CN104531714A

CN104531714A - 适用于植物表达体系的表达贝伐单抗的基因、重组载体及产贝伐单抗植物的构建方法及应用

Info

Publication number: CN104531714A
Application number: CN201510035897.6A
Authority: CN
Inventors: 陈磊; 于为常
Original assignee: Shenzhen Research Institute of CUHK
Current assignee: Shenzhen Research Institute of CUHK
Priority date: 2015-01-23
Filing date: 2015-01-23
Publication date: 2015-04-22

Abstract

本发明属于生物工程技术领域，公开了适用于植物表达体系的表达贝伐单抗的基因、重组载体及产贝伐单抗植物的构建方法及应用。该表达贝伐单抗的基因包括表达贝伐单抗重链的基因和表达贝伐单抗轻链的基因；表达贝伐单抗重链的基因具有如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列或SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个核苷酸获得的核苷酸序列；表达贝伐单抗轻链的基因具有如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列或SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个核苷酸获得的核苷酸序列。该表达贝伐单抗的基因可用于构建产贝伐单抗的植物表达体系，所得植物能够表达贝伐单抗，为贝伐单抗的制备提供了新方法。

Description

适用于植物表达体系的表达贝伐单抗的基因、重组载体及产贝伐单抗植物的构建方法及应用

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，特别涉及适用于植物表达体系的表达贝伐单抗的基因、重组载体及产贝伐单抗植物的构建方法及应用。

背景技术

随着分子生物学的发展，80年代初，科学家们开始利用基因工程技术来研制抗体，并逐渐形成了一门新型的跨学科技术——抗体生物技术(Antibodybiotechnology)。它是以DNA重组技术为手段，将动物淋巴细胞所产生的抗体基因人为地改造后转入真核或原核细胞中进行表达，产生具有免疫活性的抗体或其功能片断。

目前，基因工程抗体的表达***主要有哺乳动物细胞、大肠杆菌、酵母、昆虫以及植物，不同的表达***各有利弊。1)哺乳动物细胞表达体系：鼠骨髓瘤细胞是最理想的表达宿主，此外还有一些B淋巴细胞来源的细胞系，这些细胞具有一整套完整的合成、组装、分泌免疫球蛋白的细胞装置，能够产生完整的抗体分子。哺乳动物细胞表达的优点是能够将抗体多肽链正确装配、折叠并糖基化成有活性的完整分子，可以表达足够量的抗体，但生产成本高。2)大肠杆菌体系：大肠杆菌已被广泛地用于表达抗体功能片断，如Fab、Fv和scFv，但目前它还不能表达完整的抗体分子。利用大肠杆菌表达小分子抗体，具有规模大、速度快和成本低的优点，但原核表达中的一个重要问题是如何有效地控制转录的起始，进行预想的表达。3)酵母表达体系：酵母能够有效地表达、组装和分泌具有免疫活性的抗体或其功能片断，但由于酵母对多肽的糖基化作用与哺乳动物细胞的修饰情况不同，从而影响了抗体的ACDC(依赖抗体的补体介导的细胞毒性)效力，目前认为酵母并非是好的基因工程抗体表达体系。4)植物表达体系：1989年美国医学生物学家Hiatt首次报道了抗体在植物中的表达。他的研究结果是人类利用异质细胞表达抗体的成功范例，打破了动植物种属之间的界限，引起了生物界的极大兴趣和高度重视。研究表明，植物表达抗体的一大优势是能将全长重链和轻链组装成带有Fc区域的全抗体(而大肠杆菌能组装的最大抗体片段为单价Fab片段)，这些抗体能功能性的识别抗原并结合抗原。

研究表明，在植物中表达出具有功能性识别抗原及结合特性的全抗体或部分抗体片段是抗体基因工程研究的一个新领域，它有如下优点：(1)高表达量。在植物中表达抗体，重组抗体的产率可达植物总蛋白的4％，这是一般真核表达***所不能达到的；(2)低成本。在植物中表达重组抗体，可用大规模大田种植，条件相对简单，价格低廉；(3)外源抗体基因片段可以整合进染色体中稳定遗传，同时对植物的生长没有影响；(4)转基因植物株可以很简单地通过种子的形式长期保存；(5)植物细胞同哺乳动物细胞一样可以对表达的重组抗体蛋白进行正确的组装和后期加工，其表达产物还能保持良好的生物学特性；同时由于植物表达***表达的抗体是以二聚体形式存在，因此表达产物的亲和力高，有助于全面发挥抗体的功能。

贝伐单抗，商品名为阿瓦斯汀(Avastin)，是重组的人源化单克隆抗体，为罗氏公司研发的癌症治疗畅销药物，由中国仓鼠卵巢细胞表达***生产，分子量大约为149,000道尔顿。贝伐单抗于2004年2月26日获得FDA的批准，是美国第一个获得批准上市的抑制肿瘤血管生成的药物，其2009年的销售额达59亿美元。在批准用于治疗乳腺癌之前，这种药物还被美国药管局批准用于治疗肺癌、结肠癌和直肠癌，并已在欧洲获准用于治疗乳腺癌。贝伐单抗的作用机理为：通过抑制血管内皮生长因子(Vascular Endothelial Growth Factor、VEGF)的作用阻断对肿瘤的血液供应，抑制肿瘤在体内扩散，增强化疗效果。VEGF为肿瘤血管生成的关键调控者，并且是唯一一种表达于整个肿瘤生命周期的血管生成因子。VEGF的持续表达，以及VEGF和内皮细胞的遗传学稳定性(基于临床前研究的观察结果)，可使“直接并且持续靶向于VEGF”成为一种重要的抗肿瘤策略，因此，作为血管内皮生长因子的抑制剂，贝伐单抗作用效果好、应用范围广。但是，目前贝伐单抗制作成本高，价格昂贵，严重限制了其推广和应用，所以还需要研发新的贝伐单抗制备方法。作为一种优良的基因工程表达体系，植物表达体系无疑是优选的贝伐单抗表达体系。目前，还没有关于产贝伐单抗的植物表达体系相关的报道。

发明内容

有鉴于此，本发明的发明目的在于提供一种适用于植物表达体系的表达贝伐单抗的基因、重组载体及产贝伐单抗植物的构建方法及应用。采用本发明提供的表达贝伐单抗的基因成功构建了产贝伐单抗的植物表达体系，所得植物能够表达贝伐单抗，为贝伐单抗的制备提供了新方法。

为了实现本发明的发明目的，本发明采用如下的技术方案：

本发明提供了一种适用于植物表达体系的表达贝伐单抗的基因，其包括表达贝伐单抗重链的基因和表达贝伐单抗轻链的基因；

该表达贝伐单抗重链的基因具有：

(Ⅰ)如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列；

或(Ⅱ)与所述如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列具有≥70％同源性的序列；

或(Ⅲ)如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个核苷酸获得的核苷酸序列；

该表达贝伐单抗轻链的基因具有：

(i)如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列；

或(ii)与如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列具有≥70％同源性的序列；

或(iii)如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个核苷酸获得的核苷酸序列。

在本发明中，贝伐单抗的重链具有如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列。贝伐单抗的轻链具有如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列。

