000031514673000611
吉妥珠单抗、吉妥珠单抗奥唑米星(Gemtuzumab ozogamicin
Figure BDA000031514673000612
阿贝西普(Abatacept(CTLA4-Ig,
Figure BDA000031514673000613
贝拉西普(Belatacept(L104EA29YIg;LEA29Y;LEA))、伊匹单抗(Ipilimumab(MDX-010,MDX-101))、曲美目单抗(Tremelimumab(ticilimumab,CP-675,206))、PRS-010、PRS-050、阿柏西普(Aflibercept(VEGF Trap,AVE005))、伏洛昔单抗(Volociximab(M200))、F200、MORAb-009、SS1P(CAT-5001)、西妥木单抗(Cixutumumab(IMC-A12)),马妥珠单抗(Matuzumab(EMD72000))、尼妥珠单抗(Nimotuzumab(h-R3))、扎鲁目单抗(Zalutumumab(HuMax-EGFR))、奈昔木单抗(Necitumumab)IMC-11F8、mAb806/ch806、Sym004以及mAb-425。在一些实例中，所述抗肿瘤抗体是西妥昔单抗
Figure BDA00003151467300071
本发明所提供的方法可以在体外或体内实施。
在本发明所提供的方法中，可以测试多种蛋白，并且可以选择与中性pH相比在低pH条件下活性更强的蛋白。在本发明所提供的方法中，可以测试多种蛋白，并且可以选择在存在于肿瘤微环境中的条件下比非肿瘤微环境活性更强的蛋白。所述多种蛋白可以包括治疗蛋白的修饰变体，并且可以测试变体的集合。
治疗蛋白可以包括多聚化结构域，且多聚化结构域可以包括Fc结构域或修饰的Fc结构域。治疗蛋白可以是抗体(包括抗肿瘤抗体)、酶、激素或细胞因子。在本发明所提供的方法中，抗肿瘤抗体可以选自西妥昔单抗
Figure BDA00003151467300072
曲妥珠单抗
Figure BDA00003151467300073
利妥昔单抗
Figure BDA000031514673000713
贝伐单抗
Figure BDA00003151467300075
阿仑单抗
Figure BDA000031514673000714
帕尼单抗
Figure BDA00003151467300076
雷珠单抗
Figure BDA00003151467300077
Ibritumomab、替伊莫单抗(Ibritumomab tiuxetan,
Figure BDA00003151467300078
托西莫单抗、碘I131托西莫单抗
Figure BDA00003151467300079
卡妥索单抗
Figure BDA000031514673000710
吉妥珠单抗、吉妥珠单抗奥唑米星阿贝西普(CTLA4-Ig,
Figure BDA000031514673000712
贝拉西普(L104EA29YIg;LEA29Y;LEA)、伊匹单抗(MDX-010,MDX-101)、曲美目单抗(ticilimumab,CP-675,206)、PRS-010、PRS-050、阿柏西普(VEGF Trap,AVE005)、伏洛昔单抗(M200)、F200、MORAb-009、SS1P(CAT-5001)、西妥木单抗(IMC-A12)、马妥珠单抗(EMD72000)、尼妥珠单抗(h-R3)、扎鲁目单抗(HuMax-EGFR)、奈昔木单抗IMC-11F8、mAb806/ch806、Sym004以及mAb-425。
治疗蛋白或多种治疗蛋白的修饰变体，与所述治疗蛋白的非修饰形式相比，可以包括一个氨基酸残基或多个氨基酸残基的取代、***和/或缺失。例如，每一变异蛋白，与所述治疗蛋白的非修饰形式相比，可以含有单个氨基酸取代。每一变异蛋白，与所述变异蛋白如治疗抗体的非修饰形式相比，可以含有2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或更多个氨基酸取代。
在一些实例中，所测试的蛋白是与抗体的非修饰形式相比在互补性决定区(CDR)中包含一个或多个氨基酸取代的变异抗体。
在本发明所提供的方法中，可以测试治疗蛋白的变体，所述变体可以在每一改变的位置包括被多达1-19种除了在所述位置的最初氨基酸以外的其他氨基酸取代的氨基酸，并且每个氨基酸可以沿着所述治疗蛋白或其所选部分的长度被取代。本发明提供修饰蛋白是抗体并且其受到修饰的所选部分是CDR的方法。
取代氨基酸可以选自Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr以及Val，前提条件是取代氨基酸不同于所述治疗蛋白相应位置处的氨基酸。取代氨基酸的实例是组氨酸。在一些实例中，蛋白中的组氨酸被非碱性或不带电荷氨基酸取代。在一些方法中，修饰包括用选自Arg、Asp、Glu、His以及Lys的氨基酸进行的氨基酸取代，在一些实例中，用His进行取代。
在本发明所提供的方法中，可以在例如阵列，包括可寻址阵列中，测试每一变异蛋白，如集合中的变异蛋白。
在本发明所提供的方法中，测试的活性可以是与治疗蛋白的靶蛋白的结合。结合可以利用免疫测定如ELISA来评估。免疫测定的实例是异相免疫测定，所述异相免疫测定可以包括，将靶蛋白固定于固相支持物；使治疗蛋白与靶蛋白接触，其中可检测地标记治疗蛋白；除去未结合的治疗蛋白；以及检测或测量标记的治疗蛋白与靶蛋白的结合。免疫测定可以是均相的，包括使治疗蛋白与靶蛋白接触，其中可检测地标记治疗蛋白；并检测或测量标记的治疗蛋白与靶蛋白的结合。
本发明提供利用细胞表面表达***评估结合活性的方法，所述细胞表面表达***包含在表面表达治疗蛋白的一种或多种细胞。治疗蛋白可以在细胞表面表达，可使靶蛋白与细胞群接触；可以鉴定结合靶蛋白的一种或多种细胞，从而鉴定表现出结合活性的治疗蛋白。可以可检测地标记或可以检测靶蛋白。可以荧光标记或利用荧光标记的第二试剂检测靶蛋白。
利用荧光激活细胞分选术(FACS)，可以检测或测量结合。
可以在利用细胞表面表达***的方法中测试结合活性，所述细胞表面表达***包含表达治疗蛋白的细胞，并且可以选择结合靶蛋白的一种或多种细胞，和选择不结合靶蛋白的一种或多种细胞。可以分离所选的不结合靶蛋白的一种或多种细胞，并使其于细胞培养基中生长，以便产生在表面表达治疗蛋白的第二细胞群。在一些实例中，在条件下测试结合活性，从而使来自第二细胞群的细胞与靶蛋白接触，并且鉴定结合靶蛋白的一种或多种细胞。
附图的简单描述
图1.单克隆抗体
Figure BDA00003151467300091
的序列。图1描绘了
Figure BDA00003151467300092
的序列(SEQID NO:1和2)。图1A描绘了重链的序列。图1B描绘了轻链的序列。可变链加有下划线，且修饰所选的残基以粗体、斜体显示。
详细描述
概要
A.定义
B.方法综述
C.体外生理敏感方法
1.含有靶蛋白的支持物
2.在浓密的结合条件下接触结合生物分子
a.变异蛋白产生
b.抗体变体
示例性的抗体结合分子：抗EGFR抗体
3.肿瘤特异性结合分子的检测和鉴定
D.表达蛋白的方法
1.载体
2.细胞和表达***
a.原核表达
b.酵母
c.昆虫
d.哺乳动物细胞
e.植物
3.纯化
E.实施例
A.定义
除非另有定义，否则本文所用的所有科技术语与本发明所属技术领域技术人员通常所理解的具有相同的涵义。除非另有指出，否则将本文的整个公开所提到的所有专利、专利申请、公开的申请和出版物、GenBank序列、数据库、网站和其他公开的材料通过引用整体并入。在本文的术语由多个定义的情况下，以本部分中的定义为准。如果参考URL或其他测量标示符或地址，应当理解到，这类标示符可以变化，并且互联网上的具体信息可能来来往往，但是通过检索互联网，可以发现等同信息。对其进行参考，证明了这类信息的可利用性和公众传播。
本文所用的条件活性蛋白在一种环境、特别是一种体内环境中，与第二环境相比，更具有活性。例如，条件活性蛋白可以在肿瘤环境中比在非肿瘤环境如皮肤、GI道的非肿瘤环境或其他非肿瘤环境中更具有活性。
本发明所用的治疗蛋白是已经用于治疗患有疾病或疾病状况的个体、可以用于治疗或是用于治疗的候选者的蛋白。例如，用于疗法的候选者是已经用于疗法的治疗蛋白的变体(例如含有氨基酸修饰)。出于本发明的目的，治疗蛋白，包括已经用于治疗、可以用于治疗或是治疗的候选者的蛋白在内，可以用于本发明所述方法实践中，作为测试蛋白来鉴定在一组条件下比在另一在条件下表现出更多活性的治疗蛋白，并因此是治疗活性的。
本文所用的“测试蛋白”、“受试蛋白”“结合分子”、“结合蛋白”或其其他变型，指用于本发明所述方法中的分子或蛋白。本发明所述方法可以使用任何分子或蛋白来鉴定是条件活性的并且与存在于非患病微环境中的一种或多种条件相比在存在于患病微环境(如肿瘤微环境)中的一种或多种条件中表现出活性的蛋白。为了发展条件活性的治疗剂，受试蛋白的实例是治疗蛋白。示例性的受试蛋白列于表3中。
本发明所用的抗体指免疫球蛋白或免疫球蛋白部分，无论其是天然的或部分或全部合成的，如重组产生的，包括其含有免疫球蛋白分子的足以形成抗原结合位点的可变区的至少一部分的任何部分。因此，抗体或其部分包括具有与免疫球蛋白抗原结合位点同源或基本上同源的结合结构域的任何蛋白。例如，抗体指含有两条重链(其可以表示为H和H’)和两条轻链(其可以表示为L和L’)的抗体，其中每一条重链都可以是全长免疫球蛋白重链或其足以形成抗原结合位点的一部分(例如，重链包括但不限于VH链、VH-CH1链、以及VH-CH1-CH2-CH3链)，并且每条轻链都可以是全长轻链或其足以形成抗原结合位点的一部分(例如，轻链可以包括但不限于VL链和VL-CL链)。每一条重链(H和H’)都与每一条轻链(分别为L和L’)配对。通常，抗体最低限度包括所有或至少部分可变重(VH)链和/或可变轻(VL)链。抗体还可以包括所有或部分恒定区。
出于本发明的目的，术语抗体包括全长抗体和其部分，包括抗体片段，如但不限于Fab、Fab'、F(ab’)2、单链Fv(scFv)、Fv、dsFv、双价抗体(diabody)、Fd和Fd’片段、Fab片段、Fd片段以及scFv片段。其他已知的片段包括但不限于scFab片段(Hust et al.,BMC Biotechnology(2007),7:14)。抗体包括任何免疫球蛋白类别的成员，包括IgG、IgM、IgA、IgD以及IgE。
本发明所用的全长抗体是具有两条全长重链(如VH-CH1-CH2-CH3或VH-CH1-CH2-CH3-CH4)和两条全长轻链(VL-CL)以及铰链区的抗体，如抗体分泌B细胞所产生的人类抗体和具有合成产生的相同结构域的抗体。
对于抗体的“其部分”“其片段”，本文所用的抗体片段或抗体部分指全长抗体的任何部分，其小于全长，但是含有足以形成抗原结合位点的抗体可变区的至少一部分(如一个或多个CDR)并且因此保留了全长抗体的结合特异性和/或活性；抗体片段包括全长抗体的酶促处理所产生的抗体衍生物以及合成如重组产生的衍生物。抗体片段的实例包括但不限于Fab、Fab'、F(ab’)2、单链Fv(scFv)、Fv、dsFv、双价抗体、Fd以及Fd’片段(参阅例如Methods in Molecular Biology,Vol207:Recombinant抗体for CancerTherapy Methods and Protocols(2003);Chapter1;p3-25,Kipriyanov)。片段可以包括诸如通过二硫键和/或通过肽连接体而连接在一起的多条链。抗体片段通常含有至少约50个氨基酸并通常含有至少200个氨基酸。
因此，提到“抗体或其足以形成抗原结合位点的部分”表示，抗体或其部分含有足以保留含有所有6个CDR的相应全长抗体的至少一部分结合特异性的VH和VL的至少1个或2个、通常3个、4个、5个或所有6个CDR。通常，足够的抗原结合位点至少需要重链的CDR3(CDRH3)。其通常还需要轻链的CDR3(CDRL3)。如本文所述，本领域技术人员知道并且能够基于卡巴特(kabat)或Chothia编号(参见例如Kabat,E.A.et al.(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest,Fifth Edition,U.S.Departmentof Health and Human Services,NIH Publication No.91-3242，和Chothia,C.et al.(1987)J.Mol.Biol.196:901-917)鉴定CDR。
本发明所用的互补决定区(CDR；也称为高变区)是抗体内决定蛋白对特异性抗原的亲和性和特异性的区域。因此，CDR是结合抗原决定子的抗原可变区内的有限区域。抗体的CDR是已知的或可以基于卡巴特或Chothia编号来确定，这对于本领域技术人员而言是已知的。
本发明所用的，“抗原结合位点”指一个或多个互补决定区(CDR；也称为高变区)所形成的界面。每一个抗原结合位点含有3个来自重链可变区的CDR和3个来自轻链可变区的CDR。抗体分子具有2个抗原结合位点，每个位点都含有重链可变区的部分和轻链可变区的部分。除了CDR之外，抗原结合位点还可以含有可变区结构域的其他部分。
本发明所用的Fv抗体片段由通过非共价相互作用而连接的一可变重链结构域(VH)和一可变轻链(VL)结构域构成。
本发明所用的dsFv指具有稳定VH-VL对的改造的分子间二硫键的Fv。
本发明所用的Fd片段是含有抗体重链的可变结构域(VH)和一个恒定区结构域(CH1)的抗体片段。
本发明所用的“Fab片段”是含有用木瓜蛋白酶消化全长免疫球蛋白所产生的部分全长抗体的抗体片段，或合成或重组产生的具有相同结果的片段。Fab片段含有轻链(含有VL和CL部分)以及含有重链(VH)的可变区和重链的一个恒定区结构域部分(CH1)的另一链；其可以重组产生。
本发明所用的F(ab’)2片段是用胃蛋白酶于pH4.0-4.5消化免疫球蛋白而产生的抗体片段或合成如重组产生的具有相同结构的抗体。F(ab’)2片段含有两个Fab片段，但是其中每条重链部分都含有形成连接所述两个片段的二硫键的少数其他氨基酸，包括半胱氨酸残基；其可以重组产生。
Fab’片段是含有一半F(ab’)2片段的片段(一条重链和一条轻链)。
本发明所用的Fd’片段是含有F(ab’)2片段的一重链部分的抗体的片段。
本发明所用的Fv’片段仅含有抗体分子的VH和VL结构域的片段。
本发明所用的scFv片段指含有通过多肽连接体以任何顺序共价连接的可变轻链(VL)和可变重链(VH)的抗体片段。连接体具有的长度使得两个可变结构域桥接，而无实质干扰。示例性的连接体是(Gly-Ser)n残基，伴随一些Glu或Lys残基分散于其中，以增加溶解度。
本发明所用的双价抗体是二聚scFv；双价抗体通常具有比scFv短的肽连接体，并且它们优先二聚化。
本发明所用的，hsFv指这样的抗体片段，在所述抗体片段中，通常存在于Fab片段中的恒定结构域已经被异二聚体卷曲螺旋结构域取代(参见例如Arndt et al.(2001)J Mol Biol.7:312:221-228)。
本文针对抗体所用的“可变结构域”是抗体重链或轻链的、含有在不同抗体间变化的氨基酸序列的特定Ig结构域。每一条轻链和每一条重链都具有一个可变区结构域(VL和VH)。可变结构域提供了抗原特异性，并因此负责抗原设别。每一可变区结构域都含有是抗原结合位点结构域的一部分的CDR和构架区(FR)。
如本发明所用，提到可变重(VH)链或可变轻(VL)链(也称为VH结构域或VL结构域)指构成抗体的可变结构域的多肽链。
本发明所用的构架区(FR)是抗体可变区结构域内位于β折叠内的区域；FR区在其氨基酸序列方面比较而言比高变区保守。
本发明所用的恒定结构域是抗体重链或轻链中含有在抗体间相比较而言比可变区结构域更保守的氨基酸序列的结构域。每一条轻链都具有单个轻链恒定区(CL)结构域，且每一条重链都含有一个或多个重链恒定区(CH)结构域，其包括CH1、CH2、CH3以及CH4。全长IgA、IgD以及IgG同种型含有CH1、CH2、CH3和铰链区，而IgE和IgM含有CH1、CH2、CH3和CH4。CH1和CL结构域延长抗体的Fab臂，因此有助于与抗原的相互作用和抗体臂的旋转。抗体恒定区可以发挥效应子功能，诸如但不限于清除抗体例如通过与各种细胞、生物分子和组织的相互作用特异性结合的抗原、病原体和毒素。
本发明所用的抗体形式指抗体的具体结构。本发明的抗体包括全长抗体和其部分，诸如，例如Fab片段或其他抗体片段。因此，Fab是抗体的具体形式。
如本发明所用，提到抗体的“相应形式”表示，当比较两个抗体的特性或者活性时，利用相同形式的抗体比较特性。例如，如果提到与第一抗体的相应形式的活性相比，抗体的的活性较少，这表示，所述抗体的具体形式，如Fab，与第一抗体的Fab形式相比具有较少的活性。
本发明针对相应残基所用的相应的，例如“对应于……的氨基酸残基”，指在为相关序列的两条多肽(如等位基因变体、同一家族的基因、物种变体)之间或之中比较的残基。本领域技术人员能够容易地鉴定在多肽之间或之中对应的残基。例如，通过比对两条序列，本领域技术人员能够利用保守和相同氨基酸作为指导鉴定相应的残基。本领域技术人员能够手动比对序列或可以使用可用的许多比对程序中的任何程序(例如，BLAST)。因此，彼此对应的氨基酸残基或位置，是基于与指定的参照多肽的序列和/或结构比对，经测定彼此对应的残基。
本发明所用的“连接”或“间隔”肽指连接两条多肽序列的短氨基酸序列(或编码这类氨基酸序列的核酸)。“肽连接体”指连接两条多肽序列的短氨基酸序列。多肽连接体的实例是，将肽截短结构域连接于抗体的连接体或连接合成抗体片段如scFv片段的两条抗体链的连接体。连接体是熟知的，并且任何已知的连接体都可以用于所提供的方法中。多肽连接体的实例是(Gly-Ser)n氨基酸序列，伴随一些Glu或Lys残基分散于其中，以增加溶解度。其他示例性的连接体在本文中有描述；这些和其他已知的连接体中的任何连接体都可以与所提供的组合物和方法一起使用。
本文所用的“人血清”指正常血清，其可以通过汇集约等量的来自未患有任何可通过输血传播的疾病的人的凝结的全血的液体部分而获得。
如本文所用，提到“可检测的”或“可检测标记的”指原子、分子或组分，其中可以直接或间接测量原子、分子或组分的存在。可检测标记可以用于在本发明所提供的方法中鉴定一种或多种蛋白。可检测标记可以用于本发明所提供的任何方法中。可检测标记包括例如化学发光部分、生物发光部分、荧光部分、放射性核素以及金属。检测标记的方法在本领域是熟知的。可以通过视觉检查、荧光光谱、反射测量以及流式细胞术来检测这类标记。间接检测指测量直接或间接结合可检测标记的原子、分子或组分的物理现象，如直接或间接结合可检测标记的原子、分子或组分的能量或粒子发射或吸收。在间接检测的非限制性实例中，可检测标记可以是生物素，其可以通过结合抗生物素而得到检测。因此，包括于可检测标记或可检测部分范围内的是，涉及原子、分子或组分的结合标记或结合部分，其中作为结合另一原子、分子或组分的标记或部分的结果，可以检测原子、分子或组分的存在。
本文所用的标记是可以直接或间接附着于或连接于分子或与之结合的可检测标记。检测方法可以是本领域已知的任何方法。
本文所用的“筛选”指基于抗体或其部分的活性或特性的确定，从许多抗体如抗体集合或文库和/或其部分中鉴定或选择蛋白，例如人抗体或其部分。筛选可以以多种方式中的任何方式实施，并且通常涉及使集合的成员与靶蛋白或抗原接触，并评估特性或活性，例如利用评估抗体与靶蛋白直接结合(结合亲和性)的测定或利用评估靶蛋白活性调节的功能测定。
从获得抗体或其部分与靶蛋白结合的绝对值和/或抗体或其部分对靶蛋白调节的绝对值的意义上讲，以及从获得标志结合或活性水平的指数、比、百分比、视觉或其他值的意义上讲，本文所用术语“评估”或“测试”意图包括定量和定性测定。评估可以是直接的或间接的。例如，结合可以通过用可检测标记直接标记抗体或其部分和/或通过利用自标记的第二抗体测定。此外，利用本领域技术人员已知的多种测定中的任何测定例如中和测定和本文所述的其他测定，并比较在存在与不存在抗体或其部分的情况下的膜伴随抗原(如住病毒的细胞)的活性，来测定功能活性。
本文所用的“高通量”指允许操作大量分子或化合物、通常从数十到数百到数千化合物的大规模方法或过程。例如，可以使纯化和筛选方法是高通量的。高通量方法可以手动进行。然而，高通量方法通常涉及自动化、机器人或软件。
本文所用的“靶蛋白”或“蛋白的靶标”是能结合测试分子或蛋白或与之相互作用的蛋白、抗原或基质。
本文所用的"疾病”指起因于包括但不限于感染、后天条件、基因条件等的原因或条件并且特征为可确认的症状的生物体的病理状态。疾病包括癌症和肿瘤。本文所用的“患病微环境”指在具体微环境中与正常组织相比，在疾病组织中发生改变或变化的具体条件。这些条件包括例如血管形成改变升高或变化，缺氧、pH改变、辅因子、组织间隙液压以及代谢物水平如乳酸盐或丙酮酸盐水平改变。
本文所用的“非患病微环境”或“健康组织环境”条件指在正常生理条件下存在的条件。例如，在正常的生理条件下，非患病微环境如非患病组织的pH可以是中性的。
本文所用的“模拟疾病或非患病微环境的条件”指对应于存在于体内环境中的一种或多种条件的体外或体内测定条件。例如，如果微环境的特征是低pH，则模拟微环境的条件包括具有低pH的缓冲液或测定条件。
本文所用的存在于肿瘤微环境中的条件包括，与非肿瘤微环境(如健康或非患病细胞或组织)相比存在于其中的条件。存在于肿瘤微环境中的条件包括血管形成增加、缺氧、低pH、乳酸盐浓度增加、丙酮酸盐浓度增加、组织间隙液压增加以及标志肿瘤的代谢物或代谢改变。例如，存在于肿瘤微环境中的条件是小于7.4的低pH，通常介于或约介于5.6-6.8，如小于或约或pH5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7或6.8。在另一实例中，存在于肿瘤微环境中的条件是为或约为5mM至20mM的乳酸的高乳酸盐浓度，例如10mM至20mM的乳酸，如15mM至18mM，并且特别是至少为或至少约为或为16mM、16.5mM或17mM的乳酸。
本文所用的存在于非肿瘤微环境中的条件包括不存在于肿瘤微环境中的一种或多种条件。出于本发明的目的，所述多种或一种条件是存在于肿瘤微环境和非肿瘤环境中，但在所述两种微环境中不同的相应特性或特征，如pH、乳酸盐浓度或丙酮酸盐浓度。存在于非肿瘤微环境中的条件是从约7.0至约7.8的pH，如至少为或约为或为pH7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7或7.8(参见例如US Patent No.7781405)，在一些实例中为pH7.4。存在于非肿瘤微环境中的条件是为0.5-5mM乳酸盐的乳酸盐浓度，诸如，例如0.2mM-4mM的乳酸，如0.5、1、2、3、4或5mM的乳酸。
本文所用的“蛋白的集合”或“抗体的集合”指含有至少10个不同的蛋白和/或其活性部分并且通常含有至少50、100、500、1000、104、105或更多个成员的集合。集合通常含有待进行活性筛选的蛋白。包括于集合中的是天然存在的蛋白(或其活性部分)和/或修饰蛋白，特别是抗体变体或其活性片段。修饰包括沿着蛋白长度的随机突变和/或在靶向或所选区域的修饰(即集中的突变)。修饰可以是组合的，并且可以包括通过取代具体基因座或所有基因座或其子集处的所有氨基酸的所有排列。集合可以包括全长或较短的蛋白。集合的大小和具体集合可以由用户确定。在本文中术语集合与术语“文库”交换使用，并表示相同事物。
本文所用的“模板蛋白”或“不含有突变的蛋白”指具有用于诱变的氨基酸序列的蛋白。模板蛋白可以是野生型蛋白的序列，或其可以是被进行了其他突变的变异蛋白的序列。
本文所用的“选择”或其语法变型，指基于蛋白的一种或多种活性挑选或选择蛋白。选择可以基于蛋白的绝对活性，或者选择可以基于，与在不同条件下的另一蛋白、在不同条件下的相同蛋白或在不同条件下的不同蛋白相比的蛋白相对活性的比较。
本文所用的“鉴定”和其语法变型，指识别或了解在期望的条件下具有限定的活性的蛋白。通常，在本发明的方法中，通过蛋白在模拟与非患病或正常生理环境相比的患病环境的条件下优先结合，鉴定所述蛋白。
本文所用的为了检测或分离而标记的分子表示，诸如抗体或蛋白的分子与诸如荧光团的可检测标记结合或与标签或其他部分结合，用于例如纯化或分离(isolation)或分开(separation)。可检测地标记指为了检测或分离而标记的分子。
本文所用的附加表位指对应于表位以促进已附加表位的蛋白或肽的随后生化和免疫学分析的一段短氨基酸残基序列。通过在合适的表达载体中将附加表位的序列添加于蛋白编码序列，可以实现表位附加。可以利用针对标签而产生的高特异性抗体，对已附加表位的蛋白进行亲和纯化。
本发明针对反应混合物所用的均相，表示反应物位于液相中，作为混合物，包括作为溶液或悬浮液。
本发明针对反应混合物所用的异相，表示反应物位于固相中或位于液相中，作为混合物，包括作为溶液或悬浮液。异相反应混合物的实例是ELISA测定。
本文所用的“变异蛋白”、“修饰蛋白”或“突变蛋白”或其变型，指与野生型或模板蛋白相比在一级序列上具有一个或多个修饰的多肽(蛋白)。一个或多个突变可以是一个或多个氨基酸取代(替换)、***、缺失、以及其任意组合。修饰蛋白多肽包括具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多个修饰位置的那些蛋白多肽。修饰蛋白可以是全长蛋白，如全长抗体，或可以是其抗体片段。修饰蛋白与不含有突变的野生型或支架蛋白通常具有60%、70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多的序列相同性。
如本文所用的，提到“重要(critical)氨基酸残基”指当发生改变(例如通过氨基酸取代)时降低或消除蛋白活性的蛋白中的残基。通常，活性降低小于70%、60%、50%、40%、30%、20%、10%或小于不含有改变的或取代的氨基酸的修饰蛋白的活性。
如本文所用的，提到“关键(key)残基”指这样的残基，其位于重要氨基酸位置附近或邻近重要氨基酸位置，并且当发生改变(例如通过氨基酸取代)时不产生表现出不期望的或预定的活性或状况，例如在不期望的条件(如pH7.4时，具有活性，但是在pH6.0时无活性)下，蛋白表达降低或无表达或活性降低或无活性。因此，关键残基是表达且表现出期望的活性的残基。
本文所用的活性指与全长(完整)蛋白相关的多肽或其部分的功能活性或活性。功能活性包括但不限于生物活性、催化或酶促活性、抗原性(能结合多肽或与多肽竞争与抗多肽抗体的结合的能力)、免疫原性、形成多聚体的能力以及特异性结合多肽的受体或配体的能力。
本文所用的结合活性指分子例如多肽的特征，涉及其是否和如何结合一个或多个结合伴侣。结合活性包括结合结合伴侣的能力、其结合结合伴侣的亲和性(例如高亲和性)、其结合结合伴侣的亲和力、与结合伴侣的键的强度以及与结合伴侣结合的特异性。
本文所用的“结合”、“结合的”或其语法变型，指分子参与与另一分子的任何有吸引力的相互作用，从而导致所述两个分子彼此紧密接近的稳定缔合。结合包括但不限于非共价键、共价键(例如可逆和不可逆的共价键)，并包括分子间的相互作用，所述分子包括但不限于蛋白、核酸、碳水化合物、脂质以及小分子，如化学化合物，包括药物在内。键的实例是抗体抗原相互作用和受体配体相互作用。当抗体“结合”特定抗原时，结合指抗体在抗体结合位点通过同源抗体抗原相互作用特异性识别抗原。结合也可以包括通过二硫键相互作用的多肽的多条链如抗体链的缔合。
本文针对抗体或其抗原结合片段所用的“特异性结合”或“免疫特异性结合”在本文中交换使用，并指抗体或抗原结合片段与同源抗原通过抗体和抗原的抗体结合位点之间的非共价相互作用形成一个或多个非共价键的能力。通常，免疫特异性结合(或特异性结合)抗原的抗体是以亲和常数Ka约为或为1×107M-1or1×108M-1或更大(解离常数(Kd)为1×10-7M或1×10-8M或更小)结合抗原的抗体。亲和常数可以利用抗体反应的标准动力学方法来测定，例如免疫测定、表面等离子体共振(SPR)(Rich and Myszka(2000)Curr.Opin.Biotechnol11:54;Englebienne(1998)Analyst.123:1599)、等温滴定量热法(ITC)或本领域已知的其他动力学相互作用测定(参见例如Paul,ed.,Fundamental Immunology,2nd ed.,Raven Press,New York,pages332-336(1989)；有关示例性SPR和ITC方法的描述还参见U.S.Pat.No.7,229,619)。实时监测和监测结合速率的仪器和方法是已知的，并且可商购获得(例如，BiaCore2000,Biacore AB,Upsala,Sweden和GE Healthcare LifeSciences;Malmqvist(2000)Biochem.Soc.Trans.27:335)。
在提到本发明所提供的多肽或抗体时，本文所用的术语“选择性结合(bind selectively)”或“选择性结合(selectively binds)”，表示多肽或抗体与表位、抗原或基质结合，而基本上不结合另一表位、抗原或基质。通常，选择性结合所选表位的抗体或其片段，特异性结合表位，且亲和常数Ka为例如约为或为1×107M-1、1×108M-1或更大。
本文所用的"亲和性"或"结合亲和性"指抗体分子或其部分结合靶蛋白或抗原上表位的强度。经常利用平衡缔合常数(KA)或平衡解离常数(KD)测量亲和性。低亲和性抗体抗原相互作用是弱的，并且分子倾向于快速解离，而高亲和性抗体抗原结合是强的，并且分子保持更长时间的结合。高抗体亲和性表示，抗体特异性结合靶蛋白，并且平衡缔合常数(KA)大于或等于约106M-1、大于或等于约107M-1、大于或等于约108M-1或大于或等于约109M-1、1010M-1、1011M-1或1012M-1。抗体的特征还以平衡解离常数(KD)为10-4M、10-6M-10-7M或10-8M、10-10M、10-11M或10-12M或更低为特征。通常，具有纳摩尔或或亚纳摩尔解离常数的抗体被视为高亲和性抗体。利用常规技术，例如通过平衡透析，使用BIAcore2000仪器、利用制造商所概述的通用程序，通过利用放射性标记的靶抗原的放射免疫测定或利用本领域技术人员已知的另一方法，可以很容易地测定这类亲和性。例如利用Scatchard et al.,Ann N.Y.Acad.ScL,51:660(1949)的方法，可以分析亲和性数据。
