CN105505555A - 一种从含有产油微生物细胞的发酵液中提取油脂的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于油脂的提取方法，特别是指一种从含有产油微生物细胞的发酵液中提取油脂的方法。包括裂解破壁、萃取精炼、废酸的循环利用等工艺步骤。本发明解决了现有技术存在的废酸处理成本高、酸利用率低、破壁效果差、油脂提取率低等问题，具有油脂提取率高、原料成本和废酸处理成本低、有效降低了能耗等优点。
Description
技术领域
本发明属于油脂的提取方法，特别是指一种从含有产油微生物细胞的发酵液中提取油脂的方法。
背景技术
微生物油脂是继动植物油脂之后开发出来的又一油脂新资源。近年来，随着生产具有医疗和保健作用的功能油脂以及能源油脂的资源匮乏，微生物来源的细胞油脂受到广泛的关注和研究。因微生物细胞的培养具有占地面积小、生长快速、周期短、不受气候条件影响的优点，所以具有很大的开发潜力。产油微生物的种类繁多，主要有微藻、霉菌、细菌、酵母菌等种类，常见的产油微藻有光合自养型的硅藻(Diatom)和螺旋藻(Spirulina)等，异养型的裂壶藻(Schizochytrium)和隐甲藻(Crypthecodiumcohnii)等；酵母菌包括斯达氏油脂酵母(Lipomyces)、胶粘红酵母(Rhodotorulagiutinis)、产油油脂酵母(Lipomyslipofer)等；霉菌有高山被孢霉(Mortierellaalpina)、深黄被孢霉(Mortierellaisabellina)等,这些微生物均可通过人工培养获得大量含油脂的生物质。
在微生物油脂生产过程中油脂提取是重要的环节，一般步骤是将浓缩及干燥后的发酵物进行一定处理，再用有机溶剂萃取得到油脂。由于微生物细胞具有细胞壁，仅用有机溶剂浸泡很难穿过细胞壁将细胞内的油脂提取出来，必须先将细胞壁结构破碎后再萃取油脂。然而，细胞壁是由很多高分子化合物构成的坚固结构，包括肽聚糖、纤维聚糖等，这些聚糖是由单糖通过β-1,4或β-1,6等糖苷键结合在一起形成，在细胞外层构成一种纤维网状结构，用以维持细胞形状和保护细胞,坚固的细胞壁很难被破坏，因此细胞的破壁处理成为微生物油脂提取工艺中的难点。
目前所研究报道的破壁的方法主要包括机械研磨、热裂解、超声/微波辅助、高压匀质、化学水解、生物酶水解等。例如，CN102051330B采用液氮冷冻-机械研磨方法提取裂殖壶菌油脂，但在工业中藻液含有大量的水分，冷冻时需要消耗大量的液氮，液氮是一次消耗品不能重复利用，成本较高。CN102051331A和CN102533879B均采用生物酶的方法进行破壁，该方法虽然省去了生物质浓缩和干燥的步骤，但是发酵液的生物质浓度较低，体积庞大，需要加入大量的生物酶进行细胞壁水解反应，并加入大量有机溶剂进行萃取，操作体积过大反而造成耗能增加，所以直接以不经浓缩的发酵液为物料在工业上不适用，此外，生物酶制剂的价格非常昂贵，处理时间也较长，油脂提取率并不高。CN103173273A的方法是先向藻液加入酸，调节pH至1.5-3，在100-150℃并加压条件下处理，由于单独的稀酸和加热处理不能彻底裂解细胞壁，所以降温后再加入生物酶制剂进一步水解细胞壁，该发明通过化学-生物结合的方式来提取微藻的油脂，但该方法同样存在生物酶制剂价格昂贵的问题，并且加入酸热处理步骤造成步骤繁琐，生产成本进一步提高。CN101638361A采用化学-物理结合的方法提取裂殖壶菌的油脂，其将固液分离后收获的菌体加入NaOH溶液处理，再送入胶体磨碾磨成细胞碎片，再送入均质破碎机中高压破碎，所得细胞浆液再离心去除水分后用有机溶剂萃取，该发明虽然采用多种方法组合的方式破碎细胞壁提高了油脂提取率，但是所使用的NaOH价格昂贵，碾磨和均质破碎的能耗高，工艺复杂，在工业中并不实用。CN102965182B和CN104293473A将发酵液的pH调至酸性，在稀酸并加热条件下裂解微藻细胞壁，再加入有机溶剂进行油脂提取，但CN102965182B的处理条件对细胞壁的裂解效率低，大量油脂仍然存在于细胞中不能被提取出来，导致总油脂的回收率很低；而CN104293473A为了提高稀酸条件下细胞壁的破壁效率，将反应温度提高至260℃，然而在如此高的温度下极易导致一些功能油脂的氧化，损害所提取油脂的质量。此外，稀酸处理后的废酸液由于酸浓度较低，不能被重新利用，只能排放造成浪费和环境污染。孔凡敏等在2010年第5期《中国酿造》的文献中采用了4mol/L的盐酸于沸水浴中处理8min的条件提取酵母油脂得到了最高油脂相对得率，但没有实现废酸液的循环利用，使得废酸液只能废弃造成浪费和增加处理成本。
总之，目前所用的微生物油脂提取方法存在破壁效果不佳、成本高、步骤繁多的问题。因此需要开发一种提取效率更高，破壁速度更快、步骤简单、工业适用且无废物排放的绿色油脂提取方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种提取效率高，破壁速度快、废物排放少的从含有产油微生物细胞的发酵液中提取油脂的方法。
本发明的整体技术构思是：
一种从含有产油微生物细胞的发酵液中提取油脂的方法，包括如下工艺步骤：
A、裂解破壁
将含有产油微生物的发酵液经固液分离后得到含水质量百分含量为70-90％的湿菌泥,向湿菌泥中加入裂解液，升温裂解破壁后将反应物冷却，所述的裂解液选用浓盐酸、浓硫酸或浓磷酸中的一种；