在本发明的一些实施例中，本发明提供的表达贝伐单抗的基因中的表达贝伐单抗重链的基因具有如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列，标记为BHC。

在本发明的另外一些实施例中，本发明提供的表达贝伐单抗的基因中的表达贝伐单抗轻链的基因具有如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列，标记为BLC。

优选地，本发明提供的表达贝伐单抗的基因所适用的植物表达体系，具体为水稻。在本发明的一些实施例中，本发明提供的表达贝伐单抗的基因所适用的水稻具体为日本晴水稻。

本发明还提供了一种重组载体，其整合有本发明提供的表达贝伐单抗重链的基因和/或所述表达贝伐单抗轻链的基因。

用植物表达***表达完全抗体可采用不同的策略：一种是把重链和轻链基因分别转化植物，再通过有性杂交获得共表达植株；也可用两个基因的载体共转化同一植物，筛选获得共表达植株；还可把两个基因构建到同一个T-DNA上，使转基因工作更容易。本领域技术人员可以根据实际情况选择合适的策略，进而选择使用哪个或者哪些重组载体组合。

优选地，本发明提供的重组载体中，包括所述表达贝伐单抗重链的基因和所述表达贝伐单抗轻链的基因，即植物双元表达载体，在本发明中，称为贝伐单抗植物双元表达载体。

优选地，本发明提供的重组载体中，所用的载体为双元表达载体。

在本发明的一些实施例中，本发明提供的重组载体中，所用的双元表达载体为pBI系列载体、pCAMBIA植物表达系列载体、pRTL系列载体或以它们为基础的改造产物。在本发明的另外一些实施例中，本发明提供的重组载体中所用的载体具体为质粒pUN1301。

优选地，本发明提供的重组载体中的整合为整合到所用载体的T-DNA区域。

优选地，本发明提供的重组载体中，表达贝伐单抗重链的基因、表达贝伐单抗轻链的基因中至少一个以表达盒的形式整合到所述载体中。

在本发明的一些实施例中，本发明提供的重组载体中，表达贝伐单抗重链的基因和表达贝伐单抗轻链的基因各自以表达盒的形式整合到所述重组载体中。在本发明中，表达贝伐单抗重链的基因表达盒、表达贝伐单抗轻链的基因表达盒在重组载体中的排列顺序不固定。在本发明的一些实施例中，本发明提供的重组载体中，两个表达盒按照如下顺序排列：表达贝伐单抗重链的基因表达盒、表达贝伐单抗轻链的基因表达盒的前后顺序排列。

在本发明的一些实施例中，本发明提供的重组载体中，表达贝伐单抗重链的基因以表达盒的形式整合到所述重组载体中，并且该表达盒包括启动子、表达贝伐单抗重链的基因、终止子。

优选地，在本发明提供的重组载体中，当表达贝伐单抗重链的基因以表达盒的形式整合到重组载体中时，所用启动子为组成型启动子、组织特异表达启动子或诱导表达启动子。在本发明的一些实施例中，所用启动子为Ubi启动子，即玉米泛素启动子。表达贝伐单抗重链的基因表达盒中的启动子不受本发明提供的启动子的限制，本领域技术人员可以根据实际情况选择合适的启动子。

优选地，在本发明提供的重组载体中，当表达贝伐单抗重链的基因以表达盒的形式整合到重组载体中时，所用终止子为任意类型终止子。在本发明的一些实施例中，所用终止子为Nos终止子，即胭脂碱合成酶终止子。表达贝伐单抗重链的基因表达盒的终止子不受本发明提供的终止子的限制，本领域技术人员可以根据实际情况选择合适的终止子。

在本发明的一些实施例中，本发明提供的重组载体中，表达贝伐单抗轻链的基因以表达盒的形式整合到重组载体中，并且该表达盒包括启动子、表达贝伐单抗轻链的基因、终止子。

优选地，在本发明提供的重组载体中，当表达贝伐单抗轻链的基因以表达盒的形式整合到重组载体中时，所用启动子为组成型启动子，组织特异表达启动子或诱导表达启动子。在本发明的一些实施例中，所用启动子为Ubi启动子，即玉米泛素启动子。表达贝伐单抗轻链的基因表达盒的启动子不受本发明提供的启动子的限制，本领域技术人员可以根据实际情况选择合适的启动子。

优选地，在本发明提供的重组载体中，当表达贝伐单抗轻链的基因以表达盒的形式整合到重组载体中时，所用终止子为任意类型终止子。在本发明的一些实施例中，所用终止子为Nos终止子，即胭脂碱合成酶终止子。表达贝伐单抗轻链的基因表达盒的终止子不受本发明提供的终止子的限制，本领域技术人员可以根据实际情况选择合适的终止子。

优选地，本发明提供的重组载体中还整合有筛选标记基因。

筛选标记基因便于识别和筛选导入重组载体的转化子或所得基因工程植物，筛选标记基因的种类和个数可以根据实际情况而定。

在本发明的另外一些实施例中，本发明提供的重组载体中，筛选标记基因以表达盒的形式整合到重组载体中，并且表达盒包括启动子、筛选标记基因、终止子。

在本发明的一些实施例中，本发明提供的重组载体中，当所用的植物表达体系为水稻时，其中的筛选标记基因为两个，一个为抗潮霉素基因，标记为HptII；另一个基因为β-葡萄糖苷酸酶基因，标记为GUS。

在本发明的另外一些实施例中，本发明提供的重组载体中，抗潮霉素基因以表达盒的形式整合到重组载体中，并且表达盒包括启动子、抗潮霉素基因和终止子。在本发明的一些实施例中，抗潮霉素基因表达盒中的启动子为35S启动子，即CaMV35S启动子。在本发明的另外一些实施例中，抗潮霉素基因表达盒中的终止子为T35S终止子，即CaMV35S终止子。

在本发明的另外一些实施例中，本发明提供的重组载体中，β-葡萄糖苷酸酶基因以表达盒的形式整合到重组载体中，并且表达盒包括启动子、β-葡萄糖苷酸酶基因和终止子。在本发明的一些实施例中，β-葡萄糖苷酸酶基因表达盒中的启动子为35S启动子，即CaMV35S启动子。在本发明的另外一些实施例中，β-葡萄糖苷酸酶基因表达盒中的终止子为Nos终止子，即胭脂碱合成酶终止子。

