CN103173273A - 微藻油脂提取方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种微藻油脂提取方法，包括调节微藻藻液的pH值，加热加压处理，随后恢复到常压状态，加入生物酶混合，所述生物酶分两步加入，先加入非蛋白酶，再加入蛋白酶。根据本发明提供的方法，使用生物酶处理湿藻时，在非蛋白酶作用一段时间后再加入蛋白酶，非蛋白酶不会被蛋白酶分解破坏，导致破壁效率大幅升高，与同时加入蛋白酶和非蛋白酶的方法相比，破壁效率明显提高，从而导致油脂提取率和产率明显提高。

Description

微藻油脂提取方法

技术领域

本发明涉及微藻的加工方法，具体而言，本发明涉及微藻油脂提取方法。

背景技术

微藻是一类个体微小的光能自养和/或异养型单细胞生物，具有分布广泛、种类繁多、光合效率高、生长速度快、适应性强等特点。微藻每年固定的CO₂约占全球净光合产量的40％，再加上其富含脂类、烃类、蛋白、可溶性多糖，以及虾青素、β-胡萝卜素等高价值天然色素，因此在环保、能源和健康等问题备受瞩目的今天，微藻越来越受到人们的关注。

微藻养殖完成后，要对进行收集、干燥、破壁与提取等处理以获得微藻藻油。

由于微藻具有纤维素性细胞壁，某些种类的微藻细胞壁厚、质地坚硬，在对微藻藻油进行提取前需进行破壁处理以提高藻油提取率。传统的微藻破壁方法很多，如传统上的机械粉碎、冻融、超声波、胶体磨等物理方法和生物酶解方法等。近几年先后提出了气爆法、高压均质和超高速气体粉碎法等。但上述方法都存在明显的缺点，或用时较长、或温度较高、或粉碎效果不佳、或没有有效保护生物活性成分。结果导致细胞壁破壁效率低下以及生物活性成分损失严重。

专利200810047859公开了一种利用生物酶法破壁，生产二十二碳六烯酸油脂的方法，在该方法中将蛋白酶和非蛋白酶同时加入、同时参与酶解反应，由于非蛋白酶本身也是蛋白质，因此在实际使用中，各种蛋白酶也会分解破坏其他生物酶，导致破壁效率大幅降低。

发明内容

由于现有技术中的用于微藻破壁的生物酶法具有破壁效率低的缺点，因此针对该缺点，本发明提出了一种新的微藻破壁方法，该方法主要分为两个步骤，第一步先以酸为催化剂，向密闭反应容器通入蒸汽，微藻细胞壁和胞间质在较高温度与压力下充分活化；第二步加入纤维素酶、果胶酶、蛋白酶等生物酶，在其最适温度下将绝大部分多糖、蛋白质继续水解为小分子单糖、氨基酸。微藻细胞壁结构被彻底破坏，胞内油脂与其他组分彻底分开，水解产物极易分层为油相、固相和水相，其中在第二步中，先加入非蛋白酶，反应一段时间，再加入蛋白酶反应一段时间，由于蛋白酶不干扰非蛋白酶的作用效果，因此相比于现有技术，本发明提供的方法破壁效率更高。

蛋白酶，也称为蛋白水解酶，是水解蛋白质肽键的一类酶的总称。常见的蛋白酶有胃蛋白酶、胰蛋白酶、组织蛋白酶、木瓜蛋白酶和枯草杆菌蛋白酶等。本文中的蛋白酶是包括多种常见的蛋白酶的复合物。

本文中的生物酶包括蛋白酶和非蛋白酶，其中非蛋白酶是指除蛋白酶之外的其他生物酶，包括纤维素酶、果胶酶、半纤维素酶、木聚糖酶、***聚糖酶、甘露聚糖酶、蜗牛酶等生物酶中的一种或多种。

根据本发明的一个方面，提供了一种微藻破壁方法，包括调节微藻藻液的pH值，加热加压处理，随后恢复到常压状态，加入生物酶混合，所述生物酶分两步加入，先加入非蛋白酶，再加入蛋白酶。