B、萃取精炼
向步骤A中冷却后的反应物中加入有机溶剂后得到有机相和废酸水相，将有机相经过滤后减压蒸馏获得毛油和有机溶剂蒸汽，将毛油精炼得到精炼油；
C、废酸的循环利用
将步骤B中产生的废酸液作为裂解液循环利用到步骤A中。
本发明的具体技术构思还有：
所述的步骤A中湿菌泥：裂解液的质量比＝1:0.6-10。
所述的步骤A中升温裂解的条件为温度40-120℃，时间10-100分钟。
其中较为优选的实施方式包括以下三种技术方案：
(一)以浓盐酸作为裂解液
各工艺步骤的工艺条件如下：
A、裂解破壁
将经过培养的产油微生物发酵液经固液分离得到含水质量百分含量为70-90％的湿菌泥,按湿菌泥：裂解液的质量比＝1:1-4.5的比例向湿菌泥中加入裂解液，在40-80℃下反应进行10-90分钟裂解破壁后将反应物冷却，裂解液选用质量百分比浓度为37％的浓盐酸；
B、萃取精炼
向步骤A中冷却后的反应物中加入有机溶剂后得到有机相和废酸水相，将有机相经过滤后减压蒸馏获得毛油和有机溶剂蒸汽，将毛油精炼得到精炼油；
C、废酸的循环利用
C1、第一次循环利用：按湿菌泥：废酸液质量比＝1:1.3-3.3向湿菌泥中加入步骤B剩余的废酸液，在40-90℃下进行裂解破壁反应10-90分钟后重复步骤B；
C2、第二次循环利用：按湿菌泥：废酸液质量比＝1:1-2.5向湿菌泥中加入步骤C1剩余的废酸液，在50-90℃下进行裂解破壁反应20-90分钟后重复步骤B；
C3、第三次循环利用：按湿菌泥：废酸液质量比＝1:1.5-2向湿菌泥中加入步骤C2剩余的废酸液，在75-90℃下进行裂解破壁反应60-90分钟后重复步骤B。
(二)以浓硫酸作为裂解液
各工艺步骤的工艺条件如下：
A、裂解破壁
将经过培养的产油微生物发酵液经固液分离得到含水质量百分含量为70-90％的湿菌泥,按湿菌泥：裂解液的质量比＝1:0.6-1的比例向湿菌泥中加入裂解液，在40-70℃下反应进行10-90分钟裂解破壁后将反应物冷却，裂解液选用质量百分比浓度为98％的浓硫酸；
B、萃取精炼
向步骤A中冷却后的反应物中加入有机溶剂后得到有机相和废酸水相，将有机相经过滤后减压蒸馏获得毛油和有机溶剂蒸汽，将毛油精炼得到精炼油；
C、废酸的循环利用
C1、第一次循环利用：按湿菌泥：废酸液质量比＝1:2-3.5向湿菌泥中加入步骤B剩余的废酸液，在40-90℃下进行裂解破壁反应10-90分钟后重复步骤B；
C2、第二次循环利用：按湿菌泥：废酸液质量比＝1:1.5-2.5向湿菌泥中加入步骤C1剩余的废酸液，在50-90℃下进行裂解破壁反应20-90分钟后重复步骤B；
C3、第三次循环利用：按湿菌泥：废酸液质量比＝1:0.8-1.5向湿菌泥中加入步骤C2剩余的废酸液，在75-90℃下进行裂解破壁反应60-90分钟后重复步骤B。
(三)以浓磷酸作为裂解液
各工艺步骤的工艺条件如下：
A、裂解破壁
将经过培养的产油微生物发酵液经固液分离得到含水质量百分含量为70-90％的湿菌泥,按湿菌泥：裂解液的质量比＝1:4.5-10的比例向湿菌泥中加入裂解液，在70-120℃下反应进行20-100分钟裂解破壁后将反应物冷却，裂解液选用质量百分比浓度为85％的浓磷酸；
B、萃取精炼
向步骤A中冷却后的反应物中加入有机溶剂后得到有机相和废酸水相，将有机相经过滤后减压蒸馏获得毛油和有机溶剂蒸汽，将毛油精炼得到精炼油；
C、废酸的循环利用
C1、第一次循环利用：按湿菌泥：废酸液质量比＝1:4-12向湿菌泥中加入步骤B剩余的废酸液，在90-120℃下进行裂解破壁反应50-100分钟后重复步骤B；
C2、第二次循环利用：按湿菌泥：废酸液质量比＝1:2-4向湿菌泥中加入步骤C1剩余的废酸液，在90-120℃下进行裂解破壁反应70-100分钟后重复步骤B；
C3、第三次循环利用：按湿菌泥：废酸液质量比＝1:1-2.5向湿菌泥中加入步骤C2剩余的废酸液，在100-120℃下进行裂解破壁反应90-100分钟后重复步骤B。
本发明中步骤A中产油微生物选自微藻、酵母菌、霉菌。
所述的步骤A中固液分离方法选用絮凝沉淀、过滤、离心、膜脱水的一种或其结合。
为提高本发明中热量的利用率，优选的技术方案是，在步骤A后还包括一步骤A1，该步骤是将步骤A中升温用的热量循环利用到步骤B的减压蒸馏中。
所述步骤B中减压蒸馏的温度为35-75℃。
所述的步骤B中有机溶剂选用正己烷、石油醚、6号溶剂中的一种或其结合。
所述的步骤B所述有机相过滤时使用孔径为0.5-30微米的有机系滤膜、陶瓷滤膜或砂板滤器。
为提高本发明中有机溶剂的利用率，优选的技术方案是，在步骤B后还包括一步骤B1，该步骤是将步骤B中的有机溶剂蒸汽经加压冷凝液化形成有机溶剂，循环利用到步骤B的萃取中。
为实现本发明中裂解破壁反应的效果，优选的技术方案是，步骤C中废酸液的质量百分比浓度不低于4％。
为提高本发明中废酸的利用效果，减少废弃物的排放，优选的技术方案是，步骤C后还包括一步骤D，该步骤是将步骤C中的循环利用后剩余的废酸液经脱色后用于制取副产物。
在步骤D中的废酸液脱色采用吸附法，吸附剂选用活性炭、膨润土、活性白土、硅藻土、硅胶中的一种或其结合。
所述的步骤B中毛油精炼依次包括脱色、碱炼、脱臭处理。
所述的步骤D中制取副产物为向脱色后的废酸液中加入生石灰、石灰石或石灰乳用于制备氯化钙、硫酸钙、磷酸钙、磷酸二氢钙。
本发明所取得的实质性特点和显著的技术进步在于：