优选地，本发明提供的重组载体中，包括贝伐单抗重链的基因表达盒、贝伐单抗轻链的基因表达盒、抗潮霉素基因表达盒和β-葡萄糖苷酸酶基因表达盒。本发明提供的重组载体中，贝伐单抗重链的基因表达盒、贝伐单抗轻链的基因表达盒、抗潮霉素基因表达盒和β-葡萄糖苷酸酶基因表达盒的排列顺序不固定。各个基因表达盒之间可以通过一段短的核苷酸序列连接，也可以直接连接。在本发明的一些实施例中，本发明提供的重组载体中，四个基因表达盒均整合在载体的T-DNA区域，并且这四个基因表达盒按照如下顺序排列：表达β-葡萄糖苷酸酶基因表达盒、表达贝伐单抗重链的基因表达盒、表达贝伐单抗轻链的基因表达盒、抗潮霉素基因表达盒的前后顺序排列。在本发明的一些实施例中，本发明提供的重组载体中，四个基因表达盒，在重组载体中的排列顺序(5’-3’)如下所示：

DNA分子1-DNA分子2-DNA分子3-DNA分子4

其中，DNA分子1为表达β-葡萄糖苷酸酶基因表达盒，DNA分子2为表达贝伐单抗重链的基因表达盒，DNA分子3为表达贝伐单抗轻链的基因表达盒，DNA分子4为抗潮霉素基因表达盒。其中DNA分子1、DNA分子2直接相连；DNA分子2、DNA分子3直接相连；DNA分子3、DNA分子4直接相连；且表达贝伐单抗重链的基因表达盒、表达贝伐单抗轻链的基因表达盒、抗潮霉素基因表达盒，这三个基因表达盒的转录方向相同，与β-葡萄糖苷酸酶基因表达盒的转录方向相反，将该重组载体命名为pUN1301-UBHLC。

本发明还提供了一种本发明提供的重组载体的构建方法，在该重组载体中整合有表达β-葡萄糖苷酸酶基因表达盒、表达贝伐单抗重链的基因表达盒、表达贝伐单抗轻链的基因表达盒、抗潮霉素基因表达盒，四个基因表达盒均整合在载体的T-DNA区域，并且这四个基因表达盒按照如下顺序排列：表达β-葡萄糖苷酸酶基因表达盒、表达贝伐单抗重链的基因表达盒、表达贝伐单抗轻链的基因表达盒、抗潮霉素基因表达盒的前后顺序排列；

该构建方法包括以下步骤：

步骤1：获得第一linker核苷酸，该第一linker核苷酸包括以下酶切位点，并且各个酶切位点按照如下顺序排列：SpeI-PacI-AscI-SacI-EcoRI-HindIII；所得第一linker核苷酸具有如SEQ ID NO:5所示核苷酸序列，将所得第一linker核苷酸克隆到T载体pMD19simple上，命名为pMD19S-L；

步骤2：获得TNos终止子片段，用SacI和EcoRI酶解，克隆到步骤1所得的pMD19S-L上，命名为pMD19S-L-Tnos；

步骤3：获得表达贝伐单抗重链的基因，该基因具有如SEQ ID NO:1所示核苷酸序列；在所得表达贝伐单抗重链的基因的两端分别加入酶切位点PacI和AscI，之后克隆到pMD19S-L-Tnos，命名为pMD19S-L-BHC-Tnos；

步骤4：以pUN1301为模板，扩增片段Ubi promoter(即Ubi启动子)使其两端引入SpeI和PacI的酶切位点，之后以SpeI和PacI酶解克隆到步骤3所得pMD19S-L-BHC-Tnos，命名为pMD19S-L-UNBHC-Tnos；

步骤5：获得第二linker核苷酸，该第二linker核苷酸包括以下酶切位点，并且各个酶切位点按照如下顺序排列：HindIII*-SpeI-HindIII-BamHI，所得第二linker核苷酸具有如SEQ ID NO:6所示核苷酸序列；使用HindIII和BamHI酶解质粒pUN1301，将第二linker核苷酸克隆到pUN1301上，命名为p1301-L；使用HindIII和BamHI酶解质粒p1301-L，将PUbi启动子使用相同的酶解克隆到p1301-L上，命名为pUN1301-L；

步骤6：获得表达贝伐单抗轻链的基因，该基因具有如SEQ ID NO:2所示核苷酸序列；在所得表达贝伐单抗轻链的基因的两端分别加入酶切位点BamHI和SacI之后，克隆到pMD19simple，命名为pMD19S-BLC；

步骤7：使用BamHI和SacI双酶酶解步骤6所得pMD19S-BLC和步骤5所得pUN1301-L之后，将所得含表达贝伐单抗轻链的片段克隆到所得pUN1301-L上，命名为pUN1301-L-BLC；

步骤8：使用SpeI和HindIII双酶酶解步骤4所得pMD19S-L-BHC-Tnos，得UNBHC-Tnos片段；使用SpeI和HindIII双酶酶解步骤7所得pUN1301-L-BLC之后，将所得UNBHC-Tnos片段克隆到pUN1301-L-BLC上，得到重组载体，即获得重组载体，命名为pUN1301-UBHLC。

本发明还提供了一种产贝伐单抗植物的构建方法，其包括以下步骤：

步骤1：获得表达贝伐单抗重链的基因和表达贝伐单抗轻链的基因；该表达贝伐单抗重链的基因具有如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列、或SEQ IDNO:1所示的核苷酸序列具有≥70％同源性的序列或SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个核苷酸获得的核苷酸序列；

该表达贝伐单抗轻链的基因具有如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列、或SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列具有≥70％同源性的序列或SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个核苷酸获得的核苷酸序列；

步骤2：取步骤1所得表达贝伐单抗重链的基因、表达贝伐单抗轻链的基因，构建贝伐单抗植物双元表达载体；

步骤3：将步骤2所得贝伐单抗植物双元表达载体导入植物组织细胞，经培养、筛选，即得。

优选地，本发明提供的构建方法中，步骤3中所用植物组织细胞具体为水稻组织细胞。

优选地，本发明提供的构建方法中，步骤2中的贝伐单抗植物双元表达载体中，还整合有筛选标记基因。在本发明的另外一些实施例中，当步骤3中所用植物组织细胞具体为水稻组织细胞时，步骤2中的贝伐单抗植物双元表达载体中整合有两个筛选标记基因：一个为抗潮霉素基因，另一个基因为β-葡萄糖苷酸酶基因。

在本发明的一些实施例中，本发明提供的构建方法中，步骤2中的贝伐单抗植物双元表达载体中，表达贝伐单抗重链的基因、表达贝伐单抗轻链的基因、抗潮霉素基因、β-葡萄糖苷酸酶基因中至少一个基因以表达盒的形式整合到植物双元表达载体中。

