CN104788175B - 木霉菌生物颗粒剂及其制备方法和应用 - Google Patents
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Landscapes
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Abstract
本发明公开了一种木霉菌颗粒剂及其制备方法和应用；所述木霉菌颗粒剂包括如下组分及重量含量木霉菌液体发酵液30～40％，玉米粉5～10％，硅藻土30～40％，麦麸10～20％，硫酸锌肥1～2.0％，腐殖酸0.4～0.6％，氮磷钾复合肥0.4～0.6％。本发明的生防颗粒剂具有高拮抗性、强专化性的优点，应用该颗粒剂能够有效防治玉米茎腐病，具有既能抑制土壤中病原菌萌发，又能促进木霉菌的繁殖，同时促进作物根系生长的多重协同功效。
Description
技术领域
本发明涉及一种生防作用菌剂，具体为一种木霉菌生物颗粒剂及其制备方法和应用，特别是一种防治玉米茎腐病的木霉菌生物颗粒剂的制备方法及其防治应用。
背景技术
木霉菌(Trichoderma viride)是一种国际上应用相当普遍的生物防治微生物，作为具一类有重要生防价值的拮抗性真菌，早在20世纪30年代就已经发现对植物病原真菌有拮抗作用，其作用机制包括产生抗生作用、重寄生作用、溶菌作用、竞争作用等。
玉米是我国第一大粮食作物，玉米茎腐病是一类严重威胁玉米生产的土传病害，造成严重倒伏和产量损失，目前对于该病害的防治主要采取化学农药拌种的方法，但防效普遍缺佳，防效多数仅在30％左右。另一方面，随着我国对农作物病虫害绿色防控的需求的增加，化学农药的长期使用对生态环境已引起不同程度的不良影响。如何利用生物防治微生物控制玉米病害的发生和危害是实现玉米病害绿色防控的技术突破，寻求一种可以减少化学农药使用的生物防治方法得到普遍重视。木霉菌是一种广泛存在于土壤中的资源丰富的生防真菌，不仅能够广泛用于防治各类作物土传病害，还能促进植物生长、增加产量，减少土壤农化污染，应用前途广阔。因此，开发出具有良好生防及增产作用的生防木霉菌剂对于土传病害绿色防控具有十分重要的意义。并将这些制剂推广到全国各粮食主产区具有广泛前景。
目前国内登记的木霉菌菌剂多数为可湿性粉剂，主要登记在蔬菜和花卉植物上(如美国拜沃的哈茨木霉菌可湿性粉剂，登记作物温室观赏百合的根腐病以及番茄的立枯病、猝倒病。山东泰诺药业有限公司的木霉菌可湿性粉剂，主登记在蔬菜灰霉病防治)，而这种可湿性粉剂不适合处理土壤和玉米种子包衣，一方面目前木霉菌可湿性粉剂主要以对环境敏感的分生孢子为主要成分，另一方面，木霉菌可湿性粉剂直接处理玉米种子易影响种子萌发，而且木霉菌分生孢子活性易受种子表面已包衣的化学种衣剂的影响(国内所有商业化销售的玉米种子大多数均已包衣各种化学种衣剂)。木霉菌颗粒剂配方生产的有效成分主要抗逆性厚垣孢子，适用于各种土壤逆境因子，有明显耐药性，在干旱土壤条件下可存活6个月，并可施用于已包衣化学种衣剂的种子周围，而其活性不受影响。此外，木霉菌颗粒剂中的锌肥和氮磷钾复合肥的组分除了为木霉菌在土壤内定殖提供营养外，还可被木霉菌在土壤中转化为可被玉米高效利用的速效营养和诱导玉米免疫性的生化物质，从而诱导玉米对茎腐病的***免疫能力。
发明内容
本发明的目的是提供一种木霉菌生物颗粒剂及其制备方法和应用，具体为一种用于防治玉米土传病害茎腐病的木霉菌生防菌剂的制备方法及生防效果。本发明木霉菌制剂可有效用于防治玉米土传病害茎腐病。
本发明通过多年大量研究发现棘孢木霉菌ZJSX5003(中国生物工程杂志，2013，33(2)：97-104)，具有强烈的竞争生存能力、对土壤中病原菌的重寄生作用和诱导抗性的能力。