本文所用的“可寻址的”表示，成员是可鉴定的或先天已知的，例如可通过以下来鉴定：通过它们的地址、在诸如微量滴定板孔的空间阵列中的位置或在固相支持物上的位置，或通过可鉴定的或可检测标记，如通过颜色、荧光、电子信号(即基本上不改变目的分子的相互作用的RF、微波或其他频率)、条形码或其他符号、化学或其他此类标记。
本文所用的可寻址阵列是这样的阵列，在所述阵列中，阵列的成员位于固相表面的可鉴定位置，或直接或间接连接于可鉴定标记或与之缔合，如附着于微球体或其他微粒支持物(在本文中也称为珠)，并悬浮于溶液中或散布于表面。
本文所用的荧光激活细胞分选术(FACs)指基于荧光鉴定或分选细胞的方法。例如，在FACS中，将细胞染色，以表达一种或多种荧光标记。在这种方法中，使细胞穿过从标记激发荧光并检测荧光的仪器。在检测到细胞的给定光谱部分的荧光后，FACS仪器允许将所述细胞与未表达所述荧光光谱的细胞分开。
如本文所用的，提到“细胞表面表达***”或“细胞表面展示***”指在细胞表面展示或表达蛋白或其部分。通常，产生表达与细胞表面蛋白融合的目的蛋白的细胞。例如，将蛋白表达为与跨膜结构域的融合蛋白。
本文所用的“多聚化结构域”促进多肽分子与一个或多个其他多肽分子稳定相互作用的氨基酸序列，每个多肽分子都含有互补的多聚化结构域，从而与第一结构域形成稳定的多聚体，所述多聚化结构域可以是相同的或不同的多聚化结构域。通常，直接或间接将多肽连接于多聚化结构域。示例性多聚化结构域包括免疫球蛋白序列或其部分、亮氨酸拉链、疏水区、亲水区以及相容的蛋白-蛋白相互作用结构域。多聚化结构域，例如可以是免疫球蛋白恒定区或结构域，诸如，例如IgG的Fc结构域或其部分，包括IgG1、IgG2、IgG3或IgG4亚型，IgA、IgE、IgD和IgM以及其修饰的形式。
本文所用的人类蛋白是存在于人类基因组中的核酸分子如DNA所编码的蛋白，包括其所有等位基因变体和保守变异。如果修饰是基于人类蛋白的野生型或突出序列，则蛋白的变体或修饰是人类蛋白。
本文所用的天然存在的α氨基酸的残基，是自然界中发现的、在人类中通过带电荷的tRNA分子与其同源mRNA密码子的特异性识别并入蛋白中的20个α氨基酸残基。
本文所用的非天然存在的氨基酸指非基因编码的氨基酸。
本文所用的核酸包括DNA、RNA及其类似物，包括肽核酸(PNA)和其混合物。核酸可以是单链的或双链的。当涉及诸如用可检测标记如荧光或放射性标记任选地标记的探针或引物时，考虑了单链分子。这类分子的所具有的长度通常使得它们的靶标是统计上独特的或具有低拷贝数(通常小于5，一般小于3)，用于探测或引发文库。通常，探针或引物含有至少14、16或30个与目的基因互补或相同的连续核苷酸序列。探针和引物的长度可以为10、20、30、50、100或更多个核酸。
本文所用的肽指长度为2-40个氨基酸的多肽。
本文所用的存在于本发明所提供的各种氨基酸序列中的氨基酸，根据它们已知的三字母或一字母(表1)缩写来确定。存在于各种核酸片段中的核苷酸，以本领域通常所用的标准单字母命名法来命名。
本文所用的“氨基酸”是含有氨基和羧酸基的有机化合物。多肽含有2个或更多个氨基酸。出于本发明的目的，氨基酸包括20种天然存在的氨基酸、非天然氨基酸以及氨基酸类似物(即α碳具有侧链的氨基酸)。
本文所用的“氨基酸残基”指在其肽连接处化学消化(水解)多肽后所形成的氨基酸。假定本文所述的氨基酸残基采取“L”同分异构型。“D”同分异构型的残基，其根据上述指定，可以被用来取代任何L-氨基酸残基，只要多肽保留了期望的功能特性。NH2指存在于多肽的氨基末端的游离氨基。COOH指存在于多肽的羧基末端的游离羧基。与J.Biol.Chem.,243:3557-3559(1968)所述的标准多肽命名法一致，并且接受37C.F.R.§§1.821-1.822，氨基酸残基的缩写显示于表1中：
表1–对应表
Figure BDA00003151467300211
Figure BDA00003151467300221
应当指出，本文公式所代表的所有氨基酸残基序列在氨基末端至羧基末端的常规方向上为从左到由定向。此外，短语“氨基酸残基”广泛定义为，包括对应表(表1)所列的氨基酸和修饰的以及不常见的氨基酸，如37C.F.R.§§1.821-1.822所提到的那些氨基酸，并通过引用并入。此外，一贯的指出，氨基酸残基序列的开始或末端的破折号表示与一个或多个氨基酸残基的另一序列或与氨基末端基团如NH2或与羧基末端基团如COOH的肽键。
本发明所用的“天然存在的氨基酸”指存在于多肽中的20种L-氨基酸。
本发明所用的“非天然氨基酸”指结构与天然氨基酸相似但是在结构上已经受到修饰以模拟天然氨基酸的结构和反应性的有机化合物。非天然存在的氨基酸因此包括例如除了20种天然存在的氨基酸之外的氨基酸或氨基酸类似物，并且包括但不限于氨基酸的D-电子等排体(D-isostereomer)。示例性的非天然氨基酸在本文中有描述，并且是本领域技术人员已知的。
本文所用的等速混合物是这样的混合物，在所述混合物中，已经基于氨基酸的报道反应速率，对它们的摩尔比率进行了调整(参见例如Ostreshet al.,(1994)Biopolymers34:1681)。
本文所用的修饰涉及多肽氨基酸序列或核酸分子中核苷酸序列的修饰，并分别包括氨基酸和核苷酸的缺失、***以及取代。修饰多肽的方法，对于本领域技术人员而言是常规的，例如利用重组DNA技术。
本文所用的核酸的氨基酸保守取代是本领域技术人员已知的，并且通常可以进行而不改变所得分子的生物活性。本领域技术人员了解，通常，多肽非必须区中单个氨基酸取代基本上不改变生物活性(参见例如Watsonet al.Molecular Biology of the Gene,4th Edition,1987,TheBenjamin/Cummings Pub.co.,p.224)。可以根据表2如下所提出的那些取代，进行这类取代：
表2
最初的残基 示例性保守取代
Ala(A) Gly;Ser
Arg(R) Lys
Asn(N) Gln;His
Cys(C) Ser
Gln(Q) Asn
Glu(E) Asp
Gly(G) Ala;Pro
His(H) Asn;Gln
Ile(I) Leu;Val
Leu(L) Ile;Val
Lys(K) Arg;Gln;Glu
Met(M) Leu;Tyr;Ile
Phe(F) Met;Leu;Tyr
Ser(S) Thr
Thr(T) Ser
Trp(W) Tyr
Tyr(Y) Trp;Phe
Val(V) Ile;Leu
其他取代也是允许的，并且可以根据经验或根据已知的保守取代来确定。
本文所用的DNA构建体是以自然界未发现过的方式结合和并列的DNA节段的单链或双链、线性或环状DNA分子。DNA构建体由于人类的操作而存在，并且包括所操作的分子的克隆和其他拷贝。
本文所用的DNA节段是具有指定属性的较大DNA分子的一部分。例如，编码指定多肽的DNA节段是较长DNA分子的一部分，如质粒或质粒片段，当从5’至3’方向读取时，其编码指定多肽的氨基酸序列。
本文所用的术语多核苷酸表示从5’至3’末端读取的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸碱基的单链或双链多聚体。多核苷酸包括RNA和DNA，并且可以从天然来源分离、体外合成或由天然和合成分子制备。多核苷酸分子以核苷酸(所写为“nt”)或碱基对(缩写为“bp”)的术语给出。如果上下文许可，术语核苷酸用于单链和双链分子。当所述术语应用于双链分子时，其用于表示全长，并且应当被理解为等同于术语碱基对。本领域技术人员应当认识到，双链多核苷酸的两条链可以在长度上稍微不同，并且其末端可以是交错的；因此双链多核苷酸分子内的所有核苷酸并非都配对。这类非配对末端的长度通常不超过20个核苷酸。
本文所用的两个蛋白或核酸之间的“相似性”指所述蛋白的氨基酸序列或所述核酸的核苷酸序列之间的相关性。相似性可以基于残基序列相同性和/或同源性的程度和其中所含的残基。评估蛋白或核酸之间相似性程度的方法是本领域技术人员已知的。例如，在评估序列相似性的一个方法中，以在两条氨基酸或核苷酸序列之间产生最大相同性水平的方式比对所述序列。"相同性"指氨基酸或核苷酸序列不变的程度。氨基酸序列和在一定程度上核苷酸序列的比对，也可以考虑氨基酸(或核苷酸)中的保守差异和/或频繁取代。保守差异是保留了所涉及的氨基酸的理化特性的那些差异。比对可以是全局的(所比较序列的比对在序列的全部长度上进行，并且包括所有残基)或局部的(仅包括最相似的一个或多个区域的序列的一部分的比对)。
"相同性"本身具有本领域公认的涵义，并且可以利用出版的技术来计数(参见例如Computational Molecular Biology,Lesk,A.M.,ed.,OxfordUniversity Press,New York,1988;Biocomputing:Informatics and GenomeProjects,Smith,D.W.,ed.,Academic Press,New York,1993;ComputerAnalysis of Sequence Data,Part I,Griffin,A.M.,and Griffin,H.G.,eds.,Humana Press,New Jersey,1994;Sequence Analysis in Molecular Biology,vonHeinje,G.,Academic Press,1987；以及Sequence Analysis Primer,Gribskov,M.and Devereux,J.,eds.,M Stockton Press,New York,1991)。While thereexists a number of methods to measure identity between two多核苷酸orpolypeptides,the term"identity"is well known to技术人员s(Carrillo,H.&Lipton,D.,SIAM J Applied Math48:1073(1988))。
本文所用的同源的(针对核酸和/或氨基酸序列而言)表示约大于或等于25%序列同源性，通常大于或等于25%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%或95%的序列同源性；如果需要，可以指定准确的百分比。出于本发明的目的，除非另有说明，术语"同源性"和"相同性"经常交换使用。通常，为了测定百分比同源性或相同性，比对序列，从而使得获得最高位匹配(参见例如：Computational Molecular Biology,Lesk,A.M.,ed.,Oxford University Press,New York,1988;Biocomputing:Informatics andGenome Projects,Smith,D.W.,ed.,Academic Press,New York,1993;Computer Analysis of Sequence Data,Part I,Griffin,A.M.,and Griffin,H.G.,eds.,Humana Press,New Jersey,1994;Sequence Analysis in Molecular Biology,von Heinje,G.,Academic Press,1987；以及Sequence Analysis Primer,Gribskov,M.and Devereux,J.,eds.,M Stockton Press,New York,1991;Carrillo et al.(1988)SIAM J Applied Math48:1073)。以序列同源性的方式，保守氨基酸的数量可以利用标准比对算法程序来确定，并且可以与每个供应商所建立的缺省缺口罚分一起使用。基本上同源的核酸分子通常会以适度严格性或高严格性、都顺着目的核酸的长度杂交。还考虑了含有取代杂交核酸分子中密码子的简并密码子的核酸分子。
任何两个分子是具有至少60%、70%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%"相同"或"同源"的核苷酸序列还是氨基酸序列，可以利用已知的计算机算法如"FASTA"程序、利用例如Pearson et al.(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:2444中的缺省参数来测定(其他程序包括GCG程序包(Devereux,J.,et al.,Nucleic Acids Research12(I):387(1984)),BLASTP,BLASTN,FASTA(Altschul,S.F.,et al.,J Molec Biol215:403(1990));Guideto Huge Computers,Martin J.Bishop,ed.,Academic Press,San Diego,1994，以及Carrillo et al.(1988)SIAM J Applied Math48:1073)。例如，国立生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information)数据库的BLAST功能可以用于测定相同性。其他商业或公众可获得的程序包括DNAStar"MegAlign"程序(Madison,WI)和威斯康星大学传学计算机小组(Universityof Wisconsin Genetics Computer Group,UWG)"Gap"程序(Madison WI)。可以通过例如利用GAP计算机程序(如Needleman et al.(1970)J.Mol.Biol.48:443，由Smith and Waterman((1981)Adv.Appl.Math.2:482)做了修订)比较序列信息，来测定蛋白和/或核酸分子的百分比同源性或相同性。简而言之，GAP程序将相似性定义为相似的比对符号(即核苷酸或氨基酸)的数量除以两条序列中较短序列内符号的总数。GAP程序的缺省参数可以包括：(1)Gribskov et al.(1986)Nucl.Acids Res.14:6745的一元比较矩阵(对于相同性，所含有的值为1，对于非相同性，所含有的值为0)和加权比较矩阵，如以下所述：Schwartz and Dayhoff,eds.,ATLAS OF PROTEIN SEQUENCEAND STRUCTURE,National Biomedical Research Foundation,pp.353-358(1979)；(2)对于每一缺口，罚分为3.0，并且对于每一缺口中的每一符号，额外罚分0.10；以及(3)对于末端缺口，无罚分。
因此，本文所用的术语"相同性"或"同源性"表示测试多肽或多核苷酸与参照多肽或多核苷酸之间的比较。本文所用的术语与至少"90%相同"指相对于参照核酸或多肽的氨基酸序列，从90至99.99%的百分比相同性。90%或更高水平的相同性表示这样一个事实：即假定出于举例的目的，比较长度为100个氨基酸的测试多肽和参照多肽。测试多肽中仅仅10%(即100个中有10个)的氨基酸不同于参照多肽的氨基酸。可以在测试多核苷酸和参照多核苷酸之间进行相似的比较。这类差异可以说成是随机分布于多肽全长的点突变，或它们可以聚集于不同长度、多达最大可允许长度的一个或多个位置中，例如10/100氨基酸差异(约90%相同性)。差异被定义为核酸或氨基酸取代、***或缺失。在高于约85-90%的同源性或相同性水平，结果应当独立于程序和缺口参数集；可以容易地评估这类高水平相同性，经常通过手动比对而不依赖软件来进行。
本文所用的比对的序列指利用同源性(相似性和/或相同性)比对核苷酸或氨基酸序列中的相应位置。通常比对50%或更高相同性相关的两条或多条序列。一组比对的序列指2条或更多条在相应位置比对且可以包括来源于与基因组DNA序列比对的RNA如EST和其他cDNA的比对序列的序列。
本文所用的“引物"指在适当的缓冲液中、并在合适的温度下，在适当的条件下(例如存在4种不同的核苷三磷酸和聚合试剂，如DNA聚合酶、RNA聚合酶或逆转录酶)，可以充当模板指导的DNA合成的起始点的核酸分子。应当认识到，某些核酸分子可以充当“探针”并可以充当“引物”。然而引物具有用于延伸的3’羧基。引物可以用于多种方法中，包括例如，聚合酶链式反应(PCR)、逆转录酶(RT)-PCR、RNA PCR、LCR、多重PCR、锅柄PCR、捕获PCR、表达PCR、3'和5'RACE、原位PCR、连接介导的PCR和其他扩增方案。
本文所用的“引物对”指一组包括与待扩增(如通过PCR)的序列的5’末端杂交的5'(上游)引物和与待扩增的序列的3’末端的互补物杂交的3'(下游)引物的引物。
本文所用的"特异性杂交"指核酸分子(如寡核苷酸)与靶核酸分子通过互补碱基配对退化。本领域技术人员熟悉影响特异性杂交的体外和体内参数，如具体分子的长度和组成。特别与体外杂交相关的参数还包括退火和洗涤温度、缓冲液组成以及盐浓度。用于在高严格性下除去非特异性结合的核酸分子的示例性洗涤条件是0.1x SSPE、0.1%SDS，65°C，并且用于在中度严格性下除去非特异性结合的核酸分子的示例性洗涤条件是0.2xSSPE、0.1%SDS、50°C。等同的严格性条件在本领域内是已知的。技术人员能容易地调整这些参数，以实现核酸分子与适合具体应用的靶核酸分子的特异性杂交。
本文所用的与产物基本上相同表示足够的相似性，从而使得目的特性未被充分改变，从而可以使用基本上相同的产物，代替所述产物。
本文所用的，还应当理解到，术语“基本上相同”或“相似”，正如相关技术领域技术人员所理解的，可以随着语境而改变。
本文所用的等位基因变体或等位基因变异，指占据相同染色***置的基因的两个或多个替代形式中的任何形式。等位基因变异由突变天然引起，并且可以在群体内产生表型多态性。基因突变可以是沉默的(编码的多肽没有变化)或可以编码氨基酸序列改变的多肽。术语“等位基因变体”在本文中还用于表示基因的等位基因变体所编码的蛋白。通常，参照形式的基因编码物种的群体或单个参照成员的野生型形式和/或主要形式的多肽。通常，包括物种之间或物种中变体的等位基因变体通常与相同物种的野生型和/或主要形式具有至少80%、90%或更大的氨基酸相同性；相同性的程度取决于基因和比较是种间的还是种内的。通常，种内等位基因变体与野生型和/或主要形式具有至少约80%、85%、90%或95%的相同性或更高，包括与野生型和/或主要形式的多肽具有96%、97%、98%、99%或更多的相同性。在本文中提到等位基因变体通常指蛋白在相同物种的成员之间的变异。
本文所用的“等位基因”，在本文中与“等位基因变体”交换使用，指基因或其部分的替代形式。等位基因在同源染色体上占据相同的基因座。当个体具有基因的两个相同的等位基因时，认为所述个体对于该基因或等位基因是纯合的。当个体具有基因的两个不同的等位基因时，认为所述个体对于该基因是杂合的。具体基因的等位基因彼此之间的不同之处在于单个核苷酸或数个核苷酸，并且可以包括核苷酸的取代、缺失和***。基因的等位基因还可以是含有突变的基因形式。
本文所用的物种变体指不同物种间的多肽的变体，包括不同哺乳动物物种，如小鼠和人类。
本文所用的剪接变体指导致多于一个类型的mRNA的基因组DNA初级转录本的差异加工所产生的变体。
本文所用的肽模拟物是模拟生物活性形式的具体肽的构象和某些立体化学特征的化合物。通常，肽模拟物被设计为，模拟化合物的某些期望的特性而不是导致生物活性构象丧失或键断裂的不期望的特性，如柔性。通过用生物电子等排体取代有助于不期望的特性的某些基团或键，可以由生物活性化合物制备肽模拟物。生物电子等排体是本领域技术人员已知的。例如，亚甲基生物电子等排体CH2S已经在脑啡肽类似物中用作酰胺取代物(参见例如,Spatola(1983)pp.267-357in Chemistry and Biochemistry ofAmino Acids,Peptides,and Proteins,Weinstein,Ed.volume7,Marcel Dekker,New York)。***可以口服给予，其是肽即内啡肽的肽模拟物。出于本发明的目的，环状肽包括于为一个或多个肽键被模拟物取代的多肽的肽模拟物中。
本文所用的包含参照多肽所示的指定百分比的氨基酸的多肽，指多肽与参照多肽间共有的连续氨基酸的比例。例如，包含70%具有SEQ IDNO:XX(所述SEQ ID NO:XX详述了147个氨基酸)所示氨基酸序列的参照多肽中所示的氨基酸的同种型，表示参照多肽含有至少103个SEQ IDNO:XX的氨基酸序列所示的连续氨基酸。
本文所用的术语启动子表示含有DNA序列的基因的一部分，所述DNA序列提供RNA聚合酶的结合和转录起始。启动子序列通常但并非总是见于基因的5’非编码区。
本文所用的分离的或纯化的多肽或蛋白或其生物活性部分，基本上不含来自所述蛋白来源的细胞或组织的细胞材料或其他污染性蛋白，或当合成时基本上不含化学前体或其他化学品。如果制剂看起来不含标准分析方法所测定的可容易检测的杂质，则可以确定所述制剂基本上不含杂质，所述标准分析方法如本领域技术人员用来评估这类纯度的薄层层析(TLC)、凝胶电泳和高压液相色谱(HPLC)；或可以确定所述制剂是足够纯的，从而其他纯化不会可检测地改变物质的物理和化学特性，如酶促活性和生物活性。用于纯化化合物以便产生基本上化学纯的化合物的方法，是本领域技术人员已知的。然而，基本上化学纯化的化合物可以是立体异构体的混合物。在这种情况下，另外的纯化可能增强所述化合物的特异性活性。
术语基本上不含细胞材料包括这样的蛋白制剂，在所述制剂中，蛋白与其分离或重组产生的细胞的细胞组分分离。在一实施方案中，术语基本上不含细胞材料包括具有小于约30%(干重)的非蛋白酶蛋白(在本文中也称为污染性蛋白)、通常小于约20%的非蛋白酶蛋白或10%的非蛋白酶蛋白或小于约5%的非蛋白酶蛋白的蛋白酶蛋白制剂。当重组产生蛋白酶蛋白或其活性部分时，其含基本上不含培养基，即培养基占小于约或为20%、10%或5%的蛋白酶蛋白制剂体积。
本文所用的术语基本上不含化学前体或其他化学品包括蛋白酶制剂，在所述蛋白酶制剂中，蛋白与参与所述蛋白合成的化学前体或其他化学品分离。该术语包括具有小于约30%(干重)、20%、10%、5%或更少的化学前体或非蛋白酶化学品或组分的蛋白酶制剂。
本文针对例如合成的核酸分子或合成的基因或合成的肽所用的合成指利用重组方法和/或化学合成方法所产生的核酸分子或多肽分子。
本文所用的利用重组DNA方法通过重组方式产生，表示利用分子生物学的公知方法表达克隆的DNA所编码的蛋白。
本文所用的载体(或质粒)指用来将异源核酸引入用于其表达或复制的细胞的离散元件。载体通常保持游离，但是经设计，也可以实现基因或其部分整合到基因组的染色体中。还考虑了为人工染色体的载体，如酵母人工染色体和哺乳动物人工染色体。这类媒介的选择和使用，是本领域技术人员熟知的。
本文所用的表达载体包括能表达与调节序列可操作连接的DNA的载体，所述调节序列，如启动子区能引起这类DNA片段的表达。这类其他节段可以包括启动子和终止子序列，并且任选地，可以包括一个或多个复制起点、一个或多个选择标记、增强子、聚腺苷酸化信号等。表达载体通常来源于质粒或病毒DNA或可以含有这两种元件。因此，表达载体指重组DNA或RNA构建体，如质粒、噬菌体、重组病毒或在引入适当的宿主细胞后导致克隆的DNA表达的其他载体。合适的表达载体是本领域技术人员熟知的，并包括能在真核细胞和/或原核细胞中复制的载体和保持游离的载体或整合到宿主细胞基因组中的载体。
本文所用的载体还包括“病毒载体(virus vector)”或“病毒载体(viralvector)”。病毒载体是可操作连接于外源基因以便将外源基因转移(作为媒介或穿梭运载工具)到细胞中的改造的病毒。
本文所用的腺病毒指引起人类结膜炎和上呼吸道干扰的任何一组含有DNA的病毒。本文所用的裸DNA指可以用于疫苗或基因疗法的不含组蛋白的DNA。裸DNA是在称为转化的基因转移过程中在细胞间穿过的遗传材料。在转化时，纯化的或裸DNA被受体细胞摄取，所述纯化的或裸DNA会带给受体细胞新特征或表型。
本文所用的可操作(operably)或可操作(operatively)连接的，当涉及DNA节段时，表示该节段的排列使得它们一致发挥功能，用于其既定目的，例如在启动子中启动转录，并继续穿过编码节段到达终止子。
本文所用的蛋白结合序列指通常能与其他蛋白或肽序列、一组蛋白或肽序列或具体蛋白或肽序列特异性结合的蛋白或肽序列。
从获得蛋白活性的绝对值和获得表示活性水平的指数、比例、百分比、可视值或其他值的意义上讲，本文所用的术语评估意图包括定量和定性测定。评估可以是直接的或间接的，并且实际检测的化学品当然不必自身是活性产物但是例如可以是活性产物的衍生物或一些其他物质。
本文所用的对照指与测试样品基本上相同的样品，除了其不用测试参数来处理，或如果其是样品、血浆样品，则其可以来找未受到目的疾病状况影响的正常志愿者。
本文所用的单数形式"一个(a)"、"一个(an)"以及"所述(the)"，除非上下文另一明确的表述，否则包括复数指示物。因此，例如，提到包含"细胞外结构域(an extracellular domain)"的化合物，包括具有一个或多个细胞外结构域的化合物。
本文所用的范围和量可以表示约为具体值或范围。约还包括准确的量。因此“约5个碱基”表示“约5个碱基”还表示“5个碱基”。
本文所用的"任选的(optional)"或"任选的(optionally)"表示，随后所述的事件或环境确实发生或不发生，并且该描述包括所述事件或情况发生的情况和所述事件或情况不发生的情况。例如，任选地取代的基团表示所述基本未被取代或被取代。
除非另有说明，否则本文所用的任何保护基、氨基酸和其他化合物的缩写与其普通用法、公认的缩写或IUPAC-IUB生物化学命名委员会(IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature)一致(参见(1972)Biochem.11:1726)。
B.鉴定条件活性分子的方法
本发明提供鉴定或选择条件活性分子如治疗蛋白的方法，所述条件活性分子在患病微环境比在正常组织微环境中更具有活性，或反之亦然。特别是，所述方法用于鉴定在肿瘤微环境中比在正常微环境中更具有活性或反之亦然的分子，如治疗蛋白。在所述方法中，在一组条件下测试分子如治疗蛋白的活性，并且在与第一组条件相比期望该活性降低的第二组条件下测试所述分子的活性。可以鉴定有活性的或在第一组条件下比在第二组条件下更具有活性的的分子，如蛋白，从而使得鉴定在一组预定条件下是条件活性的分子。通常，在所述方法中，第一组条件模拟(mimic)或模仿(simulate)在患病微环境如肿瘤微环境体内存在的条件。第二组条件模拟或模仿正常组织或细胞的生理条件。
因此，在经设计模拟或模仿存在于患病微环境和正常组织微环境中的预定条件的体外测定中实施本发明的方法。预定条件包括例如诸如pH、温度、O2浓度以及乳酸盐浓度的条件。例如，第一组预定条件可以包括存在于肿瘤微环境中的条件，并且第二组条件可以包括存在于正常环境中的条件。因此，可以鉴定在患病环境如肿瘤中比在周围的正常组织中表现出更大的活性的、具有生物功效的分子，如治疗蛋白。因此，本发明所提供的方法可以用于鉴定在一组条件下具有条件活性的修饰分子，如治疗蛋白。
通过将疗法仅靶向患病组织如肿瘤组织以便降低或防止副作用，包括局部和***副作用，这是有利的。鉴定的治疗蛋白可以用作癌症治疗剂，同时降低与***暴露相关的副作用。与副作用降低相关的治疗蛋白可以以较高的剂量给药方案使用，并且可以具有改善的功效和安全性。可以降低的副作用包括任何不期望的非治疗效果，如恶心、呕吐、胸闷、头痛和相关的心血管反应如血压不稳定和动脉收缩、皮肤毒性、骨髓抑制、心脏重度、脱发、肾功能障碍、口腔炎、贫血、癫痫、免疫反应如急性过敏性反应、血清病、抗体产生、感染、癌症、自身免疫病以及心脏中毒。
在所述方法的第一步骤中，选择一种或多种分子或蛋白来在本发明所提供的方法中测试。所述分子可以是具有生物功效的任何分子或可以是具有生物功效的修饰分子，包括小分子、肽、蛋白、酶、抗体或其他生物分子。所述分子可以是非修饰的或包括本文所述的任何修饰。在一些实例中，制备修饰分子的文库。制备测试分子的方法是熟练的技术人员已知的。D部分描述了克隆、修饰以及制备包括抗体在内的蛋白的方法。此外，本文描述了利用标准重组DNA技术诱变和产生变异分子的文库或集合的方法，并且所述方法是本领域技术人员已知的。
在选择和制备了一种或多种分子如一种或多种蛋白后，可以在第一组条件下和第二组不同的条件下测试或筛选它们的活性或特性。第一组条件和第二组条件是分别模拟或模仿在生理上存在于患病或正常组织或微环境中的那些条件的条件。例如，患病组织或患病微环境条件可以是存在于肿瘤微环境中的条件。这类条件的实例包括例如化学条件如pH和化学浓度如O2或乳酸盐的浓度；和物理条件，如温度和压力。因此，第一和第二条件的不同可以在于下述中的一种或多种：pH、O2或乳酸盐浓度或水平或其他化学条件、温度和/或压力。
利用可以检测或区分受试分子或蛋白的活性或特性的任何体外或体内方法，可以实施受试分子的测试。通常，测试在体外进行。所用的具体测定取决于受试分子或蛋白。方法的实例包括本文所述或本领域技术人员已知的任何方法并包括生化测定和/或基于细胞的测定。
在一实例中，可以汇集和筛选测试的分子。在另一实例中，可以以物理方式分离并单独筛选受试分子，例如通过在阵列如可寻址阵列中格式化。在第二组条件下测试分子也可以在在第一组条件下筛选之前、之后进行，或与其同时进行。例如，可以同时在第一组条件和第二组条件下筛选和/或选择分子，或可以在第一组条件下筛选和/或选择分子，并随后在第二组条件下进行筛选和/或选择。
在两组条件下测试分子后，评估一种或两种条件下分子的活性，以便鉴定在第一条件下比在第二条件下更具有活性的所得分子。活性可以包括任何可观察的生物、生化或生物物理学现象，诸如，例如发光、酶促活性分子相互作用，如与同源生物分子的结合。活性的比较可以是定性的或定量的。
在一实例中，在两组条件下测试分子后，比较在两组条件下的每一分子的活性，以便鉴定在第一组条件下比在第二组条件下更具有活性的分子(即所述分子式条件活性的)。
在其他实例中，在步骤中，通过在两种不同的条件下筛选和/或选择，鉴定条件活性分子。例如，条件活性分子可以通过以下方式鉴定：首先选择在第一组条件下具有活性的分子和/或排除在第一组条件下无活性分子(阳性选择)。随后在第二组条件下进行数轮筛选，并鉴定在第一组条件下比在第二组条件下表现出更大活性的分子。在另一实例中，可以通过首先排除在第二组条件下具有活性的分子来鉴定条件活性分子(阴性选择)。在阴性选择的实例中，将未满足一定标准如高于或低于活性阈值的分子，从随后的数轮筛选和/或选择中排除。因此，鉴定仅在第一组条件下表现出活性的分子。因此，在第一和/或第二组条件下筛选的分子可以包括所有在其他组的条件下筛选的分子或其子集。可以重复阳性选择和阴性选择，直到鉴定了具有预定条件活性的分子。