在本发明的一些实施例中，本发明提供的构建方法中，步骤2中的贝伐单抗植物双元表达载体整合有贝伐单抗重链的基因表达盒、贝伐单抗轻链的基因表达盒、抗潮霉素基因表达盒和β-葡萄糖苷酸酶基因表达盒。本发明提供的构建方法中，贝伐单抗植物双元表达载体中贝伐单抗重链的基因表达盒、贝伐单抗轻链的基因表达盒、抗潮霉素基因表达盒和β-葡萄糖苷酸酶基因表达盒的排列顺序不固定。各个基因表达盒之间可以通过一段短的核苷酸序列连接，也可以直接连接。在本发明的一些实施例中，本发明提供的构建方法中，贝伐单抗植物双元表达载体中四个基因表达盒均整合在植物双元表达载体的T-DNA区域，并且这四个基因表达盒按照如下顺序排列：表达β-葡萄糖苷酸酶基因表达盒、表达贝伐单抗重链的基因表达盒、表达贝伐单抗轻链的基因表达盒、抗潮霉素基因表达盒的前后顺序排列。在本发明的一些实施例中，本发明提供的构建方法中，四个基因表达盒，在贝伐单抗植物双元表达载体中的排列顺序(5’-3’)如下所示：

DNA分子1-DNA分子2-DNA分子3-DNA分子4

其中，DNA分子1为表达β-葡萄糖苷酸酶基因表达盒，DNA分子2为表达贝伐单抗重链的基因表达盒，DNA分子3为表达贝伐单抗轻链的基因表达盒，DNA分子4为抗潮霉素基因表达盒。其中DNA分子1、DNA分子2直接相连；DNA分子2、DNA分子3直接相连；DNA分子3、DNA分子4直接相连；且表达贝伐单抗重链的基因表达盒、表达贝伐单抗轻链的基因表达盒、抗潮霉素基因表达盒，这三个基因表达盒的转录方向相同，与β-葡萄糖苷酸酶基因表达盒的转录方向相反。

在本发明的一些实施例中，本发明提供的构建方法中，步骤2中的贝伐单抗植物双元表达载体具体为pUN1301-UBHLC。

在本发明的另外一些实施例中，本发明提供的构建方法中，步骤3中导入所采用的方法具体为农杆菌介导法。

本发明还提供了一种利用本发明提供的构建方法构建获得的产贝伐单抗的植物表达获得贝伐单抗的应用。

本发明提供一种适用于植物表达体系的表达贝伐单抗的基因、重组载体及产贝伐单抗植物的构建方法及应用。本发明提供的表达贝伐单抗的基因，包括表达贝伐单抗重链的基因和表达贝伐单抗轻链的基因；该表达贝伐单抗重链的基因具有如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列、或SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列具有≥70％同源性的序列或SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个核苷酸获得的核苷酸序列；该表达贝伐单抗轻链的基因具有如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列、或SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列具有≥70％同源性的序列或SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个核苷酸获得的核苷酸序列。实验结果证实，采用本发明提供的表达贝伐单抗的基因成功构建了产贝伐单抗的水稻，所得水稻能够表达贝伐单抗，为利用植物表达体系制备贝伐单抗提供了新方法。

附图说明

图1实施例1中构建重组载体过程中所涉及的质粒或片段的图谱；

其中，图1-A为载体pMD19S-L；图1-B为载体pMD19S-L-Tnos；图1-C为载体pMD19S-L-BHC-Tnos；图1-D为载体pMD19S-L-UNBHC-Tnos；图1-E为载体pUN1301；图1-F为载体p1301-L；图1-G为载体pUN1301-L；图1-H为载体pUN1301-L-BLC；图1-J为载体pUN1301-UBHLC；图1-K为载体pUN1301-UBHLC的T-DNA结构；

图2为实施例2中GUS染色鉴定结果，其中WT代表野生型水稻愈伤组织样品，1-6号管为不同的转基因抗性愈伤组织样品；

图3为实施例2中PCR鉴定结果，其中Vector为贝伐单抗的植物双元表达载体为阳性对照；WT为野生型水稻DNA为阴性对照，1-15为不同的转基因水稻株系；

图4为实施例2中Southern blot鉴定结果，其中(a)为贝伐单抗重链基因为探针进行杂交所得条带；(b)为贝伐单抗轻链基因为探针进行杂交所得条带；(c)为潮霉素基因为探针进行杂交得到的条带；WT为野生型水稻DNA样品；泳道1至泳道14为不同的转基因水稻DNA样品；

图5为实施例2中Northern blot鉴定结果，其中泳道WT为野生型水稻RNA为阴性对照，泳道1-7为不同转基因水稻RNA；

图6为实施例2中Western Blot鉴定结果，其中泳道WT为野生型水稻蛋白，泳道1-8为不同转基因水稻样品。

具体实施方式

本发明公开了一种适用于植物表达体系的表达贝伐单抗的基因、重组载体及产贝伐单抗植物的构建方法及应用。本领域技术人员可以参考本文内容，获得表达贝伐单抗的基因、重组载体，实现其应用，特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明内。本发明的制备方法及应用已经通过较佳的实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文制备方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明提供的一种适用于植物表达体系的表达贝伐单抗的基因、重组载体及产贝伐单抗植物的构建方法及应用中所用到的试剂和原料均可由市场购得。

为了使本技术领域的技术人员能够更好地理解本发明的技术方案，下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1表达贝伐单抗的重组载体的构建

实验材料：

各种限制性内切酶购于NEB(http://www.neb-china.com/search.asp)；

Ubi启动子和Tnos片段来源于pUN1301；

pMD19simple质粒购于TaKaRa公司(http://www.takara.com.cn/)；

pUC57质粒购于GenScript公司(http://www.genscript.com/)；

pUN1301质粒购于金维克(中国)生物技术中心；

潮霉素基因探针来源于pUN1301。

实验方法：

表达贝伐单抗重链的基因、表达贝伐单抗轻链的基因的获得：

以水稻密码子优化并合成贝伐单抗重链和轻链基因，其中，表达贝伐单抗重链的基因具有如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列；表达贝伐单抗轻链的基因具有如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列；将所得基因序列信息提交GenScript公司合成基因片段，将表达贝伐单抗重链的基因标记为BHC，将表达贝伐单抗轻链的基因标记为BLC。所得表达贝伐单抗重链的基因BHC保存在质粒pUC57上，该合成载体标记为pUC57-BHC；所得表达贝伐单抗轻链的基因BLC保存在质粒pUC57上，该合成载体标记为pUC57-BLC。

贝伐单抗双元表达载体的构建：

1.设计合成Linker-1(即第一linker核苷酸)：其包括以下酶切位点，且酶切位点排列顺序如下：SpeI-PacI-AscI-SacI-EcoRI-HindIII(其具有如SEQ IDNO:5所示核苷酸序列)，克隆到T载体pMD19simple上，将所得重组载体命名为pMD19S-L，其质粒图谱见图1-A。