本发明的目的是通过如下技术方案实现的：所采用的生防菌为木霉菌ZJSX5003，经纯化后转移至试管斜面内作母菌剂，在三角瓶内振荡培养为液体菌种，再与营养基质玉米面及无机盐类进行固体发酵使其产生木霉菌液体发酵液，将载有大量木霉菌孢子的发酵液与载体混合后制成木霉菌生防制剂，在盆栽与田间播种前进行土壤穴施对于玉米茎腐病的防治具有明显增效作用。
第一方面，本发明提供一种木霉菌生物颗粒剂，所述木霉菌生物颗粒剂包括如下组分及重量含量：
优选地，所述木霉菌液体发酵液的制备如下：将发酵培养基装入发酵罐中，在121℃下灭菌30～60分钟，接入0.5％重量比的二级菌种，于28℃条件下发酵至发酵培养基变成绿色即木霉菌液体发酵液。
优选地，所述发酵培养基成分为：玉米面10千克，水210千克、磷酸二氢钾766克、硫酸镁100克、硫酸锰0.5克、硫酸锌0.4克、硝酸钠284克、硫酸铵220克、氯化钠200克；
所述发酵培养基的制备具体为：先将磷酸二氢钾、硫酸镁、硫酸锰、硫酸锌、硝酸钠、硫酸铵、氯化钠溶入水中，再加入玉米面混合后于121℃下灭菌30～60分钟即得。
优选地，所述发酵罐的体积为300L。
优选地，所述发酵的时间为7天。
优选地，所述二级菌种的制备如下：向已灭菌的二级发酵培养基中接入平板菌种，于28℃、180转/分条件下发酵时间为3天，即得二级菌种，是大量发散的絮状菌丝及分散的分生孢子液体菌种。
优选地，所述二级发酵培养基为取马铃薯200克、葡萄糖20克、水1升，调pH值为6～8；所述二级发酵培养基分装在250毫升三角瓶中100毫升；所述灭菌指在121℃下灭菌30分钟。
优选地，所述平板菌种的制备如下：将棘孢木霉菌ZJSX5003接种于PDA培养基平皿中，28℃培养箱中，倒置培养2～3天，即得。
PDA培养基：200克土豆切成1cm3的小块，小火煮30分钟，4层纱布过滤，保留汁液；加入20克葡萄糖，20克琼脂粉，蒸馏水定容至1升，121℃高压蒸汽灭菌30分钟。
由于木霉菌颗粒剂中各组分是有机整体的并有明显的协同增效作用。木霉菌产生的有机酸、多糖、蛋白质和植酸酶提高了土壤中可溶性磷和钾的含量和植物吸收能力，钾主要为植物表皮细胞壁提供木质素，提高对病原菌侵染的抵抗能力。玉米粉主要为木霉菌在土壤中和植物根系上的定殖提高碳源。腐殖酸除可增中土壤中的可溶性钾和磷以外，还能刺激植物生长和抗病性。除上述功能外，本技术方案最大的特点是各成分组合后产生了新的功能：(1)由于木霉菌颗粒剂使土壤中可溶性营养增加，加速了木霉菌在玉米根际土壤和根表定殖效率，其定殖效率(5叶期苗龄)从单一木霉菌剂组分(木霉发酵液+硅藻土)的40～50％，提高到80～90％(全组合)，使木霉菌能够从苗期-成株期(灌浆期)全程高效定殖，占领生态位，阻止病菌的侵染；(2)研究发现腐殖酸组分可刺激木霉菌产生分生孢子；(3)腐殖酸提高木霉菌组分诱导根系产生木质素能力二倍以上；(4)研究发现颗粒剂的麦麸和玉米粉明显诱导木霉菌纤维素酶活性提高，比单木霉菌组分提高30％，而我们首次证明纤维素酶是***诱导玉米抗性的激发子。
第二方面，本发明提供一种所述木霉菌生物颗粒剂的制备方法，所述制备方法如下：
将原料木霉菌液体发酵液30～40％、玉米粉5～10％、硅藻土30～40％、麦麸10～20％、硫酸锌肥1～2.0％、腐殖酸0.4～0.6％、氮磷钾复合肥0.4～0.6％搅拌均匀，然后挤压造粒，于43～50℃条件下干燥1～2h即得木霉菌颗粒剂。
优选地，所述搅拌中每批次搅拌原料的重量为：9～10kg木霉菌液体发酵液及10～12kg固体物料；所述固体物料即为玉米粉、硅藻土、麦麸、硫酸锌肥、腐殖酸、氮磷钾复合肥。