1、本发明采用浓酸水解细胞壁的方法进行破壁处理，破壁效率高，经申请人进行的对比试验证明，本发明的方法能有效提高油脂提取率。
2、浓酸水解后的废酸液被循环利用，避免酸浪费，大大减少了酸用量，降低了原料成本和废酸处理成本。
3、当废酸液被多次利用后导致浓度较低时，即被用于制备副产物，实现废物利用，避免直接排放造成的环境污染。
4、工艺中的有机溶剂和废热均被循环利用，有利于降低能耗和生产成本。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明做进一步描述，但不应理解为对本发明的限定，本发明的保护范围以权利要求记载的内容为准，任何依据说明书所作出的等效技术手段替换，均不脱离本发明的保护范围。
实施例1
浓酸法与其他方法提取微生物细胞油脂的比较
本实施例所用藻种为裂殖壶菌Schizochytriumsp.CGMCCNo.11382。
种子液培养：以葡萄糖20g/L、酵母提取物1g/L、海盐15g/L、余量为无菌水配制种子液培养基，在25℃、200rpm的摇床中培养，制备种子液。
发酵罐培养：以葡萄糖80g/L、玉米浆粉5g/L、海盐15g/L、余量为无菌水配制发酵培养基，于5L发酵罐中进行发酵培养，发酵温度25℃、搅拌转速500rpm，通气量2.5L/min，发酵结束后取样收集发酵液。
发酵液经离心获得含水率为80％的菌泥，称取5g湿菌泥于50ml离心管中，按湿菌泥：浓盐酸的质量比＝1:1.5的比例加入质量百分比浓度为37％的浓盐酸，振荡混匀后在70℃下反应10min；或按湿菌泥：浓硫酸的质量比＝1:0.6的比例加入质量百分比浓度为98％的浓硫酸，振荡混匀后在70℃下反应10min；或按湿菌泥：浓磷酸的质量比＝1:8的比例加入质量百分比浓度为85％的浓磷酸，振荡混匀后在90℃下反应20min，反应完成后于冷水中冷却。加入石油醚萃取三次，合并有机相用氮气吹干，测定细胞油脂含量。本实施例同时采用本领域公知的Bligh-Dyer法，超声辅助萃取法、高压匀质法和索氏抽提法测定总脂含量作为比较，具体方法均参照本领域已知的方法步骤。以经典的Bligh-Dyer测总脂含量方法为标准，计算得出油脂相对得率，结果如下表：
| 测定方法 | 细胞总脂含量 | 油脂相对得率 | 平均耗时 |
| Bligh-Dyer法 | 58.1±5.1％ | 100.0％ | 16h |
| 超声辅助萃取法 | 61.5±4.4％ | 105.9％ | 10h |
| 索氏抽提法 | 62.7±3.8％ | 107.9％ | 12h |
| 浓盐酸法 | 66.1±1.9％ | 113.8％ | 1h |
| 浓硫酸法 | 66.3±2.1％ | 114.1％ | 1h |
| 浓磷酸法 | 65.9±2.3％ | 113.4％ | 1h |
由结果看出，浓酸法获得的细胞总脂含量高于其他三种方法，与经典Bligh-Dyer方法相比，油脂的相对得率明显提高，且浓酸法测定总脂含量的平均耗时远低于另外三种方法，说明本发明的方法破壁速度快,效率更高。
实施例2
本实施例采用浓硫酸作为裂解液从含有酵母菌CryptococcuscurvatusATCC20508的发酵液中提取油脂
种子液培养基：葡萄糖20g/L，酵母提取物3g/L，麦芽提取物3g/L，蛋白胨5g/L，余量为无菌水制备种子液培养基，调节pH＝5.5。
发酵培养基：葡萄糖40g/L，酵母提取物5g/L，蛋白胨5g/L，氯化铵0.5g/L，磷酸二氢钾2.7g/L，磷酸氢二钠0.95g/L，七水硫酸镁1g/L，余量为无菌水。
取一管保藏的酵母CryptococcuscurvatusATCC20508接种至50ml种子培养基中，装于250ml摇瓶，于30℃，200rpm转速培养至糖浓度10g/L左右，按5％接种量转接至新的种子培养基中，如此培养三代后以10％接种量接种至100L发酵罐中，200rpm搅拌转速，通气量2.5vvm，控制pH5.5-6.5，糖浓度降至5g/L时补加葡萄糖，发酵5天后放罐。
总脂的测定方法采用传统的溶剂浸提法，根据经典的Bligh-Dyer脂肪酸提取及酯化方法，称取一定量的冻干细胞，与甲醇:氯仿:水＝1:2:0.8的混合液一起搅拌30分钟，离心后收集上清液，反复清洗数次后合并上清液，用氮气吹干溶剂得到藻细胞的脂，称重，测得总脂含量。
提取步骤如下：
A、裂解破壁
将培养好的酵母菌发酵液经过絮凝沉降和膜过滤后获得湿菌泥，称取40千克含水率90％的湿菌泥加入反应釜中，按湿菌泥：浓硫酸的质量比＝1：0.6的比例缓慢向反应釜中加入质量浓度为98％的硫酸24kg，稍加搅拌使酸液与湿菌泥充分混匀，通入热水加热，并搅拌，控制温度70℃，裂解反应90min。反应结束后迅速释放热水浴，并通入冷却水使反应釜内的温度降至室温。
B、萃取
向反应釜内加入100L石油醚，搅拌5min。待两相分层后取出有机相并经过滤器除去固体杂质，将有机相加入减压蒸馏釜中。将反应釜中释放出的热水浴通入蒸馏釜夹层中，控制温度75℃，通过减压蒸馏获得毛油和石油醚蒸汽。
B1、有机溶剂蒸汽循环利用
将石油醚蒸汽置入冷凝液化器中，在加压冷凝条件下液化。回收的石油醚返回反应釜中萃取，如此反复萃取3次。
C、废酸的循环利用
C1、第一次循环利用：以湿菌泥：步骤B剩余的废酸的质量比＝1:2的比例称取含水率90％的湿菌泥30kg加入反应釜中，搅拌混匀。将减压蒸馏后的热水经水浴加热槽加热后通入反应釜夹层，控制温度90℃，搅拌处理90min后重复步骤B。