具体操作为：

合成以下核苷酸：

Linker-1a：5’actagt ttaattaa ct ggcgcgcc gagctc ac gaattc aagctt a 3’；

Linker-1b：5’aagctt gaattc gt gagctc ggcgcgcc ag ttaattaa actagt a 3’；

将Linker-1a和Linker-1b等摩尔混合，94℃5min，慢慢冷却至室温，取4.5μL连接T载体pMD19simple。

2.取TNos片段，使用SacI和EcoRI酶解，克隆到步骤1所得的pMD19S-L上，将所得重组载体命名为pMD19S-L-Tnos，其质粒图谱见图1-B。

3.以合成载体pUC57-BHC为模板，PCR扩增BHC片段使其两端加入酶切位点Pac I和AscI，之后将所得含BHC的片段克隆到步骤2所得pMD19S-L-Tnos，将所得重组载体命名为pMD19S-L-BHC-Tnos，并测序验证，测序结果正确，其质粒图谱见图1-C。

4.以pUN1301为模板，设计引物扩增片段Ubi promoter、并使其两端引入SpeI和PacI的酶切位点，以SpeI和PacI酶解克隆到步骤3所得pMD19S-L-BHC-Tnos，将所得重组载体命名为pMD19S-L-UNBHC-Tnos，并测序验证，测序结果正确，其质粒图谱见图1-D。

5.设计合成Linker-2(即第二linker核苷酸)：其包括以下酶切位点，且酶切位点排列顺序如下：HindIII*-SpeI-HindIII-BamHI(其具有如SEQ ID NO:6所示核苷酸序列)。使用HindIII和BamHI酶解质粒pUN1301(该质粒上整合有GUS基因表达盒、HptII基因表达盒，其质粒图谱见图1-E)，将Linker-2克隆到pUN1301上将所得重组载体命名为p1301-L，其质粒图谱见图1-F。

具体操作为：

合成以下核苷酸：

Linker-2a：5’agcta actagt ct aagctt ac g3’；

Linker-2b：5’gatcc gt aagctt ag actagt t3’；

将Linker-2a和Linker-2b等摩尔混合，94℃5min，慢慢冷却至室温，取10μL连接到用HindIII和BamHI酶解的pUN1301，即得p1301-L。

使用HindIII和BamHI酶解质粒p1301-L，将启动子Ubi promoter使用相同的酶解之后，克隆到p1301-L上，将所得重组载体命名为pUN1301-L，其质粒图谱见图1-G。

6.以合成载体pUC57-BLC为模板，PCR扩增BLC片段使其两端加入酶切位点BamHI和SacI，之后将所得含BLC的片段克隆到pMD19simple，命名为pMD19S-BLC，并测序验证，验证结果正确。

7.分别使用BamHI和SacI双酶酶解步骤6所得pMD19S-BLC和步骤5所得pUN1301-L，将所得BLC片段克隆到所得pUN1301-L上，命名为pUN1301-L-BLC，其质粒图谱见图1-H。

8.分别使用SpeI和HindIII双酶酶解步骤7所得pUN1301-L-BLC和步骤4所得pMD19S-L-BHC-Tnos，将所得片段UNBHC-Tnos克隆到pUN1301-L-BLC上，得到最终载体，命名为pUN1301-UBHLC，其质粒图谱见图1-J，其T-DNA结构见图1-K，该结构包括如SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列(该核苷酸序列方向为T-DNA的LB端至RB端)。

实施例2产贝伐单抗植物的构建

实验材料：

水稻种子“日本晴”为常规转基因用材料。

农杆菌(EHA105)来源于：上海迈其生物科技有限公司。

N₆D₂培养基：3.9g/L Chu’s N6(Chu,1975)(CHP01-50LT，10402809，Caisson,USA)，N6维生素，(2mg/L甘氨酸，0.5mg/L烟酸，1.0mg/L维生素B1，0.5mg/L维生素B₆)，0.1g/L肌醇，1.0g/L水解酪蛋白，0.5g/L脯氨酸,0.5g/L谷氨酰胺，2mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)，30g/L蔗糖，1M KOH调节pH5.8，3.0g/L植物凝胶，121℃，220KPa，灭菌20分钟。

N₆D₂-Co培养基：N₆D₂中加入10g/L葡萄糖，1M KOH调节pH5.5，3.0g/L植物凝胶，121℃，220KPa，灭菌10分钟，待培养基冷却到50℃，加入200uM的乙酰丁香酮(Acetosyringone，AS)。

N₆D₂-Se培养基：N₆D₂培养基冷却到50℃，121℃，220KPa，灭菌20分钟，加入50mg/L潮霉素B和500mg/L头孢霉素。

MS-Re培养基：4.6g/L MS(M10400-50.0，P06968，rpi，USA)，2.0mg/L 6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)，0.5mg/L萘乙酸(NAA)，1.0mg/L激动素(KT)，30g/L蔗糖，30g/L山梨醇，1M KOH调节pH5.8，3.0g/L Gelrite，121℃，220KPa，灭菌20分钟，冷却到50℃，加入50mg/L潮霉素B和500mg/L头孢霉素。

MS-HF培养基：2.3g/L MS(M10400-50.0，P06968，rpi，USA)，30g/L蔗糖，1M KOH调pH5.8，3.0g/L Gelrite，121℃，220KPa，灭菌20分钟，冷却到50℃，加入50mg/L潮霉素B。

AAM培养基：0.5g/L水解酪蛋白，68.5g/L蔗糖，36g/L葡萄糖，0.9g/L谷氨酰胺，0.3g/L天冬氨酸，3g/L氯化钾，10mg/L五水硫酸锰，3.0mg/L硼酸，2.0mg/L七水硫酸锌，0.25mg/L二水钼酸纳，0.025mg/L五水硫酸铜，0.025mg/L六水氯化钴，0.75mg/L碘化钾，15mg/L二水氯化钙，25mg/L七水硫酸镁，4mg/L乙二胺四乙酸(EDTA)，15mg/L二水磷酸二氢钠，1mg/L烟酸，1mg/L维生素B₆，10mg/L维生素B₁，100mg/L肌醇，176mg/L精氨酸，75mg/L甘氨酸，1M KOH调节pH到5.2，0.22uM滤膜过滤除菌。

Southern blot所需试剂：

变性缓冲液：20g/L NaOH，87.75g/L NaCl；

中和缓冲液：60.05g/L Tris(三羟甲基氨基甲烷)，87.75g/L NaCl，37％的浓盐酸调节pH7.2；

转移缓冲液(20×SSC)：175.3g/L NaCl，88.2g/L柠檬酸三钠，4M盐酸调节pH7.0；

洗脱缓冲液W1：2×SSC；0.1％SDS(十二烷基磺酸钠)(M/V)；

洗脱缓冲液W2：0.5×SSC；0.1％SDS；

洗脱缓冲液W3：11.607g/L马来酸，8.775g/L NaCl，用固体NaoH调节pH值至7.5，用前加入0.3％吐温20；

检测缓冲液S3：12.1g/L Tris，5.85g/L NaCl，调节pH 9.5；

杂交液：70g/L SDS，50％甲酰胺，25％20XSSC，2％脱脂奶粉(罗氏)，50mL 1M磷酸钠缓冲液(pH7.2)，1.0g/L十二烷基肌胺酸钠；

封闭液S1：1％脱脂奶粉(M/V)溶解在洗脱缓冲液W3中；

地高辛抗体反应液S2：将Anti-Digoxigenin-AP以10000转每分钟离心5分钟，吸取上层溶液以1：10000溶解于封闭液S1。

Northern blot缓冲液和试剂的配制：

10×MOPS电泳缓冲液：用700mL水溶解41.8g丙磺酸(MOPS)，用2mol/LNaOH调pH值至7.0；加20mL 1mol/L乙酸钠和20mL 0.5mol/L EDTA(pH8.0)；用水定容到1L；加1mL DEPC处理过夜后过滤灭菌；