优选地，所述搅拌的转速为40～50转/min。
优选地，所述搅拌具体采用立式和面机，型号HLN25。
优选地，所述造粒中每批次造粒重量为25kg，造粒温度为25～30℃，颗粒含水量为30～40wt％。
优选地，所述造粒具体采用挤压造粒机，型号XL-300。
优选地，所述干燥中每批次干燥重量为50kg，干燥温度为45～50℃，干燥时间为40～60min，干燥后所得木霉菌生物颗粒剂的含水量为10～20wt％。
优选地，所述干燥具体采用沸腾干燥器，型号：FG-120。
本制备方法制备出的木霉菌生物颗粒剂的质量标准具体为：粒径0.15～0.2cm，表面光滑，坚硬，含水量10～20％，pH5～7，活孢子量2～4×108CFU/g，颗粒6～10分钟可全溶于水中，适于机械化与化肥混合施用。
第三方面，本发明提供一种所述木霉菌生物颗粒剂在防治玉米土传病害茎腐病中的应用。
优选地，所述应用具体指：田间试验以每亩地5千克的用量穴施所述木霉菌生物颗粒剂；盆栽试验施用方法为播种前每盆(直径20cm)，穴施木霉菌生物颗粒剂6克。
优选地，所述穴施为播种前穴施所述木霉菌生物颗粒剂。
与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：
1.木霉菌菌株经发酵与载体混合制成生防颗粒剂，制作方法简单，适合于不同规模生产；
2.木霉菌颗粒剂是防治玉米土传病害茎腐病引起的连作障碍的土壤改良剂，木霉菌制成生防制剂施入土壤，既有利于改善土壤环境，又有利于菌丝在土壤中的伸展蔓延，在木霉菌大量繁殖的过程中抑制土壤致病菌的生长，同时解决土传病和连作障碍问题；
3.按照本发明提供的颗粒剂，在播种前施入土壤作物根围，并随着根系的生长在土壤进一步繁衍，无残留，无污染，在海城试验站、江苏大丰市试验站、黑龙江肇东试验站、四川成都试验站、通化梅河口试验站、贵州遵义试验站、宁夏银川试验站田间试验，颗粒剂处理组的茎腐病发病率比对照组低防效可达55％以上；
4.本发明适用于大多数木霉菌株，制作方法简单，省水省电，适合于不同规模生产，市场前景广阔；
5.易于运输保藏，耐储存，可长效作用于玉米茎腐病防治作用。
附图说明
通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：
图1(a)(b)本发明的棘孢木霉菌ZJSX5003活体幼苗抑制玉米茎腐病菌及促进玉米幼苗生长的结果示意图；(c)为棘孢木霉菌ZJSX5003活体成株抑制玉米茎腐病菌的结果示意图；其中左、中、右分别为本申请木霉菌颗粒剂、大井生物科有限公司木霉菌肥、空白对照处理；
图2为本发明的棘孢木霉菌ZJSX5003田间抑制茎腐病生防效果的结果示意图；
图3为本发明的棘孢木霉菌ZJSX5003单一木霉菌剂与全组合木霉菌剂在玉米根际土壤和根表定殖效率的比较；
图4为本发明的棘孢木霉菌ZJSX5003复合颗粒剂与单一颗粒剂纤维素酶活性比较。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。
实施例1
本实施例提供一种木霉菌生物颗粒剂的制备方法，具体包括如下步骤：
1、平板菌种：将棘孢木霉菌ZJSX5003接种于PDA培养基平皿中，28℃培养箱中；倒置培养2～3天。
PDA培养基：200克土豆切成1cm3的小块，小火煮30分钟，4层纱布过滤，保留汁液；加入20克葡萄糖，20克琼脂粉，蒸馏水定容至1升，121℃高压蒸汽灭菌30分钟。
2、二级菌种的制备：取马铃薯200克、葡萄糖20克、水1升，配制成二级发酵培养液，调pH值为6～8，分装在250毫升三角瓶中100毫升，在121℃下灭菌30分钟，接入平板菌种，摇床转速为180转/分，发酵温度28℃，发酵时间为3天，得到大量发散的絮状菌丝及分散的分生孢子液体菌种。