所述方法可以多次进行，从而所述方法的步骤重复1、2、3、4或5次。例如，可以再筛选被鉴定为与在第二组条件下相比在第一组条件下表现出活性增强的测试分子，例如蛋白变体，以证实活性。本发明所提供的方法还是迭代的。在一实例中，在实施所述方法后，可以修饰或进一步修饰任何鉴定的条件活性分子，以增强或优化条件活性。例如，可以通过在第一修饰条件活性蛋白中引入其他修饰产生第二文库。例如，可以组合被鉴定为增强条件活性的修饰。可以利用本发明所述的测定和方法测试第二文库。在所述方法迭代方面的另一实例中，分子被鉴定为未表现出条件活性，从而使得它们在第一组条件下是无活性的或活性并未增强，针对条件活性，可以对所述分子进行进一步修饰和再测试。可将进一步修饰靶向与分子的活性和/或稳定性相关的具体区域(如具体氨基酸残基)附近。
所述方法步骤的描述和所述方法的组成提供于下文的子章节中。
1.治疗蛋白
用于实施本发明以鉴定条件活性分子的受试分子，可以是已知治疗或改善一种或多种具体疾病或疾病状况的治疗蛋白。例如，治疗蛋白是已知治疗或改善肿瘤或癌症的蛋白。在一些实例中，受试分子是包括一种或多种修饰如氨基酸取代、***或缺失的治疗蛋白的变体。因此，所述方法可以用于鉴定与正常组织或细胞细胞相比在患病微环境如肿瘤环境中是治疗活性的变异治疗蛋白。示例性的治疗蛋白是肿瘤或癌症治疗剂，从而使得所述方法可以用于鉴定在肿瘤微环境中比在正常微环境中更具有活性的条件活性治疗剂。
在所述方法的一些实例中，所述方法是鉴定与在正常生理条件下相比在肿瘤微环境中表现出活性改变的分子的高通量筛选方法。因此，所述方法可以用于发展治疗蛋白的活性，如结合活性。特别是，所述方法可以用于筛选现有治疗蛋白的变体，以鉴定在肿瘤的疾病微环境而不是在正常组织中优先具有活性的那些变体。例如，可以诱变与已知的毒性相关的治疗蛋白并在本发明所提供的测定中筛选，以鉴定与不含有所述突变的治疗剂相比仅凭借在肿瘤微环境中的优先活性而副作用降低的变异蛋白。因此，所述方法可以用于鉴定条件活性生物制剂(CAB)。所得的鉴定的CAB可能是候选的癌症治疗剂。
a.肿瘤或癌症治疗剂
在一些实例中，测试分子是为已知的临床候选癌症治疗剂或现有癌症治疗剂的变体的治疗蛋白。可以在本发明所提供的方法中筛选已知癌症治疗蛋白的变体，以鉴定在患病微环境如肿瘤微环境中比在正常环境中表现出更高的活性的发展的治疗蛋白。例如，如果活性是结合活性，则本发明所提供的方法可以用于鉴定与正常微环境相比在肿瘤或癌症微环境中优先结合的条件活性癌症治疗蛋白。
例如，用作产生变体的测试分子或支架的治疗蛋白可以是与靶蛋白相互作用的蛋白，所述靶蛋白在肿瘤或癌症的治疗中是干预点。这类癌症促进靶蛋白包括与癌细胞和肿瘤的增殖、血管形成或细胞生长特性相关的任何配体、受体、酶或其他试剂。可以基于治疗干预的已知靶标选择靶蛋白。所述靶标可以是治疗蛋白的同源结合伴侣或替代的蛋白抗原。已知的癌症治疗剂的靶标是已知的。这类靶蛋白的实例是表中所示的任何靶蛋白，包括但不限于EGFR、HER2、CD20、VEGF-A、EpCAM、CD3、CD33、CD80、CTLA-4、α5β1整联蛋白、间皮素或IGF-1R。例如，示例性的治疗分子是与EGFR相互作用或具有与EGFR相互作用相关的治疗效果的分子或蛋白。
可以用于产生修饰蛋白并可以在本发明的测定中筛选的示例性肿瘤或癌症治疗蛋白列于表3中。所述表还列举了癌症治疗剂的靶蛋白，如同源或替代蛋白抗原。因此，在本发明所提供的方法中，可以筛选结合它们的同源靶蛋白如替代蛋白配体的癌症治疗蛋白或修饰的癌症治疗蛋白，和/或可以筛选实现靶蛋白活性改变的治疗蛋白或修饰的癌症治疗蛋白。鉴定或选择的、在肿瘤微环境中是条件活性的蛋白，如突变蛋白，是与正常生理条件相比，在模拟肿瘤微环境的体外条件下表现出优先结合活性和/或其他活性的蛋白。在一些实例中，也可以鉴定，与非修饰蛋白、例如不含有突变的治疗或亲代对照抗体相比，在肿瘤微环境中表现出活性增强的修饰蛋白。
Figure BDA00003151467300351
Figure BDA00003151467300361
Figure BDA00003151467300371
b.产生修饰蛋白的文库
用于所述方法中的治疗蛋白可以是为现有治疗剂的非修饰蛋白。也可以筛选现有治疗剂的文库或集合。在其他实例中，治疗蛋白包括修饰蛋白，如修饰肽、修饰酶、修饰抗体或其他修饰多肽。在修饰治疗剂用于实践所述方法的实例中，可以进行利用非修饰蛋白的测定，作为阳性对照，用来与以修饰蛋白进行的测定的结果进行比较。
可以利用改变蛋白结构的本领域技术人员已知的任何方法修饰治疗蛋白。修饰的实例包括蛋白的一个或多个氨基酸的取代、添加以及缺失，以形成修饰的治疗蛋白的文库或集合。可以在本发明所提供的测定中，在模拟患病微环境和正常微环境的条件下，筛选所述文库或集合，以鉴定条件活性治疗蛋白。
产生供用于本发明方法中的修饰蛋白或变异蛋白，在本领域技术人员技能范围内。诱变的方法在本领域内是熟知的，并包括例如定点诱变，诸如，例如QuikChange(Stratagene)或饱和诱变。诱变方法包括但不限于位点介导的诱变(site-mediated mutagenesis)、PCR诱变、盒式诱变、定点诱变、随机点诱变、利用含有尿嘧啶的模板的诱变、管核苷酸定点诱变、硫代磷酸修饰的DNA诱变、利用有缺口的双链DNA的诱变、点错配修复、利用修复缺陷宿主菌株的诱变、限制-选择和限制-纯化、缺失诱变、通过总基因合成的诱变、双链断裂修复以及技术人员已知的许多其他方法。在本发明的方法中，可以在蛋白的全长或蛋白的区域内实现诱变。可以理性地或随机地进行突变。
如果测试分子是蛋白，则修饰可以包括所述蛋白的一个或多个氨基酸的取代。在一些实例中，随机选择修饰。在一些实例中，选择导致分子具有条件活性的修饰。例如，合理的诱变包括突变本领域已知的或确定对于治疗蛋白的活性和/或结构稳定性重要的氨基酸。已知重要的残基的实例包括，例如活性位点残基或结合口袋中的氨基酸。例如，可以选择对于治疗蛋白的活性或结构稳定性重要的氨基酸使其被取代，从而形成可以筛选以鉴定条件活性治疗蛋白的修饰的治疗蛋白文库。同时，突变的残基还可以根据经验利用技术人员已知的方法来鉴定，包括定点诱变、丙氨酸扫描、结构/功能关系、同源性建模、理论建模以及本文所述的任何测定。此外，可以通过随机选择待取代的氨基酸形成文库。在本的方法中，可以产生并测试或筛选突变蛋白的文库或集合。
为了鉴定在疾病条件、例如存在于肿瘤环境中的酸性条件下更具有活性的条件活性蛋白，可以用具有可以在两种pH条件之间改变质子化状态的可电离基团的氨基酸独立地取代所述蛋白中的一个或多个氨基酸。具体氨基酸的选择取决于正被测试条件活性的具体pH。本领域技术人员可以选择一个或多个包括可以在两个不同的pH值之间改变质子化状态的可电离基团的取代氨基酸。例如，可以用汉—哈氏公式(Henderson-Hasselbalchequation)(pH=pKa+log([A-]/[HA])测定氨基酸的质子化和未质子化侧链的比例，作为侧链pKa的函数，pKa可以利用本领域已知的任何方法测量(例如滴定曲线和/或核磁共振)或可以利用本领域技术人员已知的任何方法计算(Davies et al.(2006),BMC Biochem.7:18;Juffer(1998),Biochem.CellBiol.76(2-3):198-209;Sham et al.(1997),J.Phys.Chem.B101(22):4458-4472;Nielsen(2007)J.Mol.Graph.Model.25(5):691-699;Bas et al.(2008),Proteins73(3):765-783)，如分子动力学建模(e.g.,Li et al.(2005),Proteins,61:704-721;Bas et al.(2008),Proteins,73:765-783)或泊松-玻尔兹曼方程(Poisson–Boltzmann equation)(Fogolari et al.(2002)J.Mol.Recognit.15(6):377–392)。在一些实例中，利用氨基酸侧链的模型值测定氨基酸的pKa(参见例如,Nielsen(2001),Proteins43(4):403-12)。蛋白中可电离残基的质子化状态可以以pH依赖性方式改变蛋白的一种或多种活性(如亲和性、催化活性、溶解性、电荷以及稳定性)。(Rostkowski et al.(2011),BMC Struct.Biol.11:6)。这类残基的实例是Asp、Glu、Lys、Arg以及His。
特别是，出于本发明所提供的方法鉴定在低pH肿瘤微环境中活性改变的蛋白的目的，可以将治疗分子的氨基酸残基变成组氨酸。例如，已经将组氨酸侧链鉴定为，与pH7.0相比，在pH6.0下参与抗体的pH依赖性亲和性(参见例如Raghavan et al.(1995)Biochemistry,34:14649-14657)。
在一些实例中，实施本发明所提供的方法，从而使得在测试所述蛋白之前，每一突变的蛋白是以推理而知的。例如，本发明所提供的方法可以有利于诱变和筛选或可寻址的测试方法。这可以允许在活性测定条件之间进行便利的比较，所述活性测定条件，例如结合测定条件，在二元比较测定方法中模拟患病微环境和正常微环境的。例如，定点诱变方法可以用于单独产生突变蛋白。诱变可以通过依次取代具体靶标位置处的单个氨基酸残基来进行，从而使得所产生的个体突变体都是每一诱变反应的单个产物。可以设计突变的DNA分子、使其利用诱变产生，并将其单独克隆于诸如可寻址阵列中，从而使得它们以物理方式彼此分离，并且每一突变的DNA分子都是独立诱变反应的单个产物。选择用来取代被优化的具体蛋白上的靶标位置的氨基酸可以是所有剩余的19种氨基酸或仅含有所选氨基酸的更局限的组。在本发明所提供的一些方法中，被取代的每一种氨基酸独立地被19种剩余的氨基酸取代，或比小于19种的剩余氨基酸取代，如10、11、12、13、14、15、16、17或18种剩余的氨基酸。
修饰蛋白，例如来源于突变的DNA分子集合的突变蛋白分子彼此可以以物理方式分离，例如通过在诸如可寻址阵列的阵列中格式化。因此，可以产生许多修饰的蛋白分子，如突变的蛋白分子。例如，本发明所提供的方法所用的修饰蛋白可以在具体靶位置处含有单个氨基酸取代。本发明所提供的方法，可以在每一修饰蛋白上、在本文所述的一种或多种测定条件下进行。一旦鉴定了在患病微环境中表现出优先活性的、含有单个突变的修饰蛋白，则可以产生含有单个氨基酸突变的一些或所有排列的组合突变体，如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多个突变。
(a)修饰的治疗抗体
在一些实例中，利用为修饰的治疗抗体的修饰的治疗蛋白实施所述测定。用于本发明所提供的方法中的抗体通常含有可变重链和可变轻链或其足以形成抗原结合位点的部分。然而，应当理解的是，抗体还可以包括全部或部分恒定重链(例如一个或多个CH结构域，如CH1、CH2、CH3以及CH4，和/或恒定轻链(CL))。因此，抗体可以包括为全长抗体的那些抗体，且也可以包括其片段或部分，包括例如Fab、Fab'、F(ab’)2、单链Fvs(scFv)、Fv、dsFv、双价抗体、Fd和Fd’片段、Fab片段、scFv片段以及scFab片段。应当理解到，所得到修饰抗体可以作为全长抗体或其片段产生，如Fab、Fab'、F(ab’)2、单链Fvs(scFv)、Fv、dsFv、双价抗体、Fd和Fd’片段、Fab片段、scFv片段以及scFab片段。此外，任何同种型的恒定区都可以用来产生全部或部分抗体片段，包括IgG、IgM、IgA、IgD以及IgE恒定区。这类恒定区可以从任何人类或动物种类获得。应当理解到，活性和结合亲和性可以不同，这取决于抗体的结构。例如，通常二价抗体，例如二价F(ab’)2片段或全长IgG，比单价Fab抗体具有更好的结合亲和性。因此，如果Fab对于具体靶标具有指定的结合亲和性，则预料所述结合亲和性对于二价的全长IgG甚至更大。因此，抗体之间结合亲和性的比较通常在具有相同结构的抗体之间进行，例如Fab与Fab进行比较。
可以产生并在本发明所提供的方法中筛选抗体变体。特别是，可以产生现有抗体癌症治疗剂的变体，如抗EGFR抗体的突变体，例如Erbitrux的突变体。在一些实例中，用含有位于抗体的任何位置处的一个或多个氨基酸修饰的修饰变体实施所述法方法。在本发明所提供的方法的一些实例中，在抗体的可变重链和/或可变轻链中进行修饰。
通常，将氨基酸突变引入抗体的一个或多个CDR中。例如，可以将氨基酸突变引入编码重链和/或轻链可变区的CDR1、CDR2和/或CDR3区的序列中。在一些实例中，还可以在抗体的构架区(FR)，特别是，在已知参与与抗体接触的FR残基中进行突变。基于卡巴特或Chothia编号(参见例如Kabat,E.A.et al.(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest,Fifth Edition,U.S.Department of Health and Human Services,NIH PublicationNo.91-3242，以及Chothia,C.et al.(1987)J.Mol.Biol.196:901-917)，本领域技术人员知道并且可以鉴定CDR和FR。例如，基于卡巴特编号，CDR-L1对应于残基L24-L34；CDR-L2对应于残基L50-L56；CDR-L3对应于残基L89-L97；取决于长度，CDR-H1对应于残基H31-H35、35a或35b；CDR-H2对应于残基H50-H65；以及CDR-H3对应于残基H95-H102。例如，基于Kabat编号，FR-L1对应于残基L1-L23；FR-L2对应于残基L35-L49；FR-L3对应于残基L57-L88；FR-L4对应于残基L98-L109；FR-H1对应于残基H1-H30；FR-H2对应于残基H36-H49；FR-H3对应于残基H66-H94；以及FR-H4对应于残基H103-H113。
产生含有突变的抗体文库的方法是本领域技术人员熟知的，并包括例如，通过利用易错PCR随机在体外引入突变，利用已知的抗体作为模板(Zhou et al.,(1991)Nucleic Acids Research19(21):6052；以及US2004/0110294)；随机突变一个或多个CDR或FR(参见例如WO96/07754;Barbas et al.(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.,91:3809-3813;Cumberset al.(2002)Nat.Biotechnol.,20:1129-1134;Hawkins et al.(1992)J.Mol.Biol.,226:889-896;Jackson et al.,(1995)J.Immunol.,154:3310-3319;Wu et al.(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.,95:6037-6042;McCall et al.(1999)MolecularImmunology,36:433-445)；寡核苷酸定点诱变(Rosok et al.,(1998)TheJournal of Immunology,160:2353-2359)；密码子盒式诱变(Kegler-Ebo et al.,(1994)Nucleic Acids Research,22(9):1593-1599)；简并引物PCR，包括两步PCR和重叠PCR(U.S.Patent Nos.5,545,142,6,248,516和7,189,841；Higuchi et al.,(1988)Nucleic Acids Research16(15):7351-7367；以及Dubreuil et al.,(2005)The Journal of Biological Chemistry280(26):24880-24887)；通过以下方式的结构域穿梭：将利用噬菌体展示所选的VH或VL结构域与由未免疫的供体所获得的天然存在的V结构域变体库重组，并在数轮链再混编中筛选较高的亲和性，这描述于Marks et al.,Biotechnology,10:779-783(1992)中。例如，如上文所讨论的，可以以可寻址模式依次实现CDR或FR残基的诱变，从而产生易于在本发明的二元测定方法中筛选的个体突变体。
i.修饰的抗EGFR治疗剂
在本发明所提供的方法的一些实例中，被修饰用于本发明方法中的治疗蛋白是与全部或部分表皮生长因子受体相互作用的蛋白(EpidermalGrowth Factor Receptor,EGFR)。因此，例如，用于在本发明的方法中进行诱变和筛选的治疗蛋白是与EGFR的细胞外结构域、与EGFR的细胞质结构域或与EGFR的内部酪氨酸激酶结构域相互作用的蛋白。在一些实例中，非修饰治疗蛋白是抑制EGFR介导的信号转导的蛋白。例如，蛋白与EGFR的相互作用可以防止EGFR与EGFR的一个或多个配体相互作用，包括，例如，EGF、TGF-α、双调蛋白、肝素结合EGF(HB-EGF)以及乙胞素。在具体实例中，抗EGFR的治疗蛋白防止EGFR与EGF和/或TGF-α相互作用。治疗蛋白可以与EGFR相互作用，并抑制EGFR与其他EGFR受体亚基的二聚化(即EGFR同源二聚体)或与其他生长因子受体(如HER2)的异源二聚化。
在一些实例中，与EGFR相互作用的蛋白是抗EGFR抗体。抗EGFR抗体可以是人源化抗EGFR抗体。因此，供用于本发明所提供的方法中的修饰蛋白的实例，如本发明提供的抗体变体，是修饰的抗EGFR抗体。可以进行诱变并用于本发明所提供的方法中的抗EGFR抗体的实例包括Zhu(WO2005/090407)的称为11F8的抗体、EMD72000(马妥珠单抗)、VectibixTM(帕尼单抗;ABX-EGF)、TheraCIM(尼妥珠单抗)和Hu-Max-EGFR(扎鲁目单抗)以及本文所述的抗EGFR抗体。特别是，本发明提供抗EGFR抗体
Figure BDA00003151467300421
变体，用于在本发明的方法中筛选在肿瘤微环境比在正常环境中更具有活性的条件活性蛋白。
抗EGFR抗体以及小分子可以特异性结合正常细胞和肿瘤细胞两者上的EGF受体，并竞争性抑制表皮生长因子(EGF)与其同源受体的结合。封闭可以防止受体磷酸化和受体相关激酶活性的激活，从而最终切断导致细胞死亡的受体介导的细胞信号传导。具体而言，抗EGFR抗体
Figure BDA00003151467300422
(西妥昔单抗或C225)(SEQ ID NO:1和2)是抗EGFR的嵌合抗体，用于治疗结肠直肠癌和鳞状细胞癌。
Figure BDA00003151467300428
是人类-小鼠嵌合单克隆EGFR拮抗剂抗体，其结合EGFR的细胞外结构域并阻断配体结合。
Figure BDA00003151467300423
与EGFR的结合可以抑制二聚作用并最终抑制肿瘤生长和转移(Blick et al.,(2007)Drugs67(17):2585-2607)。
Figure BDA00003151467300424
通过抑制血管形成也可以诱导抗肿瘤作用。
Figure BDA00003151467300425
以剂量依赖性的方式抑制VEGF、IL-8和bFGF在高转移性人类TCC253JB-V细胞中的表达，并降低微血管密度(Perrotte et al.(1999),Clin.Cancer Res.,5:257-264)。
Figure BDA00003151467300426
可以在体内或体外下调肿瘤细胞中的VEGF表达(Petit et al.(1997),Am.J.Pathol.,151:1523-1530;Prewett et al.(1998),Clin.Cancer Res.4:2957-2966)。
在美国，
Figure BDA00003151467300427
已经获得许可单独使用或与放射疗法联合来治疗头颈鳞状细胞癌(SCCHN)，所述头颈鳞状细胞癌在世界范围内是癌症死亡的第六主要原因。约40%患有SCCHN的患者表现出转移性疾病，并且在一项为期5年的研究中，I期疾病的存活率为91%，II期疾病的存活率为77%，III期疾病的存活率为61%，IVa期疾病的存活率为32%，IVb期疾病的存活率为25%，以及IVc期疾病的存活率小于4%(Lefebvre(2005)Ann.Oncol.16(Suppl6):vi7-vi12)。与伊立替康联合的西妥昔单抗已经获得许可来治疗患有表达EGFR的肿瘤的患者的治疗转移性结肠直肠癌(mCRC)，所述患者难以被基于伊立替康的疗法治愈(Blick et al.,(2007)Drugs67(17):2585-2607)。
抗EGFR试剂，如抗体
Figure BDA00003151467300431
与明显且特征性的不良事件有关，如皮肤毒性和消化不良(包括恶心、呕吐、腹泻)，所述不良事件经常导致剂量给药中断和不连续的治疗。Erbitux可以防止皮肤EGFR配体结合未分化的角质细胞上的受体，从而导致未分化的细胞聚集和补充上皮的成熟细胞的缺乏。这可以导致重度痤疮样皮肤皮疹(Eng C(2009)Nat.Rev.Clin.Oncol.6:207-18)。作为副作用的结果，76%的患者与剂量给药中断相关，60%的患者与剂量降低有关，以及32%的患者与剂量不连续相关。
Figure BDA00003151467300432
的其他可能副作用包括深静脉和动脉血栓形成、痤疮、呼吸困难、疲劳、腹痛、无力以及心房颤动(Fakih and Vincent,(2010)Curr.Oncol.17(S1):S18-S30)。在一些病例中，副作用可能阻止患者接受西妥昔单抗的进一步治疗。因此，需要表现出最小化的或有限的***副作用，但是还在肿瘤微环境内保留它们的靶标结合活性的治疗分子，如治疗蛋白。
可以产生并在本发明提供的测定中筛选抗EGFR抗体的抗体变体，如被实施用来模拟患病微环境和正常微环境的二元测定。本发明提供抗EGFR抗体的抗体变体的集合，所述抗体变体在抗EGFR抗体的可变重链和轻链总含有单个氨基酸取代(参见例如实施例8和图1)。特别是，在CDRL1、CDRL2、CDRL3、CDRH1、CDRH2以及CDRH3中和在与EGFR接触相关的构架残基中的100个残基中的每一个残基，都可以独立地被多达19种其他氨基酸取代，例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18或19种氨基酸，并且特别是至少或约至少15个其他氨基酸残基。在抗EGFR抗体Erbitux中，CDR-H1对应于SEQ ID NO:2的氨基酸26-35或31-35；CDR-H2对应于SEQ ID NO:2的氨基酸50-65，CDR-H3对应于SEQ ID NO:2的氨基酸98-108，CDR-L1对应于SEQ ID NO:1的氨基酸24-34，CDR-L2对应于SEQ ID NO:1的氨基酸50-56，以及CDR-L3对应于SEQ ID NO:1的氨基酸89-97。选择用来修饰的氨基酸包括SEQ ID NO:2的重链残基23-37、50-77、93-94和96-112以及SEQ ID NO:1的轻链残基1-5、24-34、48-56、86-87和89-100。(参见图1)。在变异的抗EGFR抗体的集合中，集合中的所有位置都可以含有针对组氨酸的氨基酸取代，除了组氨酸存在于亲代Erbitux抗体的那些位置。可以将抗EGFR抗体集合提供于可寻址阵列中。
可以产生并在本发明的二元测定中筛选抗EGFR抗体的抗体变体，例如变异的Erbitux抗体，以鉴定用于治疗癌症的改善的变异的抗EGFR类似物。例如，本发明所提供的方法可以用于测试抗EGFR变异抗体，例如变异的Erbitux抗体，并鉴定与pH降低且乳酸盐浓度升高、而非正常生理pH的肿瘤微环境中的EGFR结合的一种或多种变体。
2.在条件活性的两种不同的生理条件下筛选或测试活性
在本发明所提供的方法中，在两组不同的条件下筛选或测试一种或多种分子例如上文所述的任何分子的活性，所述两组不同的条件模拟两种不同生理环境中的一种或多种条件，例如患病微环境和非患病微环境的正常生理条件。通常，所述条件是可以在体外模拟或复制的条件。一组条件可以包括模拟与疾病相关的微环境的一种或多种条件。疾病可以改变细胞内和细胞外的内环境稳定。例如，患病微环境可以模拟肿瘤微环境或癌症微环境中的一种或多种条件。通常，在所述两组条件下活性的一种或多种差异可以导致分子的条件活性。因此，将与第二组条件(例如模拟正常或非患病环境中的条件)相比，在第一组条件(例如模拟肿瘤微环境中的条件)下表现出更强活性的分子鉴定为是条件活性的候选分子。
可以选择两组条件，以由在两种生理环境中不同的一个或多个参数来改变，所述参数如本文所述或本领域技术人员已知的参数，包括但不限于化学条件、生物条件或物理条件。可以在两组条件之间改变的参数可以包括选自以下的一种或多种条件：压力、温度、pH、离子强度、浊度、暴露于光(包括UV、红外或可见光)、诸如电解质的一种或多种溶质的浓度、乳酸的浓度、O2的浓度以及氧化剂和还原剂的存在。通过改变校准液中的电解质和缓冲液***，可以将诸如pH、缓冲容量、离子环境、温度、葡萄糖浓度以及离子强度等的生理条件调整为待模拟的生物环境的那些生理条件。经选择，模拟正常生理环境的一组条件与模拟患病微环境如肿瘤微环境的一组条件的不同，可以在于一种或多种本文所述的条件。
例如，如下文所讨论的，与非肿瘤微环境相比，肿瘤微环境的各种参数不同，包括但不限于氧浓度、压力、存在辅因子、pH、乳酸盐浓度和丙酮酸盐浓度。可以在体外复制任何这些参数，以模拟与存在于非肿瘤或正常环境中的条件相比存在于肿瘤或癌症环境中的一种或多种条件。可以模拟的正常生理条件包括见于身体的任何部位的健康或非环境组织中的环境，如GI道、皮肤、脉管***、血液以及细胞外基质。
通常，在本发明的测定中，通过选择用于评估蛋白活性的缓冲液，可以在体外模拟生理条件。例如，利用用于在测定中评估蛋白活性的测定缓冲液中的差异，可以模拟患病微环境(如肿瘤微环境)和非患病环境的任何一种或多种条件。因此，在本发明鉴定条件活性蛋白的方法中，可以改变测定缓冲液的一种或多种组分或一种或多种特征，或使其在在第一条件下测试活性的第一测定中和在在第二条件下测试活性的第二测定中不同。例如，如本文所讨论的，与非肿瘤环境相比，肿瘤微环境的各种参数不同，包括但不限于氧、压力、存在辅因子、pH、乳酸盐浓度(乳酸盐浓度增加或降低)和丙酮酸盐浓度(包括丙酮酸盐浓度增加或降低)。通过选择具体测定缓冲液，可以在体外模拟这些参数中的任意一种或多种。
模拟患病微环境的测定缓冲液的组成经选择，可以与模拟正常环境的测定缓冲液的组成相同，例外是在患病微环境中改变的已知的或本文所述的一种或多种条件。此外，在两组不同条件下筛选或鉴定一种或多种测试分子的活性时，通常仅在测定中改变的条件与模拟体内微环境的缓冲液条件相关。对于两组条件而已，测定的其他条件，如时间、温度以及孵育条件，可以是相同的。
通常，同一基础缓冲液可以用于模拟患病微环境的条件和模拟正常微环境的条件中，但是可以使缓冲液组成的设计在一个或多个参数方面不同，如pH、氧、压力、存在辅因子、pH、乳酸盐浓度(乳酸盐浓度增加或降低)和/或丙酮酸盐浓度(包括丙酮酸盐浓度增加或降低)。在模拟患病微环境的条件和模拟正常微环境的条件中，可以使用的任何基础缓冲液都是本领域技术人员已知的，包括TAPS((N-三[羟甲基]甲基-3-氨基丙磺酸),)、Tris(三(羟甲基)甲胺)、Tricine(N-三(羟甲基)甲基甘氨酸、TAPSO(3-[N-三(羟甲基)甲氨基]-2-羟基丙磺酸、HEPES(4-2-羟乙基-1-哌嗪乙烷磺酸)、TES(2-{[三(羟甲基)甲基]氨基}乙基磺酸)、MOPS(3-(N-吗啉代)丙磺酸)、PIPES(哌嗪-N,N′-二(2-乙基磺酸))、卡可酸盐(二甲胂酸)、SSC(柠檬酸钠盐水,saline sodium citrate)、MES(2-(N-吗啉代)乙基磺酸)以及任何Good的缓冲液(MES、ADA、PIPES、ACES、氯化胆胺(Cholamine chloride)、BES、TES、HEPES、Acetamidoglycine、Tricene、甘氨酰胺(Glycinamide)以及Bicine(N,N-二(2-羟乙基)甘氨酸))。
通过考虑合适的因素，技术人员可以寻找适当的缓冲液，所述因素如缓冲液pKa、溶解性、膜不渗透性、最低盐效应、最下缓冲液浓度影响、有关缓冲液解离的温度和离子组成、稳定性、低光吸收率(参见例如,Goodet al.,(1966)Biochemistry5(2):467-477)。所用的缓冲液的选择可以由本领域技术人员根据经验来确定，这取决于所模拟的一种或多种具体参数。可以在测定中使用的缓冲包括具有pH范围的适当缓能力的任何缓冲液。通常，缓冲的离子强度或浓度越高，则缓冲能力越强。通常，选择反应生理环境的缓冲液。生理缓冲液的实例包括但不限于磷酸缓冲盐溶液(PBS)、汉克平衡盐溶液(HBSS)、林格氏液或克雷布斯液(Krebs)。
此外，在本文所述的任何条件下，可以添加模拟生理条件浓度的人血清来模拟生理环境，如1-40%人血清，在一些实例中5-30%人血清，并且在一些实例中5%、10%、15%、20%、25%或30%人血清。
a.肿瘤微环境
可以选择测定的一组条件，例如，以便与非肿瘤环境或正常生理条件相比，模拟肿瘤微环境(如见于肿瘤微环境内细胞外基质中的条件)中的细胞外和/或细胞内条件。在一些实例中，由于存在与肿瘤相关或肿瘤特异性条件，测定所用的一组条件模拟肿瘤微环境的条件。例如，癌症与许多生物标志物相关，包括pH改变和氧化电势增加、血管形成改变、缺氧、细胞外和细胞pH、组织间隙液压增加(IFP)、氧水平、压力、乳酸盐浓度和丙酮酸盐浓度以及诱导的辅因子(参见下文的表4)(Aluri et al.(2009),Adv.Drug.Deliv.Rev.61(11):940-952;Gerweck and Seetharaman(1996),CancerRes.56(6):1194-1198;Cook et al.(2004),Semin.Radiat.Oncol.14(3):259-266;Schafer and Buettner(2001);Free Radic.Biol.Med.30(11):1191-1212)。可以在测定中模拟这些条件中的任一种或多种条件。
(1)pH