RNA变性缓冲液：取0.8mL 10×MOPS电泳缓冲液，加入2mL甲酰胺，1.3mL37％甲醛，0.04mL 0.5M EDTA，定容到4mL，-20℃保存备用；

5×BPB-Solution：溴酚兰(0.2％)；甘油(50％)；1×MOPS；

洗脱缓冲液W3溶液：0.1×SSC；0.1％SDS。

实验方法：

1.水稻愈伤组织的诱导:

将成熟的日本晴水稻种子去壳，用75％的酒精消毒30秒，再用5％次氯酸钠溶液消毒25分钟，无菌水漂洗3次，置无菌纸上，在超净工作台上吹干，接种于N₆D₂愈伤组织诱导培养基上，每个培养皿接种15粒，于28℃暗培养4周，期间切除胚根，每两周继代一次，得结构致密的愈伤组织，备用。

2.根癌农杆菌的活化:

1)取实施例1所得贝伐单抗双元表达载体pUN1301-UBHLC，转化到农杆菌EHA105中，得转化了贝伐单抗质粒的农杆菌。

具体操作为：

(1)制备根癌农杆菌感受态细胞

①挑取EHA105单菌落接种于5mL附加50mg/L Rif的YEB液体培养基中，28℃、200rpm振荡培养过夜。

②取2mL菌液转入50mL YEB液体培养基中继续培养至OD₆₀₀为0.3～0.4。

③转入无菌离心管，冰浴30min。

④5000rpm离心5min，弃上清。

⑤加入2mL 20mmol/L CaCl₂重悬菌体。

⑥每管200μL分装于无菌离心管中。在液氮中速冻后转入-70℃冰箱保存，使用时先置冰上解冻。

(2)将重组质粒导入根癌农杆菌EHA105

①取2μg纯化的质粒DNA，即pUN1301-UBHLC，加入200μL解冻的感受态EHA105中，混匀。

②冰浴5min，转入液氮中冷冻1min，迅速置37℃水浴5min。

③加入800μL YEB液体培养基，28℃，250rpm预培养4～5h。

④离心，保留约200μL上清液与菌体沉淀用抢头混匀移至附加50mg/LRif、50mg/L Km的YEB固体选择培养基，均匀涂布整个平板。待液体被吸收后，用封口膜封好，28℃倒置培养1～2d，4℃保存。

⑤挑取单菌落接种于7mL附加50mg/L Rif、50mg/L Km的YEB液体培养基中，28℃，200rpm振荡培养约24h。

⑥取5mL菌液提取质粒，取较多量的质粒溶液进行酶切检测，剩余菌液于4℃暂存。经酶切鉴定正确的质粒，取其对应的农杆菌菌液，加入终浓度为15％的甘油，混匀，分装于无菌离心管，每50μL一管，在液氮中速冻后放入-70℃冰箱保存。

2)将转化了贝伐单抗质粒的农杆菌(EHA105)接种在含有50mg/L的卡纳霉素和50mg/L利福平的LB液体培养基中，28℃，转速200转每分钟振荡培养18小时。

3)取1mL步骤2)所得培养好的农杆菌放在2mL灭菌的离心管中，转速6000转每分钟，离心5分钟，收集菌体，用200μL的AAM液体培养基重悬菌体，取10μL菌液接种到50mL含有200μM AS(乙酰丁香酮)的AAM液体培养基中，28℃，转速160转每分钟振荡培养2小时，以备转化之用。

3.农杆菌转化水稻胚性愈伤组织：

1)浸染；选取直径为3～5mm的结构致密的愈伤组织颗粒(步骤1制备获得)，在制备好的AAM菌液中浸染10min；

2)共培养；将浸染后的愈伤组织放在无菌滤纸上吸去组织表面的菌液，转接至共培养基N₆D₂-Co上，26℃暗培养3天；

3)选择培养；将共培养3天的愈伤组织用含有0.01％吐温的无菌水漂洗5次，然后在含500mg/L头孢霉素的无菌水中漂洗10分钟，将愈伤组织放置无菌滤纸上，在超净工作台上晾干愈伤组织上的水，再转接至选择培养基N₆D₂-Se上，28℃暗培养四周，得抗性愈伤组织；

4)分化培养；将抗性愈伤组织转接至分化培养基MS-Re上，16小时光照，8小时黑暗，28℃培养至分化出绿苗。将小苗转接至用灭菌瓶装的生根培养基MS-HF上，培养2周后，洗净小苗根上的培养基转到水中培养3天，然后移栽到大田，共得30个株系，分别标记为T1#至T30#。

4.贝伐单抗转基因水稻的鉴定：

4.1.GUS染色鉴定贝伐单抗转基因水稻：

取移栽到大田中的转基因小苗的叶片，剪成2cm的小段置于2mL的离心管中；抗性愈伤组织用镊子分成小块，浸入GUS染色液中(100mM磷酸钠缓冲液，pH＝7.0，内含0.5mg/mL X-GluC、1％Triton X-100、1％DMSO和10mMEDTA)，抽真空15min，37℃保温12h，用85％的乙醇脱色几次，拍照。

检测结果见图2，其中WT代表野生型水稻愈伤组织样品，1-6号管为不同的转基因水稻株系的抗性愈伤组织样品，其中1-6分别代表的株系为：T1#，T2#，T3#，T4#，T5#，T6#。

从检测结果可知，相比野生型水稻，所有转基因水稻的抗性愈伤组织样品均产生了肉眼可见的蓝色，说明β-葡萄糖苷酸酶基因成功导入了转基因水稻中，反应了表达贝伐单抗的基因也成功导入到了水稻中。

4.2.PCR鉴定贝伐单抗转基因水稻：

PCR反应溶液配制为:

Premix Ex Taq Hot Start Version 10μL，基因组DNA 500ng(转基因水稻提取)，轻链、重链正向和反向引物10μM各1μL，双蒸水定容到20μL。PCR程序为：95℃5分钟；95℃20秒，60℃20秒，72℃1.5分钟，30个循环；72℃5分钟。PCR反应结束后，取5μL反应液电泳检测。