3、木霉菌液体发酵液制备：发酵培养基成分为：玉米面10千克，水210千克、磷酸二氢钾766克、硫酸镁100克、硫酸锰0.5克、硫酸锌0.4克、硝酸钠284克、硫酸铵220克、氯化钠200克，先将无机盐溶入水中，再将培养料与水充分混合后制成固体发酵培养基，固体发酵培养基装入300升发酵罐中，在121℃下灭菌30～60分钟，接入重量比例0.5％的二级菌种，控制发酵温度为28℃，发酵时间7天，至培养料变成绿色即木霉菌液体发酵液；
4、木霉菌颗粒剂制备：木霉菌液体发酵液40％、玉米粉5.2％、硅藻土40％、麦麸13％、硫酸锌肥1％、腐殖酸0.4％、氮磷钾复合肥0.4％使用搅拌机搅拌均匀，造粒机挤压造粒后，干燥机43～50℃干燥1～2小时成品即为木霉菌颗粒剂。
5、活体玉米苗期实验：每盆称量相同基质，种植郑丹958玉米种子，处理组种植前每盆土壤穴施6g不同配方的颗粒剂，以目前大井生物牌木霉菌肥为对照。正常种植的作为空白对照，每盆5株，每处理10盆，待所有盆栽出苗50％后，每7天记录出苗率，玉米三叶期记录玉米苗期株高，所有盆栽伤根法填埋接种含有茎腐病病菌的玉米粒，7d后记录发病率，病情指数，计算防效，测量鲜重、干重、根部长度。
6、成株期接种试验：每盆称量相同基质，处理组种植前每盆土壤穴施6克棘孢木霉菌ZJSX5003颗粒剂，以常规木霉菌肥(大井生物科技有限公司)和空白处理为对照，每盆5株，每处理5盆，大喇叭口期盆栽茎基部分别接种两种病原菌病菌(伤根法填埋接种含有茎腐病病菌的玉米粒)，发病后统计生防效果。
表1
棘孢木霉菌ZJSX5003对玉米茎腐病的生防效果调查:
病株率＝病株率/调查总株数×100％
生防效果＝[(对照病株率-处理的病株率)/对照病株率]×100％
活体玉米苗期实验中:如图1(a)所示为空白对照组与木霉菌颗粒剂处理差别，木霉菌颗粒剂处理比空白对照组根系粗、多，植株高、叶片大(左侧为空白对照，右侧为本发明木霉菌颗粒剂处理)。如图1(b)所示为空白对照组与大井生物科有限公司木霉菌肥处理差别，大井生物科有限公司木霉菌肥处理比空白对照组根系粗、多，但比木霉菌颗粒剂处理少(左侧为空白对照，右侧为大井生物科有限公司木霉菌肥处理)。木霉菌颗粒剂处理的出苗率、株高、鲜重、干重、根长分别为96％、14.50厘米、1.649克、0.208克、10.82厘米；大井生物科有限公司木霉菌肥分别为94％、13.1厘米、1.5克、0.1克、9.0厘米。空白对照组分别为94％、12.74厘米、1.386克、0.193克、10.24厘米。木霉菌颗粒剂处理组的发病率、病情指数分别为14％、21；大井生物科有限公司木霉菌肥分别为30％、40；空白对照组分别为62％、77。木霉菌颗粒剂和大井生物科有限公司木霉菌肥对茎腐病的防分别为72.73％、48％。木霉菌颗粒剂处理在玉米苗期生长指标和防效上均好于常规菌肥对照和空白对照。
成株期接种试验：如图1(c)所示，其中左、中、右分别为本申请木霉菌颗粒剂、大井生物科有限公司木霉菌肥、空白对照处理；木霉菌颗粒剂处理的发病率、病情指数分别为40％、21，大井生物科有限公司木霉菌肥的发病率和病情指数，分别为65％和40，空白对照组分别为80％、60。木霉菌颗粒剂和大井生物科有限公司木霉菌肥对茎腐病的防分别为65％和33％。木霉菌颗粒剂处理对玉米苗期生长和茎腐病防效均好于对照。
实施例2
本实施例提供一种木霉菌生物颗粒剂的制备方法，具体包括如下步骤：
1、平板菌种：将棘孢木霉菌ZJSX5003接种于PDA培养基平皿中，28℃培养箱中，倒置培养2～3天。