在上述方法中，将pH值调节为1.5～6.5，优选调节为1.5～3。

在上述方法中，其中加热温度为100～150℃，优选加热到120～150℃，加压到0.1～0.5MPa，优选加压到0.1～0.3MPa，保持加热加压状态1～120分钟，优选保持加压加热状态1～10分钟。

在上述方法中，其中在加入生物酶混合的步骤中，在30～50℃的反应温度下，先加入非蛋白酶，混合4～48小时，优选为4～6小时，再加入蛋白酶，混合4～48小时，优选为4～6小时。

根据一个优选的实施方式，在上述方法中，pH值为1.5～3，藻液加热到120～150℃，加压到0.1～0.3MPa，加压加热状态保持1～10分钟，非蛋白酶和蛋白酶的混合时间分别为4～10小时。

在上述方法中，根据微藻种类的不同，各个温度、压力条件以及反应时间可以适当调整。

根据本发明的一个具体实施方式，其中调节pH值的步骤通过加入无机酸或有机酸或者通入含酸性氧化物的气体实施，其中优选的无机酸为稀硫酸、盐酸、或稀硝酸，优选的有机酸为醋酸。优选的酸性氧化物包括二氧化碳、硫氧化物、氮氧化物中的一种或者多种。其中优选的硫氧化物包括二氧化硫和/或三氧化硫。氮氧化物包括一氧化二氮(N₂O)、一氧化氮(NO)、二氧化氮(NO₂)、三氧化二氮(N₂O₃)、四氧化二氮(N₂O₄)和五氧化二氮(N₂O₅)中的一种或者多种，优选的氮氧化物包括一氧化氮和/或二氧化氮。

根据本发明的优选实施方式，在上述方法中，其中含酸性氧化物的气体优选为电厂烟道气，电厂烟道气是燃煤或燃气热电厂由烟道排出的废气，成分为氮气、二氧化碳、氧和水蒸气和硫化物等，使用含酸性氧化物的气体如电厂烟道气降低藻液pH值，由于多余气体可以从藻液中蒸出，因此不仅有利于前一阶段微藻的养殖，而且基本无化学污染，减轻后一阶段废水处理的难度。

根据本发明的一个具体实施方式，其中在加热加压步骤中，通过连续进料出料或者批次进料的方式将酸性藻液导入压力反应罐中，然后向罐中通入水蒸气实现加热加压，使用蒸汽加热加压，升温快，成本低廉。

根据本发明的一个具体实施方式，其中通过同批加入或者分批加入的方式加入非蛋白酶。

根据本发明的一个具体实施方式，其中混合步骤通过慢速搅拌或泵回流循环的方式实施。其中慢速搅拌的速度为30rpm～120rpm，在酶处理过程中，不需连续搅拌，只需不定时搅拌或不定时泵打回流即可，耗能少。

根据本发明的一个具体实施方式，在上述方法中，其中在加入生物酶的步骤之后还包括加入有机溶剂提取微藻油脂的步骤，其中优选的有机溶剂为正己烷。

本文中的微藻可以为栅藻(Scenedesmus sp.)、绿球藻(Chlorococcumsp.)、绿藻、轮藻、甲藻、金藻、或硅藻等。

根据本发明的一个具体实施方式，本发明提供了一种以稀酸水解和酶水解为基础，低成本、低能耗的湿藻快速破壁并直接获取油脂的方法，该方法具体为将含油微藻采收后得到浓度为10g/L～400g/L的湿藻液，向藻液加入一定量无机酸或有机酸，或通入含酸性氧化物的气体(如含有CO₂、SO_x、NO_x的气体)，降低藻液pH值至1.5～6.5，将此酸性藻液导入耐酸耐高温的压力反应罐中，向反应罐通入蒸汽，使温度达到100℃～150℃，压力达到0.1MPa～0.5MPa，并维持1～120min。可以采用连续进料出料的方式，亦可批次进罐后加以充分搅拌。此时组成微藻细胞壁与细胞间物质在稀酸与高温高压的作用下充分软化、疏松。常压下，向反应罐内已软化疏松的藻细胞加入生物酶，生物酶可包括纤维素酶、果胶酶、半纤维素酶、蛋白酶、蜗牛酶、木聚糖酶、***聚糖酶、甘露聚糖酶等各种酶，除蛋白酶外其他所有酶可同批或分批加入，蛋白酶须在其他酶作用一段时间后再加入。反应温度在30℃～50℃，使用慢速搅拌或泵回流循环的方式充分混合，将全部或部分藻细胞壁与胞间质分解为水溶性小分子。通入少量溶剂如正己烷，充分搅拌，即可分层为油-有机相、和水相，分离油-有机相得到微藻油脂；或不加溶剂，直接分离油相与水相得到微藻油脂。