C2、第二次循环利用：以湿菌泥：步骤C1中剩余的废酸的质量比＝1:1.5的比例称取含水率90％的湿菌泥58kg加入反应釜中，搅拌混匀。将减压蒸馏后的热水经水浴加热槽再加热后通入反应釜夹层，控制温度90℃，搅拌处理90min后重复步骤B。
C3、第三次循环利用：以湿菌泥：步骤C2中剩余的废酸的质量比＝1:0.8的比例称取含水率90％的湿菌泥174kg加入反应釜中，搅拌混匀。将减压蒸馏后的热水经水浴加热槽再加热后通入反应釜夹层，控制温度90℃，搅拌处理90min后重复步骤B。
D、制备副产物
萃取结束后将步骤C3剩余的废酸液取出用膨润土吸附脱色，存于废酸液槽中，在搅拌过程中加入石灰乳，制备硫酸钙。
收集所提取的四个批次的毛油并称重，共得到14.9kg毛油。毛油经本领域公知的技术进行脱臭-碱炼-脱色处理得到精炼油。Bligh-Dyer法测得的细胞总脂含量为44.7±3.1％，与Bligh-Dyer法相比本方法最终获得油脂的相对提取率为110.4±1.2％。
实施例3
以酵母菌CryptococcuscurvatusATCC20508为菌种进行发酵培养，所得发酵液进行油脂提取。酵母菌的发酵培养同实施例2。
提取的工艺步骤如下：
A、裂解破壁
将培养好的酵母菌发酵液经过絮凝沉降和膜过滤后获得湿菌体，称取40千克含水率90％的湿菌泥加入反应釜中，按湿菌泥：浓硫酸的质量比＝1：1的比例缓慢向反应釜中加入质量浓度为98％的硫酸40kg，稍加搅拌使酸液与湿菌泥充分混匀，通入热水加热，并搅拌，控制温度40℃，裂解反应10min。反应结束后迅速释放热水浴，并通入冷却水使反应釜内的温度降至室温。
B、向反应釜内加入100L正己烷，按实施例2所述的步骤进行萃取及有机溶剂循环利用操作。
C、废酸的循环利用
C1、第一次循环利用：以湿菌泥：步骤B中剩余的废酸的质量比＝1:2.4的比例称取含水率90％的湿菌泥31.7kg加入反应釜中，搅拌混匀。将减压蒸馏后的热水经水浴加热槽再加热后通入反应釜夹层，控制温度50℃，搅拌处理50min后重复步骤B。
C2、第二次循环利用：以湿菌泥：步骤C1中剩余的废酸的质量比＝1:1.8的比例称取含水率90％的湿菌泥58.1kg加入反应釜中，搅拌混匀。将减压蒸馏后的热水经水浴加热槽再加热后通入反应釜夹层，控制温度75℃，搅拌处理50min后重复步骤B。
C3、第三次循环利用：以湿菌泥：步骤C2中剩余的废酸的质量比＝1:1的比例称取含水率90％的湿菌泥156.8kg加入反应釜中，搅拌混匀。将减压蒸馏后的热水经水浴加热槽再加热后通入反应釜夹层，控制温度80℃，搅拌处理70min后重复步骤B。
收集所提取的四个批次的毛油并称重，共得到13.8kg毛油。毛油经本领域公知的技术进行脱臭-碱炼-脱色处理得到精炼油。与Bligh-Dyer法相比本方法最终获得油脂的相对提取率为107.8±2.2％。
实施例4
以酵母菌CryptococcuscurvatusATCC20508为菌种进行发酵培养，所得发酵液进行油脂提取。酵母菌发酵培养同实施例2。
提取的工艺步骤如下：
A、裂解破壁
将培养好的酵母菌发酵液经过絮凝沉降和膜过滤后获得湿菌体，称取40千克含水率70％的湿菌泥加入反应釜中，按湿菌泥：浓硫酸的质量比＝1：0.7的比例缓慢向反应釜中加入质量浓度为98％的硫酸28kg，稍加搅拌使酸液与湿菌泥充分混匀，通入热水加热，并搅拌，控制温度50℃，裂解反应50min。反应结束后迅速释放热水浴，并通入冷却水使反应釜内的温度降至室温。
B、萃取
向反应釜内加入100L的6号溶剂，按实施例2所述的步骤进行萃取及有机溶剂循环利用操作。
C、废酸的循环利用
C1、第一次循环利用：以湿菌泥：步骤B中剩余的废酸的质量比＝1:2.8的比例称取含水率70％的湿菌泥20kg加入反应釜中，搅拌混匀。将减压蒸馏后的热水经水浴加热槽再加热后通入反应釜夹层，控制温度40℃，搅拌处理70min后重复步骤B。
C2、第二次循环利用：以湿菌泥：步骤C1中剩余的废酸的质量比＝1:2的比例称取含水率70％的湿菌泥35kg加入反应釜中，搅拌混匀。将减压蒸馏后的热水经水浴加热槽再加热后通入反应釜夹层，控制温度60℃，搅拌处理30min后重复步骤B。
C3、第三次循环利用：以湿菌泥：步骤C2中剩余的废酸的质量比＝1:1.2的比例称取含水率70％的湿菌泥78.75kg加入反应釜中，搅拌混匀。将减压蒸馏后的热水经水浴加热槽再加热后通入反应釜夹层，控制温度75℃，搅拌处理60min后重复步骤B。
收集所提取的四个批次的毛油并称重，共得到24.8kg毛油。毛油经本领域公知的技术进行脱臭-碱炼-脱色处理得到精炼油。与Bligh-Dyer法相比本方法最终获得油脂的相对提取率为106.3±1.8％。
实施例5
以酵母菌CryptococcuscurvatusATCC20508为菌种进行发酵培养，所得发酵液进行油脂提取。酵母菌发酵培养同实施例2。
提取的工艺步骤如下：
A、裂解破壁
将培养好的酵母菌发酵液经过絮凝沉降和膜过滤后获得湿菌体，称取40千克含水率75％的湿菌泥加入反应釜中，按湿菌泥：浓硫酸的质量比＝1：0.8的比例缓慢向反应釜中加入质量浓度为98％的硫酸50kg，稍加搅拌使酸液与湿菌泥充分混匀，通入热水加热，并搅拌，控制温度60℃，裂解反应30min。反应结束后迅速释放热水浴，并通入冷却水使反应釜内的温度降至室温。
B、萃取