PDA培养基：200克土豆切成1cm3的小块，小火煮30分钟，4层纱布过滤，保留汁液，加入20克葡萄糖，20克琼脂粉，蒸馏水定容至1升，121℃高压蒸汽灭菌30分钟。
2、二级菌种的制备：取马铃薯200克、葡萄糖20克、水1升，配制成二级发酵培养液，调pH值为6～8，分装在250毫升三角瓶中100毫升，在121℃下灭菌30分钟，接入平板菌种，摇床转速为180转/分，发酵温度28℃，发酵时间为3天，得到大量发散的絮状菌丝及分散的分生孢子液体菌种。
3、木霉菌液体发酵液制备：发酵培养基成分为：玉米面10千克，水210千克、磷酸二氢钾766克、硫酸镁100克、硫酸锰0.5克、硫酸锌0.4克、硝酸钠284克、硫酸铵220克、氯化钠200克，先将无机盐溶入水中，再将培养料与水充分混合后制成固体发酵培养基，固体发酵培养基装入300升发酵罐中，在121℃下灭菌30～60分钟，接入重量比例0.5％的二级菌种，控制发酵温度为28℃，发酵时间7天，至培养料变成绿色即木霉菌液体发酵液；
4、木霉菌颗粒剂制备：木霉菌液体发酵液30％、玉米粉10.0％、硅藻土36.8％、麦麸20％、硫酸锌肥2.0％、腐殖酸0.6％、氮磷钾复合肥0.6％，使用搅拌机搅拌均匀，造粒机挤压造粒后，干燥机43～50℃干燥1～2小时成品即为木霉菌颗粒剂。
5、田间试验：处理与示范田设计：选择面积连片、地势平坦、肥力均匀的田块做示范田。共设三个处理：木霉菌颗粒剂处理、空白对照、当地化学种衣剂。田间管理与当地生产田相同。
颗粒剂处理方法：品种为当地主栽品种，在海城试验站、江苏大丰市试验站、黑龙江肇东试验站、四川成都试验站、通化梅河口试验站、贵州遵义试验站、宁夏银川试验站分别种植的瑞德999、苏玉29、龙单76、仲玉3号、天农9号、益玉8号先玉335。在播种期分别将颗粒剂穴施入土壤，然后播种，每亩施用5kg，种植密度为4500株每亩，化肥施用量按当地实际应用水平。
田间防效调查：在成株期(乳熟期后)，每重复随机取3垄，20米垄长，每垄随机调查20株，三个重复共计60株，调查各重复的病株率、统计田间防效。
病株率％＝病株率/调查总株数×100％
防效＝[(对照病株率-处理的病株率)/对照病株率]×100％
如图2所示结果，在海城试验站、江苏大丰市试验站、黑龙江肇东试验站、四川成都试验站、通化梅河口试验站、贵州遵义试验站、宁夏银川试验站颗粒剂处理防效分别为66.67％、63.64％、66.67％、70.46％、55.5％、55.67％、100％，而种衣剂火龙神防效一般为35～40％。
实施例3
1、平板菌种：将棘孢木霉菌ZJSX5003接种于PDA培养基平皿中，28℃培养箱中；倒置培养2～3天。
PDA培养基：200克土豆切成1cm3的小块，小火煮30分钟，4层纱布过滤，保留汁液；加入20克葡萄糖，20克琼脂粉，蒸馏水定容至1升，121℃高压蒸汽灭菌30分钟。
2、二级菌种的制备：取马铃薯200克、葡萄糖20克、水1升，配制成二级发酵培养液，调pH值为6～8，分装在250毫升三角瓶中100毫升，在121℃下灭菌30分钟，接入平板菌种，摇床转速为180转/分，发酵温度28℃，发酵时间为3天，得到大量发散的絮状菌丝及分散的分生孢子液体菌种。
3、木霉菌液体发酵液制备：发酵培养基成分为：玉米面10千克，水210千克、磷酸二氢钾766克、硫酸镁100克、硫酸锰0.5克、硫酸锌0.4克、硝酸钠284克、硫酸铵220克、氯化钠200克，先将无机盐溶入水中，再将培养料与水充分混合后制成固体发酵培养基，固体发酵培养基装入300升发酵罐中，在121℃下灭菌30～60分钟，接入重量比例0.5％的二级菌种，控制发酵温度为28℃，发酵时间7天，至培养料变成绿色即木霉菌液体发酵液；