本发明提供的微藻破壁方法具有以下优点：

1)使用生物酶处理湿藻时，蛋白酶在非蛋白酶作用一段时间后再加入，各种蛋白酶不会分解破坏其他生物酶，导致破壁效率大幅升高，与同时加入蛋白酶和其他非蛋白酶的方法相比，破壁效率明显提高，从而导致油脂提取率和产率明显提高。

2)使用酸与酶做催化剂，因此破坏湿藻细胞壁所需时间少。

3)只需要水解纤维素为短链多糖，而不需要热解成烃类，因此对温度和压力要求不高。

4)处理工艺是水解过程，因此原料可以是湿藻，而不必耗费能量预先烘干，能耗极低。

5)使用蒸汽加热加压，升温快，成本低廉。

6)酶处理时不用连续搅拌，只需不定时搅拌或不定时泵打回流即可，耗能少。

7)使用含酸性氧化物的气体如电厂烟道气降低藻液pH值，不仅有利于前一阶段微藻的养殖，而且基本无化学污染，减轻后一阶段废水处理的难度。

附图说明

图1示出在使用生物酶处理微藻藻液时，蛋白酶与非蛋白酶的加入方式对藻油提取率的影响，其中A组表示同时加入蛋白酶与非蛋白酶的情况，B组表示先加入非蛋白酶反应一段时间之后再加入蛋白酶的情况。

图2示出酸化、加热加压以及酶解条件对藻油提取率的影响。

具体实施方式

下面的实施例可以使本领域技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。

破壁后藻油提取率和产率的测试方法如下：取少量未处理藻泥置烘箱105℃下烘干，按气相色谱法测定脂肪本底值C_藻，取提油后藻渣置烘箱105℃下烘干，按气相色谱法测定脂肪含量C_渣，按气相色谱法测定提取毛油中的脂肪含量C_毛油；设m_藻为提取用藻的干重质量(g)，m_渣为提取后藻渣的干重质量(g)，m_毛油为提取得到的毛油的质量(g)；根据公式提取率＝(C_藻×m_藻-C_渣×m_渣)/C_藻×m_藻计算提取率，根据公式产率＝(C_毛油×m_毛油)/C_藻×m_藻计算产率。

实施例1

使用湿藻进行油脂提取，藻种为一种绿球藻。设计A、B两个实验组，每组3个平行样，每个样品取30g湿藻，根据含水量调节湿藻的最终浓度至100g/L。向A、B两组均加入稀硫酸直至pH值为2，均用封瓶膜封口，135℃，0.2MPa处理1min；再向A组加入酸性纤维素酶0.1g、酸性果胶酶0.02g、酸性蛋白酶0.05g，40℃、120rpm振荡混旋12h；B组加入酸性纤维素酶0.1g，酸性果胶酶0.02g，40℃、120rpm振荡混旋6h，再加入酸性蛋白酶0.05g，40℃、120rpm继续振荡混旋6h。

将各藻样置于500mL三角瓶中，按1∶10(藻干重/溶剂，DWg/mL)加入正己烷，在50℃下水浴充分搅拌浸提20min，3000rpm离心3min，将上层液转移出来；重复此步骤三次。合并上层液，经滤纸过滤后用旋转蒸发仪蒸出溶剂，得到毛油。