在模拟肿瘤微环境的一组条件的一些实例中，调整一种或多种缓冲液的pH，来模拟肿瘤的微环境。pH改变的微环境是疾病状态中最常见的微环境，例如，肿瘤微环境，并且与其他诸如缺氧的其他特性相比，其在疾病微环境中是最均衡的(参见例如Fogh Andersen et al.(1995)Clin.Chem.,41:1522-1525;Bhujwalla et al.(2002)NMR Biomed.,15:114-119;Helmlingeret al.(1997)Nature Med.,3:177;Gerweck and Seetharaman(1996),Cancer Res.56(6):1194-1198)。例如，在许多肿瘤中，‘瓦氏效应’产生pH范围为5.6-6.8的微环境。与正常生理pH环境相比，本文所述的条件包括模拟低pH细胞外微环境(ECM)的条件。因此，在模拟低pH的条件下和在模拟正常生理pH(如中性pH)的条件下测量活性的测定，可以用于鉴定具有在肿瘤微环境为条件活性的生物功效的分子。
例如，正常微环境条件的pH可以是存在于生理条件下的任何pH，如从约7.0到约7.8的任何pH，至少为或约为或为pH7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7或7.8(参见例如US Patent No.7781405)，在一些实例中pH7.4。
将肿瘤微环境的pH选择为，可以具有比正常微环境更具有酸性的pH，如从约5.6到6.8的任何pH，如小于或约或为pH5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7或6.8。因此，模拟正常微环境的一组条件的pH可以比肿瘤条件更具有碱性。可以将本领域技术人员已知的或本文所述的任何缓冲液调整至期望的pH。
在一些实例中，通过改变测定所用的缓冲液的pH，在所述测定中模拟肿瘤的pH环境。pH和缓冲能力是测定条件的函数，并且可以由本领域技术人员根据经验来测定或选择。可以将本领域技术人员已知的或本文所述的任何缓冲液调整到期望的pH，并用于本文所述的测定中。通过添加诸如HCl的酸或诸如NaOH的碱，本领域技术人员可调整缓冲液的pH。通常，允许缓冲液平衡至测定条件的温度，并且如果必要在使用前，证实并调整缓冲液的pH。
例如，可以将生理缓冲液如克林二氏碳酸氢盐缓冲液(Krebs-Ringerbicarbonate Buffer,KRB)调整至为或约介于5.6-6.8的低pH，例如6.0-6.5，如为或约为6.0。在一些实例中，可以将生理缓冲液例如KRB调整至pH为或约为7.4。KRB缓冲液是可以维持已建立的细胞系和人类初级细胞的结构完整性的平衡盐溶液。此外，碳酸氢盐缓冲***是用于维持哺乳动物血液pH的主要缓冲***之一，并且与粘膜保护和腔缓冲有关(Kaunitz andAkiba(2006),Ailment Pharmacol.Ther.24(S4):169-176)。因此，KRB缓冲液是可以模拟在身体内发现的条件的生理缓冲液。表5列出了与PBS相比的克林二氏碳酸氢盐缓冲液的缓冲液组分。可以用1N HCl将缓冲液调整至最终pH。
Figure BDA00003151467300491
(2)乳酸盐浓度
在正常环境与患病环境如肿瘤环境之间可以不同的条件，可以包括乳酸盐浓度。除了为肝的葡萄糖异生作用底物之外(Gladden,(2008),Med.Sci.Sports Exerc.40(3):477-485)，乳酸盐在许多生化过程中是中重要的媒介物，包括创伤修复、再生、需氧代谢(Gladden(2004),J.Physiol.558(Pt1):5-30)。本领域技术人员熟悉在身体的健康组织中产生和维持乳酸盐的机制(参见例如,Brooks(2010)J.Appl.Physiol.108(6):1450-1451)，并熟悉健康和患病组织两者中的示例性乳酸盐浓度(参见例如,Soliman and Vincent(2010),Acta Clin.Belg.65(3):176-181;Friedman et al.(1995),Crit.Care.Med23(7):1184-1193;Myburgh et al.(2001),Med.Sci.Sports Exer.33(1):152-156)。
在许多肿瘤中，‘瓦氏效应’产生乳酸盐浓度介于10-15mM的微环境。乳酸盐水平升高，据发现与多种肿瘤相关，包括但不限于头颈癌、转移性结肠直肠癌、***以及鳞状细胞癌(参见例如Correlation of High LactateLevels in Head and Neck Tumors with Incidence of Metastasis.Stefan Walenta,Ahmad Salameh,Heidi Lyng,Jan F.Evensen,Margarethe Mitze,Einar K.Rofstad,and Wolfgang Mueller-Klieser.(1997)American Journal of Pathology150(2):409-415;Correlation of High Lactate Levels in Human Cervical Cancerwith Incidence of Metastasis.Georg Schwickert,Stefan Walenta,KolbeinSuiulfor.Einar K.Rofstad,and Wolfgang Mueller-Klieser.(1995)CancerResearch55:4757-4759;High Lactate Levels Predict Likelihood of Metastases,Tumor Recurrence,and Restricted Patient Survival in Human Cervical Cancers.Stefan Walenta,Michael Wetterling,Michael Lehrke,Georg Schwickert,Kolbein 
Figure BDA00003151467300492
,Einar K.Rofstad,and Wolfgang Mueller-Klieser.(2000)Cancer Research60:916–921;In Vitro Proton Magnetic ResonanceSpectroscopic Lactate and Choline Measurements,18F-FDG Uptake,andPrognosis in Patients with Lung Adenocarcinoma.JianFei Guo,Kotaro Higashi,Hajime Yokota,Yosinobu Nagao,Yoshimichi Ueda,Yuko Kodama,ManabuOguchi,Suzuka Taki,Hisao Tonami,and Itaru Yamamoto.(2004)J Nucl Med45:1334–1339;Lactate and malignant tumors:A therapeutic target at the endstage of glycolysis.Saroj P.Mathupala,Chaim B.Colen,Prahlad Parajuli,Andrew E.Sloan(2007)J Bioenerg Biomembr39:73–77;Lactate Metabolismin Patients with Metastatic Colorectal Cancer.Christopher P.Holroyde,Rita S.Axelrod,Charles L.Skutches,Agnes C.Haff,Pavle Paul,and George A.Reichard.(1979)Cancer Research39:4900-4904;Lactate,not pyruvate,isneuronal aerobic glycolysis end product:an in vitro electrophysiological study.A Schurr and R.S.Payne.(2007)Neuroscience147:613–619;Tumor lactatecontent predicts for response to fractionated irradiation of human squamous cellcarcinomas in nude mice.Verena Quennet,Ala Yarominab,Daniel Zipsb,Andrea Rosnerb,Stefan Walentaa,Michael Baumannb,Wolfgang Mueller-Kliesera.(2006)Radiotherapy and Oncology81:130–135)。
本文所述的模拟肿瘤微环境的一组条件可以包括，在一种或多种缓冲液中乳酸盐水平增加。通过调整一种或多种缓冲液中乳酸的浓度，可以在测定中模拟肿瘤的乳酸盐浓度。例如，可以利用一种或多种缓冲液进行测定，所述缓冲液含有为或约为5mM至20mM的乳酸，例如10mM至20mM的乳酸，如15mM至18mM，以及特别是为至少或至少约或为16mM、16.5mM或17mM的乳酸。在一些实例中，将模拟用于本发明所提供的测定中的正常环境的一种或多种缓冲液的乳酸盐浓度调整至为或约介于0.5-5mM乳酸盐，诸如，例如0.2mM至4mM的乳酸，如0.5、1、2、3、4或5mM的乳酸。
(3)缺氧
在正常环境与诸如肿瘤环境的患病环境之间可以不同的一组条件的另一实例可以包括缺氧。缺氧即氧的可利用性降低，是大多数实体肿瘤的特征，并且与几种癌症类型的不良预后有关，包括乳腺癌(Favaro et al.,Genome Med.(2011),3(8):55),这是由于其有助于化学抗性、放射抗性、血管形成、血管生成(vasculogenesis)、侵入力、转移、细胞死亡抗性、代谢改变以及基因组不稳定性(Wilson and Hay(2011),Nat.Rev.Cancer11(6):393-410)。与缺氧和不良预后之间的关联有关的因子是转录因子缺氧可诱导型因子(HIF)，其响应缺氧而被激活并且可以激活调节以下的基因：细胞增殖和存活、pH和迁移、细胞永生化和去分化、干细胞维持、遗传不稳定性、葡萄糖吸收和代谢、自分泌生长/存活、血管形成、侵入/转移以及化疗抗性(Semenza(2009),Curr.Pharm.Des.15(33):3839-3843;Patiarand Harris(2006),Endocr.Relat Cancer S1:S61-75)。缺氧与侵入性增强和远距离转移有关(Hashimoto et al.,(2011)Pathobiology,78(4):181-192)，并促进肿瘤的耐受性和血管形成(Facciabene et al.(2011),Nature475(7355):226-230)。肿瘤缺氧起因于不充足的血液供应和去组织化的肿瘤脉管***，从而影响氧送递(Carroll and Ashcroft(2005),Expert.Rev.Mol.Med.7(6):1-16)。
利用技术人员已知的任何方法，例如缓冲液除气，可以在测定中模拟缺氧条件。例如，可以在使用前，使惰性气体从缓冲液中冒泡(参见例如,Nayler et al.,(1979),11(10):1053-1071)。用N2:CO2(19:1vol/vol)的混合物使缓冲液冒泡，可以模拟缺氧条件(Martou et al.,(2006)J.Appl.Physiol.101(5):1335-1342)。此外，在测定过程中通过以下方式可以维持缺氧条件，在氧(O2)浓度低于大气氧的大气中进行反应，例如小于21%O2(McCord et al.(2009),Mol.Cancer Res.7:489-497)，或将具有小于21%O2的空气向反应中吹泡泡。缺氧条件包括氧浓度小于空气暴露中氧气的平衡浓度的任何条件，并且可以包括例如，0-20%氧，包括0-10%氧，如0%、1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%或15%氧。
此外，模拟正常微环境的条件可以包括对应于通常见于生理条件下的O2浓度的O2浓度。例如，在模拟健康环境的条件下进行的测定，可以在暴露于空气(约21%的气相氧)的反应中进行。在这些条件下，可以将细胞暴露于200μM或更低的溶氧浓度。然而，细胞可以在高于或低于200μM的氧浓度下生长，诸如，例如40μM-400μM。因此，模拟正常微环境的条件可以包括在介于或约介于40μM至400μM范围内的氧浓度，在一些情况下，40μM至200μM，并且在一些情况下，40μM至140μM。如果需要，可通过用空气或空气/氧混合物充气，来提高溶氧浓度。(参见例如,Oller et al.(1989),J.Cell Sci.94:43-49)。
3.条件活性修饰蛋白的检测和鉴定
在所述方法中，在选择一种或多种条件后，在第一条件和第二条件下评估测试分子的活性，诸如治疗蛋白或修饰的治疗蛋白，例如修饰的抗EGFR抗体。评估分子蛋白的活性的各种测定是本领域技术人员已知的，并且取决于具体分子或蛋白。例如，测定包括结合测定或功能测定。示例性测定描述于下文的C部分。例如，为了评估抗EGFR抗体的活性，可以评估与EGFR的结合。
随后比较在每一所述条件下的所得活性。鉴定或选择在第一次条件下表现出更强活性的分子或蛋白，所述第一组条件通常是模拟或复制患病条件例如存在于肿瘤环境中的条件。例如，将在模拟肿瘤微环境的条件下的活性(例如结合活性)与在模拟非肿瘤或正常生理环境的条件下的相同活性(例如结合活性)进行比较。为了比较，可以将活性表示为，在第二条件(例如疾病微环境的条件)下的活性相比在第一组条件(例如非患病的正常微环境的条件)下的活性的比。例如，如果在第一和第二条件之间不同的参数是pH，则可以将活性表示为，在酸性pH相比更中性pH下所观察的活性的比，例如在pH6.0/7.4下的活性比。鉴定或选择表现出比大于1的测试分子，诸如治疗蛋白或修饰的治疗蛋白，诸如抗体或变异抗体，例如修饰的抗EGFR抗体，从而使得所述分子在患病或肿瘤微环境中表现出更强的活性。例如，所述比为或约介于1.5-100，诸如2-50，例如5-30或更多。因此，在所述方法中，可以鉴定条件活性蛋白或变体。
此外，可以将活性与对照进行比较，如不含有突变的蛋白，以便鉴定，与不含有一个突变或多个突变的蛋白相比，在患病或肿瘤微环境中表现出活性增强的蛋白。在一些实例中，可以将修饰蛋白的活性标准化至非修饰蛋白的活性。因此，可以基于标准化活性，测定修饰蛋白的条件活性。作为说明性实例，如果非修饰蛋白所具有的活性在正常微环境和患病微环境中分别为10和1；并且修饰蛋白所具有的活性在正常微环境和患病微环境中分别为2和1，则修饰蛋白在正常和患病环境中的标准化活性分别为0.2(2/10)和1(1/1)。因此，在这种假设的实例中，修饰蛋白在正常微环境中的活性是在患病微环境中活性的2倍,但是其对于患病微环境而言可以是条件活性的，因为修饰蛋白在患病环境中的标准化活性是在正常环境中标准化活性的5倍(1/0.2=5)。因此，本发明所提供的方法可以用于鉴定可以改变修饰蛋白的标准化活性比的修饰。
4.迭代法
在一实例中，在实施所述方法后，可以修饰或进一步修饰任何鉴定的条件活性分子，以增强或优化条件活性。例如，利用鉴定的治疗蛋白或变体作为模板，并通过在第一鉴定的条件活性蛋白中引入其他修饰，可以产生第二文库。例如，可以组合被鉴定为增强条件活性的修饰。可以利用本文所述的测定和方法，测试所述第二文库。
在所述方法的迭代方面的另一实例中，任选地，被鉴定为未表现出条件活性从而使得它们在第一组条件下是无活性的或不具有增强的活性的分子，可以被进一步修饰并再测试条件活性。可以将其他修饰靶向与分子的活性和/或稳定性有关的具体区域(例如具体氨基酸残基)附近。例如，与分子的活性和/或稳定性有关的残基通常是重要残基，并且参与分子的结构折叠或其他活性，如结合。
可以鉴定重要残基，因为当突变时，蛋白的正常活性消除或降低。例如，可以鉴定当突变时，表现出治疗蛋白与其同源结合伴侣的结合活性降低或消除的重要残基。重要残基可以包括位于结合口袋中的残基。特别是，出于本发明的目的，如果条件活性依赖于pH差异(例如肿瘤环境的酸性pH环境)，则可以通过以下方式测定对蛋白的电荷效应：鉴定当突变为带电荷的氨基酸残基(例如Asp、Glu、Lys、Arg以及His)时消除或降低与同源结合伴侣的结合的重要残基。将重要残基鉴定为不应当被靶向诱变以产生条件活性蛋白的残基，因为它们是活性所需的。然而，邻近或位于所鉴定的重要残基附近的残基可以是可以改变并且可以影响诸如结合的特异性活性的具体靶标。例如，邻近残基的突变可以影响结合的口袋，并从而改变结合活性。
因此，在所述方法的任选步骤的实例中，可以鉴定对蛋白活性和/或稳定性、特别是结合(例如在酸性pH下)重要的氨基酸残基，其在本文中称为重要残基。随后，可以用靠近所鉴定的重要氨基酸残基、例如邻近所鉴定的重要氨基酸残基而靶向的氨基酸突变，产生修饰蛋白的另一文库。在一些实例中，突变可以是针对邻近位置处多达19种其他氨基酸残基的任何其他氨基酸的氨基酸取代。在其他实例中，可以合理地或根据经验进行突变，例如，这取决于正发展的具体条件活性。例如，如果正发展pH条件下的条件活性，则在靠近或邻近重要残基的氨基酸残基处的突变，应当针对带电荷的残基，特别是针对组氨酸(H)残基，其带弱电并且其pK约为6.5-6.8。例如，可以产生蛋白突变体文库，其中产生了许多突变或变异蛋白，每一所述突变或变异蛋白都在邻近或靠近重要氨基酸残基的氨基酸残基处含有针对组氨酸的单个氨基酸取代。
可以评估或测定在邻近重要残基的残基中含有突变的许多新突变体中每一突变体的活性。例如，可以单独表达另一文库的每一成员，并且在本文上文所述的第一条件和第二条件下单独测试其活性。在两种条件下测试后，排除在第二条件下(如非期望的环境，如正常组织的生理或中性pH环境)不表达或表现出优先结合的蛋白变体。因此，仅表达在任一条件下表现出相似活性的变体(即不影响活性，如结合)，和/或选择仅在第一条件下表现出优先活性的变体。可以确定突变残基的身份，并将其称为关键残基。
接着，产生包括关键残基位置处的突变的另一组合文库。关键残基处的突变可以是针对多达19种其他氨基酸残基中任何其他残基的氨基酸取代。在其他实例中，可以合理地或根据经验进行突变，这取决于所发展的具体条件活性。例如，如果正在发展pH条件下的条件活性，则关键氨基酸残基残基处的突变可以针对带电荷的残基、特别是针对组氨酸(H)残基。例如，如果鉴定了11个关键残基，则可以产生含有蛋白的组合物文库，所述蛋白具有以任何组合改变的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或所有11个残基。作为实例，如果产生仅关键残基被突变成组氨酸(H)残基的组合文库，则可以将文库中突变体的数量(文库的大小)计算为211个成员或2048个组合突变体，因为每一位置都可以是野生型氨基酸或组氨酸，且存在11个可以突变和组合的位点。应当理解到，排除野生型和11个单个His突变(上文已经测试)，所述文库含有2036个突变。还应当理解到，文库的大小可以增加或降低，这取决于所鉴定的关键残基的数量和在每一关键残基位置所进行的氨基酸取代的数量。随后可以在上文所述的本发明方法中筛选所述另一文库，以鉴定预定条件下的条件活性蛋白，如与非肿瘤或健康环境相比，在肿瘤环境中活性增强。
例如，为了选择在模拟肿瘤微环境(例如pH6.0)的条件下与在正常微环境(例如pH7.4)下相比活性增强的条件活性的修饰的治疗蛋白，诸如，治疗抗体，例如Erbitux，可以突变治疗蛋白中的氨基酸，以形成单氨基酸修饰的治疗蛋白的文库。可以在体外测定中、在模拟肿瘤微环境和正常环境的条件下测定这种文库，以鉴定，当突变时导致在这两种情况下活性丧失的重要残基。例如，文库的一个或多个成员包括这样的修饰蛋白，即其可以被具有可以在两种pH条件下改变质子化状态的可电离基团的氨基酸(诸如例如，Asp、Glu、Lys、Arg、His)独立地取代。蛋白中可电离残基的质子化状态可以以pH依赖性方式改变蛋白的一种或多种活性(诸如亲和性、催化活性、溶解性、电荷和稳定性)(Rostkowski et al.(2011),BMCStruct.Biol.11:6)。重要残基可以被定义为，当突变为带电荷的氨基酸时导致在两种条件下都无活性的氨基酸位置。因此，所述残基是位于结合口袋中和/或否则与有关与其同源结合伴侣结合的电荷效应相关的残基。根据活性筛选，如ELISA筛选，可以鉴定，当突变为带电荷的残基时在pH6.0和7.4下丧失活性的重要残基。
在第二步骤中，在鉴定了重要残基之后，可以测定或评估含有邻近重要残基的氨基酸取代的蛋白变体的活性。取代氨基酸可以随机选自所有可能的氨基酸，或选自所有可能的氨基酸的子集。例如，取代氨基酸可以包括可以在上文所讨论的肿瘤条件和正常条件之间改变质子化状态的氨基酸，如带电荷的氨基酸残基。在具体实例中，在邻近残基处被取代的氨基酸是组氨酸。可以在模仿或模拟肿瘤环境条件(如酸性H和/或高乳酸条件)的第一条件下和在模仿或模拟非肿瘤环境条件(如中性pH7.4和/或较低的乳酸浓度的条件)的第二条件下，评估或测定在邻近重要残基的残基处含有突变的多个新突变体中每一个突变体的活性。表达在任一条件下表现出相似或的变体(即不影响活性，如结合)，和/或选择在第一条件下表现出优先活性的变体。确定所选突变体的突变残基的身份，并将其称为关键残基。
接着，作为最后步骤，产生在所鉴定的关键残基位置处含有所有突变体组合的另一组合文库。为了选择与正常微环境(例如pH7.4)相比在模拟肿瘤微环境(例如pH6.0)的条件下活性增强的条件活性的修饰的治疗蛋白，诸如治疗抗体，例如Erbitrux，取代氨基酸是具有可以在两种pH条件下改变质子化状态的可电离基团的氨基酸(诸如，例如，Asp、Glu、Lys、Arg、His)。例如，产生组合文库，其中在每一关键残基处的取代氨基酸是组氨酸。在模仿或模拟肿瘤环境条件(如酸性pH条件，诸如pH6.0，和/或高乳酸条件)的第一条件下和在模仿或模拟非肿瘤环境(如中性pH7.4和/或较低的乳酸浓度的条件)的第二条件下，可以评估或测定所述组合文库的每一成员的活性。鉴定在第一条件下活性增强的变体，并选择其作为条件活性蛋白。
C.鉴定条件活性分子的测定
在上文B部分所提供的选择或鉴定条件活性治疗分子例如治疗蛋白诸如抗体治疗剂(例如，变异的抗EGFR抗体，诸如变异的Erbitrux抗体)的方法的步骤，可以在适合改变或变更与生理环境有关的一个或多个条件参数的体外或体内测定中实施。通常，所述测定是体外测定。所述测定可以是能够以可检测的或可测量的方式测试或评估治疗分子的活性的任何测定，从而使得在第一条件下所测定的活性和在第二条件下所测定的活性可以进行比较。因此，测定或方法实施两次(即以二元模式)，从而仅首次迭代和第二次迭代中测定的差异是，与第二条件(非患病或正常生理环境)相比，在第一条件(如患病或肿瘤环境)之间不同的参数或条件。例如，如果在如同存在于肿瘤环境中的酸性pH和/或高乳酸盐浓度下评估活性，则实施第一测定，并且实施与第一测定相同的第二测定，除了在如同存在于非肿瘤或正常生理环境的较高的pH(例如中性pH)和/或或较低的乳酸盐浓度下评估活性。
本文所述的任何测定，可以用于评估蛋白的活性，以便产生并鉴定在一个环境中比在另一个环境中更具有活性的蛋白。例如，示例性的测定是测量治疗分子与其同源结合伴侣的结合活性或治疗分子的功能活性的那些测定。为了以二元模式一次评估许多测试分子如蛋白变体的活性，可以以高通量模式发展本发明所提供的测定。本发明所提供的是可以用于本发明所提供的方法中的示例性测定。并非意图限制所述测定。考虑了本领域技术人员已知的任何测定，包括检测结合的测定和功能测定，供用于本发明所提供的方法中。
1.检测结合的测定
在一些实例中，用于本发明所提供的方法中的测定测量测试分子与同源结合伴侣的结合，所述测试分子诸如治疗蛋白或其变体，例如抗体变体(例如EGFR)，所述同源结合伴侣诸如受体、配体或抗原。因此，本发明所提供的是，鉴定和区分两种不同生理微环境之间的活性例如配体结合对的结合活性的体外生理敏感方法。所述方法是鉴定在一种环境中比在另一种环境中表现出更高活性例如结合活性的蛋白的比较方法。例如，本发明所提供的体外测定是在下述条件下单独(例如并行或顺序)实施的结合测定：1)模拟见于肿瘤微环境内细胞外基质中的结合条件的条件，和2)模拟生理结合条件的条件，例如见于非患病位点的生理结合条件。所述方法可以用于鉴定，与非肿瘤微环境的正常生理条件相比，例如与存在于皮肤、GI道或其他组织中的正常生理条件相比，在肿瘤微环境的患病状态下优先结合其配体或受体的任何测试分子。所述方法是二元测定比较方法，从而使同源结合伴侣(如靶抗原或配体)与测试分子在两种不同的结合条件下分别接触。
在所述测定中，筛选在两种模拟的条件下单独和分别结合其同源结合伴侣(例如靶抗原)的每一结合分子(例如治疗蛋白或变体)。例如，可以使治疗蛋白与同源结合伴侣如靶抗原接触，并且，可以评估和比较治疗蛋白对同源结合伴侣的结合活性。测量结合的测定的实例包括，溶液结合测定和固相支持物结合测定，例如表面等离子体共振，以及诸如ELISA的免疫测定。
用于本文所述的结合测定中的示例性同源结合伴侣，包括小分子、肽、蛋白、酶、抗体或其他生物分子。在一些实例中，所述同源结合伴侣是***或癌症的干预点，如与增殖、血管形成或癌症细胞和肿瘤的细胞生长特性相关的任何配体、受体、酶或其他蛋白。因此，提到同源结合伴侣与靶蛋白在本文中交换使用。可以基于治疗干预的已知靶标，选择靶蛋白。例如，在本发明的方法中，可以选择已知癌症治疗剂的替代靶标，作为靶蛋白。应当理解到，本发明的结合测定所用的靶蛋白的选择取决于所筛选的测试分子靶蛋白。表3列出了示例性治疗蛋白的同源结合伴侣或靶蛋白。这类靶蛋白的实力显示于上文的表3中，并且包括例如EGFR(包括全长蛋白或细胞外结构域)、HER2/Neu、CD20(全长或大细胞外环)、VEGF-A、CD52(全长或细胞外结构域)、EpCAM(全长或细胞外结构域)、CD3(全长、细胞外结构域、γ链、ζ链或ε链)、CD33(全长或细胞外结构域)、CD80(全长或细胞外结构域),CD86(全长或细胞外结构域)、CTLA-4(全长或细胞外结构域)、PLGF、α5β1整联蛋白(全长、细胞外结构域、α5或β1)、间皮素(全长或细胞外结构域)以及IGF-1R(全长或细胞外结构域)。
此外，靶蛋白片段可以用于本发明所提供的测定中。例如，靶蛋白，诸如靶抗原，可以作为可溶性蛋白表达。例如，用作靶蛋白的可溶性EGFR是可溶性EGF受体细胞外结构域(sECD)。同源结合伴侣还包括本文所述的包括细胞外结构域和/或细胞内结构域的任何同源结合伴侣的细胞外结构域细胞内结构域。
在本发明所提供的方法的一些实例中，所述测试分子是抗EGFR抗体或其变体，且所述同源结合伴侣是配体或其可溶性片段，诸如，例如，可溶性EGFR受体。表皮生长因子受体(EGFR、HER1、c-ErbB-1；SEQ IDNO:10)是用于干预和治疗各种癌症的靶标。EGFR是跨膜糖蛋白，其是I型受体酪氨酸激酶亚家族的成员，包括EGFR、HER2、HER3以及HER4。EGFR组成型表达于许多正常上皮组织中，包括皮肤和毛囊。EGFR在几种表皮来源的癌症中超表达。在许多人类癌症中检测到EGFR的表达，包括头颈癌、结肠直肠癌。例如，头颈的鳞状细胞癌与EGFR的超表达有关(Parikh et al.,(2011)Indian J Cancer48:145-147)。EGFR与不良的患者预后和对细胞毒性化疗的抗性有关(Ryan and Chabner(2000),Clin.Cancer Res.6:4607-4609;Fox et al.,(1994)Breast Cancer Res.Treat.,29:41-49;Rubin Grandis et al.,(1998)J.Natl.Cancer Inst.(Bethesda),90:824-832;Uhlman et al.(1995)Clin.Cancer Res.,1:913-920;Neal et al.,(1990)Cancer(Phila.),65:1619-1625)。EGFR在上皮肿瘤中超表达，并且EGFR表达可能与肿瘤对细胞毒性剂和化疗的抗性相关(Ryan and Chabner(2000),Clin.Cancer Res.6:4607-4609)。
配体与EGFR细胞外结构域的结合可以刺激二聚化、激活内部酪氨酸激酶结构域以及能激活几种下游信号，包括例如，可以磷酸化bcl-2的蛋白激酶A。(Ryan and Chabner(2000),Clin.Cancer Res.6:4607-4609;Ciardiello and Tortora(1998),Clin Cancer Res.4:821-828)。
在本发明的具体实例中，可以在低pH(<7.4)和升高的乳酸浓度的条件下和在约7.3-7.4的生理pH和低乳酸盐浓度的条件下，评估抗EGFR抗体或其变体与EGFR或可溶性EGFR的结合活性。此外，也可以将人血清包括于结合测定中，以进一步模拟自然环境。可以在鉴定生物分子结合试剂的两种条件之间比较结合活性，与正常生理条件相比，所述生物分子结合试剂在肿瘤微环境条件下表现出更强的结合活性。可以鉴定在模拟肿瘤微环境的条件下比在模拟正常生理条件的条件下表现出对其EGFR同源结合伴侣的更强结合的抗EGFR抗体。
通常，可检测地标记测试分子或同源结合伴侣，从而可以评估和测定结合活性。例如，为了检测结合，可以用可检测部分或标签标记诸如治疗蛋白的测试分子，例如抗体变体(例如抗EGFR抗体变体)，以便促进检测。技术人员能够选择用于测定条件的合适的可检测部分或标签。例如，一些二级试剂(secondary reagent)，如抗Ig抗体，不能用于在含有人血清中检测是抗体的修饰蛋白的结合。此外，抗IgG抗体步不能用于检测是抗体的生物分子的结合。
可以使用任何可检测部部分或能得到检测或鉴定的本领域技术人员已知的其他部分。可以使用例如连接体，将所述部分或标签直接或间接地连接于测试分子，如治疗蛋白或抗体。链接可以位于治疗抗体的N或C末端。可以用于本发明方法中的示例性标签或部分包括但不限于表6所列的任何标签或部分。
Figure BDA00003151467300591
可以使用本领域技术人员已知的能将可检测部分连接于本文所述的治疗抗体的任何连接体。示例性的连接体包括富甘氨酸柔性连接体(-G4S-)n，其中n是正整数，例如1(SEQ ID NO:4)、2(SEQ ID NO:70)、3(SEQ IDNO:71)、4(SEQ ID NO:72)、5(SEQ ID NO:73)或更多。
结合测定可以在溶液中进行，或通过将测试分子或同源结合伴侣附着于固相支持物而进行。在一些实例中，可以由细胞表达同源结合分子或测试分子，并在基于细胞的测定中评估结合。
a)固相支持物结合测定