4、木霉菌颗粒剂制备：单一木霉菌剂组分：木霉菌液体发酵液37.8％、硅藻土62.2％。全组合木霉菌剂组分：木霉菌液体发酵液37.8％、玉米粉9％、硅藻土40％、麦麸10％、硫酸锌肥2％、腐殖酸0.6％、氮磷钾复合肥0.6％；使用搅拌机搅拌均匀，造粒机挤压造粒后，干燥机43～50℃干燥1～2小时成品即为木霉菌颗粒剂。
5、活体玉米苗期实验：每盆称量相同基质，种植郑丹958玉米种子，处理组种植前每盆土壤穴施6g不同配方的颗粒剂，以目前单一木霉菌剂为对照。每盆5株，每处理10盆，玉米五叶期测量玉米苗期木霉菌在根际土壤和根表定殖效率
6、测量玉米苗期木霉菌定殖效率：木霉菌在根际土壤定殖效率：每处理分别取待测玉米根3株，取10克加入盛有90毫升无菌水的三角瓶中；将抖掉表面土的根际土取5g，加入盛有45毫升无菌水的三角瓶中，150r/min，振荡30min，制成土含量为10-1g/mL土壤悬浮液；未沉淀前吸取1毫升加入另一盛有9毫升无菌水的试管中摇匀，并依次稀到10-5g/mL、分别吸取0.2毫升加入预先倒好的孟加拉红链霉素培养基平板上，用灭菌玻璃棒涂抹均匀。每处理重复3皿。培养24h后记录培养基上的菌落数目，并根据菌落数目分析土壤微生物的种群密度。
木霉菌在根表定殖效率：玉米根系用自来水冲洗干净后用无菌水反复冲洗，彻底去除根际土，将不同处理的玉米根系减成0.5mm左右的小段，于研钵中研成匀浆，稀释后涂布到制备好的孟加拉红链霉素培养基，培养24h后记录培养基上的菌落数目。
结果见图3，由于木霉菌颗粒剂使土壤中可溶性营养增加，加速了木霉菌在玉米根际土壤和根表定殖效率，其定殖效率(5叶期苗龄)从单一木霉菌剂组分的40～50％，提高到全组合的80～90％，使木霉菌能够从苗期到成株期全程高效定殖，占领生态位，阻止病菌的侵染。
实施例4
1、平板菌种：将棘孢木霉菌ZJSX5003接种于PDA培养基平皿中，28℃培养箱中；倒置培养2～3天。
PDA培养基：200克土豆切成1cm3的小块，小火煮30分钟，4层纱布过滤，保留汁液；加入20克葡萄糖，20克琼脂粉，蒸馏水定容至1升，121℃高压蒸汽灭菌30分钟。
2、二级菌种的制备：取马铃薯200克、葡萄糖20克、水1升，配制成二级发酵培养液，调pH值为6～8，分装在250毫升三角瓶中100毫升，在121℃下灭菌30分钟，接入平板菌种，摇床转速为180转/分，发酵温度28℃，发酵时间为3天，得到大量发散的絮状菌丝及分散的分生孢子液体菌种。
3、木霉菌液体发酵液制备：发酵培养基成分为：玉米面10千克，水210千克、磷酸二氢钾766克、硫酸镁100克、硫酸锰0.5克、硫酸锌0.4克、硝酸钠284克、硫酸铵220克、氯化钠200克，先将无机盐溶入水中，再将培养料与水充分混合后制成固体发酵培养基，固体发酵培养基装入300升发酵罐中，在121℃下灭菌30～60分钟，接入重量比例0.5％的二级菌种，控制发酵温度为28℃，发酵时间7天，至培养料变成绿色即木霉菌液体发酵液；
4、单一木霉菌剂组分：木霉液体发酵液40％、硅藻土60％；复合木霉菌剂组分：木霉菌液体发酵液40％、玉米粉20.0％、硅藻土30％、麦麸10％使用搅拌机搅拌均匀，造粒机挤压造粒后，干燥机43～50℃干燥1～2小时成品即为木霉菌颗粒剂。
5、活体玉米苗期实验：每盆称量相同基质，种植郑丹958玉米种子，处理组种植前每盆土壤穴施6g不同配方的颗粒剂，以单一木霉菌剂为对照。正常种植的作为空白对照，每盆5株，每处理10盆，每处理取根部样品进行纤维素酶活活力测定
6、纤维素酶活力测定