按照上述破壁后藻油提取率和产率的测试方法测试藻油提取率和产率，其中C_藻、C_渣、m_藻、m_渣、C_毛油、m_毛油的具体数值见下表1，经计算，A组的藻油提取率和产率分别为49.48％和61.50％，B组的藻油提取率和产率分别为81.14％和96.32％，A组与B组的比较结果参见图1，从图1看出，从油脂提取率和产率看，B组的油脂提取率和产率大于A组。因此使用生物酶处理湿藻时，蛋白酶在其他酶作用一段时间后再加入，破壁效果明显好于蛋白酶开始就与其他酶混合作用。

表1

	m藻(g)	m渣(g)	m毛油(g)	C藻(％	C渣(％)	C毛油(％)
							A	8.98	4.42	2.93	34.682	35.593	65.368
B	8.98	3.02	4.82	34.682	19.436	62.237

实施例2

用湿藻进行油脂提取，藻种为一种栅藻。按下表2设计四个实验组，每组3个平行样，每个样品取30g湿藻，根据含水量调节湿藻的最终浓度至100g/L。

表2

实验组编号	实验组处理方式
		A’	无
B’	pH＝2，酶处理
		C’	高温高压，pH＝2
D’	高温高压，pH＝2；酶处理

A’组为对照组，不进行任何处理；C’组、D’组加入稀硫酸直至pH值为2，均用封瓶膜封口，135℃，0.2MPa处理1min；B’组加入稀硫酸直至pH值为2，与降温后的D’组加入酸性纤维素酶0.1g，酸性果胶酶0.02g，40℃、120rpm振荡混旋6h，再加入酸性蛋白酶0.05g，40℃、120rpm继续振荡混旋6h。

将各藻样置于500mL三角瓶中，按1∶10(藻干重/溶剂，DWg/mL)加入正己烷，在50℃下水浴充分搅拌浸提20min，3000rpm离心3min，将上层液转移出来；重复此步骤三次。合并上层液，经滤纸过滤后用旋转蒸发仪蒸出溶剂，得到毛油。

按照上述破壁后藻油提取率和产率的测试方法测试藻油提取率和产率，其中C_藻、C_渣、m_藻、m_渣、C_毛油、m_毛油的具体数值见下表3，经计算，A’组的藻油提取率和产率分别为9.83％和21.73％，B’组的藻油提取率和产率分别为24.81％和28.33％，C’组的藻油提取率和产率分别为72.32％和79.07％，D’组的藻油提取率和产率分别为90.76％和98.19％，A’组、B’组、C’组和D’组的比较结果参见图2，从图2看出，D’组的油脂提取率和产率最高，这说明D’组的微藻破壁效果最好，也就是说在高温高压、酸化和酶解的共同作用下，微藻的破壁效果最好。

表3

	m藻(g)	m渣(g)	m毛油(g)	C藻(％)	C渣(％)	C毛油(％)
							A’	8.97	8.17	1.28	41.332	40.934	62.96
B’	8.99	5.09	1.78	41.332	54.894	59.149
							C’	9.16	7.19	5.17	41.332	14.569	57.877
D’	9.05	3.93	5.88	41.332	8.794	62.45

实施例3

使用湿藻进行油脂提取，藻种为一种栅藻。设计A、B两个实验组，每组3个平行样，每个样品取30g湿藻，根据含水量调节湿藻的最终浓度至100g/L。A组为对照组，不进行任何处理；B组加入稀硫酸直至pH值为1.5，均用封瓶膜封口，150℃，0.1MPa处理120min；再加入酸性纤维素酶0.1g、酸性果胶酶0.02g、酸性蛋白酶0.05g，30℃、30rpm振荡混旋48h。

将各藻样置于500mL三角瓶中，按1∶10(藻干重/溶剂，DWg/mL)加入正己烷，在50℃下水浴充分搅拌浸提20min，3000rpm离心3min，将上层液转移出来；重复此步骤三次。合并上层液，经滤纸过滤后用旋转蒸发仪蒸出溶剂，得到毛油。

按照上述破壁后藻油提取率和产率的测试方法测试藻油提取率和产率，其中C_藻、C_渣、m_藻、m_渣、C_毛油、m_毛油的具体数值见下表4，经计算，A组的藻油提取率和产率分别为9.20％和23.82％；B组的藻油提取率和产率分别为78.27％和91.91％。从油脂提取率和产率看，B组的油脂提取率和产率大于A组，因此在高温、酸化和酶解的共同作用下，微藻的破壁效果较好。