用于本发明所提供的方法中的测定包括这样的结合测定，在所述测定，在诸如治疗靶蛋白或其变体的测试分子和同源结合伴侣中的一个或两者连接于固相支持物的条件下，测量两者的结合。例如，溶液中的同源结合伴侣可以与固定于固相支持物的测试分子相互作用，或溶液中的测试分子可以与固定于固相支持物的同源结合伴侣相互作用。与溶液结合测定相比，固相支持物可以是有利的，因为固定于固相上可以促进结合蛋白与未结合蛋白的分离。考虑了供用于本发明所提供的方法中中的技术人员已知的任何固相支持物结合测定，包括表面等离子体共振和ELISA。
例如，通过测量样品中分析分子与固定分子的分子结合后发生的折射率变化，可以在高敏感测定中用表面等离子体共振(SPR)来检测未标记的分子的结合(Piliarik et al.,(2009)Methods Mol Biol.503:65-88)。当在金属/介质表面激发表面等离子体波时，发生SPR，表面等离子体波是金属中电子的集体振荡。SPR以角度和波长的具体组合，降低反射的光强度。分子结合可以改变金属膜上超薄有机(绝缘体)层的反射率和厚度，这改变了SPR共振条件。可以使具有同源结合伴侣的溶液经过固定的治疗蛋白，或可以是具有治疗蛋白的溶液经过固定的同源结合伴侣。通过测量SPR信号作为时间的函数，可以测量缔合速率(association rate)。在缔合后，可以使空白溶液经过固定的治疗蛋白或同源结合伴侣，并且可以作为时间的函数测量解离速率。根据缔合和解离速率，可以计算平衡结合常数。(Jecklin etal.(2009),J.Mol.Recognit.22(4):319-29;Nguyen et al,(2007)Methods.42(2):150-61;Tanious et al.(2008),Methods Cell Biol.84:53-77)。因此，可以用SPR测量治疗蛋白与同源结合伴侣之间相互作用的动力学和热力学。
在另一实例中，利用酶联免疫吸附测定(ELISA)可以检测治疗蛋白与同源结合伴侣之间的结合。ELISA是可以用于检测蛋白/配体相互作用例如抗体/抗原相互作用的免疫测定。通常，在ELISA中，抗体/抗原相互作用可以通过测量来自直接或间接连接于抗体/抗原复合体的酶标记的信号而检测。几种ELISA方法是技术人员已知的，并且可以使用本领域技术人员已知的或本文所述的任何ELISA方法，包括直接ELISA和间接ELISA。在直接ELISA中，检测与固定分子相互作用的标记的一抗。直接ELISA可以包括以下步骤：1)用诸如抗体的测试分子的同源结合伴侣(即配体或抗原)涂覆固相；2)将固相与封闭剂一起孵育，以便封闭固相上的非特异性结合位点；3)将固相与结合同源结合伴侣的可检测分子一起孵育；以及4)检测结合的可检测测试分子。在间接ELISA中，检测与一抗相互作用的标记的二抗。间接ELISA包括以下步骤：1)用诸如抗体的测试分子的同源结合伴侣(即配体或抗原)涂覆固相；2)将固相与封闭剂一起孵育，以便封闭固相上的非特异性结合位点；3)将固相与结合同源结合伴侣的测试分子一起孵育；4)与能检测测定缓冲液所含的测试分子而不是能结合治疗抗体的人血清组分的第二检测试剂如标记的二抗一起孵育；以及5)检测第二检测试剂。此外，对于直接或间接ELISA方法，在所述方法的任何步骤之间，可以包括一个或多个洗涤步骤(例如1、2、3、4或更多个洗涤步骤)。
根据同源结合蛋白和所测定的生物分子，依经验确定准确测定或测定条，是本领域技术人员的技能。在固相支持物结合测定所进行的方法的步骤包括1)将同源结合蛋白固定于固相支持物；2)使一种或多种测试分子(例如抗体变体)与同源结合蛋白接触；以及3)检测并鉴定表现出与同源结合蛋白的结合活性的结合的测试分子。应当理解到，可以进行所述方法的步骤，以便将测试分子固定于固相支持物，并且使同源结合分子在那与之接触。可以在模拟两种体内生理条件的条件下进行任何步骤。例如，如果测定是ELISA，则ELISA的任何步骤，如涂覆、封闭、与测试分子(如治疗抗体或其变体)一起孵育或检测，可以在本文所述的条件下进行，如模拟肿瘤微环境(例如pH6.0)的条件下或在模拟正常微环境(例如pH7.4)的条件或本领域技术人员已知的其他合适条件下进行。
下文参考基于基于免疫测定的模式，提供了通用测定方法的描述。本领域技术人员可以使一个或多个步骤适应以其他固相支持物模式实施结合测定，例如通过表面等离子体共振。可以测试上文B部分所述的诸如治疗蛋白或变体的任何测试分子对本文所述的其同源结合蛋白的结合活性。特别是，可以产生抗EGFR抗体的抗体变体例如变异的Erbitux抗体，并在本发明的二元测定中筛选，以鉴定用于治疗癌症的改善的变异的抗EGFR类似物，所述类似物在pH降低和乳酸盐浓度升高的肿瘤微环境内而不是在正常生理pH下结合EGFR。
1)固定于固相支持物
作为所述方法的第一步骤，目的同源结合蛋白(如配体或抗原)适合用于促进结合分子的捕获，从而使得所述结合分子的检测或鉴定稍后可以实现。为了促进捕获，可以将用于筛选的同源结合蛋白提供于溶液、悬浮液中，或可以连接于适合所述测定方法的固相支持物。例如，将同源结合蛋白固定于固相支持物。可选地或另外，可以修饰测试分子以促进捕获。例如，可以将测试分子固定于固相支持物或可检测地标记。通常，在固相支持物上实现亲和测定。
可以用于本发明所提供的亲和测定中的固相支持物，包括能用分子例如测试分子或诸如配体、受体或抗原等蛋白的同源结合伴侣附着的任何载体。通常，为了促进变异的测试分子的高通量筛选(例如，抗体变体如抗EGFR抗体变体的文库或集合)，将同源结合伴侣附着于固相支持物。用作本发明所提供的方法中的固相支持物的载体的实例，包括但不限于玻璃、聚苯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、葡聚糖、尼龙、直链淀粉、天然和修饰纤维素、聚丙烯酰胺、琼脂糖以及磁性固相支持物，如包括磁铁的固相支持物。固相支持物可以是一个或多个珠或颗粒、微球、管或板的表面、滤膜以及本领域已知的其他固相支持物。示例性的固相支持物***包括但不限于由例如玻璃、硅、金属、尼龙、纤维素、塑料或复合材料构成的平表面，包括多孔板或膜；或可以采用珠的形式，如硅胶、可控孔度玻璃、磁性(Dynabead)或纤维素珠。此外，这类方法可以适合在悬浮液中使用或适合以柱的形式使用。
根据具体测定条件来选择合适的固相支持物是本领域技术人员的技能。例如，镍涂覆的微量培养板可能较不适合His-标记的蛋白的结合，因为缓冲液pH可能影响抗原涂覆Ni-涂覆的而不是高结合的平板。确定固相支持物是否适合与变化的pH条件一起使用，是本领域技术人员的技能。
利用本领域技术人员已知的任何方法，可以将测试分子或同源结合伴侣固定于固相支持物。可以使用用于连接的共价或非共价方法。通常，通过从水介质中吸附，固定测试分子或同源结合伴侣(如配体或抗原)。在一些实例中，可以在模拟患病微环境(如肿瘤或癌症微环境)的条件下、在模拟正常微环境的条件下或在本领域技术人员已知的标准条件下进行吸附。例如，可以利用pH范围为或约介于6.0-7.4、在一些实例中为或约为pH7.4的缓冲液，进行吸附。特别是，为了实现吸附，可以使用高亲和微量培养板作为固相支持物。高亲和平板是本领域技术人员已知的，并且可以从各种制造商获得(参见例如Nunc Maxisorp平底板可以从eBioscience,SanDiego,CA,Cat.No.44-2404-21获得;Costar96EIA/RIA Stripwell板，Costar2592)。
可以使用将靶蛋白附着于固体基质的其他模式，如共价偶联或其他公知的方法。连接治疗蛋白和/或同源结合伴侣的共价方法包括化学交联方法。反应试剂可以在支持物与蛋白或同源结合伴侣上的官能团之间产生共价键。可以化学反应的官能团的实例是氨基、巯基以及羧基。N-乙基马来酰亚胺、碘乙酰胺、N-羟基琥珀酰亚胺(hydrosuccinimide)以及戊二醛是与官能团反应的试剂的实例。在其他实例中，可以将测试分子和/或同源结合伴侣间接连接于固相支持物，所用的方法包括但不限于免疫亲和性或配体受体相互作用(如生物素-链霉亲和素或谷胱甘肽S-转移酶-谷胱甘肽)。例如，可以将测试分子涂覆于ELISA板或其他相似的可寻址阵列。
在一实例中，可以用亲和捕获剂涂覆固相支持物，如微量培养板的孔，所述亲和捕获剂结合并捕获测试分子或同源结合伴侣以将其附着于所述固相支持物。可以将测试分子和/或同源结合伴侣修饰为含有与任何所选的亲和捕获剂相容的标签。可以用于本发明测定中的示例性标签或部分包括但不限于His、T7、Myc、HA、VSV-G或Flag Tag(参见例如SEQ IDNO:3,5,7,15-16,25)。这类标签是本领域技术人员熟知的。例如，可以将生物素化的抗His抗体涂覆于含有链霉亲和素的平板上，以促进含有His-tag同源结合伴侣或测试分子蛋白的捕获。链霉亲和素和亲和捕获剂涂覆的平板可以从制造商获得(参见例如Thermo Fisher Scientific,Rockford,IL;Catalog No.15500)，或可以由本领域技术人员制备。如上文所指出的，通常选择与可变的pH环境相容的吸附或固定技术。
在将同源结合伴侣附着于固相支持物的本文的实例中，可以在与筛选的测试分子或测试分子的文库接触前、接触过程中或接触后，将同源结合伴侣(如，sEGFR)附着于固相支持物。例如，在与测试分子一起孵育之前，可以将一种或多种同源结合伴侣预吸附于固相支持物，如层析柱或微量培养板的孔。在其他实例中，使同源结合伴侣与测试分子在溶液中接触，随后将同源结合伴侣捕获于固相支持物上。
在二元模式或重复测定(duplicate assay)中，在相同的条件下，固定固定的试剂，通常同源结合伴侣。通常，用于在两种条件下促进吸附或固定的缓冲液是中性或生理缓冲液。生理缓冲液的实例包括但不限于磷酸缓冲盐溶液(PBS)、汉克平衡盐溶液(HBSS)、林格氏液或克雷布斯液。pH和缓冲能力是测定条件的函数，并且由本领域技术人员依据经验来确定或选择。生理缓冲液的实例是克林二氏碳酸氢盐(KRB)缓冲液(Sigma Aldrich,Catalog No.K4002)。此外，固定的试剂通常是同源结合伴侣，其在固相支持物上的吸附或固定在不含有人血清的缓冲液中实现，因为人血清用于接触步骤或筛选以模拟自然环境条件。
例如，可以将KRB缓冲液或相似生理缓冲液中浓度可变的同源结合伴侣如抗原吸附于固相支持物上。例如，可以吸附以下浓度的同源结合伴侣(例如，诸如sEGFR的抗原)的KRB缓冲液或其他相似的生理缓冲液：为或约为1-50nM,例如，3-30nM，如5-20nM，例如为或约为3、6、9、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40或50nM。待吸附的靶抗原的量是结合剂的函数，并可以使用已知结合靶抗原的对照来根据经验测定。吸附可以以任何请问的时间长度和温度来进行，以允许同源结合蛋白结合固相支持物上的结合位点。例如，吸附通常在4°C-37°C、如4°C、室温(即22°C)或37°C下进行。吸附的时间通常为30分钟到48小时或更多，并且可以随温度函数来改变。例如，可以将同源结合蛋白于4°吸附于固相支持物如高亲和微孔板，持续6小时到48小时，例如12小时到36小时，通常过夜，例如，12小时到24小时。在另一实例中，将同源结合蛋白于室温下吸附于固相支持物如高期货微孔板，持续30分钟到4小时，如1小时到2小时，特别是2小时。可以用与吸附所用的缓冲液相同的缓冲液将固相支持物洗涤一次或多次，例如1、2、3、4或更多次，以除去任何未结合的靶抗原。
2)在模拟条件下接触
在测定中，在模拟两种不同的生理条件即患病微环境和非患病微环境的正常生理条件的条件下，实现结合把绿与试剂的结合。例如，患病微环境可以模拟肿瘤微环境的条件。因此，在靶抗原附着于支持物后，通常作为单独的测定，进行所述方法的随后步骤。因此，对于每一靶抗原，如上文所述，将抗原吸附、连接或固定于副本固相支持物。随后，单独的处理副本支持物，用于在两种变动测定条件下进行亲和测定，一种条件模拟肿瘤微环境，而另一种条件模拟正常的生理环境。这类条件描述于上文的B部分中。如上文B部分所讨论的，应当理解到，在进行单独的测定时，仅变动的条件与模拟体内微环境的缓冲液条件有关。在并行测定中，时间和温度孵育条件通常相同。
例如，在本发明所提供的方法中，在两个单独的测定中，使测试分子与同源结合蛋白接触，以测试结合活性。在一个测定中，如上文所述，在存在模拟肿瘤微环的缓冲液的情况下，使测试分子与同源结合蛋白接触或与之一起孵育。在另一测定中，如上文所述，在存在模拟正常生理条件的缓冲液的情况下，使测试结合分子与同源结合蛋白接触或与之一起孵育。通常，可以以任何期望的时间长度和温度进行孵育反应，以允许测试分子或蛋白结合同源结合伴侣(如抗原)。例如，例如通常在4°C-37°C，如4°C、室温或37°C下进行进行结合。结合的时间通常为30分钟到48小时或更多，并且可以是温度的函数。通常，亲和分子或蛋白的结合在室温下进行或进行约30分钟到4小时，如1小时到2小时，例如约1小时。可以在结合所用的相同缓冲液中洗涤固相支持物，以除去任何未结合的靶抗原。
例如，接触可以用1mM乳酸、pH7.4和25%人血清来进行，以模拟非肿瘤微环境。单独地，接触步骤可以以16.5mM乳酸、pH6.0、25%人血清来进行，以模拟肿瘤微环境。在每一接触反应中，接触可以在室温(即22°C)下进行1小时。
因此，在每一测定条件下，可以将测试分子如治疗抗体或抗体变体(如抗EGFR抗体变体)与同源结合伴侣如靶抗原孵育合适的时间长度和温度，以允许结合在存在必须的缓冲液条件(如患病的或正常微环境)下发生。除了模拟微环境的缓冲液条件，测定条件(时间和温度)是相同的。可以在存在不同浓度的测试分子的情况下进行测定。与同源结合蛋白(如抗原)接触的测试分子的量是例如同源结合蛋白和测试分子(如EGFR和抗EGFR或变体)与具体亲和条件的函数，并且可以根据经验来确定。通常，以连续稀释，测定不同的浓度。可以测试全部上清液、稀释的上清液或纯化的蛋白。如上文所讨论的，用可检测部分或标签标记测试分子，以便促进结合的抗原结合分子复合体的检测，从而评估结合活性。
在一些实例中，在使测试分子(如修饰的治疗蛋白)与同源结合蛋白(如靶抗原)接触之前，通常封闭固相支持物表面上的非特异性蛋白结合位点。因此，使治疗抗体或起变体(如抗EGFR变体)和同源结合伴侣(如EGFR或sEGFR)接触的步骤，通常在封闭步骤之后进行。固相支持物的封闭可以降低与固相支持物的非特异性结合，降低背景信号、降低与吸附的蛋白的非特异性结合以及稳定吸附的蛋白。选择进行封闭的条件，是本领域技术人员能力范围内的事。可以将现有技术所述的任何封闭条件用于本发明所提供的方法中。
因此，例如，在吸附固相结合的同源结合伴侣如靶抗原后，可以将不干扰测定的蛋白的水溶液与固相混合，以将混合的蛋白吸附于含有抗原的固相支持物表面中未被抗原分子占据的表面上的结合蛋白位点。例如，封闭溶液包括含有人类、牛、马或其他血清白蛋白的封闭溶液。通常，封闭溶液含有人血清。固相支持物如平板的封闭，可以用添加了一种或多种封闭剂的亲和测定缓冲液进行。示例性的封闭剂包括1-5%牛血清白蛋白、1-5%脱脂乳粉以及25%人血清。可以将诸如Tween-20的去污剂和诸如thimerisol的防腐剂添加于封闭溶液中。亲和测定缓冲液包括即肿瘤微环境缓冲液或正常生理缓冲液。通常将蛋白水溶液-固相支持物混合物维持30分子、1小时或更长的时间，并且作为温度的函数而变动。封闭反应可以在任何温度下进行，并通常在4°C-37°C、如4°C、室温(即22°C)或37°C下进行。在一些实例中，允许反应在约4°C-37°C的温度下进行至少1小时。例如，可以在室温下、在1小时内实现封闭。在孵育和封闭后，在与测试分子(如治疗蛋白或抗体或其变体)之前，洗涤所得的固相，以除去未结合的蛋白。
3).条件活性测试分子的检测和鉴定
可以选择或鉴定特异性结合同源结合伴侣的测试分子，如治疗蛋白，例如抗体变体(如抗EGFR抗体)。在洗涤掉未结合的蛋白后，可以用于本领域技术人员已知的任何测定或方法，检测治疗蛋白。例如，在存在荧光、放射性或其他可检测部分的情况下，可以促进检测。因为通常标记测试分子(如治疗蛋白，如抗体变体)，因此，了利用抗标签试剂实现检测。抗标签试剂的选择是结合分子或蛋白所用的标签的功能(function)。此外，选择与测定所用的环境条件(例如pH)相容的抗标签试剂。鉴定或选择这类试剂并测试它们与测定条件的相容性，是本领域技术人员的技能。例如，实施例列举了这类方法。
抗标签试剂易于获得，例如从商业来源或其他来源获得。可以用于在本发明的方法中进行检测的示例性抗标签试剂包括但不限于抗FLAG抗体或抗Myc抗体(可从诸如Abcam,Cambridge,MA;GeneTex,Irvine,CA的供应商获得)。
通常，在本发明的方法中，检测结合的分子的方法，是能被定量从而可以评估活性水平的方法。例如，标记可以产生信号，例如比色信号、化学发光信号、化学荧光信号或放射性信号。取决于标记的属性，可以用各种技术检测或检测和定量标记。例如，定量的方法包括但不限于分光光度法、荧光法以及放射性法。
酶标记的实例包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶以及β-D-半乳糖苷酶。可以添加以使信号显影的酶底物的实例包括PNPP(p-硝基苯磷酸，二钠盐)、ABTS(2,2'-联氮双[3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸]-二铵盐)、OPD(o-苯二胺盐酸盐)以及TMB(3,3',5,5'-四甲基联苯胺)(SOMA Labs,Romeo,Mich.)，包括Sureblue TMB Microwell Peroxidase Substrate1-组分(KPL,#52-00-03)。通过添加终止试剂(如TMB终止溶液)，可以终止反应。可以测定合适波长(即450nm)下的吸光度。
对于荧光，可以利用大量荧光计。对于化学发光剂，例如辣根过氧化物酶(HRP)，可以利用光度计或膜。用酶可以以荧光测定法、发光计量法、分光光度法或视觉检查法，测定或测量荧光、化学发光或着色的产物。例如，可以将抗标签试剂缀合于辣根过氧化物酶(HRP)或其他可检测试剂。
通常，孵育反应可以以任何其他的时间长度和温度进行，以允许检测结合分子或蛋白。例如，检测通常在4°C-37°C，如4°C、室温或37°C下进行。结合的试剂通常为30分钟到48小时或更多，并且是温度的函数。通常，结合分子或蛋白的结合为或约为30分钟到4小时，例如1小时到2小时，例如约1小时。可以在结合所用的相同缓冲液中洗涤固相支持物，以除去任何未结合的靶抗原。
一旦在每一测定条件下测定了结合活性，则如上文B.3部分所述，比较第一条件(如患病环境，例如肿瘤环境)下和第二条件(例如非患病或正常环境)下的结合活性。鉴定在第一条件下比在第二条件下表现出更强活性的条件活性分子。例如，活性比为或约为1.5-100，如2-50，例如5-30或更高。
b.溶液结合测定
用于本发明所提供的方法中的测定，包括在溶液中测量治疗蛋白与同源结合伴侣结合的测定。技术人员可以选择溶液结合测定，用于本发明所提供的方法中。以下是可以用于本发明所提供的方法中的示例性溶液结合测定简单描述。然而，并非意图这些是限制性的，并且技术人员已知的任何溶液结合测定都可以考虑用于本发明所提供的方法中，包括平衡透析、竞争性结合测定(例如Myers et al.,(1975)Proc.Natl.Acad.Sci.USA72(9):3683-3686)、放射性标记的亲和测定(例如Feau et al.,(2009)J.Biomol.Screen.14(1):43-48)、量热法(包括等温滴定量热法(ITC)以及差示扫描量热法(例如Perozzo et al.,(2004)J.Recept Signal.Transduct Res.24(1-2):1-52;Holdgate(2001)Biotechniques31(1):164-166,168,170),Celej et al.(2006)Anal.Biochem.350(2):277-284))以及光谱荧光测定，包括荧光共振能量转移测定。本领域技术人员基于本文的描述，可以确定在溶液中测定结合活性的本发明方法的条件。例如，所述条件可以改编自上文所述讨论的用于在固相支持物上进行的亲和测定的条件。
1)等温滴定量热法(ITC)
在ITC中，将一种结合伴侣滴定到含有其他结合伴侣的溶液中，由此产生或吸附热，所述热可以利用热量计来定量。ITC可以用来检测来自纳摩尔或更低数量的反应物的热效应。例如，可以实施等温滴定量热测定来测量所有和治疗蛋白与同源结合伴侣的结合有关的热力学参数，结合的自由能(ΔG)、焓(ΔH)和结合的熵(ΔS)以及热容量变化(ΔCp)。这些特征的分析，可以有助于阐明治疗蛋白与同源结合伴侣之间的结合机制和热力学参数(Perozzo et al.,(2004)J.Recept.Signal.Transduct.Res.24(1-2):1-52)。
2)光谱测定
本领域技术人员已知的任何光谱测定都可以在本发明所提供的方法中用来检测治疗蛋白的结合。修饰蛋白与同源结合伴侣之间的相互作用，可以用本领域技术人员已知的任何光谱测定检测，包括紫外可见光谱技术(UV-vis spectroscopic technique)、诸如荧光共振能量转移测定和荧光淬灭测定的荧光测定(Wu(2007),J.Pharm.Biomed.Anal.44(3):796-801)。例如，由于治疗蛋白结合同源结合伴侣，例如淬灭固有荧光，可以检测荧光或紫外/可见吸收的变化。在一些实例中，可以用荧光标记或紫外/可见标记来标记治疗蛋白和/或同源结合伴侣。在测量光谱信号后，可以计算所观察的结合常数(例如，Zhang et al.(2009)Spectrochim Acta A Biomol.Spectrosc.72(3):621-626)。
c.基于细胞的测定
用于本发明所提供的方法中来检测治疗蛋白与同源结合伴侣结合的测定包括基于细胞的测定，特别是利用细胞表面展示***如哺乳动物细胞表面展示***进行的测定。在示例性方法中，可以将编码治疗蛋白或变异的治疗蛋白文库、包括修饰的治疗蛋白的文库的核酸，引入适合在诸如哺乳动物细胞的细胞中表达的载体中。随后用载体转染细胞，并且利用细胞表达治疗蛋白。可以使含有表面表达的治疗蛋白的细胞库与含有可溶性或表面结合的同源结合伴侣的溶液接触。可以利用能检测与细胞表面的结合的任何测定检测结合活性。通过评估测试分子或治疗蛋白的功能活性，也可以评估活性。考虑了技术人员已知的任何基于细胞的测定，来用于本发明所提供的方法中，包括细胞增殖测定、细胞死亡测定、流式细胞术、细胞分离技术、荧光激活细胞分选术(FACS)、相位显微术(phase microscopy)、荧光显微术、受体结合测定、细胞信号测定、免疫细胞化学以及报道基因测定。在一些实例中，所述测定是荧光激活细胞分选术(FACS)测定。
利用哺乳动物细胞可以将蛋白表达为分泌的可溶性分子、细胞表面分子或细胞内抗体。在示例性方法中，可以在大多数或所有细胞都表现出锚定于细胞表面的蛋白库的条件下，用所述蛋白库转染所述细胞。任选地，可以使用这样的表达***，在所述表达***中，大多数哺乳动物细胞转染子仅具有一个整合于其基因组中的质粒。因此大多数(即至少约70%或约80%或约90%)转染子表达一种治疗蛋白的一个或多个分子。这可以得到证实，例如，通过分离和培养个体转染子；以及扩增表达的序列并对其测序，以确定它们是否具有的单一序列。
在本发明所提供的方法的一些实例中，治疗蛋白是展示于哺乳动物细胞表面的抗体。可以将本文所述的任何抗体，包括全长、二价、功能性抗体，如IgG抗体，表达于哺乳动物细胞的表面。抗体可以是片段，例如，Fab片段或scFv片段。抗体可以包括Fc区，如scFv-Fc，或包含2条重链和2条轻链的全长抗体。技术人员能够选择合适的抗体片段。例如，在哺乳动物细胞中制备的ScFv-Fcs和全长抗体能够相对于scFv's或Fab片段具有若干优势，包括它们的多聚体属性和它们更长的体内半衰期、更高的抗原亲和性以及更小的形成聚集体的倾向。例如，将抗EGFR变异抗体展示于细胞表面，并评估与同源结合伴侣(例如和EGFR或可溶性EGFR)的活性。
(a)测试分子的细胞表面表达
可以将测试分子，诸如治疗蛋白，例如抗体变体(如抗EGFR抗体变体)表达于细胞表面。可以将编码诸如治疗蛋白的测试分子的核酸***合适的载体中，如本文所述的载体，并用于转染细胞。可以使用的细胞系包括本领域所述的或可以从诸如美国典型培养物保藏中心(American TypeCulture Collection)的库获得的任何细胞系。技术人员可以选择具有期望特性的细胞系。例如，在哺乳动物细胞中制备的抗体比在原核细胞中制备的抗体更可能适当折叠和糖基化。在一些实例中，在哺乳动物细胞，例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中表达治疗蛋白。
本领域已知的用于在哺乳动物细胞表面展示诸如抗体的蛋白的任何载体，都可以用于本发明所提供的方法中(参见例如,Zhou et al.(2010),MAbs2(5):508-518)。例如，载体可以编码治疗蛋白的核酸表达为分泌的蛋白、可溶性蛋白或细胞表面蛋白。任选地，为了产生用于哺乳动物转染的足够质量和数量的核酸，载体适合在细胞中表达。这些细胞可以是例如，细菌细胞，如大肠杆菌(Escherichia coli)或枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilus)，或真菌细胞如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。可以选择载体，从而使得宿主细胞仅表达转化的文库的一种类型的治疗蛋白。转染细胞的方法是本领域技术人员已知的(例如Hahn and Scanlan(2010)Top.Curr.Chem.296:1-13)，并包括，例如，化学方法，诸如聚阳离子环状糊精载体(例如，Cryanet al,(2004)Eur J Pharm Sci.21(5):625-33)和脂质体复合体，包括阳离子脂质体(例如，Gao and Huang(1995)Gene Ther.2(10):710-722)。可以使用的示例性的阳离子脂质体包括US7989606所述的那些脂质体，包括3-β-[N—(N′,N′-二甲基-氨基乙烷)-1-氨基甲酰基]-胆固醇(DC-Chol)、1,2-二(油酰基氧-3-三甲基胺基-丙烷(DOTAP)(参见例如，WO98/07408)、赖氨酰磷脂酰乙醇胺(L-PE)、诸如脂精氨的脂多胺、N-(2-羟乙基)-N,N-d-二甲基-2,3-二(十二烷氧基)1-丙基溴化铵、二甲基二十八烷溴化铵(DDAB)、二油酰基磷脂酰基乙醇胺(DOPE)、二油酰基磷脂酰基胆碱(DOPC)、N(1,2,3-二油基氧(dioleyloxy))丙基-N,N,N-三乙胺(DOTMA)、DOSPA、DMRIE、GL-67、GL-89、Lipofectin(脂质体)以及Lipofectamine(Thiery,et al.Gene Ther.(1997);Felgner,et al.,Annals N.Y.Acad.Sci.(1995);Eastman,et al.,Hum.Gene Ther.(1997))。转染的方法还包括非化学方法，例如电穿孔(Chu et al.(1987),Nucl.Acid.Res.15(3)1311–1326.)、超音波穿孔(sonoportation)(例如Kumon,et al(2009),Ultrasound Med Biol.35(3):494–506)、基因枪(例如O'Brien and Lummis(2004)Methods33(2):121-125)以及病毒转导(例如Flotteand Carter(1995),Gene Ther.2(6):357-362)。
在一些实例中，转染子可以表达治疗蛋白以及细胞表面蛋白。技术人员能够选择载体来表达本文所述的修饰蛋白。例如，可以使用整合到哺乳动物细胞系基因组的具***点的载体。可以使用的载体的一个实例是FLP-INTM载体(Invitrogen)，可以将其转染到含有合适的位点特异性染色体整合位点的细胞中。FLP-INTM可以整合到利用酿酒酵母的FLP重组酶经基因改造而含有FLP重组靶(FRT)位点的哺乳动物细胞系基因组的具***点(参见例如,U.S.Patent Nos.5,654,182;5,677,177;5,885,836;6,956,146;和7,884,054;以及O'Gorman et al.(1991),Science251:1351-1355)。可以使用的其他载体***是Cre-LoxP***(Trinh and Morrison(2000),J.Immunol.Methods244:185-193)。Cre重组酶能够催化两个LoxP位点之间的重组。在一些实施方案中，具有稍微序列差异的两个LoxP位点(从而使得两个不同位点之间的重组不能被Cre重组酶催化)可以存在于转染了修饰的抗体编码序列的哺乳动物细胞中，所述编码序列的侧翼是相同的两个不同的LoxP位点。在这种情况下，可以将抗体编码序列***所述两个不同的LoxP位点之间，而同样不可能被Cre重组酶切除。在其他实施方案中，LoxP位点可以是相同的。在另一方面，Cre重组酶的表达或活性可以是条件可控的。
载体所用的调节序列通常来源于哺乳动物、微生物、病毒和/或昆虫基因。调节序列的实例包括转录启动子、操纵基因以及增强子、核糖体结合位点(参见例如Kozak(1991),J.Biol.Chem.266:19867-19870)、内部核糖体进入位点、控制转录和翻译起始和终止的合适序列、聚腺苷酸化信号(参见例如McLauchlan et al.(1988),Nucleic Acids Res.16:5323-5333)以及基质和支架附着位点(参见Phi-Van et al.(1988),Mol.Cell.Biol.10:2302-2307;Stiefet al.(1989),Nature341:343-345;Bonifer et al.(1990),EMBO J.9:2843-2848)。当调节序列在功能上于多肽编码序列有关时，核苷酸序列是可操作连接的。因此，如果启动子核苷酸序列控制编码序列的转录，则启动子核苷酸序列可以可操作地连接于所述多肽编码序列。