向反应釜内加入100L石油醚，按实施例2所述的步骤进行萃取剂有机溶剂循环利用操作。
C、废酸的循环利用
C1、第一次循环利用：以湿菌泥：步骤B中剩余的废酸的质量比＝1:3的比例称取含水率75％的湿菌泥26.7kg加入反应釜中，搅拌混匀。将减压蒸馏后的热水经水浴加热槽再加热后通入反应釜夹层，控制温度60℃，搅拌处理10min后重复步骤B。
C2、第二次循环利用：以湿菌泥：步骤C1中剩余的废酸的质量比＝1:2.3的比例称取含水率75％的湿菌泥43.5kg加入反应釜中，搅拌混匀。将减压蒸馏后的热水经水浴加热槽再加热后通入反应釜夹层，控制温度50℃，搅拌处理20min后重复步骤B。
C3、第三次循环利用：以湿菌泥：步骤C2中剩余的废酸的质量比＝1:1.4的比例称取含水率75％的湿菌泥94.7kg加入反应釜中，搅拌混匀。将减压蒸馏后的热水经水浴加热槽再加热后通入反应釜夹层，控制温度77℃，搅拌处理75min后重复步骤B。
收集所提取的四个批次的毛油并称重，共得到25.3kg毛油。毛油经本领域公知的技术进行脱臭-碱炼-脱色处理得到精炼油。与Bligh-Dyer法相比本方法最终获得油脂的相对提取率为110.5±1.5％。
实施例6
以酵母菌CryptococcuscurvatusATCC20508为菌种进行发酵培养，所得发酵液进行油脂提取。酵母菌发酵培养同实施例2。
提取的工艺步骤如下：
A、裂解破壁
将培养好的酵母菌发酵液经过絮凝沉降和膜过滤后获得湿菌体，称取40千克含水率80％的湿菌泥加入反应釜中，按湿菌泥：浓硫酸的质量比＝1：0.9的比例缓慢向反应釜中加入质量浓度为98％的硫酸36kg，稍加搅拌使酸液与湿菌泥充分混匀，通入热水加热，并搅拌，控制温度65℃，裂解反应70min。反应结束后迅速释放热水浴，并通入冷却水使反应釜内的温度降至室温。
B、萃取
向反应釜内加入100L正己烷，按实施例2所述的步骤进行萃取及有机溶剂循环利用操作。
C、废酸的循环利用
C1、第一次循环利用：以湿菌泥：步骤B中剩余的废酸的质量比＝1:3.5的比例称取含水率80％的湿菌泥19.4kg加入反应釜中，搅拌混匀。将减压蒸馏后的热水经水浴加热槽再加热后通入反应釜夹层，控制温度75℃，搅拌处理30min后重复步骤B。
C2、第二次循环利用：以湿菌泥：步骤C1中剩余的废酸的质量比＝1:2.5的比例称取含水率80％的湿菌泥33.4kg加入反应釜中，搅拌混匀。将减压蒸馏后的热水经水浴加热槽再加热后通入反应釜夹层，控制温度80℃，搅拌处理70min后重复步骤B。
C3、第三次循环利用：以湿菌泥：步骤C2中剩余的废酸的质量比＝1:1.5的比例称取含水率80％的湿菌泥73.5kg加入反应釜中，搅拌混匀。将减压蒸馏后的热水经水浴加热槽再加热后通入反应釜夹层，控制温度85℃，搅拌处理80min后重复步骤B。
收集所提取的四个批次的毛油并称重，共得到15.0kg毛油。毛油经本领域公知的技术进行脱臭-碱炼-脱色处理得到精炼油。与Bligh-Dyer法相比本方法最终获得油脂的相对提取率为100.8±2.2％。
实施例7
以隐甲藻CrypthecodiumcohniiATCC30556为菌种进行发酵培养，所得发酵液进行油脂提取。
隐甲藻的发酵培养：
取一管保藏的隐甲藻CrypthecodiumcohniiATCC30556接种至50ml种子培养基中，装于250ml摇瓶，于25℃，150rpm转速培养36h，按5％接种量转接至新的种子培养基中，如此培养三代后以10％接种量接种至100L发酵罐中，200rpm搅拌转速，通气量2.5vvm，控制pH＝6-7，糖浓度降至5g/L时补加葡萄糖，发酵4天后放罐。所述培养采用的培养基中包括碳源为葡萄糖，氮源为酵母提取物和玉米浆，无机盐包括钠盐、镁盐、磷酸盐、钾盐、钙盐、硫酸盐、氯化物等。微量元素包括锰，锌、钴、镍、铁等。
总脂测定方法同实施例2。
提取油脂的工艺步骤如下：
A、裂解破壁
将培养好的隐甲藻发酵液经过离心获得湿菌泥，称取50千克含水率90％的湿菌泥加入反应釜中，按湿菌泥：浓盐酸的质量比＝1：1的比例向反应釜中加入质量浓度为37％的浓盐酸50kg，稍加搅拌使酸液与湿菌泥充分混匀，通入热水加热，并搅拌，控制温度80℃，裂解反应10min。反应结束后迅速释放热水浴，并通入冷却水使反应釜内的温度降至室温。
B、萃取
向反应釜内加入100L正己烷，按实施例2所述的步骤进行萃取及有机溶剂循环利用操作。
C、废酸的循环利用
C1、第一次循环利用：以湿菌泥：步骤B中剩余的废酸的质量比＝1:3.3的比例称取含水率90％的湿菌泥28.8kg加入反应釜中，搅拌混匀。将减压蒸馏后的热水经水浴加热槽再加热后通入反应釜夹层，控制温度90℃，搅拌处理30min后重复步骤B。
C2、第二次循环利用：以湿菌泥：步骤C1中剩余的废酸的质量比＝1:1的比例称取含水率90％的湿菌泥120.9kg加入反应釜中，搅拌混匀。将减压蒸馏后的热水经水浴加热槽再加热后通入反应釜夹层，控制温度90℃，搅拌处理90min后重复步骤B。
C3、第三次循环利用：以湿菌泥：步骤C2中剩余的废酸的质量比＝1:2的比例称取含水率90％的湿菌泥114.9kg加入反应釜中，搅拌混匀。将减压蒸馏后的热水经水浴加热槽再加热后通入反应釜夹层，控制温度90℃，搅拌处理90min后重复步骤B。
D、制备副产物
萃取结束后将步骤C3剩余的废酸液取出用活性炭吸附脱色，存于废酸液槽中，在搅拌过程中加入石灰石，制备氯化钙。