表4

	m藻(g)	m渣(g)	m毛油(g)	C藻(％)	C渣(％)	C毛油(％)
							A	9.04	8.22	1.47	41.332	41.254	60.507
B	9.19	5.44	6.03	41.332	15.168	57.865

实施例4

使用湿藻进行油脂提取，藻种为一种甲藻。设计A、B两个实验组，每组3个平行样，每个样品取30g湿藻，根据含水量调节湿藻的最终浓度至100g/L。A组为对照组，不进行任何处理；B组加入稀硫酸直至pH值为6.5，均用封瓶膜封口，100℃，0.5MPa处理1min；再加入酸性纤维素酶0.1g、酸性果胶酶0.02g、酸性蛋白酶0.05g，50℃、120rpm振荡混旋4h。

将各藻样置于500mL三角瓶中，按1∶10(藻干重/溶剂，DWg/mL)加入正己烷，在50℃下水浴充分搅拌浸提20min，3000rpm离心3min，将上层液转移出来；重复此步骤三次。合并上层液，经滤纸过滤后用旋转蒸发仪蒸出溶剂，得到毛油。

按照上述破壁后藻油提取率和产率的测试方法测试藻油提取率和产率，其中C_藻、C_渣、m_藻、m_渣、C_毛油、m_毛油的具体数值见下表5，经计算，A组的藻油提取率和产率分别为8.62％和22.55％；B组的藻油提取率和产率分别为68.31％和88.26％。从油脂提取率和产率看，B组的油脂提取率和产率大于A组，因此在高温高压、酸化和酶解的共同作用下，微藻的破壁效果较好。

表5

	m藻(g)	m渣(g)	m毛油(g)	C藻(％)	C渣(％)	C毛油(％)
							A	9.18	7.42	1.33	37.497	42.393	58.373
B	9.06	4.23	4.82	37.497	25.454	62.204

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims (11)

1.一种微藻油脂提取方法，包括调节微藻藻液的pH值，加热加压处理，随后恢复到常压状态，加入生物酶混合，所述生物酶分两步加入，先加入非蛋白酶，再加入蛋白酶。

2.根据权利要求1所述的方法，其中将pH值调节为1.5～6.5，优选调节为1.5～3。

3.根据权利要求2所述的方法，其中调节pH值的步骤通过加入无机酸或有机酸或者通入含酸性氧化物的气体实施。

4.根据权利要求3所述的方法，其中所述无机酸为稀硫酸、盐酸、或稀硝酸，所述有机酸为醋酸，所述酸性氧化物包括二氧化碳、硫氧化物、电厂烟道气、氮氧化物中的一种或者多种。

5.根据权利要求1～4中任一项所述的方法，其中加热温度为100～150℃，优选加热到120～150℃，加压到0.1～0.5MPa，优选加压到0.1～0.3MPa，保持加热加压状态1～120分钟，优选保持加压加热状态1～10分钟。

6.根据权利要求1～5中任一项所述的方法，其中，在加入生物酶混合的步骤中，在30～50℃的反应温度下，先加入非蛋白酶，混合4～48小时，优选为4～6小时，再加入蛋白酶，混合4～48小时，优选为4～6小时。

7.根据权利要求1所述的方法，其中所述非蛋白酶包括纤维素酶、果胶酶、半纤维素酶、蜗牛酶、木聚糖酶、***聚糖酶、甘露聚糖酶中的一种或多种。

8.根据权利要求1所述的方法，其中通过同批加入或者分批加入的方式加入非蛋白酶。

9.根据权利要求1所述的方法，其中加入生物酶混合的步骤通过慢速搅拌或泵回流循环的方式实施，其中所述慢速搅拌的速度为30rpm～120rpm。

10.根据权利要求1所述的方法，其中在加入生物酶混合的步骤之后还包括加入有机溶剂提取微藻油脂的步骤。

11.根据权利要求1所述的方法，其中所述微藻为栅藻、绿球藻、绿藻、轮藻、甲藻、金藻、或硅藻。

Images