表达载体会弹出包含可操作连接于编码治疗蛋白的核酸的、可以指导哺乳动物细胞的转录的启动子。启动子会经常能进行高水平转录。在检测结合需要高水平表达的情况下，则在与FLP-INTM类型的载体相比时，表达载体是有利的。这类启动子的实例包括CMV和SV40病毒启动子、哺乳动物肌动蛋白启动子、包含于劳氏肉瘤病毒的3′长末端重复的启动子、疱疹胸苷激酶启动子或金属硫蛋白基因启动子。例如，可以使用人类CMV启动子/立即早期基因1的增强子(参见例如Paterson et al.(1994),AppliedMicrobiol.Biotechnol.40:691-698)。来源于SV40病毒基因组例如SV40来源的DNA序列，即早期和晚期启动子、增强子、剪接以及聚腺苷酸化位点，可以用于提供用于在哺乳动物宿主细胞中表达结构基因序列的其他遗传因子。病毒早期和晚期启动子特别有用，因为两者易于作为片段从病毒基因组获得，并且它们还含有病毒的复制起点(Fiers et al.(1978),Nature273:113;Kaufman(1990),Meth.in Enzymol.185:487-511)。也可以使用更小或更大的SV40片段，只要包括从Hind III位点向位于SV40病毒复制位点起点的Bgl I位点延伸的约250bp的序列。
还可以使用来自其他高表达哺乳动物基因的启动子。表达载体通常还包含细菌DNA复制起点、编码可以在细菌中阳性选择的基因产物的序列、聚腺苷酸化位点、核糖体结合位点以及任选地编码可以在哺乳动物细胞中阳性选择的基因产物的序列，如赋予潮霉素、新霉素或G418抗性的序列。表达载体的实例是pDC302(Mosley et al.(1989),Cell59:335-348)。表达载体的其他实例包括包括商购可获得的载体，如pTriETM-4Ek/LIC载体(Novagen,Wis.,USA)或pGEN载体(Promega,Wis.,USA)。
在一些实例中，例如，通过将跨膜结构域连接于蛋白的N末端和/或C末端，用一个或多个展示于细胞表面的所述跨膜结构域表达治疗蛋白。可以在本发明所提供的方法中用作膜关联序列(membrane association sequence)的跨膜结构域包括本文所述、本领域已知的或可以预测的任何跨膜结构域(参见例如,Kahsay et al.(2005)Bioinformatics21(9):1853-1858)。示例性膜关联序列包括本领域技术人员已知的跨膜结构域和糖磷脂酰肌醇(GPI)锚定序列(参见例如,Udenfriend and Kodukula(1995),Methods Enzymol.250:571-582)。可以将跨膜结构域连接于治疗蛋白的示例性载体包括载体FVTM(Zhou et al.(2010),MAbs2(5):508-518)。
技术人员能够选择提供治疗蛋白表达的其他表达***。例如，如果治疗蛋白是抗体，则可以选择适合表达抗体的载体。用于哺乳动物在细胞表面表达抗体的许多载体是本领域技术人员已知的。例如，可以选择能够单独转录和翻译重链和轻链编码序列的载体，或可以选择能够同时转录和翻译重链和轻链编码序列的载体。可以将膜关联序列，如跨膜结构域连接于重链或轻链，或可以将跨膜结构域连接于重链和轻链。可以将膜关联序列连接于重链和/或轻链的N末端或C末端。
(b)利用荧光激活细胞分选术(FACS)进行结合和监测
荧光激活细胞分选术(FACS)是可以区分荧光细胞与非荧光细胞的细胞分离技术(Current Protocols in Cytometry,Robinson et al.,eds.,John Wiley&Sons(2004);Edidin(1989),Methods in Cell Biology29:87-102;Herzenberg etal.,(1976)Sci.Am.234(3):108-117,US Patent Nos.5,968,738和5,804,387)。流式分选仪能快速含有文库***物的大量个体细胞(例如10-100百万个细胞/小时)(Shapiro et al.,Practical Flow Cytometry,1995)。简而言之，使需费用中的细胞在小滴中的激光前穿过，每一小滴都含有单个细胞。将电荷施加于小滴，静电偏转***控制带电小滴进入合适的管中(Basu et al.(2010),J.Vis.Exp(41):1546)。分选和检查生物细胞的流式细胞仪在本领域内是公知的。已知的流式细胞仪描述于例如U.S.Pat.Nos.4,347,935、5,464,581、5,483,469、5,602,039、5,643,796以及6,211,477中。其他已知的流式细胞仪是Becton Dickinson and Company制造的FACS VantageTM***和制造的Union Biometrica COPASTM相同。
可以用FACS选择展示了具有期望的结合特性的蛋白的细胞。在本发明所提供的方法中，通过筛选在不同条件下蛋白与同源结合伴侣的结合，利用FACS测定可以鉴定条件活性测试分子，如蛋白。在示例性方法中，用编码展示于细胞表面的蛋白的载体转染细胞。然后使细胞与同源结合伴侣接触。展示于细胞表面的蛋白与同源结合伴侣的结合可以导致细胞相关荧光。将荧光细胞与非荧光细胞分离，因此使展示了与同源结合伴侣结合的活性蛋白的细胞与展示了不结合同源结合伴侣的蛋白的细胞分离。可以分离编码活性和/或无活性蛋白的核酸，并对其测序，以鉴定与同源结合伴侣相互作用的蛋白。此外，分离的细胞可以进行其他测定，如本文所述的测定，包括其他FACS测定。
通常，可检测地标记同源结合伴侣，以辅助检测。可选地，不同源结合伴侣，但是其可以通过使用第二试剂来检测。用于第二试剂的同源结合伴侣的标记包括荧光标记(例如Francisco et al.(1993),Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:10444-10448)或与荧光第二标记相互作用的标记。Any fluorophoreknown本领域技术人员已知的任何荧光团都可以用作荧光标记，诸如，例如，同源结合伴侣上的荧光标记或第二标记。示例性荧光团包括荧光素、若丹明或德克萨斯红(Texas Red)、
Figure BDA00003151467300741
ALEXA FLUOR、OREGON GREEN、TMR(四甲基若丹明)、ROX(X-rhodamine)、BODIPY630/650以及Cy5(可以从Amersham Pharmacia Biotech of Piscataway,N.J.或从Molecular Probes Inc.of Eugene,Oreg获得)或本领域技术人员已知的任何其他荧光标记(参见例如,Giepmans et al.(2006),Science Apr14;312(5771):217-24)。当分析荧光样品中所考虑的标准概括于Alexay et al.(1996)The PCT International Society of Optical Engineering2705/63。
在另一实例中，为了辅助与第二试剂的相互作用，同源结合伴侣可以包括与荧光第二标记相互作用的标记。可以使用与同源结合伴侣上的标记相互作用的任何第二标记。在一些实例中，用本领域技术人员已知的或本文所述的连接体，用生物素标记同源结合伴侣，如EGFR或EGFRsECD，并且将细胞与连接于与生物素例如链霉亲和素相互作用的分子的荧光第二标记混合。在一些实例中，第二标记是连接于荧光素的链霉亲和素。
在一实例中，在同时或并行进行的不同组条件下，可以作单独的测定实施FACS分析。在一实例中，并行进行测定，并且将表达测试分子或治疗蛋白的细胞群分子两个群。使一个群与测试分子或治疗蛋白在模拟期望该活性的第一条件(例如患病微环境或肿瘤环境)的测定缓冲液中接触。使另一群与测试分子在模拟不期望该活性的条件(例如生理正常环境)的测定缓冲液中接触。在FACS测定中，可以在模拟患病微环境如肿瘤的条件下或在模拟正常微环境的条件下，进行任何步骤，如接触。模拟肿瘤微环境的示例性条件是一组诸如16.5mM乳酸、pH6.0、25%人血清的条件。模拟正常微环境的一组示例性条是一组模拟非肿瘤或微环境的诸如1mM乳酸、pH7.4和25%人血清的条件。
例如，可以使表达治疗蛋白的细胞与标记的同源结合伴侣接触，例如，通过与含有同源结合伴侣的溶液或缓冲液混合，其中结合缓冲液是模仿或模拟期望的条件(如本文所述的第一条件或第二条件)的缓冲液。单独地(同时实施，或如本文所述在阳性或阴性选择后作为迭代步骤)，可以是表达测定的治疗蛋白的第二相同细胞群与标记的同源结合伴侣接触，例如，通过与含有同源结合伴侣的溶液或缓冲液混合，其中亲和缓冲液是模仿或模拟其他条件的缓冲液。在每一步骤中，接触步骤是相同的，除了具体亲和缓冲液或溶液之外。可以以任何期望的时间长度和温度进行接触步骤，从而允许细胞表面蛋白结合同源结合伴侣(例如抗原)。例如，通常在4°C-37°C，如4°C、室温或37°C下进行结合。结合的时间通常为30分钟到48小时或更多，并且可以是温度的函数。通常，结合分子或蛋白的结合在室温下进行或约进行30分钟到4小时，如1小时到2小时，例如约1小时。可以在结合所用的相同缓冲液中洗涤细胞，以除去任何未结合的同源结合伴侣。另外，可以改变的用于优化的具体参数包括但不限于同源伴侣的浓度、动力学竞争时间以及FACS严格性。此外，可以在平衡或动力学条件下进行FACS筛选。
如果检测步骤使用第二试剂，在洗涤细胞以除去未结合的同源结合伴侣后，使细胞与适当的第二试剂接触。可以以任何期望的时间长度和温度进行这另一接触步骤，从而允许第二试剂结合同源结合蛋白。例如，通常在4°C-37°C，如4°C、室温或37°C下进行结合。结合的时间通常为5分钟到2小时或更多，并且可以是温度的函数。通常，第二试剂盒细胞的结合在室温下进行或进行约30分钟到4小时，如1小时到2小时，例如约1小时。可以在亲和所用的相同缓冲液中洗涤细胞，以除去任何未结合的第二试剂。
可以使荧光细胞与非荧光细胞分离，从而使展示了结合同源结合伴侣的蛋白的细胞与展示了不结合同源结合伴侣的蛋白的细胞分离。可以从分离的荧光细胞和非荧光细胞分离核酸，并且可以对核酸测序，从而鉴定与同源结合伴侣相互作用或不与之相互作用的表达蛋白。
通常，通过首先进行阳性或阴性选择步骤来进行亲和测定。流式分选仪可以收集或分选具有指定的荧光特性的细胞。可以利用这种特征选择或排除被鉴定为表现出结合和/或未表现出结合的第一细胞群，这取决于所期望的具体结合特征。例如，在阳性选择步骤中，如上文所述进行解除和结合反应，并分离细胞，以富集展示了在一组条件下结合同源结合伴侣的蛋白的细胞。通常，在阳性选择步骤中，在模拟期望蛋白活性的生理条件的一组条件下进行解除、标记和分选。用于阳性选择步骤的条件的实例是模拟肿瘤微环境的生理条件的条件。在阴性选择步骤中，分离细胞，以分离和/或富集展示了在一组条件下具有很少或不具有同源结合伴侣结合的蛋白的细胞。通常，在阴性选择步骤中，在模拟期不期望蛋白活性的生理条件的一组条件下进行接触、标记和分选。用于阴性选择步骤的条件的实例是模拟正常微环境的生理条件的条件。
选择步骤或一系列替代性选择步骤可以进行一次或多次，例如，至少约2、3、4、5、6或7次。如果需要，可以同时或顺序进行两个或多个不同的选择步骤。例如，阳性选择步骤之后是阴性选择步骤，并且阳性选择步骤和阴性选择步骤的组合可以按分离展示条件活性蛋白的细胞的需要频繁重复。在一些实例中，可以调准本领域技术人员已知的或本文所述的任何FACS参数，以增加或降低选择的严格性。例如，在初始轮的选择中，选择严格性可以低，并且随着细胞变得富集了展示了条件活性蛋白的细胞群，在稍后轮的选择中，增加选择的严格性。可以监理费分选门控(Sortgate)，以选择表现出对同源结合伴侣的最高亲和性或最低亲和性的细胞。本领域技术人员可以根据经验建立分选门控。此外，可以将文库超取样至少10倍，以改善分离稀有克隆的概率。
在每一轮庁之间，可以再生长和/或诱导细胞，以允许细胞恢复和/或增强细胞表面的蛋白表达。尽管不意图限于具体作用模式，但是这种迭代过程有助于富集表达条件活性蛋白的细胞群。
D.表达蛋白的方法
利用标准细胞培养和本领域已知的其他表达***，可以表达用于本发明的筛选测定中的测试分子，特别是治疗蛋白或抗体。在用于筛选方法之前，可以纯化蛋白。可选地，可以在本发明的二元测定中筛选全部上清液或稀释的上清液。
可以重组产生或凑够商业供应商购买本发明的方法所用的结合分子、蛋白以及靶抗原。例如，可以通过本领域技术人员技能范围内的重组DNA方法制备诸如抗体的结合分子。利用常规程序(利用能特异性结合编码抗体的重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)，可以合成产生或可以容易地分离编码目的蛋白的DNA，并对其进行测序。例如，已知产生或表达目的蛋白或抗体的任何细胞源都可以用作这类DNA的优先来源。在另一实例中，一旦确定了编码抗体的DNA序列，则可以利用基因合成技术构建核酸序列。
此外，也可以利用诱变技术产生任何蛋白的变异形式。也可以修饰DNA。例如，可以利用基因合成、常规分子生物学技术实现核苷酸的***、缺失或取代。例如，可以将其他核苷酸序列连接于核酸序列。在一实例中，出于将合成基因克隆到载体中的目的，例如，蛋白表达载体，可以添加连接序列，如含有限制内切核酸酶位点的序列。此外，可以将指定功能DNA元件的其他核苷酸序列可操作连接于核酸分子。这类序列的实例包括但不限于经设计促进细胞内蛋白表达的启动子序列和经设计促进蛋白分泌的前导肽序列。
可以将蛋白如抗体表达为全长蛋白或小于全长的蛋白。例如，可以表达抗体片段。可以利用本领域技术人员已知的任何方法制备本发明所提供的核酸分子和蛋白。这类程序是常规的，并且是技术人员熟知的。它们包括常规分子生物学技术，包括基因合成、PCR、连接、克隆、转染和纯化技术。下文提供了这类程序的描述。
一旦分离，可以将DNA置于表达载体中，接着将所述表达载体转染到宿主细胞中。载体的选择取决于期望的应用。例如，在***核酸后，通常用载体转化宿主细胞，例如，以扩增用于其复制和/或表达的蛋白基因。在这类实例中，使用适合高水平表达的载体。
为了表达抗体，通常，将编码抗体重链的核酸克隆到载体中，并将编码抗体轻链的核酸克隆到载体中。可以将基因克隆到用于其二元表达的单个载体中或克隆到单独的载体中。如果需要，载体还可以含有产生其他抗体形式的编码其他恒定区或铰链区的序列。可以在宿主细胞中转染并表达载体。表达可以在本领域技术人员已知的任何细胞表达***中。例如，宿主细胞包括不另外产生免疫球蛋白的细胞，以在重组宿主细胞中获得抗体的合成。例如，宿主细胞包括但不限于猿COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、293FS细胞、HEK293-6E细胞、NSO细胞或其他骨髓瘤细胞。下文描述了其他表达载体和宿主细胞。
在一实例中，将编码抗体重链的核酸连接于第一表达载体，并将编码抗体轻链的核酸连接于第二表达载体。表达载体可以是相同的或不同的，尽管通常它们足以相容，以允许由此可标记的蛋白表达(重链和轻链)。通常以1:1比例，将第一和第二表达载体一般共转染到宿主细胞中。载体的实例包括但不限于pγ1HC和pκLC(Tiller et al.(2008)J Immunol.Methods,329:112-24)。其他表达载体包括轻链表达载体pAG4622和重链表达载体pAH4604(Coloma et al.(1992)J Immunol.Methods,152:89-104)。pAG4622载体含有编码人类κL链的C区结构域的基因组序列和gpt选择标记。pAH4604载体还有hisD选择标记和编码人类H链γ1C区结构域的序列。在另一实例中，可以将重链和轻链克隆到具有用于重链和轻链两者的表达盒的单个载体中。
因此，可以将本发明所提供的抗体产生或表达为全长抗体或小于全长的抗体，包括但不限于Fabs、Fab铰链片段、scFv片段、scFv串联片段和scFv铰链以及scFv铰链(ΔE)片段。已经研发了用于产生抗体片段的各种技术。传统上，通过蛋白水解消化天然抗体而衍生这些片段(参见例如Morimoto et al.(1992)Journal of Biochemical and Biophysical Methods,24:107-117;Brennan et al.(1985)Science,229:81)。还通过重组宿主细胞直接产生片段。可以在宿主细胞如E.coli中表达Fab、Fv和scFv抗体片段，并从中分泌它们，从而允许温和产生大量这些蛋白。还可以将Fab’-SH片段化学偶联以形成F(ab’)2片段(Carter et al.(1992)Bio/Technology,10:163-167)。根据另一方法，可以直接从宿主细胞培养物中分离F(ab’)2片段。在其他实例中，所选的抗体是单链Fv片段(scFv)(参见例如WO93/16185;US Patent No.5,571,894和U.S.Patent No.5,587,458)。Fv和sFv是具有不含恒定区的完整结合位点的唯一种类；因此，它们适合在体内应用中降低非特异性结合。可以构建sFv融合蛋白，以在sFv的氨基或羧基末端产生效益蛋白的融合物。抗体片段还可以是线性抗体(参见例如U.S.Patent No.5,641,870)。这类线性抗体片段可以是单特异性的或双特异性的。用意产生抗体片段的其他技术是本领域技术人员已知的。
例如，在表达后，抗体重链和轻链通过二硫键配对，从而形成全长抗体或其片段。例如，为了表达全长Ig，可以将编码VH-CH1-铰链-CH2-CH3的序列克隆到第一表达载体中，并将编码VL-CL结构域的序列克隆到第二表达载体中。在与编码VL-CL结构域的第二表达载体共表达后，表达全长抗体。在另一实例中，为了产生Fab，将编码VH-CH1的序列克隆到第一表达载体中，并将编码VL-CL结构域的序列克隆到第二表达载体中。重链与轻链配对，并产生Fab单体。各种IgG亚型的CH1铰链、CH2和/CH3的序列是本领域技术人员已知的(参见例如U.S.Published Application No.20080248028)。同样，CL、λ或k的序列也是已知的(参见例如U.S.Published Application No.20080248028)。
可以***载体用于表达完整抗体和抗体片段的示例性序列包括表3所提供的抗体片段的序列。例如，可以将以下序列***本文所述的或本领域技术人员已知的合适的表达载体中，用于表达IgG抗体：
Figure BDA00003151467300791
(西妥昔单抗)的重链和轻链序列(分别为SEQ ID NO:2和1)或任何其他抗体的重链和轻链序列(即分别为SEQ ID NO:74和75
Figure BDA00003151467300792
分别为SEQ IDNO:76和77
Figure BDA00003151467300793
分别为SEQ ID NO:78和79
Figure BDA00003151467300794
分别为SEQ ID NO:80和81，
Figure BDA00003151467300795
分别为SEQ ID NO:82和83
Figure BDA00003151467300796
分别为SEQ ID NO:41和42，
Figure BDA00003151467300797
分别为SEQ IDNO:43和44
Figure BDA00003151467300798
分别为SEQ ID NO:45和46(伏洛昔单抗)；分别为SEQ ID NO:47和46(F200)或分别为SEQ ID NO:48和49(西妥木单抗)。此外，可以将VH-CH1和VL-CL序列，例如分别为SEQ ID NO84和85
Figure BDA00003151467300801
***到合适的表达载体中，用于表达Fab分子。还可以在合适的表达载体中，如编码可变重链和可变轻链之间的连接体的载体中表达以下：抗体的可变重链和可变轻链结构域(即分别为SEQ ID NO:29和30，
Figure BDA00003151467300802
分别为SEQ ID NO:31和32
Figure BDA00003151467300803
分别为SEQ IDNO:33和34
Figure BDA00003151467300804
分别为SEQ ID NO:35和36
Figure BDA00003151467300805
分别为SEQ ID NO:37和38
Figure BDA00003151467300806
以及分别为SEQ ID NO:39和40
Figure BDA00003151467300807
示例性连接体包括富含甘氨酸的柔性连接体(-G4S-)n，其中n是正整数，例如1(SEQ ID NO:4)、2(SEQ ID NO:70)、3(SEQ IDNO:71)、4(SEQ ID NO:72)、5(SEQ ID NO:73)或更高。
1.载体
载体的选择取决于期望的应用。许多表达载体是可以利用的，并且是本领域技术人员已知的，用于表达重组抗体或其部分。表达载体的选择受宿主表达***选择的影响。这类选择在技术人员的技术水平范围内。通常，表达载体可以包括转录启动子和任选地增强子、翻译信号以及转录和翻译终止信号。用于稳定转化的表达载体通常具有允许选择和维持转化的细胞的选择标记。在一些情况下，可以用复制起点在细胞中扩增载体的拷贝数量。载体还通常含有可操作连接于连接的核酸分子(例如His标签、Flag标签)的其他核苷酸序列。为了与抗体一起应用，载体通常包括编码恒定区的序列。因此，抗体或其部分也可以作为蛋白融合物表达。例如，可以产生融合物，以孵育多肽其他功能性。融合蛋白的实例包括但不限于fusions of信号序列、诸如用于定位的附加表位如his6标签或myc标签或用于纯化的标签的融合物，例如，GST融合物，以及用于指导蛋白分泌和/或膜结合的序列。
例如，可以用本领域已知的任何启动子/增强子控制蛋白的表达合适的细菌启动子在本领域内是熟知的，并且在本文的下文有描述。用于哺乳动物细胞、酵母细胞以及昆虫细胞的其他合适的启动子是本领域熟知的，并且在下文示例了一些。用于指导异源核酸表达的启动子的选择，取决于具体应用。可以使用的启动子包括但不限于含有SV40早期启动子的真核表达载体(Bernoist and Chambon,Nature290:304-310(1981))、包含于劳氏肉瘤病毒3’长末端重复的启动子(Yamamoto et al.Cell22:787-797(1980))、疱疹胸苷激酶启动子(Wagner et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA78:1441-1445(1981))、金属硫蛋白基因的调节序列(Brinster et al.,Nature296:39-42(1982))；原核表达载体，如β-内酰胺酶启动子(Jay et al.,(1981)Proc.Natl.Acad.Sci.USA78:5543)或tac启动子(DeBoer et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA80:21-25(1983))；还参见“Useful Proteins from Recombinant Bacteria”:in Scientific American242:79-94(1980)；含有胭脂碱合成酶启动子的植物表达载体(Herrera-Estrella et al.,Nature303:209-213(1984))or the花椰菜花叶病毒35S RNA启动子(Gardner et al.,Nucleic Acids Res.9:2871(1981))，和光合作用酶二磷酸核酮糖羧化酶的启动子(Herrera-Estrella et al.,Nature310:115-120(1984))；来自酵母和其他真菌的启动子元件，如Gal4启动子，醇脱氢酶启动子、磷酸甘油激酶启动子、碱性磷酸酶启动子和表现出组织特异性并且已经用于转基因动物中的下述动物转录控制区：在胰腺腺泡细胞中是活性的弹性蛋白酶I基因控制区(Swift et al.,Cell38:639-646(1984);Ornitz et al.,Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.50:399-409(1986);MacDonald,Hepatology7:425-515(1987))；在胰岛β细胞中是活性的胰岛素基因控制区(Hanahan et al.,Nature315:115-122(1985))、在淋巴样细胞中是或的免疫球蛋白基因控制区(Grosschedl et al.,Cell38:647-658(1984);Adams et al.,Nature318:533-538(1985);Alexander et al.,Mol.Cell Biol.7:1436-1444(1987))、在睾丸、***细胞、淋巴样细胞以及肥大细胞中是活性的乳腺肿瘤病毒控制区(Leder et al.,Cell45:485-495(1986))、在肝中是活性的白蛋白基因控制区(Pinkert et al.,Genes and Devel.1:268-276(1987))、在肝中是活性的甲胎蛋白基因控制区(Krumlauf et al.,Mol.Cell.Biol.5:1639-1648(1985);Hammer et al.,Science235:53-58(1987))、在肝中是活性的α-1抗胰蛋白酶基因控制区(Kelsey et al.,Genes and Devel.1:161-171(1987))、在骨髓细胞中是活性的β球蛋白基因控制区(Magram et al.,Nature315:338-340(1985);Kollias et al.,Cell46:89-94(1986))、在脑的少突细胞中是活性的髓鞘碱性蛋白基因控制区(Readhead et al.,Cell48:703-712(1987))、在骨骼肌中是活性的肌球蛋白轻链-2基因控制区(Shani,Nature314:283-286(1985))以及在下丘脑的***细胞中是活性的促性腺激释放激素基因控制区(Mason et al.,Science234:1372-1378(1986))。
除了启动子之外，表达载体通常含有转录单位或表达盒，所述转录单位或表达盒含有抗体或其部分在宿主细胞中表达所需的所有其他元件。典型的表达盒含有可操作连接于核酸序列的启动子、核糖体结合位点和翻译终止子，所述核酸序列编码转录本的有效聚腺苷酸化所需的蛋白和信号。盒的其他元件可以包括增强子。此外，盒通常含有位于结构基因下游的转录终止区，以提供有效终止。终止区可以从与启动子序列相同的基因获得，或可以从不同的基因获得。
一些表达***具有提供基因扩增的标记，如疱疹胸苷激酶和二氢叶酸还原酶。可选地，不涉及基因扩增的高产率表达***也是合适的，例如在昆虫细胞中使用杆状病毒载体和在多面体启动子或其他强杆状病毒启动子的指导下编码蛋白的核酸序列。
出于本发明有关表达抗体或抗体变体的目的，提供了含有编码抗体的恒定区的核苷酸序列的载体，所述核苷酸序列可操作连接于编码所述抗体的可变区的核酸序列。载体可以包括CH1、CH2、铰链、CH3或CH4和/或CL中的一个或全部的序列。通常，例如为了表达Fabs，载体含有CH1或CL(k或λ轻链)的序列。恒定区或铰链区的序列是本领域技术人员已知的(参见例如U.S.Published Application No.20080248028)。
示例性表达载体包括任何哺乳动物表达载体，诸如，例如，pCMV。对于细菌表达，这类载体包括pBR322、pUC、pSKF、pET23D，以及诸如MBP、GST和LacZ的融合载体。可以使用其他真核载体作为真核表达载体，例如含有来自真核病毒的调节元件的任何真核载体。这些包括例如，SV40载体、***瘤病毒载体以及来源于EB(Epstein-Bar virus)病毒的载。其他示例性真核载体包括pMSG、pAV009/A+、pMT010/A+、pMAMneo-5、杆状病毒pDSCE以及允许蛋白在以下启动子的指导下表达的任何其他载体：CMV启动子、SV40早期启动子、SV40晚期启动子、金属硫蛋白启动子、鼠哺乳腺肿瘤病毒启动子、劳氏肉瘤病毒启动子、多面体启动子或被证明在真核细胞中有效表达的其他启动子。
可以利用本领域技术人员已知的用于将DNA片段***载体中的任何方法构建含有核酸的表达载体，所述核酸编码蛋白或抗体链。这些方法可以包括体外重组DNA和合成技术和体内重组体(基因重组)。例如，通过将DNA片段连接于具有互补粘末端的克隆载体，可以实现***到克隆载体中。如果用于使DNA片段化的互补限制位点不存在于克隆载体中，则DNA分子的末端可以进行酶促修饰。可选地，通过将核苷酸序列(连接体)连接于DNA末端可以产生期望的任何位点；这些链接的连接体可以含有编码限制内切核酸酶识别序列的特异性化学合成的核酸。
2.细胞和表达***
还提供了含有载体的细胞。通常，合适的是可以经改造而表达异源DNA并具有分泌途径的任何细胞类型。表达宿主包括原核和真核生物体，如细菌细胞(如E.coli)、酵母细胞、真菌细胞、古细菌、植物细胞、昆虫细胞和动物细胞，包括人类细胞。表达宿主的不同可以在与它们的蛋白产生水平，以及存在于所表达的蛋白上的翻译后修饰类型。此外，表达宿主的选择经常与载体的选择以及所用的转录和翻译元件有关。例如，表达宿主的选择经常但并非总是依赖于所用的前体序列的选择。例如，许多异源信号序列可以仅在相同种类的宿主细胞中表达(即昆虫细胞信号序列在昆虫细胞中最佳表达)。相比之下，前体信号序列可以用于异源宿主中，例如，在酵母、昆虫或哺乳动物宿主细胞中工作良好的人血清白蛋白(hHSA)信号序列和经证明在昆虫和哺乳动物细胞中是功能性的组织纤溶酶原激活物前/原序列(Tan et al.,(2002)Protein Eng.15:337)。基于这些和其他因素，例如调节和安全考虑、生产成本以及纯化方法的需要，可以进行表述宿主的选择。因此，载体***必须与所用的宿主细胞相容。
在真核宿主中的表达可以包括在诸如酿酒酵母和巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)的酵母、诸如果蝇属(Drosophila)细胞和鳞翅目(lepidopteran)细胞的昆虫细胞、诸如烟草、玉米、水稻、藻类以及浮萍的植物和植物细胞中表达。用于表达的真核细胞还包括诸如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或幼小仓鼠肾(BHK)细胞的哺乳动物细胞系。真核表达宿主还包括在转基因动物中产生，例如，包括在血清、乳和卵中产生。