收集所提取的四个批次的毛油并称重，共得到18.0kg毛油。毛油经本领域公知的技术进行脱臭-碱炼-脱色处理得到精炼油。通过Bligh-Dyer法测得的细胞总脂含量为48.6±2.9％，与Bligh-Dyer法相比本方法最终获得油脂的相对提取率为117.8±1.2％。
实施例8
以隐甲藻CrypthecodiumcohniiATCC30556为菌种进行发酵培养，所得发酵液进行油脂提取。隐甲藻的发酵培养同实施例7。
提取的工艺步骤如下：
A、裂解破壁
将培养好的隐甲藻发酵液经过离心湿菌泥，称取50千克含水率80％的湿菌泥加入反应釜中，按湿菌泥：浓盐酸的质量比＝1：4.5的比例向反应釜中加入质量浓度为37％的浓盐酸225kg，稍加搅拌使酸液与湿菌泥充分混匀，通入热水加热，并搅拌，控制温度40℃，裂解反应90min。反应结束后迅速释放热水浴，并通入冷却水使反应釜内的温度降至室温。
B、萃取、向反应釜内加入100L正己烷，按实施例2所述的步骤进行萃取及有机溶剂循环利用操作。
C、废酸的循环利用
C1、第一次循环利用：以湿菌泥：步骤B中剩余的废酸的质量比＝1:1.3的比例称取含水率80％的湿菌泥203.9kg加入反应釜中，搅拌混匀。将减压蒸馏后的热水经水浴加热槽再加热后通入反应釜夹层，控制温度75℃，搅拌处理10min后重复步骤B。
C2、第二次循环利用：以湿菌泥：步骤C1中剩余的废酸的质量比＝1:2.5的比例称取含水率80％的湿菌泥171.2kg加入反应釜中，搅拌混匀。将减压蒸馏后的热水经水浴加热槽再加热后通入反应釜夹层，控制温度70℃，搅拌处理30min后重复步骤B。
C3、第三次循环利用：以湿菌泥：步骤C2中剩余的废酸的质量比＝1:1.5的比例称取含水率80％的湿菌泥376.7kg加入反应釜中，搅拌混匀。将减压蒸馏后的热水经水浴加热槽再加热后通入反应釜夹层，控制温度85℃，搅拌处理75min后重复步骤B。
D、制备副产物
萃取结束后将步骤C3剩余的废酸液取出用活性白土吸附脱色，存于废酸液槽中，在搅拌过程中加入生石灰，制备氯化钙。
收集所提取的四个批次的毛油并称重，共得到83.2kg毛油。毛油经本领域公知的技术进行脱臭-碱炼-脱色处理得到精炼油。与Bligh-Dyer法相比本方法最终获得油脂的相对提取率为106.8±2.5％。
实施例9
以隐甲藻CrypthecodiumcohniiATCC30556为菌种进行发酵培养，所得发酵液进行油脂提取。隐甲藻的发酵培养同实施例7。
提取的工艺步骤如下：
A、裂解破壁
将培养好的隐甲藻发酵液经过离心湿菌泥，称取50千克含水率70％的湿菌泥加入反应釜中，按湿菌泥：浓盐酸的质量比＝1：2的比例向反应釜中加入质量浓度为37％的浓盐酸100kg，稍加搅拌使酸液与湿菌泥充分混匀，通入热水加热，并搅拌，控制温度70℃，裂解反应50min。反应结束后迅速释放热水浴，并通入冷却水使反应釜内的温度降至室温。
B、萃取
向反应釜内加入100L正己烷，按实施例2所述的步骤进行萃取及有机溶剂循环利用操作。
C、废酸的循环利用
C1、第一次循环利用：以湿菌泥：步骤B中剩余的废酸的质量比＝1:2的比例称取含水率70％的湿菌泥67.5kg加入反应釜中，搅拌混匀。将减压蒸馏后的热水经水浴加热槽再加热后通入反应釜夹层，控制温度60℃，搅拌处理50min后重复步骤B。
C2、第二次循环利用：以湿菌泥：步骤C1中剩余的废酸的质量比＝1:1.5的比例称取含水率70％的湿菌泥121.5kg加入反应釜中，搅拌混匀。将减压蒸馏后的热水经水浴加热槽再加热后通入反应釜夹层，控制温度80℃，搅拌处理20min后重复步骤B。
C3、第三次循环利用：以湿菌泥：步骤C2中剩余的废酸的质量比＝1:1.6的比例称取含水率70％的湿菌泥167.1kg加入反应釜中，搅拌混匀。将减压蒸馏后的热水经水浴加热槽再加热后通入反应釜夹层，控制温度80℃，搅拌处理70min后重复步骤B。
D、制备副产物
萃取结束后将步骤C3剩余的废酸液取出用硅藻土吸附脱色，存于废酸液槽中，在搅拌过程中加入石灰乳，制备氯化钙。
收集所提取的四个批次的毛油并称重，共得到65.1kg毛油。毛油经本领域公知的技术进行脱臭-碱炼-脱色处理得到精炼油。与Bligh-Dyer法相比本方法最终获得油脂的相对提取率为110.1±1.2％。
实施例10
以隐甲藻CrypthecodiumcohniiATCC30556为菌种进行发酵培养，所得发酵液进行油脂提取。隐甲藻的发酵培养同实施例7。
提取的工艺步骤如下：
A、裂解破壁
将培养好的隐甲藻发酵液经过离心湿菌泥，称取50千克含水率75％的湿菌泥加入反应釜中，按湿菌泥：浓盐酸的质量比＝1：3的比例向反应釜中加入质量浓度为37％的浓盐酸150kg，稍加搅拌使酸液与湿菌泥充分混匀，通入热水加热，并搅拌，控制温度60℃，裂解反应30min。反应结束后迅速释放热水浴，并通入冷却水使反应釜内的温度降至室温。
B、萃取
向反应釜内加入100L正己烷，按实施例2所述的步骤进行萃取及有机溶剂循环利用操作。
C、废酸的循环利用
C1、第一次循环利用：以湿菌泥：步骤B中剩余的废酸的质量比＝1:2.4的比例称取含水率75％的湿菌泥78.1kg加入反应釜中，搅拌混匀。将减压蒸馏后的热水经水浴加热槽再加热后通入反应釜夹层，控制温度50℃，搅拌处理70min后重复步骤B。
C2、第二次循环利用：以湿菌泥：步骤C1中剩余的废酸的质量比＝1:2的比例称取含水率75％的湿菌泥123.1kg加入反应釜中，搅拌混匀。将减压蒸馏后的热水经水浴加热槽再加热后通入反应釜夹层，控制温度50℃，搅拌处理50min后重复步骤B。