平板菌种：样品根系用自来水冲洗干净后用无菌水反复冲洗，将不同处理的玉米根系减成0.5mm左右的小段，于研钵中研成匀浆，稀释后涂布到制备好的孟加拉红链霉素培养基，
(1)取马铃薯200克、葡萄糖20克、水1升，配制成二级发酵培养液，调pH值为6～8，分装在250毫升三角瓶中100毫升，在121℃下灭菌30分钟，接入平板菌种，摇床转速为180转/分，发酵温度28℃，发酵时间为2d，至菌丝体繁盛。真空抽滤除上清液，沉淀即种子菌。
(2)称取若干份1g种子菌，转接到产酶诱导培养基中。28℃，180rpm恒温振荡培养4d。每天取样1毫升，6000rpm离心10分钟。取50μL木聚糖酶发酵液(木聚糖酶诱导培养基上清液为对照)，醋酸-醋酸钠缓冲液(0.1mol/L，pH 5.0)稀释至200μL，加入1.8毫升1％木聚糖溶液底物，充分混匀，50℃水浴10分钟。加入3毫升DNS剂，沸水浴反应10分钟，稀释后测定OD540nm吸光值。实验3次重复。为棘孢木霉菌木聚糖酶活力检测结果，在发酵3d达到最大值。
(3)木糖标准曲线的制备参照(费笛波，冯观泉，袁超.饲用木聚糖酶活性测定方法的研究.浙江农业学报，2004，1:53-58)。酶活力单位定义：在上述条件下，每分钟产生1μmol木糖所需酶量定为1个酶活力单位。
醋酸-醋酸钠缓冲液(0.1mol/L，pH 5.0)：吸取冰醋酸1.8毫升，加适量水，加醋酸钠5.78克，溶解，超纯水定容至1000毫升，调节PH至5.0后使用。
1％木聚糖底物：称取木聚糖1.00克于烧杯中，用2毫升0.5mol/L氢氧化钠润湿成糊状，加40毫升醋酸-醋酸钠缓冲液(0.1mol/L，pH 5.0)，于60-70℃水浴中加热溶解，冷凉后用0.5mol/L醋酸(约2mL-醋酸钠缓冲液(0.1mol/L，p-醋酸钠缓冲液(0.1mol/L，pH 5.0)定容至100毫升，搅拌均匀，贮存于-20℃冰箱中备用。
如图4所示，复合颗粒剂较比单一颗粒剂纤维素酶活性提高，比单木霉菌组分提高30％，复合颗粒剂中组分麦麸和玉米粉明显诱导木霉菌纤维素酶活性提高。
实施例5
1、平板菌种：将棘孢木霉菌ZJSX5003接种于PDA培养基平皿中，28℃培养箱中；倒置培养2～3天。
PDA培养基：200克土豆切成1cm3的小块，小火煮30分钟，4层纱布过滤，保留汁液；加入20克葡萄糖，20克琼脂粉，蒸馏水定容至1升，121℃高压蒸汽灭菌30分钟。
2、二级菌种的制备：取马铃薯200克、葡萄糖20克、水1升，配制成二级发酵培养液，调pH值为6～8，分装在250毫升三角瓶中100毫升，在121℃下灭菌30分钟，接入平板菌种，摇床转速为180转/分，发酵温度28℃，发酵时间为3天，得到大量发散的絮状菌丝及分散的分生孢子液体菌种。
3、木霉菌液体发酵液制备：发酵培养基成分为：玉米面10千克，水210千克、磷酸二氢钾766克、硫酸镁100克、硫酸锰0.5克、硫酸锌0.4克、硝酸钠284克、硫酸铵220克、氯化钠200克，先将无机盐溶入水中，再将培养料与水充分混合后制成固体发酵培养基，固体发酵培养基装入300升发酵罐中，在121℃下灭菌30～60分钟，接入重量比例0.5％的二级菌种，控制发酵温度为28℃，发酵时间7天，至培养料变成绿色即木霉菌液体发酵液；
4、木霉菌颗粒剂制备：
原木霉菌剂组分：木霉菌液体发酵液30％、玉米粉8％、硅藻土40％、麦麸20％、硫酸锌肥1％、氮磷钾复合肥0.6％。
改良木霉菌剂组分：向所述原木霉菌剂组分添加腐殖酸0.4％。使用搅拌机搅拌均匀，造粒机挤压造粒后，干燥机43～50℃干燥1～2小时成品即为木霉菌颗粒剂。将不同处理颗粒剂取1克，加入盛有99毫升无菌水的三角瓶中，150r/min，振荡30分钟，制成土含量为10-2g/mL土壤悬浮液；未沉淀前吸取，用血球计数板计数。