经由例如转化、转染、感染、电穿孔以及超音波穿孔，可以将重组分子引入宿主细胞，从而使得产生许多基因序列的拷贝。通常，用标准转染方法产生大量表达抗体链的细菌、哺乳动物、酵母或昆虫细胞系，然后利用标准技术纯化所述抗体链(参见例如，Colley et al.(1989)J.Biol.Chem.,264:17619-17622;Guide to Protein Purification,in Methods in Enzymology,vol.182(Deutscher,ed.),1990)。根据标准技术(参见例如,Morrison(1977)J.Bact.132:349-351;Clark-Curtiss and Curtiss(1983)Methods in Enzymology,101,347-362)，进行真核和原核细胞的转化。例如，可以使用将外源核苷酸序列引入宿主细胞的任何公知的程序。这些程序包括使用磷酸钙转染、聚凝胺、原生质体融合、电穿孔、基因枪技术、脂质体、微注射、血浆载体(plasma vector)、病毒载体以及用于将克隆的基因组DNA、cDNA、合成DNA或其他外源遗传材料引入宿主细胞的任何其他熟知的方法。通常，出于表达抗体的目的，用编码至少VH链的第一载体和编码至少VL链的第二载体转染宿主细胞。因此，仅仅必须的是，所用的具体基因工程方法应能将至少两个基因成功地引入能表达抗体多肽或其修饰的形式的宿主细胞。
用并入了cDNA或合成的DNA序列的重组DNA分子转化宿主细胞，能产生多拷贝基因。因此，通过生长转化体、从转化体分离重组DNA分子，以及，如果需要，从分离的重组DNA取回***的基因，可以大量获得基因。
利用高通量方法，通过本领域已知的用于蛋白产生的任何方法，包括体外和体内方法，诸如，例如，将编码蛋白的核酸分子引入宿主细胞或宿主动物，并由体外编码重组抗体的核酸分子表达，可以产生蛋白，包括抗体和其部分。原核生物，特别是E.coli为大量产生重组抗体或其部分提供了***，并且在应用蛋白的高通量表达表达盒纯化中是特别期望的。E.coli的转化是本领域技术人员熟知的简单且快速的技术。用于高通量表达的E.coli宿主菌株包括但不限于BL21(EMD Biosciences)和LMG194(ATCC)。这类E.coli宿主菌株的实例是BL21。用于高通量表达的载体包括但不限于pBR322和pUC载体。
a.原核表达
原核生物，特别是E.coli为大量产生重组抗体或其部分提供了***。E.coli的转化是本领域技术人员熟知的简单且快速的技术。用于E.coli的表达载体可以含有可以用于诱导高水平蛋白表达并可以用于表达表现出一些宿主细胞毒性的蛋白的可诱导型启动子。可诱导型启动子的实例包括lac启动子、trp启动子、杂合体tac启动子、T7和SP6RNA启动子以及温度调节的λPL启动子。
可以在E.coli的细胞质环境中表达蛋白，包括抗体或其部分。细胞质是还原性环境，并且对于一些分子而言，这可以导致不溶性内含体的形成。可以用诸如二硫苏糖醇和β-巯基乙醇的还原剂和去污剂(例如，诸如胍-HCl和脲)再溶解蛋白。示例性的替代方法是在细菌的壁膜间隙表达重组的抗体或其片段，所述壁膜间隙提供了氧化环境和伴侣蛋白样二硫键异构酶，从而导致可溶性蛋白的产生。通常，前导序列融合于蛋白，这会将所述蛋白引向周质。随后利用周质中的信号肽酶去除前导序列。存在3种主要的将表达的蛋白传送到周质的途径，及Sec途径、SRP途径以及TAT途径。周质寻靶前导序列的实例包括果胶裂解酶基因的pelB引导序列、StII引导序列以及DsbA引导序列。示例性引导序列是DsbA引导序列。在一些情况下，周质表达允许表达的蛋白渗漏到培养基中。蛋白的分泌允许由培养物上清液进行快速且简单的纯化。不分泌的蛋白可以利用渗透裂解从周质获得。与周质表达相似，在一些情况下，蛋白可以变得不可溶，并且可以用变性剂和还原剂促进稳定和再折叠。诱导和生长稳定也可以影响表达水平和溶解性。通常，使用25°C至37°C的稳定。也可以用突变来增强表达的蛋白的溶解性。通常，细菌产生糖基化蛋白。因此如果蛋白功能糖基化，可以在从宿主细胞纯化后，体外添加糖基化。
b.酵母
酵母木如酿酒酵母、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)、乳酸克鲁维斯酵母(Kluyveromyces lactis)以及巴斯德毕赤酵母是用于重组的抗体或其部分的有用表达宿主。可以用附加型复制载体或通过利用同源重组的稳定的染色体整合转化酵母。通常，用可诱导型启动子调节基因表达。这类启动子的实例包括AOX1、GAL1、GAL7和GAL5以及金属硫蛋白启动子如CUP1。表达载体经常包括用于选择和维持转化的DNA的选择标记，如LEU2、TRP1、HIS3以及URA3。在酵母中表达的蛋白经常是可溶的。与诸如Bip和蛋白二硫键异构酶的伴侣蛋白共表达可以改善表达水平和溶解性。此外，利用分泌信号肽融合物，如来自酿酒酵母的酵母接合型α因子分泌信号，和利用与酵母细胞表面蛋白如Aga2p接合粘附受体或Arxula adeninivorans葡糖淀粉酶的融合物，可以指导在酵母中表达的蛋白的分泌。例如用于Kex-2蛋白酶的蛋白酶切割位点，经改在可以从表达的多肽中除去融合的序列，因为它们存在离开分泌途径。酵母还能在Asn-X-Ser/Thr基元处糖基化。
c.昆虫
昆虫细胞，同时利用杆状病毒表达，可用于表达抗体或其部分。昆虫细胞高水平蛋白并且能进行高等真核生物所用的大多数翻译后修饰。杆状病毒具有严格的宿主范围，这提高了安全性并减少了真核表达的调节问题。典型的表达载体使用高水平表达的启动子，如多杆状病毒的角体蛋白启动子和p10启动子。通常所用的杆状病毒***包括杆状病毒如苜蓿银纹夜蛾(Autographa californica)核型多角体病毒(AcNPV)和家蚕(Bombyx mori)核型多角体病毒(BmNPV)和昆虫细胞系如来自草地贪夜蛾(Spodopterafrugiperda)的Sf9和来自粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)的TN。为了高水平表达，将待表达的分子的核苷酸序列直接融合于病毒多角体蛋白起始密码子的下游。为了产生能表达人类抗体的杆状病毒，利用二元表达转移，如pAcUW51(PharMingen)。在昆虫细胞中准确处理哺乳动物分泌信号，并且其可以用于将表达的蛋白分泌到培养基中。昆虫细胞中的替代性表达***是使用稳定转化的细胞。细胞系如来自草地贪夜蛾的Sf9和来自粉纹夜蛾的TN可以用于表达。可以用杆状病毒立即早期基因启动子IE1诱导水平一致的表达。典型的表达载体包括pIE1-3和pI31-4转移载体(Novagen)。通常通过使用选择标记如新霉素和潮霉素维持表达载体。
d.哺乳动物细胞
哺乳动物表达***可以用于表达修饰蛋白，包括抗体或其部分。通过病毒感染如腺病毒，或通过直接DNA转移如脂质体、磷酸钙、DEAE-葡聚糖，以及通过物理方式如电穿孔和微注射，可以将表达构建体转移到哺乳动物细胞。用于哺乳动物细胞的表达载体通常包括mRNA帽位点、TATA盒、翻译起始序列(Kozak共有序列)以及聚腺苷酸化元件。这类载体通常包括用于高水平表达的转录启动子-增强子例如SV40启动子-增强子，人类巨细胞病毒(CMV)启动子以及劳氏肉瘤病毒(RSV)的长末端重复。这些启动子-增强子在许多细胞类型中是活性的。组织和细胞类型启动子和增强子区也可以用于表达。示例性启动子/增强子区包括但不限于来自以下基因的那些启动子/增强子区：如弹性蛋白酶I、胰岛素、免疫球蛋白、小鼠乳腺瘤病毒、白蛋白、甲胎蛋白、α1抗胰蛋白酶、β球蛋白、髓鞘碱性蛋白、肌球蛋白轻链2以及促性腺释放激素基因控制。选择标记可以用于选择并维持具有表达载体的细胞。选择标记基因的实例包括但不限于潮霉素B磷酸转移酶、腺苷脱氨酶、黄嘌呤-鸟嘌呤核糖磷酸转移酶、氨基糖苷磷酸转移酶、二氢叶酸还原酶以及疱疹胸苷激酶。抗体are typically produced通常利用NEOR/G418***、二氢叶酸还原酶(DHFR)***或谷氨酰胺合成酶(GS)***。GS***使用联合表达载体，如pEE12/pEE6，来表达重链和轻链两者。与细胞表面信号分子如TCR-ζ和FcεRI-γ的融合可以指导活性状态的蛋白在细胞表面的表达。
许多细胞系可以用于哺乳动物表达，包括小鼠、大鼠、人类、猴子、鸡以及仓鼠细胞。示例性的细胞系包括但不限于CHO、Balb/3T3、HeLa、MT2、小鼠NS0(非分泌)以及其他骨髓瘤细胞系、杂交瘤和异杂交瘤细胞系、淋巴细胞、成纤维细胞、Sp2/0、COS、NIH3T3、HEK293、293S、2B8和HKB细胞。也可以获得适应无血清培养基的细胞系，所述培养基促进分泌蛋白从培养基的纯化。一种这类实例是无血清EBNA-1细胞系(Pham et al.,(2003)Biotechnol.Bioeng.84:332-42.)。
e.植物
可以用转基因植物细胞和植物表达本文所述的蛋白，如任何抗体或其部分。通常利用直接DNA转移如微粒轰击和PEG介导的向原生质的转移与农杆菌介导的转化，将表达构建体转移到植物。表达载体可以包括启动子和增强子序列、转录终止元件以及翻译控制元件。表达载体和转化技术经常在双子叶植物宿主如拟南芥(Arabidopsis)和烟草与单子叶植物宿主如玉米和水稻之间分派。用于表达的植物启动子的实例包括花椰菜花叶病毒CaMV35S启动子、胭脂碱合酶启动子、核糖二磷酸羧化酶启动子以及玉米遍在蛋白1(ubi-1)启动子启动子。选择标记如潮霉素、磷酸甘露糖异构酶和新霉素磷酸转移酶经常用于促进转化细胞的选择和维持。转化的植物细胞维持培养为细胞、聚集体(愈伤组织)或再生为全植物。转基因植物细胞还可以包括经改造产生蛋白酶或修饰蛋白酶的藻类(参见例如，Mayfieldet al.(2003)PNAS100:438-442)。因为植物具有不同于哺乳动物细胞的糖基化模式，这可以影响在这些宿主中产生的蛋白的选择。
3.纯化
利用本领域技术人员已知的任何程序，纯化蛋白，包括抗体和其抗原结合部分。利用本领域已知的标准蛋白纯化技术，包括但不限于SDS-PAGE、粒度级份和尺寸排阻层析、硫酸铵沉淀、螯合物层析、离子交换层析或柱层析，可以将蛋白纯化为基本上纯的。例如，抗体可以利用柱层析纯化。纯化抗体的方法的实例是利用柱层析，其中将固相支持物柱材料连接于蛋白G，即来自链球菌(Streptococcus)的细胞表面相关蛋白，其以高亲和性结合免疫球蛋白。可以将抗体纯化为60%、70%、80%的纯度，通常为至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的纯度。利用标准方法，如利用SDS-PAGE和考玛斯染色，可以评估纯度。
从宿主细胞纯化蛋白、包括抗体或其部分的方法，取决于所选的宿主细胞和表达***。对于分泌的分子，在除去细胞后，通常从培养基纯化蛋白。对于细胞内表达而言，可以将细胞裂解，并从提取物中纯化蛋白。当转基因生物体如转基因植物和动物用于表达时，组织或器官可以用作制备裂解的细胞提取物的起始材料。此外，转基因动物产生可以包括在乳或卵中产生多肽，可以收集所述多肽，并且如果进一步需要，可以利用本领域的标准方法，提取蛋白并进一步纯化。
当通常在启动子诱导后利用转化的细菌大量表达蛋白时，尽管表达是组成性的，但是多肽可以形成不溶性聚集体。存在几种本领域技术人员已知的适合纯化多肽内含体的技术方案。许多改变对本领域技术人员而言是显而易见的。
例如，在一种方法中，通常离心细胞悬浮液，并且将含有内含体的沉淀悬浮液不溶解但是洗涤内含体的缓冲液中，例如20mM Tris-HCL(pH7.2)、1mM EDTA、150mM NaCl和2%Triton-X100，非离子去污剂。重复洗涤步骤以尽可能除去大量细胞碎片，可能是必须的。可以将剩余的内含体沉淀再悬浮于适当的缓冲液(如20mM磷酸钠,pH6.8,150mM NaCl)中。其他适当的缓冲液对本领域技术人员而言是显而易见的。
可选地，可以从细菌周质纯化蛋白。如果将多肽输出到细菌的周质，则除了本领域技术人员已知的其他方法以外，细菌的周质级分可以利用冷渗透休克分离。例如，在一方法中，为了从周质分离重组多肽，离心细菌细胞以形成沉淀。将沉淀重悬浮于含有20%蔗糖的缓冲液中。为了裂解细胞，离心细菌，并将沉淀重悬浮于冰冷的5mM MgSO4中，并于冰浴中保持约10分钟。离心细胞悬浮液，并将上清液移入其他容器并保存。利用本领域技术人员已知的标准分离技术，将存在于上清液中的重组多肽与宿主蛋白分离。这些方法包括但不限于下述步骤：溶解性分级、尺寸差异过滤以及柱层析。
E.实施例
提供下述实施例，仅用于说明之目的，并非意图限制本发明的范围。
实施例1
载体和表达质粒
在本实施例中，制备允许在CHO哺乳动物细胞中产生EGF受体抗体和在CHO哺乳动物细胞产生
Figure BDA00003151467300891
抗EGFR抗体的表达构建体。CHO细胞的使用，允许产生大量μg/mL抗体和相关翻译后修饰(如糖基化)。
作为包含完整ECD(N末端640个氨基酸，SEQ ID NO:13，SEQ IDNO:12所示的DNA)的可溶性细胞外结构域(sECD)，产生EGFR抗原(SEQID NO:10)。为了允许纯化，在C末端结构域并入组氨酸标签(His-标签，SEQ ID NO:7)。质粒还含有天然(SEQ ID NO:11)或IgG HC(SEQ ID NO:6)前导序列、Kozak共有序列以及任选地EGFR细胞外结构域和标签之间的Gly4Ser连接体(SEQ ID NO:4)。
制备
Figure BDA00003151467300892
抗EGFR抗体(SEQ ID NO:1和2，SEQ ID NO:9和8所示的DNA，分别是轻链和重链)质粒，其中将亲和标签(c-Myc即SEQ IDNO:5或FLAG即SEQ ID NO:3)连接于
Figure BDA00003151467300893
抗EGFR抗体Fc结构域的C末端。质粒含有重链和轻链两者的基因，从而在表达后，产生IgG抗体。质粒任选地在Fc结构域和亲和标签之间含有Gly4Ser连接体(SEQ IDNO:4)。下文的表7列出了质粒的说明。
Figure BDA00003151467300901
实施例2
结合测定显色
在本实施例中，利用商购可获得的试剂，使ELISA测定显色作为初步结合测定。在该测定中，使可溶性EGFR受体结合于96孔板，添加
Figure BDA00003151467300902
抗EGFR抗体，并允许其结合，并利用兔抗人类Fc-HRP缀合的二抗检测结合。评估缓冲液pH对以下结合的影响，即1)可溶性EGFR受体与Hi-bind或Ni涂覆的平板的结合，2)二抗结合以及3)可溶性EGFR受体
Figure BDA00003151467300903
抗EGFR抗体结合。
利用商业试剂的标准直接ELISA方案
于4°C用100μL12nM(1.32μg/mL)的sEGFR-H6抗原(Sino Biologics,Cat#10001-H08H)在PBS中过夜涂覆96孔Hi-bind平板(Hi bind,Costar#2592)。接着250μL/孔PBS洗涤平板3x，随后于RT下用250μLPBS/BSA(PBS,pH7.4,5mg/mL BSA)封闭1小时。在PBS/BSA中，制备连续稀释(3x，起始浓度500ng/mL，随后1:3稀释)的
Figure BDA00003151467300904
抗EGFR抗体，每孔添加100μL，将平板于RT下孵育1hr。随后用250μL/孔PBS/BSA将平板洗涤3x。将100μL/孔兔人类Fc-HRP缀合的二抗(在PBS/BSA中1:5000稀释)添加于每一孔中，并将平板于RT下孵育1hr。接着用250μL/孔的PBS/BSA将平板洗涤3x。最后，将100μL HRP第底物添加于每一孔，并允许平板于RT下显色15分钟(避光)。通过将100μL终止溶液添加每一孔中，终止反应，利用微量培养板分光光度计(MolecularDevices,Spectra Max M2)，于OD450nM、在30min内读取平板。动态范围约为3个自然对数，灵敏度约为50pg(在PBS中，pH7.4，具有5mg/mL BSA)。
缓冲液pH对将EGFR sECD-H6抗原涂覆到96孔板的影响
实施上文所述的测定，但具有下述修改：(1)使用Hi Bind或Ni涂覆的平板；(2)在PBS或KRB(克林二氏碳酸氢盐缓冲液)pH7.4中，涂覆3、6、12以及24nM的sEGFR-H6抗原；(3)用5mg/mL BSA的PBS或KRB溶液，pH7.4、6.5或6.0，阻断平板；以及(4)将250ng/mL的抗EGFR抗体添加于5mg/mL BSA的PBS或KRB pH7.4的溶液中。
结果表明，缓冲液pH对EGFR sECD-H6结合Hi-Bind平板的能力没有影响，但是通过His标签(H6)影响与镍平板的结合。
缓冲液pH对二抗检测的影响
在由上文所述测定修改的测定中，评估缓冲液pH对二抗结合的影响，其中将抗EGFR抗体直接涂覆于Hi-bind平板，接着在存在5mg/mL BSA和PBS pH7.4或KRB pH7.4、6.5或6.0的情况下，评估二抗结合。结果表明，
Figure BDA00003151467300913
抗EGFR抗体的二抗体检测在pH6.0或7.4时未受影响。
缓冲液pH对EGFR sECD-抗EGFR抗体结合的影响
为了评估缓冲液pH对EGFR sECD-
Figure BDA00003151467300915
抗EGFR抗体结合的影响，改变测定中
Figure BDA00003151467300916
抗EGFR抗体的浓度以及缓冲液pH。在上文所述的测定中，使用3次(3x)连续稀释的
Figure BDA00003151467300917
抗EGFR抗体，从100ng/mL开始，在KRB pH7.4、6.5或6.0中。结果表明，在高
Figure BDA00003151467300918
抗EGFR抗体浓度(即大于3ng/mL)下，对于每一pH而言，存在结合变化，同时pH7.4比pH6.0具有更好的结合。
实施例3
添加人血清对ELISA的影响
在本实施例中，测定添加人血清对ELISA结合测定影响。添加人血清以模拟肿瘤微环境。如上文实施例2所述，进行ELISA。以5%缓冲液的水平，添加正常人血清。以缓冲液的1%或5%，添加IgG耗尽的人血清。添加5mg/mL BSA作为对照。所有实验都在KRB pH7.4中进行。
结果表明，添加正常或IgG耗尽的人血清明显影响ELISA测定。添加5%人血清导致KD增加，因为人血清含有IgG，并且因此山羊抗人类Fc-HRP缀合的二抗结合血清以及
Figure BDA00003151467300921
抗EGFR抗体。添加IgG耗尽的人血清导致测定的动态范围降低30%。
实施例4
使用抗小鼠Fab二抗的影响
在本实施例中，评估在上文实施例2所述的测定中用作二抗的6种不同的抗小鼠Fab抗体。抗EGFR抗体是最初在小鼠中产生的嵌合抗体。评估这些二抗，以确定当在测定中使用人血清时，不同的二抗是否可以用于避免山羊抗人类Fc二抗的相互作用。
观察到，在ELISA测定中，抗小鼠二抗都不识别
Figure BDA00003151467300923
抗EGFR抗体。
实施例5
标记的替代蛋白间接ELISA
在本实施例中，用标记的替代蛋白间接ELISA测定作为使表位标签特异性间接ELISA显色的模型。为了允许使用人血清在测定中作为试剂/缓冲液，评估表位标签特异性间接ELISA的用途。人血清含有抗体，因此抗人类Fc二抗的使用招致来自与抗体即Erbitux以及血清结合的信号。在本测定中，将
Figure BDA00003151467300924
抗EGFR抗体在蛋白标签的C末端直接缀合于蛋白标签，并且用结合
Figure BDA00003151467300925
抗EGFR抗体上的标签的抗附加表位抗体作为二抗。常见的蛋白附加表位列于下文的表8中。评估了测定试剂盒条件即缓冲液pH和可行性。
Figure BDA00003151467300926
Figure BDA00003151467300931
利用简化的标记的替代蛋白间接ELISA，评估测定试剂盒条件，在所述测定中，用标记的替代蛋白直接涂覆96孔板，并且检测二抗标签抗体与标记的替代蛋白的结合。使用3个表位标记的替代蛋白(参见下文9)。利用商购可获得的抗标签抗体，包括抗myc抗体(GenScript,#A00173,Abcam,#ab1326或Abcam,#1261)、抗FLAG抗体(GenScript,#A01428)、抗HA抗体(GenScript,#A00169)以及抗VSV-G抗体(GenScript,#A00872)，评估6个附加表位。
Figure BDA00003151467300932
标记检测抗体的测试
为了测试抗标签抗体的检测，根据上文表8，用在PBS中稀释的替代物标记的蛋白涂覆Hi bind96孔板。用5mg/mL BSA封闭平板。然后用在具有5mg/mL BSA的PBS中稀释至浓度为1000、500、250、120以及0ng/mL的抗标签抗体检测附加表位。
结果表明，抗HA和抗FLAG抗体所给出的信号比抗Myc抗体所给出的信号高。
缓冲液pH对将标记的蛋白涂覆于Hi bind平板的影响
为了测试缓冲液pH对将标记的蛋白涂覆于Hi bind平板上的影响，涂覆在PBS pH7.4或克林二氏缓冲液(Krebs-Ringers Buffer,KRB)pH7.4中浓度为10、5、2.5以及1μg/mL的c-Myc-、FLAG和多融合标记的蛋白。随后用5mg/mL BSA的PBS或KRB pH7.4、6.5和6.0的溶液，封闭平板。用在PBS或KRB H7.4稀释的抗标签Ab(500ng/mL，具有5mg/mLBSA)检测附加表位。
结果表明，缓冲液pH对标记的蛋白对Hi bind平板的涂覆稳定性无影响，因为在用pH7.4、6.5或6.0的PBS或KRB封闭的平板之间未观察到差异。
缓冲液pH对Hi bind平板上标记的蛋白检测的影响
为了测试缓冲液pH对标记蛋白检测的影响，用连续2x稀释的c-Myc和FLAG标记的蛋白涂覆Hi bind平板，c-Myc和FLAG标记的蛋白的起始浓度为在PBS或KRB pH7.4中10μg/mL。用5mg/mL BSA的PBS或KRB pH7.4、6.5和6.0的溶液封闭平板。用在PBS或KRB pH7.4、6.5以及6.0稀释的抗标签Ab(对于抗c-Myc-tag Ab，为1μg/mL，对于抗FLAG-tag Ab为0.5μg/mL，具有5mg/mL BSA)检测附加表位。
结果表明，缓冲液pH对抗FLAG-tag抗体检测附加表位具有很小的影响，因为与pH6.5和6.0相比，在pH7.4,结合稍微降低。对于抗c-Myc-标签抗体而言，观察到同样的整体效果。
抗Myc-tag抗体的pH敏感性
进一步评估3种抗Myc-标签抗体(GenScript,#A00173,Abcam,#ab1326or Abcam,#1261)的pH敏感性。用在PBS或KRB pH7.4中以浓度为250ng/mL开始4x连续稀释的多融合标签蛋白涂覆Hi bind平板。用5mg/mL BSA的PBS或KRB pH7.4、6.5以及6.0的溶液，封闭平板。用山羊或兔抗c-Myc标签Ab(200或500ng/mL)的PBS或KRB pH7.4、6.5和6.0溶液，检测标记的蛋白。
结果表明，Abcam抗体比GenScript抗体更敏感。此外，缓冲液pH仅对来自Abcam的山羊或兔抗c-myc抗体检测附加表位具有最小影响。
缓冲液pH对抗Myc-tag抗体的影响
进一步评估缓冲液pH对Abcam抗Myc-标签抗体(Abcam,#ab1326或Abcam,#1261)结合的影响。用在PBS pH7.4中以浓度为250ng/mL开始3x连续稀释的多融合标签蛋白涂覆Hi bind平板。用5mg/mL BSA的KRBpH7.4、6.5以及6.0的溶液封闭平板。用山羊或兔抗c-Myc标签Ab(250或500ng/mL)的KRB pH7.4、6.5以及6.0的溶液检测标记的蛋白。
结果表明，缓冲液pH对来自Abcam的山羊或兔抗c-myc抗体检测附加表位仅具有最小影响。
其他抗Myc-tag抗体的评估
评估3种其他抗Myc-tag抗体，并将其与Abcam抗Myc-标签抗体(Abcam,#ab1326或Abcam,#1261)和与抗VSV-G抗体(Genscript,#A00872)进行比较。抗体是山羊抗c-Myc标签Ab(GeneTex，目录号GTX21261)、兔抗c-Myc标签Ab(GeneTex,目录号GTX19312)以及山羊抗c-Myc标签Ab(Alpha Diagnostics,Cat#MYC13-HRP)。用在PBS pH7.4中浓度为250ng/mL的多融合标签蛋白涂覆Hi bind平板。用5mg/mL BSA的PBS pH7.4的溶液封闭平板。用山羊或兔抗c-Myc标签Ab(连续稀释，从250ng/mL开始)的PBS pH7.4溶液检测标记的蛋白。
结果表明，Abcam抗体和来自GeneTex的山羊抗c-Myc标签Ab都以与亲和性稍低的来自GeneTex兔抗c-Myc标签Ab相似的亲和性结合多融合标签蛋白。来自Alpha Diagnostics的抗VSV-G抗体和山羊抗c-Myc标签Ab两者的亲和性比所测试的其他抗体的亲和性低约5倍。
人血清作为封闭剂对抗c-Myc相比抗HA抗体的影响
在存在5%人血清的情况下将5种抗c-myc抗体(见上文)的结合与抗HA-标签抗体(GenScript,#A00169)的结合进行比较。用在PBS pH7.4溶液中以浓度为250ng/mL开始3x连续稀释的多融合标记的蛋白涂覆Hi bind平板。用5%人血清的KRB pH7.4的溶液封闭平板。用山羊或兔抗c-Myc标签Ab或山羊抗HA抗体(3x连续稀释，从250ng/mL开始)的KRB pH7.4溶液检测标记的蛋白。
结果表明，在存在5%人血清的情况下，抗HA抗体以及抗c-Myc抗体不结合。Abcam和GeneTex抗c-myc抗体都具有相似的亲和性。结果还表明，人血清不干扰二抗对标记的蛋白的检测。
存在25%人血清的情况下的标记蛋白检测
评估在25%人血清的KRB缓冲液pH6.0和7.4的溶液存在的情况下，抗FLAG抗体(Abcam,ab1238)对FLAG标签蛋白的检测。pH7.4时KD的约为224ng/mL，而pH6.0时的KD约为135ng/mL。
还评估在25%人血清的KRB缓冲液pH6.0和7.4的溶液存在的情况下，抗myc抗体(Abcam,ab1326)对myc标签蛋白的检测。pH7.4时的KD约为7.98ng/mL，而pH6.0时的KD约为7.73ng/mL。
评估在25%人血清的KRB缓冲液pH7.4的溶液存在的情况下，抗Myc抗体(Abcam,ab1326)对多融合标签蛋白的检测。KD约为20ng/mL。
实施例6
人血清对抗EGFR-FL MAb pH敏感ELISA的影响
在本实施例中，利用FLAG标记的
Figure BDA00003151467300961
抗EGFR抗体和山羊抗FLAG-HRP缀合的二抗，评估增加人血清的量的影响。利用pH7.4或6.0的KRB与5%或25%人血清和不同量的乳酸(参见下文表9)，进行实验。添加人血清和乳酸是为了模拟肿瘤微环境。
简而言之，于4°C用100μL12nM(1.32μg/mL)sEGFR-HG抗原(SinoBiologics,Cat#10001-H08H)的KRB pH7.4溶液，涂覆96-孔Hi-bind平板(Costar#2592)过夜。接着用250μL/孔KRB pH7.4洗涤平板3x，随后于RT用250μL pH7.4和6.0的具有人血清和乳酸的KRB(如下文表9所示)封闭1小时。在具有人血清和乳酸的KRB pH7.4和6.0中，制备FLAG-EGFR MAb标准品或测试标准品的连续稀释液(3x，起始浓度100ng/mL，随后1:3稀释)，每孔添加100μL，将平板于RT孵育1hr。接着用250μL/孔pH7.4和6.0的具有人血清和乳酸的KRB将平板洗涤3x。将100μL/孔山羊抗FLAG-HRP缀合的二抗(在pH7.4和6.0的具有25%人血清和乳酸的KRB中以1:2000稀释)添加于每一孔中，并将平板于RT孵育1hr。接着用250μL/孔、pH7.4和6.0的具有人血清和乳酸的KRB将平板洗涤3x。最后，将100μL Sureblue TMB Microwell Peroxidase Substrate1组分(KPL,#52-00-03)溶液添加于每一孔中，并允许平板于RT显影15-20分钟(避光)。将100μL TMB终止溶液(KPL,#50-85-06)添加于每一孔中来终止反应，并利用微孔板分光光度计(Microplate Spectrophotometer,MolecularDevices, Spectra Max M2)于OD450nM在30min内读取平板。
Figure BDA00003151467300971
不管人血清浓度如何，对于每一测试的pH而言，结果是一致的。例如，在pH6.0的25%人血清中抗EGFR抗体结合的KD为2.21ng/mL，而对于利用pH6.0的5%人血清的测定而言，KD为2.12ng/mL。对于pH7.4而言，观察到相同的效果。3个不同的操作人员各自进行的3个实验的结果得到证实。因为结果表明两种百分比的人血清之间没有差异，且25%更紧密地模拟生理条件，因此选择25%用于将来的实验。5%和25%人血清鲁棒性(Robustness)的适用性标准列于下文的表11-12中。
1.0Log浓度(α-EGFR-FLAG抗体)的变化对应于OD约2.5的变化
Figure BDA00003151467300973
LLOQ：定量的下限；ULOQ：定量的上限；1.0Log浓度(α-EGFR-FLAG抗体)的变化对应于OD约2.5的变化。
实施例7
模拟肿瘤微环境和正常生理条件的ELISA
在本实施例中，使并行的高通量pH敏感性间接ELISA显色，并用来测试模拟肿瘤微环境内细胞外基质中的结合条件，如低pH(pH<7.4，例如6.0)、乳酸浓度升高(12-20mM)以及存在人血清。同时，还测试了模拟正常生理的条件(如pH7.4、1mM乳酸、25%人血清)。以此方式，可以鉴定抗体，如利用本文其他地方和下文实施例8所述的方法所产生的、在代表肿瘤微环境而不是正常靶蛋白的条件中优先结合靶蛋白的变异抗体。
选择克林二氏碳酸氢盐缓冲液用于筛选，因为其非常密切地反映了生理缓冲液。将乳酸包括在指定浓度的测定缓冲液中，并且缓冲液的pH可以利用1N HCl来调整至7.4或6.0。此外，因为在筛选中使用了人血清，因此不使用标准品和易于获得的抗人类IgG1Fc抗体，这是由于在人血清中发现的IgG的量所致(参见上文的实施例3)。因此，在测定中使用FLAG标记的抗EGFR亲代抗体作为标准品。
简而言之，将EGF受体的细胞外结构域(EGFR sECD)固定于96孔板上。利用pH7.4的缓冲液，进行这一抗原涂覆步骤。用含有FLAG-标记的抗EGFR抗体变体的细胞培养物上清液的预定稀释液孵育结合的抗体。HRP-缀合的抗FLAG抗体结合后，检测标记的抗体变体。如下文所述，在并行条件下、用pH7.4或pH6.0的缓冲液，进行最初的封闭、FLAG-抗体变体的结合和通过缀合的抗FLAG二抗检测。