C3、第三次循环利用：以湿菌泥：步骤C2中剩余的废酸的质量比＝1:1.7的比例称取含水率75％的湿菌泥199.1kg加入反应釜中，搅拌混匀。将减压蒸馏后的热水经水浴加热槽再加热后通入反应釜夹层，控制温度75℃，搅拌处理60min后重复步骤B。
收集所提取的四个批次的毛油并称重，共得到61.2kg毛油。毛油经本领域公知的技术进行脱臭-碱炼-脱色处理得到精炼油。与Bligh-Dyer法相比本方法最终获得油脂的相对提取率为111.9±1.9％。
实施例11
以隐甲藻CrypthecodiumcohniiATCC30556为菌种进行发酵培养，所得发酵液进行油脂提取。隐甲藻的发酵培养同实施例7。
提取的工艺步骤如下：
A、裂解破壁
将培养好的隐甲藻发酵液经过离心湿菌泥，称取50千克含水率85％的湿菌泥加入反应釜中，按湿菌泥：浓盐酸的质量比＝1：3.5的比例向反应釜中加入质量浓度为37％的浓盐酸175kg，稍加搅拌使酸液与湿菌泥充分混匀，通入热水加热，并搅拌，控制温度50℃，裂解反应70min。反应结束后迅速释放热水浴，并通入冷却水使反应釜内的温度降至室温。
B、萃取
向反应釜内加入100L正己烷，按实施例2所述的步骤进行萃取及有机溶剂循环利用操作。
C、废酸的循环利用
C1、第一次循环利用：以湿菌泥：步骤B中剩余的废酸的质量比＝1:2.8的比例称取含水率85％的湿菌泥77.7kg加入反应釜中，搅拌混匀。将减压蒸馏后的热水经水浴加热槽再加热后通入反应釜夹层，控制温度40℃，搅拌处理90min后重复步骤B。
C2、第二次循环利用：以湿菌泥：步骤C1中剩余的废酸的质量比＝1:1.8的比例称取含水率85％的湿菌泥157.5kg加入反应釜中，搅拌混匀。将减压蒸馏后的热水经水浴加热槽再加热后通入反应釜夹层，控制温度60℃，搅拌处理70min后重复步骤B。
C3、第三次循环利用：以湿菌泥：步骤C2中剩余的废酸的质量比＝1:1.8的比例称取含水率85％的湿菌泥231.9kg加入反应釜中，搅拌混匀。将减压蒸馏后的热水经水浴加热槽再加热后通入反应釜夹层，控制温度77℃，搅拌处理80min后重复步骤B。
收集所提取的四个批次的毛油并称重，共得到43.3kg毛油。毛油经本领域公知的技术进行脱臭-碱炼-脱色处理得到精炼油。与Bligh-Dyer法相比本方法最终获得油脂的相对提取率为114.9±2.6％。
实施例12
本实施例采用浓磷酸的方法提取裂壶藻Schizochytriumsp.CGMCCNo.11382的油脂
种子液培养：以20g/L葡萄糖、1g/L酵母提取物、15g/L海盐为种子液培养基，在25℃、200rpm的摇床中培养，制备种子液。
发酵罐培养：以80g/L葡萄糖、5g/L玉米浆粉、15g/L海盐为发酵培养基，以10％接种量接种至50L发酵罐中进行发酵培养，控制pH5.5-6.5，当糖浓度降至5g/L时补加葡萄糖，发酵4天后放罐。
提取的工艺步骤如下：
A、裂解破壁
将培养好的裂壶藻发酵液经过离心获得湿菌泥，称取20千克含水率90％的湿菌泥加入反应釜中，按湿菌泥：浓磷酸的质量比＝1：4.5的比例向反应釜中加入质量浓度为85％的浓磷酸90kg，稍加搅拌使酸液与湿菌泥充分混匀，通入热水加热，并搅拌，控制温度120℃，裂解反应20min。反应结束后迅速释放热水浴，并通入冷却水使反应釜内的温度降至室温。
B、萃取
向反应釜内加入100L正己烷，按实施例2所述的步骤进行萃取及有机溶剂循环利用操作。
C、废酸的循环利用
C1、第一次循环利用：以湿菌泥：步骤B中剩余的废酸的质量比＝1:12的比例称取含水率90％的湿菌泥9.0kg加入反应釜中，搅拌混匀。将减压蒸馏后的热水经水浴加热槽再加热后通入反应釜夹层，控制温度115℃，搅拌处理60min后重复步骤B。
C2、第二次循环利用：以湿菌泥：步骤C1中剩余的废酸的质量比＝1:2的比例称取含水率90％的湿菌泥58.1kg加入反应釜中，搅拌混匀。将减压蒸馏后的热水经水浴加热槽再加热后通入反应釜夹层，控制温度120℃，搅拌处理75min后重复步骤B。
C3、第三次循环利用：以湿菌泥：步骤C2中剩余的废酸的质量比＝1:2.5的比例称取含水率90％的湿菌泥67.3kg加入反应釜中，搅拌混匀。将减压蒸馏后的热水经水浴加热槽再加热后通入反应釜夹层，控制温度115℃，搅拌处理92min后重复步骤B。
D、制备副产物
萃取结束后将步骤C3剩余的废酸液取出用硅藻土吸附脱色，存于废酸液槽中，在搅拌过程中加入石灰乳，制备磷酸钙。
收集所提取的四个批次的毛油并称重，共得到10.6kg毛油。毛油经本领域公知的技术进行脱臭-碱炼-脱色处理得到精炼油。通过Bligh-Dyer法测得的细胞总脂含量为57.9±4.7％，与Bligh-Dyer法相比本方法最终获得油脂的相对提取率为118.9±1.7％。
实施例13
本实施例的裂壶藻培养同实施例12。
提取的工艺步骤如下：
A、裂解破壁
将培养好的裂壶藻发酵液经过离心获得湿菌泥，称取20千克含水率80％的湿菌泥加入反应釜中，按湿菌泥：浓磷酸的质量比＝1：10的比例向反应釜中加入质量浓度为85％的浓磷酸200kg，稍加搅拌使酸液与湿菌泥充分混匀，通入热水加热，并搅拌，控制温度70℃，裂解反应100min。反应结束后迅速释放热水浴，并通入冷却水使反应釜内的温度降至室温。
B、萃取