所用的PCR引物序列为：

轻链正向引物，BLCFw：5’ATGAAGTACCTCCTCCCTACC3’；

轻链反向引物，BLCRe：5’GCATTCGCCTCGGTTAAAGCTC3’；

重链正向引物，BHCFw：5’ATGGAATTCGGATTGAGCTGG3’；

重链反向引物，BHCRe：5’CTTCCCCGGGCTGAGGCTAAG 3’；

检测结果见图3，其中Vector为贝伐单抗的植物双元表达载体为阳性对照；WT为野生型水稻DNA为阴性对照，1-15为不同的转基因水稻株系，1-15分别代表的株系为：T1#，T2#，T3#，T4#，T5#，T6#，T7#，T8#，T9#，T10#，T11#，T12#，T13#，T14#，T15#。从检测结果可知，使用其全长引物扩增时得到的PCR产物分子量大小则为其基因全长大小(贝伐单抗的轻链基因全长为708bp、重链基因全长为1416bp)，说明转基因水稻株系中成功导入了表达贝伐单抗重链的基因和表达贝伐单抗轻链的基因。

4.3.Southern blot鉴定贝伐单抗转基因水稻：

1)制备地高辛标记的探针：以贝伐单抗双元表达载体DNA为模板，轻链和重链的正反向引物分别扩增制备轻链和重链的地高辛标记的探针。

PCR反应溶液为：质粒DNA 10ng作为模板，轻链和重链正反向引物10μM各1μL，Premix Ex Taq Hot Start Version 15μL，1μL的DIG-dUTP，双蒸水定容到30μL。PCR扩增反应程序为：95℃5分钟；95℃20秒，60℃20秒，72℃1.5分钟，30个循环；72℃5分钟。PCR反应结束后，取3μL反应液电泳检测。

2)转贝伐单抗基因水稻总DNA的酶解：转贝伐单抗基因水稻叶片总DNA15μg，用EcoR I限制性内切酶进行酶解，37℃反应过夜。每个样品的酶解反应体系为：总DNA 15μg，CutSmart缓冲液10μL，100U的EcoR I限制性内切酶，双蒸水定容100μL。其中以野生型水稻基因组DNA作为阴性对照，贝伐单抗双元表达载体为阳性对照。酶解反应结束后，上样5μL进行电泳检测，纯化，溶解在15μL双蒸水中，4℃备用或-20℃保存。

3)酶解产物的电泳：将纯化后的酶解产物上样于1.0％琼脂糖凝胶，以5V/cm电压电泳3小时；拍照，标记分子量的位置；将凝胶放到0.2N盐酸中处理10分钟，用双蒸水漂洗一下；放入变性缓冲液中处理30分钟；放入中和缓冲液中处理30分钟。

4)DNA印记到杂交膜：根据琼脂糖凝胶的大小，剪取大小合适的杂交膜，用双蒸水润湿；玻璃板放在托盘上，取1张3M滤纸，用转移缓冲液浸湿，放在玻璃板上，去除滤纸与玻璃板中的气泡。在托盘中加入适量转移缓冲液；将凝胶放在滤纸上，去除凝胶和印迹表面间的气泡；将杂交膜放在凝胶上面，并再次排气泡；将2张3M滤纸(比杂交膜稍大)转移缓冲液湿透后放在杂交膜上；在胶的周围放上一圈保险膜，防止液池中的液体直接流到凝胶上方的纸巾层(即“短路”现象)。在滤纸上放一叠吸水纸，然后压上重约300g的物体，转移过夜；将杂交膜在稀释10倍的转移缓冲液中漂洗一下，置于超净台下晾干，于80℃烘箱烘2小时。

5)杂交：将烘烤后的膜用灭菌水润湿卷起，放入杂交管中，加入30mL杂交液，放在42℃预杂交2小时；倒掉预杂交液，再加入10mL新的杂交液于42℃预热；取出已经做好的探针，冰上融化，加入到已经预热的杂交液里，42℃杂交过夜。

6)杂交后处理：倒出杂交液，在杂交管中倒入100mL洗脱缓冲液W1，室温下洗脱5分钟，重复一次。倒掉洗脱缓冲液W1，加入100mL洗脱缓冲液W2，于65℃洗脱15分钟，重复一次；取出膜，放入铺有保鲜膜的小平盘中，加入洗脱缓冲液W3，洗脱5分钟；倒掉洗脱缓冲液W3，加入50mL封闭液S1，室温孵育15分钟；倒掉封闭液S1，加入10mL地高辛抗体反应液S2，孵育15分钟；将膜取出放入另一个盒子，加入100mL洗脱缓冲液W3，室温下洗脱15分钟，重复洗脱一次；加入20mL的检测缓冲液S3，孵育5分钟；倒掉检测缓冲液S3，加入2mL CSPD孵育5分钟；将膜取出平铺在保鲜膜上，将其包裹起来，放在37℃孵育5分钟。

7)显影和定影：将包好的膜放在暗匣子中，在暗房中将X-胶片放在包好的膜上，关闭暗夹，37℃放置30分钟；回暗室中取出胶片，放入显影液中浸泡2分钟，在水中冲一下，再放入定影液浸泡2分钟，在流水中冲洗胶片，取出晾干。

检测结果见图4，其中琼脂糖凝胶(a)为贝伐单抗重链基因为探针进行杂交所得条带；(b)为贝伐单抗轻链基因为探针进行杂交所得条带；(c)为潮霉素基因为探针进行杂交得到的条带；泳道WT为野生型水稻DNA样品；泳道1至泳道14为不同的转基因水稻DNA样品，1-14分别代表的株系为：T1#，T2#，T3#，T4#，T5#，T6#，T7#，T8#，T9#，T10#，T11#，T12#，T13#，T14#。检测结果表明：贝伐单抗重链基因为探针进行杂交得到含有重链基因片段的2.3kb的杂交条带；贝伐单抗轻链基因为探针进行杂交得到含有轻链基因片段的1.6kb的杂交条带。潮霉素基因为探针进行杂交得出：其中1、8、13(即T1#株系、T8#株系、T13#株系)为单拷贝转基因事件；3、7、11、12(即T3#株系、T7#株系、T11#、T12#株系)为两个拷贝转基因事件；其他为多拷贝转基因事件。不同株系之间表达量不同的原因为：不同的转基因株系中T-DNA在整合到基因组中是随机***的，且***的拷贝数目也会不同。由于转基因位置效应的影响使得不同的转基因株系之间表达量存在着不同，基因转录水平不同进而引起蛋白表达量的不同。

检测结果表明，转基因水稻的DNA中成功导入了表达贝伐单抗重链的基因、表达贝伐单抗轻链的基因。

4.4.Northern blot分析贝伐单抗重链基因表达

1)水稻总RNA的提取：采用RNeasy Mini Kit Qiagen RNA提取试剂盒提取总RNA。

2)水稻总RNA质量的检测及定量：取样品1μL上样于0.8％琼脂糖凝胶中，120V电压大约5min后，紫外灯下观察。定量时，取样品1μL+99μL DEPC H₂O，混匀后，在Eppendorfs核酸定量检测仪(Eppendorfs AG22331，Hamburg)上测260nm、280nm处的吸收值，计算出RNA的产量和浓度。