5、活体玉米苗期实验：每盆称量相同基质，种植郑丹958玉米种子，处理组种植前每盆土壤穴施6克不同配方的颗粒剂，以目前原木霉菌剂为对照。正常种植的作为空白对照，每盆5株，每处理10盆，每处理取根部鲜样0.5克，用95％的乙醇研磨成匀浆，4500rpm离心10分钟后收集沉淀。用95％乙醇冲洗沉淀3次，再用体积比乙醇：正已烷＝1:1冲洗3次，收集沉淀并干燥。干燥物用0.5毫升25％溴乙酰(冰乙酸配置)溶解70℃水浴加塞保温30分钟，然后加0.9毫升2mol/L NaOH终止反应加5毫升冰乙酸和0.1毫升7.5mol/L盐酸羟胺，混匀后，4500rpm离心5分钟吸取上清液0.1毫升加3.0毫升冰乙酸稀释测定OD280nm吸光值以A280nm·mg protein-1表示木质素的含量。
原木霉菌剂、改良木霉菌剂测量分生孢子数分别为2.3×108CFU/g、5.8×108CFU/g，发现腐殖酸组分可刺激木霉菌产生更多分生孢子。木质素含量测定中改良木霉菌剂是原木霉菌剂的两倍以上，腐殖酸提高木霉菌组分诱导根系产生木质素能力二倍以上。
以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。
Claims (10)
1.一种木霉菌生物颗粒剂，其特征在于，所述木霉菌生物颗粒剂包括如下组分及重量含量：
2.根据权利要求1所述的木霉菌生物颗粒剂，其特征在于，所述木霉菌液体发酵液的制备如下：将发酵培养基装入发酵罐中，在121℃下灭菌30～60分钟，接入0.5％重量比的二级菌种，于28℃条件下发酵至发酵培养基变成绿色即木霉菌液体发酵液。
3.根据权利要求2所述的木霉菌生物颗粒剂，其特征在于，所述发酵培养基成分为：玉米面10千克，水210千克、磷酸二氢钾766克、硫酸镁100克、硫酸锰0.5克、硫酸锌0.4克、硝酸钠284克、硫酸铵220克、氯化钠200克。
4.根据权利要求2所述的木霉菌生物颗粒剂，其特征在于，所述二级菌种的制备如下：向已灭菌的二级发酵培养基中接入平板菌种，于28℃、180转/分条件下发酵时间为3天，即得二级菌种。
5.根据权利要求4所述的木霉菌生物颗粒剂，其特征在于，所述二级发酵培养基为取马铃薯200克、葡萄糖20克、水1升，调pH值为6～8；
所述平板菌种的制备如下：将棘孢木霉菌ZJSX5003接种于PDA培养基平皿中，28℃培养箱中，倒置培养2～3天，即得。
6.一种根据权利要求1所述的木霉菌生物颗粒剂的制备方法，其特征在于，所述制备方法如下：
将原料木霉菌液体发酵液30～40％、玉米粉5～10％、硅藻土30～40％、麦麸10～20％、硫酸锌肥1～2.0％、腐殖酸0.4～0.6％、氮磷钾复合肥0.4～0.6％搅拌均匀，然后挤压造粒，于43～50℃条件下干燥1～2h即得木霉菌颗粒剂。
7.根据权利要求6所述的木霉菌生物颗粒剂的制备方法，其特征在于，所述搅拌中每批次搅拌原料的重量为：9～10kg木霉菌液体发酵液及10～12kg固体物料；
所述搅拌的转速为40～50转/min。
8.根据权利要求6所述的木霉菌生物颗粒剂的制备方法，其特征在于，所述造粒中每批次造粒重量为25kg，造粒温度为25～30℃。
9.根据权利要求6所述的木霉菌生物颗粒剂的制备方法，其特征在于，所述干燥中每批次干燥重量为50kg，干燥温度为45～50℃，干燥时间为40～60min。
10.一种根据权利要求1所述的木霉菌生物颗粒剂在防治玉米土传病害茎腐病中的应用。
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