测定：
用100μL12nM(1.32μg/mL)EGFR sECD-H6抗原(如实施例1所述制备，或sEGFR-H6(Sino Biologics,Cat#10001-H08H))在缓冲液A(克林二氏缓冲液(KRB,Sigma Aldrich,#K4002)pH7.4，无人血清)的溶液，将96孔Hi-bind平板(Costar#2592)于4°C孵育过夜，或于室温(RT)下孵育2小时。接着用250μL/孔缓冲液A将平板洗涤3x，随后用250μL pH7.4的缓冲液B(1mM乳酸/25%人血清)或pH6.0的缓冲液C(16.6mM乳酸/25%人血清)于RT封闭1小时，同时覆盖。在pH7.4的缓冲液B(KRB,pH7.4,1mM乳酸/25%人血清)或pH6.0的缓冲液C(KRB,pH6.0,16.6mM乳酸/25%人血清)中，制备抗EGFR-FLAG抗体标准品的连续稀释液(3x，起始浓度100ng/mL，随后以1:3稀释)，并按每孔100μL添加。稀释后，抗EGFR-FLAG抗体的浓度为666.67pM(100ng/mL)、222.22pM(33.33ng/mL)、74.07pM(11.11ng/mL)、24.69pM(3.70ng/mL)、8.23pM(1.23ng/mL)、2.74pM(0.41ng/mL)、0.91pM(0.137ng/mL)以及0。如上文针对抗体标准品所述，制备测试样品的稀释液，并按每孔100μL添加。覆盖抗EGFR-FLAG抗体标准品和测试样品，并于RT孵育1hr。然后用250μL/孔pH7.4的缓冲液B或pH6.0的缓冲液C将平板洗涤3x。将以100μL/孔，将500ng/mL山羊抗FLAG-HRP检测抗体(Abcam,#ab1238)的pH7.4缓冲液B或pH6.0缓冲液C溶液添加于每一孔，覆盖平板，并于RT下孵育1hr。然后用250μL/孔pH7.4的缓冲液B或pH6.0的缓冲液C，将平板洗涤3x。最后将100μL Sureblue TMB Microwell Peroxidase Substrate1-组分(KPL,#52-00-03)溶液添加于每一孔，并允许平板于RT显色15-20分钟(避光)。将100μL TMB终止溶液(KPL,#50-85-06)添加于每一孔来终止反应，并利用微孔板分光光度计(Molecular Devices,Spectra Max M2)于OD450nM在30min内读取平板。
每一平板都包括抗EGFR-FLAG抗体标准品、阳性对照(亲代抗体)以及阴性对照转染。一式三份，进行ELISA。
可以将鉴定在模拟肿瘤微环境而非正常生理条件的条件下优先结合靶蛋白的抗体如变异抗体的选择标准，测定为在pH6.0/7.4结合的抗体变变体与相对于亲代对照抗体的具体折叠增加的比例。与亲代对照抗体如标记的
Figure BDA00003151467300995
抗EGFR抗体对照抗体相比，在pH6.0具有强结合活性并且在中性pH7.4结合减弱的那些抗体如变异抗体，是目的抗体。
实施例8
抗EGFR抗体突变体的产生
在本实施例中，构建并制备抗EGFR抗体单点突变体的全面位置演化文库(comprehensive positional evolution,CPE)。用于CPE文库构建的位置，集中于
Figure BDA00003151467300992
抗EGFR抗体轻链和重链的可变区CDR，包括在抗原识别中发挥作用的其他氨基酸。在
Figure BDA00003151467300993
重链或轻链可变区(分别为SEQ ID NO:2和1)内100个氨基酸位置中每一位置处产生含有至少15个氨基酸变体的单点变体文库(参见图1)。氨基酸组氨酸包括于每一位置处1个变体内。制备库成员的甘油母液并贮存于-80°C。
对库的每一成员测序、在CHO细胞中表达为IgG抗体、在96孔板的可寻址阵列中排列，并通过ELISA测试在模拟肿瘤微环境的条件下和在模拟正常生理条件的条件下与EGFR抗原细胞外结构域的结合，如实施例7所述，以鉴定与亲代标记的
Figure BDA00003151467300994
抗EGFR对照抗体相比，在较低的pH6.0下具有结合活性并且在pH7.4结合活性减弱的抗体。
另外，使用SEAP或定量测定。在本测定中，会测量细胞培养物上清液中分泌的碱性磷酸酶(SEAP)的活性。SEAP活性/抗体蛋白浓度会用来弥补转染/表达效率变化，并将抗体变体结合活性归一化为野生型。考虑从CPE筛选鉴定的阳性克隆，用于通过构建CPS文库进行发展，以筛选在低pH(6.0)条件下与EGFR sECD结合增强的突变蛋白(mutein)。
实施例9
抗EGFR抗体突变体的条件活性
利用ELISA评估实施例8所述的
Figure BDA00003151467301001
抗EGFR抗体单点突变体CPE文库的成员，以测量在pH6.0和pH7.4下与EGFR sECD-H6抗原的结合，从而鉴定实施例7所述的条件活性突变体。结果列于表13中。在所测试的1501个突变体中，248个突变体是条件活性(209个突变体的归一化的特异性活性在pH7.4时>0.4，并且在pH6.0时<0.4；且39个突变体归一化的特异性活性在pH6.0时>0.4，并且在pH7.4时<0.4)突变体。在剩余的突变体中，283个突变体具有低表达水平(<20ng/ml)，149个突变体在pH6.0或pH7.4时不具有结合活性，且737个突变体在pH6.0和pH7.4时归一化的特异性活性>0.4。
Figure BDA00003151467301003
因为修改对本领域技术人员而言是显而易见的，因此意图本发明仅受到所附权利要求书范围的限制。
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Figure IDA00003151468000471

Claims (114)

1.鉴定/选择***且在低pH下比在中性pH下更具有活性的治疗蛋白的方法，其中：
所述方法包括：
a)测试所述蛋白在包括低pH的条件下的活性；
b)测试所述蛋白在包括中性pH的条件下的活性；
c)将a)中的所述活性与b)中的所述活性进行比较；以及
d)选择/鉴定与b)相比在a)中活性更强的蛋白，由此鉴定在低pH比在高pH更具有活性的蛋白。
2.权利要求1的方法，其中低pH小于7.4。
3.权利要求1或2的方法，其中低pH介于或约介于5.8-6.8。
4.权利要求1-3任一项的方法，其中中性pH为或约为7.2-7.6。
5.权利要求1-4任一项的方法，其中中性pH约为或为7.4。
6.权利要求1-5任一项的方法，其中a)中的所述条件包括选自乳酸盐浓度增加、丙酮酸盐浓度增加以及缺氧的一种或多种条件。
7.权利要求1-6任一项的方法，其中：
a)中的所述条件包括选自以下的增加的乳酸盐浓度：10mM至20mM的乳酸或15mM至18mM的乳酸；或至少约或16mM、16.5mM或17mM的乳酸；和/或
b)中的所述条件包括选自以下的乳酸盐浓度：0.5-5mM或0.2mM-4mM的乳酸；或为或约为0.5、1、2、3、4或5mM的乳酸。
8.鉴定/选择在肿瘤微环境中比在非肿瘤微环境中更具有活性的治疗蛋白的方法，其中：
所述方法包括：
a)在存在于期望该活性的肿瘤微环境中而非存在于非肿瘤环境中的条件下测试所述蛋白的活性，
b)在存在于非肿瘤微环境的条件下，测试所述蛋白的活性，
c)将a)中的所述活性与b)中的所述活性进行比较；以及
d)选择/鉴定与b)相比，在a)中活性更强的蛋白，从而鉴定在肿瘤微环境比非肿瘤微环境中更具有活性的蛋白。
9.权利要求8的方法，其中所述非肿瘤微环境是***微环境。
10.权利要求8或9的方法，其中所述非肿瘤微环境是是健康组织。
11.权利要求8-10任一项的方法，其中所述健康组织是胃肠(GI)道、皮肤、脉管***、血液或细胞外基质。
12.权利要求8-11任一项的方法，其中除了存在于肿瘤微环境中而非存在于非肿瘤微环境中的一种或多种条件之外，a)和b)中的每一个均在相同的条件下进行。
13.权利要求8-12任一项的方法，其中所述存在于肿瘤微环境中的条件包括选自以下的一种或多种特性：血管形成增加、缺氧、pH降低、乳酸盐浓度增加、丙酮酸盐浓度增加、组织间隙液压增加以及标志肿瘤的代谢物或代谢的改变。
14.权利要求8-13任一项的方法，其中所述存在于肿瘤微环境中的条件包括比中性pH低的pH或比非肿瘤微环境pH低的pH。
15.权利要求8-14任一项的方法，其中所述存在于肿瘤微环境中的条件包括低于7.4的pH。
16.权利要求8-15任一项的方法，其中所述肿瘤的pH约为或为5.8-6.8，含5.8和6.8，并且所述存在于肿瘤微环境中的条件包括介于或约介于5.8-6.8的pH。
17.权利要求8-16任一项的方法，其中所述存在于肿瘤微环境中的条件包括与存在于非肿瘤微环境中的条件相比升高的乳酸盐浓度和/或增加的丙酮酸盐浓度。
18.权利要求8-17任一项的方法，其中与b)中的条件相比，a)的所述条件包括比中性低的pH和升高的乳酸浓度。
19.权利要求18的方法，其中所述pH介于5.8-6.8，含5.8和6.8，或5.8-6.5，含5.8和6.5。
20.权利要求8-19任一项的方法，其中a)中的所述条件包括选自以下的增加的乳酸盐浓度：10mM至20mM的乳酸或15mM-18mM的乳酸；或至少约或16mM、16.5mM或17mM的乳酸；和/或
b)中的所述条件包括选自以下的乳酸盐浓度：0.5-5mM或0.2mM至4mM的乳酸；或为或约为0.5、1、2、3、4或5mM的乳酸。
21.权利要求8-20任一项的方法，其中所述蛋白是***的治疗蛋白。
22.权利要求1-21任一项的方法，其在体外进行。
23.权利要求1-22任一项的方法，其中所述治疗蛋白是抗体、酶、激素、细胞因子或其活性部分，且所述抗体指的是抗体或其抗原结合片段。
24.权利要求1-23任一项的方法，其中所述治疗蛋白是靶受体的配体。
25.权利要求1-24任一项的方法，其中所述***的治疗蛋白是抗肿瘤抗体。
26.权利要求25的方法，其中所述抗肿瘤抗体选自西妥昔单抗
Figure FDA00003151467200031
曲妥珠单抗
Figure FDA00003151467200032
利妥昔单抗
Figure FDA00003151467200034
贝伐单抗
Figure FDA00003151467200035
阿仑单抗
Figure FDA00003151467200036
帕尼单抗
Figure FDA00003151467200037
雷珠单抗Ibritumomab、替伊莫单抗(Ibritumomab tiuxetan,
Figure FDA00003151467200039
托西莫单抗、碘I131托西莫单抗
Figure FDA000031514672000310
卡妥索单抗
Figure FDA000031514672000311
吉妥珠单抗、吉妥珠单抗奥唑米星阿贝西普(CTLA4-Ig,
Figure FDA000031514672000313
贝拉西普(L104EA29YIg;LEA29Y; LEA)、伊匹单抗(MDX-010, MDX-101)、曲美目单抗(ticilimumab,CP-675,206)、PRS-010、PRS-050、阿柏西普(VEGF Trap, AVE005)、伏洛昔单抗(M200)、F200、MORAb-009、SS1P (CAT-5001)、西妥木单抗(IMC-A12)、马妥珠单抗(EMD72000)、尼妥珠单抗(h-R3)、扎鲁目单抗(HuMax-EGFR)、奈昔木单抗 IMC-11F8、mAb806/ch806、Sym004以及mAb-425。
27.权利要求25或26的方法，其中所述抗肿瘤抗体是西妥昔单抗
Figure FDA000031514672000314
28.权利要求1-27任一项的方法，其中：
在a)和b)中的每一个中测试多种蛋白；
在a)和b)中测试每一种蛋白；以及
选择与b)相比在a)中活性更强的任何 蛋白。
29.权利要求28的方法，其中所述多种蛋白包含治疗蛋白的修饰变体或者是治疗蛋白的修饰变体，并且在a)和b)中的每一个中测试变体的集合。
30.权利要求1-29任一项的方法，其中所述治疗蛋白包含多聚化结构域。
31.权利要求30的方法，其中所述多聚化结构域包含Fc结构域或修饰的Fc结构域。
32.权利要求1-31任一项的方法，其中所述治疗蛋白是抗体、酶、激素或细胞因子。
33.权利要求32的方法，其中所述治疗蛋白是抗体。
34.权利要求1-33任一项的方法，其中所述治疗蛋白是抗肿瘤抗体。
35.权利要求34的方法，其中所述抗肿瘤抗体选自西妥昔单抗曲妥珠单抗
Figure FDA00003151467200042
利妥昔单抗
Figure FDA00003151467200043
Figure FDA00003151467200044
贝伐单抗
Figure FDA00003151467200045
阿仑单抗
Figure FDA00003151467200046
帕尼单抗
Figure FDA00003151467200047
雷珠单抗
Figure FDA000031514672000411
帕尼单抗、替伊莫单抗(Ibritumomabtiuxetan,
Figure FDA000031514672000412
托西莫单抗、碘I131托西莫单抗
Figure FDA000031514672000413
卡妥索单抗
Figure FDA000031514672000410
吉妥珠单抗、吉妥珠单抗奥唑米星
Figure FDA00003151467200048
阿贝西普(CTLA4-Ig，贝拉西普(L104EA29YIg;LEA29Y;LEA)、伊匹单抗(MDX-010,MDX-101)、曲美目单抗(ticilimumab,CP-675,206)、PRS-010、PRS-050、阿柏西普(VEGF Trap,AVE005)、伏洛昔单抗(M200)、F200、MORAb-009、SS1P(CAT-5001)、西妥木单抗(IMC-A12)、马妥珠单抗(EMD72000)、尼妥珠单抗(h-R3)、扎鲁目单抗(HuMax-EGFR)、奈昔木单抗IMC-11F8、mAb806/ch806、Sym004以及mAb-425。
36.权利要求29-35任一项的方法，其中所述修饰变体与治疗蛋白的非修饰形式相比含有一个或多个氨基酸残基的氨基酸取代、***和/或缺失。
37.权利要求1-36任一项的方法，其中测试的所述蛋白是与抗体的非修饰形式相比在互补性决定区(CDR)中包含一个或多个氨基酸取代的变异抗体。
38.权利要求29-37任一项的方法，其中每一变异蛋白与治疗蛋白的非修饰形式相比含有单个氨基酸取代。
39.权利要求29-37任一项的方法，其中每一变异蛋白与治疗抗体的非修饰形式相比含有2、3、4、5、6、7、8、9或更多个氨基酸取代。
40.权利要求29-39任一项的方法，其中：
在所述集合中，在每一改变的位置处的氨基酸，被不同于所述位置处的最初氨基酸的多达1-19种氨基酸取代；且
沿着所述治疗蛋白或其所选部分的长度，取代每一氨基酸。
41.权利要求29-40任一项的方法，其中所述取代氨基酸选自Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr以及Val，前提条件是所述取代氨基酸不同于所述治疗蛋白中相应位置处的氨基酸。
42.权利要求29-41任一项的方法，其中组氨酸是取代氨基酸或所述蛋白中的组氨酸被非碱性或非带电荷氨基酸取代。
43.权利要求29-42任一项的方法，其中所述修饰包括用选自Arg、Asp、Glu、His以及Lys的氨基酸进行氨基酸取代。
44.权利要求29-43任一项的方法，其中所述修饰包括用His进行氨基酸取代。
45.权利要求29-44任一项的方法，其中所述蛋白是抗体，且修饰的所选部分是CDR。
46.权利要求29-45任一项的方法，其中单独测试所述集合中的每一变异蛋白。
47.权利要求29-46任一项的方法，其中在阵列中测试每一变异蛋白。
48.权利要求29-46任一项的方法，其中所测试的每一变异蛋白是可寻址的。
49.权利要求1-48任一项的方法，其中所测试的活性是与所述治疗蛋白的靶蛋白的结合。
50.权利要求49的方法，其中所述结合通过免疫测定评估。
51.权利要求49或50的方法，其中所述免疫测定包括ELISA。
52.权利要求50或51的方法，其中所述免疫测定是异相的，包括：
将所述靶蛋白固定于固相支持物；
使所述治疗蛋白与所述靶蛋白接触，其中所述治疗蛋白被可检测地标记；
除去未结合的治疗蛋白；以及
检测或测量所述标记的治疗蛋白与所述靶蛋白的结合。
53.权利要求50或51的方法，其中所述免疫测定是均相的，包括：
使所述治疗蛋白与靶蛋白接触，其中所述治疗蛋白被可检测地标记；和
检测或测量所述标记的治疗蛋白与所述靶蛋白的结合。
54.权利要求1-53任一项的方法，其中利用包含在表面表达治疗蛋白的一种或多种细胞的细胞表面表达***评估结合活性。
55.权利要求54的方法，其中：
在所述细胞的表面表达治疗蛋白；
使靶蛋白与所述细胞的群接触；以及
鉴定结合所述靶蛋白的一种或多种细胞，由此鉴定表现出结合活性的治疗蛋白。
56.权利要求55的方法，其中所述靶蛋白被可检测地标记或可被检测。
57.权利要求56的方法，其中以荧光标记所述靶蛋白或利用荧光标记的第二试剂检测所述靶蛋白。
58.权利要求49-57任一项的方法，其中通过荧光激活细胞分选术(FACS)检测或测量所述结合。
59.权利要求1-58任一项的方法，其中
首先在条件b)下利用包含表达治疗蛋白的细胞的细胞表面表达***测试结合活性，由此选择结合所述靶蛋白的一种或多种细胞，并且选择不结合所述靶蛋白的一种或多种细胞；
分离所选的不结合所述靶蛋白的所述一种或多种细胞并使其于细胞培养基中生长，以产生在表面表达所述治疗蛋白的第二细胞群；
在a)条件下测试结合活性，由此使来自所述第二细胞群的细胞与所述靶蛋白接触；以及
鉴定结合所述靶蛋白的一种或多种细胞，从而鉴定在a)条件而非b)条件下表现出结合活性的治疗蛋白
60.权利要求1-58任一项的方法，其中
首先在a)条件下利用包含表达治疗蛋白的细胞群的细胞表面表达***测试结合活性，由此选择结合所述靶蛋白的一种或多种细胞，并选择不结合所述靶蛋白的一种或多种细胞；
分离所选的结合所述靶蛋白的所述一种或多种细胞，并使其生长于细胞培养基中，以产生第二细胞群；
在b)条件下测试结合或，由此使来自所述第二细胞群的细胞与所述靶蛋白接触；以及
鉴定不结合所述靶蛋白的一种或多种细胞，并鉴定结合所述靶蛋白的一种或多种细胞，
选择不结合所述靶蛋白的一种或多种细胞，由此鉴定表现出结合活性的治疗蛋白。
61.权利要求1-60任一项的方法，其中将所述治疗蛋白给予个体伴随一种或多种不良副作用。
62.权利要求61的方法，其中与a)相比在b)中降低所述蛋白的活性改善或防止所述不良副作用。
63.权利要求1-62任一项的方法，其中在存在人血清的情况下，在a)和b)中测试所述治疗蛋白的活性。
64.权利要求1-63任一项的方法，其中
在存在人血清的情况下在a)和b)中测试所述治疗蛋白的活性，所述人血清的量是存在于生理环境中的量；和
在a)中的所述血清浓度等于在b)中的所述血清浓度。
65.权利要求1-64任一项的方法，其中，按体积计，在存在选自至少介于或约介于以下浓度的人血清的情况下，进行a)和b)：3%-30%，含3%和30%；5%-30%，含5%和30%；5%-25%，含5%和25%；10%-30%，含10%和30%；15%-30%，含15%和30%；以及15%-25%，含15%和25%。
66.权利要求65的方法，其中所述人血清的浓度按体积计为或约为25%(加减10%)或15%-35%。
67.权利要求1-66任一项的方法，其中所述治疗蛋白的靶蛋白是结合配体的受体或其部分。
68.权利要求67的方法，其中所述治疗蛋白的靶蛋白是受体，所述受体是肿瘤抗原。
69.权利要求68的方法，其中所述治疗蛋白的靶蛋白是Her受体家族的成员。
70.权利要求69的方法，其中所述治疗蛋白的靶蛋白是EGFR受体或其细胞外结构域。
71.权利要求1-70任一项的方法，其中a)中的所述活性以预定量或比例高于b)中的所述活性。
72.权利要求71的方法，其中所述活性高出的比例为或至少为1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、30、40、50或更高。
73.权利要求1-72任一项的方法，其中在a)中的所述活性比在b)中的所述活性高至少5%、10%、15%、20%、25%、35%、50%、100%、2倍、5倍、10倍、20倍或更多。
74.权利要求1-73任一项的方法，其中给予所述抗肿瘤抗体伴随一种或多种不良副作用。
75.权利要求74的方法，其中所述抗体是抗EGFR抗体或抗CTLA4抗体。
76.权利要求1-75任一项的方法，其以高通量模式进行。
77.权利要求1-76任一项的方法，其中所述方法是自动化的。
78.权利要求1-77任一项的方法，其中所选的蛋白是条件活性的，从而其在肿瘤微环境中与在非肿瘤环境中相比具有更强的活性。
79.权利要求1-78任一项的方法，将其重复多次，其中在每一重复中，产生所选的一种或多种蛋白的其他变体并对其进行测试，由此使所述治疗蛋白发展为在肿瘤环境中比在非肿瘤环境中表现出增强的活性，从而表现出降低的毒性或降低的不良副作用。
80.权利要求61-79任一项的方法，其中所选治疗蛋白是抗EGFR抗体，且所述降低的不良副作用包括降低的与抗体的***暴露有关的皮肤毒性。
81.权利要求1-80任一项的方法，其中所述所选的蛋白是抗EGFR抗体变体，与在b)正常生理pH7.3-7.4和低于12mM的正常乳酸盐浓度的条件下相比，其在5.8-6.8的降低的pH和乳酸盐浓度约为12-20mM的肿瘤微环境内的条件下，优先结合EGFR。
82.权利要求1-81任一项的方法，其中：
在步骤a)-d)之前，所述方法包括
e)使第一固相支持物和第二副本固相支持物与EGFR或EGFR细胞外结构域(ECD)在pH为或约为pH7.4的缓冲液中接触；
f)用pH为或约为pH7.4的缓冲液洗涤所述第一支和第二支持物；
g)将包含25%或约25%人血清的缓冲液添加于所述第一和第二固相支持物；其中：
i)添加于所述第一固相支持物的所述缓冲液的条件包括pH为或约为6.0的12-20mM的乳酸；和
ii)添加于所述第二固相支持物的所述缓冲液的条件包括1mM或约的1mM的乳酸，pH为或约为7.4；
h)从所述固相支持物除去在步骤c)中添加的所述缓冲液；和
在进行步骤e)-h)后，进行步骤a)-d)，其中：
步骤a)包括：
将可检测标记的修饰的抗EGFR抗体添加于pH6.0的、包含12-20mM乳酸、25%人血清的结合缓冲液中的第一支持物；
用pH为或约为6.0的包含12-20mM乳酸的缓冲液洗涤所述第一支持物；以及
将检测结合的修饰的抗EGFR的试剂添加于所述第一固相支持物，并检测所述修饰蛋白与所述EGFR或EGFR ECD在所述第一固相支持物上的结合；和
步骤b)包括：
将可检测标记的修饰的抗EGFR抗体添加于pH7.4的包含1mM乳酸、25%人血清的结合缓冲液中的第二支持物；
用pH为或约为7.4的包含1mM或约1mM的乳酸的缓冲液洗涤所述第二支持物；以及
将检测结合的修饰的抗EGFR的试剂添加于所述第二固相支持物，并检测所述修饰蛋白与所述EGFR或EGFR ECD在所述第二固相支持物上的结合。
83.权利要求82的方法，其中所述抗EGFR抗体含有FLAG标签，以便用抗FLAG-TAG酶试剂进行检测。
84.权利要求82或83的方法，其中检测结合包括分光光度法测量。
85.鉴定/选择在第一组条件下比在第二组条件下更具有活性的治疗蛋白的方法，其中：
所述第一组条件包括与非肿瘤微环境相比存在于肿瘤微环境中的选自以下条件中的一种或多种条件：低pH、乳酸盐浓度增加、丙酮酸盐浓度增加以及缺氧；和
第二组条件包括存在于所述非肿瘤微环境中的相应条件；和
所述方法包括：
a)在所述第一组和第二组条件下，测试多种蛋白的活性；其中：
所述多种蛋白包含治疗蛋白的修饰变体或所述多种蛋白是治疗蛋白的修饰变体；和
在所述第一和第二组条件中的每一组条件下测试变体的第一集合；
b)选择/鉴定以下蛋白：
与所述非修饰的治疗蛋白相比，在所述第一组条件下活性降低的蛋白；和
与所述非修饰的治疗蛋白相比，在所述第二组条件下活性降低的蛋白；
c)分析在步骤在b)中选择/鉴定的蛋白，以鉴定受到修饰的氨基酸位置，由此所述氨基酸被鉴定为重要氨基酸位置；
d)产生包含取代氨基酸对邻近重要氨基酸位置或其附近的氨基酸残基的取代的变异蛋白的第二集合，其中所述文库的每一成员与所述治疗蛋白相比包含单氨基酸取代；
e)在所述第一组条件下和在所述第二组条件下测试所述修饰蛋白第二集合成员的活性；和选择/鉴定所述第二集合中表现出高于或约等于所述第二组条件下的活性的成员；
f)分析在e)中选择/鉴定的蛋白，以鉴定被取代的氨基酸位置，其中所鉴定的位置被称为关键残基位置；
g)产生变异蛋白的第三集合；其中每一成员都包含取代氨基酸对一个或多个关键残基位置的取代；
h)在所述第一组条件下和在所述第二组条件下，测试组合文库成员的活性，并选择/鉴定所述第二文库中在所述第一组条件下比在所述第二组条件下具有更强活性的成员，由此鉴定在所述第一组条件下比在所述第二组条件下更具有活性的治疗蛋白。
86.权利要求85的方法，其中步骤h)包括：
1)在所述第一组条件下测试所述第三集合成员的活性，并选择/鉴定所具有的活性高于预定活性蛋白；和
2)在所述第二组条件下测试在步骤1)中选择/鉴定的蛋白的活性，并选择/鉴定所具有的活性低于预定活性的蛋白。
87.权利要求85的方法，其中步骤h)包括：
1)在所述第二组条件下测试所述第三集合文库成员的活性，并选择/鉴定所具有的活性低于预定活性的蛋白；和
2)在所述第一组条件下测试在步骤1)中选择/鉴定的蛋白的活性，并选择/鉴定所具有的活性高于预定活性的蛋白。
88.权利要求85-87任一项的方法，其中将步骤g)重复多次，其中在每一重复中，测试选择/鉴定的蛋白。
89.权利要求88的方法，其中将步骤g)重复1、2、3或4次。
90.权利要求85-89任一项的方法，其中所述治疗蛋白是抗体、酶、激素、细胞因子或其活性部分，并且所述抗体指抗体或其抗原结合片段。
91.权利要求85-90任一项的方法，其中所述治疗蛋白是靶受体的配体。
92.权利要求85-91任一项的方法，其中所述治疗蛋白是***的蛋白。
93.权利要求92的方法，其中所述***的蛋白是抗肿瘤抗体。
94.权利要求93的方法，其中所述抗肿瘤抗体选自西妥昔单抗曲妥珠单抗
Figure FDA00003151467200112
利妥昔单抗
Figure FDA00003151467200113
贝伐单抗
Figure FDA00003151467200114
阿仑单抗
Figure FDA00003151467200115
帕尼单抗雷珠单抗
Figure FDA00003151467200117
帕尼单抗、替伊莫单抗(Ibritumomabtiuxetan,
Figure FDA00003151467200118
托西莫单抗、碘I131托西莫单抗卡妥索单抗吉妥珠单抗、吉妥珠单抗奥唑米星
Figure FDA000031514672001111
阿贝西普(CTLA4-Ig,
Figure FDA000031514672001112
贝拉西普(L104EA29YIg;LEA29Y;LEA)、伊匹单抗(MDX-010,MDX-101)、曲美目单抗(ticilimumab,CP-675,206)、PRS-010、PRS-050、阿柏西普(VEGF Trap,AVE005)、伏洛昔单抗(M200)、F200、MORAb-009、SS1P(CAT-5001)、西妥木单抗(IMC-A12)、马妥珠单抗(EMD72000)、尼妥珠单抗(h-R3)、扎鲁目单抗(HuMax-EGFR)、奈昔木单抗IMC-11F8、mAb806/ch806、Sym004以及mAb-425。
95.权利要求93或94的方法，其中所述抗肿瘤抗体是西妥昔单抗
Figure FDA000031514672001113
96.权利要求85-95任一项的方法，其中所测试的活性是与靶蛋白的结合。
97.权利要求96的方法，其中通过免疫测定测试结合活性。
98.权利要求97的方法，其中所述免疫测定包括ELISA。
99.权利要求85-98任一项的方法，其中在基于细胞的测定中测试结合活性。
100.权利要求85-99任一项的方法，其中在细胞表面表达***中测试结合活性。
101.权利要求85-100任一项的方法，其中：
将所述第二文库的成员表达于细胞表面；
使靶蛋白与所述细胞的群接触；以及
鉴定结合所述靶蛋白的一种或多种细胞，由此鉴定表现出结合活性的蛋白。
102.权利要求99-101任一项的方法，其中所述细胞是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。
103.权利要求99-102任一项的方法，其中所述基于细胞的测定是荧光激活细胞分选术(FACS)。
104.权利要求96-103任一项的方法，其中所述靶蛋白被可检测地标记或是可以检测的。
105.权利要求96-104任一项的方法，其中所述靶蛋白被荧光标记或通过荧光标记的第二试剂检测所述靶蛋白。
106.权利要求96-105任一项的方法，其中通过荧光激活细胞分选术(FACS)检测或测量结合。
107.权利要求96-106任一项的方法，其中所述靶蛋白是Her受体家族的成员。
108.权利要求96-107任一项的方法，其中所述靶蛋白是EGFR受体或其细胞外结构域。
109.权利要求85-108任一项的方法，其中：
所述第一组条件包括低于7.4的低pH；和
重要氨基酸选自包含由带电荷残基组成的氨基酸取代的蛋白变体。
110.权利要求109的方法，其中所述带电荷残基选自Arg、Asp、Glu、His以及Lys。
111.权利要求85-110任一项的方法，其中所述第二和第三集合中的氨基酸取代是用His进行的氨基酸取代。
112.权利要求85-111任一项的方法，其中所述第一组条件包括pH约为或为5.8-6.8、含5.8和6.8。
113.权利要求85-112任一项的方法，其中与所述第二组条件相比，所述第一组条件包括比中性pH低的pH和升高的乳酸浓度。
114.权利要求85-113任一项的方法，其中：
所述第一组条件包括约12-20mM的乳酸，pH为6.0或约为6.0；和
所述第二组条件包括1mM或约1mM的乳酸，pH7.4为或约为7.4。
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