3)RNA样品的变性处理：取1μg质粒DNA进行酶解，做阳性对照；取15μgRNA，加入等量的Denaturation Buffer；同时取3μg RNA Marker，40～80pg酶切好的质粒DNA，也分别加入等量的Denaturation Buffer。60℃温育20min，置冰上冷却。

4)RNA的甲醛凝胶变性电泳：用透明胶带将胶板的两端封闭，***胶梳；配胶(1.5％)，在三角烧瓶中加入110mL DEPC H₂O、15mL 10×MOPS电泳缓冲液、2.25g琼脂糖，加热融化，冷却至65℃后，加入25mL 37％的甲醛溶液，倒入胶板，待其凝固；在电泳槽中加入1×MOPS电泳缓冲液，将胶放入电泳槽中；取变性好的样品，加入0.2倍体积的BPB-Solution和1μL EB，混匀点样，70V电压电泳3.5h。

5)转膜：将胶放在DEPC-H₂O中振荡处理15min；紫外灯下观察，拍照，标记分子量的位置，切胶；其余步骤同Southern Blot。

6)Northern blot分析：杂交温度为50℃，洗脱缓冲液W3代替Southern Blot的W2，其余步骤同Southern Blot。

检测结果见图5，其中泳道WT为野生型水稻RNA为阴性对照，泳道1-7为不同转基因水稻RNA，1-7分别代表的株系为：T1#，T2#，T3#，T4#，T5#，T6#，T7#。从实验结果可知，转基因水稻均表达贝伐单抗重链，其中泳道5所对应的转基因株系的表达量最高，泳道1所对应的转基因株系的表达量最低。

4.5.Western Blot分析贝伐单抗在转基因水稻中的表达

1)样品制备：以转基因水稻叶片为材料，在液氮中研磨。称取30mg研磨好的叶片组织加入30μL 2×SDS缓冲液，旋涡振荡，70℃温育10分钟，13000转每分钟离心10分钟，取上清到新的离心管中。

2)电泳分离：将玻璃板、样品梳、Spacer用洗涤剂洗净，用ddH₂O冲洗数次，再用乙醇擦拭，晾干。将两块洗净的玻璃板之间加入Spacer，按照Bio-RadMiniⅡ/Ⅲ说明书提示装好玻璃板。按如下体积配制10％分离胶8.0mL，混匀：3.0mL ddH₂O；2.1mL 1.0mol/LTris-HCl pH＝8.8；2.8mL 30％Acr-Bis；80μL10％SDS；56μL 10％AP；6μL TEMED。向玻璃板间灌制分离胶，立即覆一层重蒸水，大约20分钟后胶即可聚合。按如下体积配制6％浓缩胶3.0mL，混匀：2.0mL ddH₂O；400μL 1.0mol/LTris-HCl pH＝6.8；600μL 30％Acr-Bis；36μL 10％SDS；24μL 10％AP；4μL TEMED。将上层重蒸水倾去，滤纸吸干，灌制浓缩胶，***样品梳。待胶凝聚后，慢慢拔出样品梳。装好电泳***，加入电极缓冲液，上样10μL，100V电泳2小时。

3)转膜：卸下胶板，剥离胶，将胶浸于转移缓冲液中平衡10min。依据胶的大小剪取膜和滤纸6片，将PVDF膜放入甲醇浸泡饱和3-5秒钟放入转移缓冲液中平衡10min。装配转移三明治：从下向上依次为3层滤纸、胶、PVDF膜、3层滤纸，每层放好后，用试管赶去气泡。插上电极，20V，45分钟。转膜结束后，切断电源，取出杂交膜。

4)免疫杂交与显色：将膜放入双蒸水中浸泡10分钟，取出放入20mL 5％脱脂奶粉的封闭液中室温孵育1小时。加入稀释2000的Peroxidase-conjugatedaffinipure Goat Anti-Human IgG(H+L)抗体(购买于Protein Tech公司)，4℃缓慢摇动孵育过夜。15mL TBS-T洗3次，每次5min。蛋白检测(按照ThermoPierce ECL Western Blotting Substrate试剂盒操作)。

检测结果见图6，其中，泳道WT为野生型水稻蛋白，泳道1-8为不同转基因水稻样品，1-8分别代表的株系为：T1#，T2#，T3#，T4#，T5#，T6#，T7#，T8#；其中条带H大小约为50KDa，与贝伐单抗重链大小相一致；条带L大小约为25KDa，与贝伐单抗轻链大小相一致。由检测结果可知，不同转基因水稻均表达贝伐单抗重链和轻链。

综合以上检测结果可知，本实施例成功获得了表达贝伐单抗的转基因水稻，所得水稻能够表达贝伐单抗，为利用植物表达体系制备贝伐单抗提供了新方法。

以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种适用于植物表达体系的表达贝伐单抗的基因，其特征在于，其包括表达贝伐单抗重链的基因和表达贝伐单抗轻链的基因；

所述表达贝伐单抗重链的基因具有：

(Ⅰ)如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列；

所述表达贝伐单抗轻链的基因具有：

(i)如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列；

2.一种重组载体，其特征在于，其整合有如权利要求1所述的表达贝伐单抗重链的基因和/或所述表达贝伐单抗轻链的基因。

3.根据权利要求2所述的重组载体，其特征在于，所述载体为双元表达载体。

4.根据权利要求2或3所述的重组载体，其特征在于，所述整合为整合到所述载体的T-DNA区域。

5.根据权利要求2至4中任一项所述的重组载体，其特征在于，所述表达贝伐单抗重链的基因、所述表达贝伐单抗轻链的基因中至少一个以表达盒的形式整合到所述载体中。

6.根据权利要求5所述的重组载体，其特征在于，所述表达贝伐单抗重链的基因以表达盒的形式整合到所述载体中，并且所述表达盒包括启动子、所述表达贝伐单抗重链的基因、终止子。

7.根据权利要求5或6所述的重组载体，其特征在于，所述表达贝伐单抗轻链的基因以表达盒的形式整合到所述载体中，并且所述表达盒包括启动子、所述表达贝伐单抗轻链的基因、终止子。

8.根据权利要求2至7中任意一项所述的重组载体，其特征在于，其中还整合有筛选标记基因。

9.一种产贝伐单抗植物的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1：获得如权利要求1所述的表达贝伐单抗重链的基因和所述表达贝伐单抗轻链的基因；

步骤2：取所述表达贝伐单抗重链的基因、所述表达贝伐单抗轻链的基因，构建贝伐单抗植物双元表达载体；

步骤3：将所述贝伐单抗植物双元表达载体导入植物组织细胞，经培养、筛选，即得。

10.一种利用如权利要求9所述的构建方法构建获得的产贝伐单抗的植物表达获得贝伐单抗的应用。