向反应釜内加入100L正己烷，按实施例2所述的步骤进行萃取及有机溶剂循环利用操作。
C、废酸的循环利用
C1、第一次循环利用：以湿菌泥：步骤B中剩余的废酸的质量比＝1:4的比例称取54kg含水率80％的湿菌泥加入反应釜中，搅拌混匀。将减压蒸馏后的热水经水浴加热槽再加热后通入反应釜夹层，控制温度120℃，搅拌处理50min后重复步骤B。
C2、第二次循环利用：以湿菌泥：步骤C1中剩余的废酸的质量比＝1:2.5的比例称取103.7kg含水率80％的湿菌泥加入反应釜中，搅拌混匀。将减压蒸馏后的热水经水浴加热槽再加热后通入反应釜夹层，控制温度115℃，搅拌处理80min后重复步骤B。
C3、第三次循环利用：以湿菌泥：步骤C2中剩余的废酸的质量比＝1:1的比例称取342.1kg含水率80％的湿菌泥加入反应釜中，搅拌混匀。将减压蒸馏后的热水经水浴加热槽再加热后通入反应釜夹层，控制温度120℃，搅拌处理90min后重复步骤B。
D、制备副产物
萃取结束后将步骤C3剩余的废酸液取出用活性白土吸附脱色，存于废酸液槽中，在搅拌过程中加入生石灰，制备磷酸二氢钙。
收集所提取的四个批次的毛油并称重，共得到63.6kg毛油。毛油经本领域公知的技术进行脱臭-碱炼-脱色处理得到精炼油。与Bligh-Dyer法相比本方法最终获得油脂的相对提取率为105.6±2.4％。
实施例14
本实施例的裂壶藻培养同实施例12。
提取的工艺步骤如下：
A、裂解破壁
将培养好的裂壶藻发酵液经过离心获得湿菌泥，称取20千克含水率70％的湿菌泥加入反应釜中，按湿菌泥：浓磷酸的质量比＝1：6的比例向反应釜中加入质量浓度为85％的浓磷酸120kg，稍加搅拌使酸液与湿菌泥充分混匀，通入热水加热，并搅拌，控制温度110℃，裂解反应40min。反应结束后迅速释放热水浴，并通入冷却水使反应釜内的温度降至室温。
B、萃取
向反应釜内加入100L正己烷，按实施例2所述的步骤进行萃取及有机溶剂循环利用操作。
C、废酸的循环利用
C1、第一次循环利用：以湿菌泥：步骤B中剩余的废酸的质量比＝1:10的比例称取含水率70％的湿菌泥13.4kg加入反应釜中，搅拌混匀。将减压蒸馏后的热水经水浴加热槽再加热后通入反应釜夹层，控制温度90℃，搅拌处理100min后重复步骤B。
C2、第二次循环利用：以湿菌泥：步骤C1中剩余的废酸的质量比＝1:3.5的比例称取含水率70％的湿菌泥41.0kg加入反应釜中，搅拌混匀。将减压蒸馏后的热水经水浴加热槽再加热后通入反应釜夹层，控制温度90℃，搅拌处理100min后重复步骤B。
C3、第三次循环利用：以湿菌泥：步骤C2中剩余的废酸的质量比＝1:1.5的比例称取含水率70％的湿菌泥114.7kg加入反应釜中，搅拌混匀。将减压蒸馏后的热水经水浴加热槽再加热后通入反应釜夹层，控制温度105℃，搅拌处理97min后重复步骤B。
收集所提取的四个批次的毛油并称重，共得到35.8kg毛油。毛油经本领域公知的技术进行脱臭-碱炼-脱色处理得到精炼油。与Bligh-Dyer法相比本方法最终获得油脂的相对提取率为109.0±2.2％。
实施例15
本实施例的裂壶藻培养同实施例12。
提取的工艺步骤如下：
A、裂解破壁
将培养好的裂壶藻发酵液经过离心获得湿菌泥，称取20千克含水率75％的湿菌泥加入反应釜中，按湿菌泥：浓磷酸的质量比＝1：8的比例向反应釜中加入质量浓度为85％的浓磷酸160kg，稍加搅拌使酸液与湿菌泥充分混匀，通入热水加热，并搅拌，控制温度100℃，裂解反应60min。反应结束后迅速释放热水浴，并通入冷却水使反应釜内的温度降至室温。
B、萃取
向反应釜内加入100L正己烷，按实施例2所述的步骤进行萃取及有机溶剂循环利用操作。
C、废酸的循环利用
C1、第一次循环利用：以湿菌泥：步骤B中剩余的废酸的质量比＝1:6的比例称取29.2kg含水率75％的湿菌泥加入反应釜中，搅拌混匀。将减压蒸馏后的热水经水浴加热槽再加热后通入反应釜夹层，控制温度110℃，搅拌处理75min后重复步骤B。
C2、第二次循环利用：以湿菌泥：步骤C1中剩余的废酸的质量比＝1:3的比例称取65.6kg含水率75％的湿菌泥加入反应釜中，搅拌混匀。将减压蒸馏后的热水经水浴加热槽再加热后通入反应釜夹层，控制温度110℃，搅拌处理70min后重复步骤B。
C3、第三次循环利用：以湿菌泥：步骤C2中剩余的废酸的质量比＝1:2的比例称取123.1kg含水率75％的湿菌泥加入反应釜中，搅拌混匀。将减压蒸馏后的热水经水浴加热槽再加热后通入反应釜夹层，控制温度110℃，搅拌处理95min后重复步骤B。
收集所提取的四个批次的毛油并称重，共得到36.9kg毛油。毛油经本领域公知的技术进行脱臭-碱炼-脱色处理得到精炼油。与Bligh-Dyer法相比本方法最终获得油脂的相对提取率为107.2±2.8％。
实施例16
本实施例的裂壶藻培养同实施例12。
提取的工艺步骤如下：
A、裂解破壁
将培养好的裂壶藻发酵液经过离心获得湿菌泥，称取20千克含水率85％的湿菌泥加入反应釜中，按湿菌泥：浓磷酸的质量比＝1：9的比例向反应釜中加入质量浓度为85％的浓磷酸180kg，稍加搅拌使酸液与湿菌泥充分混匀，通入热水加热，并搅拌，控制温度90℃，裂解反应80min。反应结束后迅速释放热水浴，并通入冷却水使反应釜内的温度降至室温。
B、萃取
向反应釜内加入100L正己烷，按实施例2所述的步骤进行萃取及有机溶剂循环利用操作。
C、废酸的循环利用
C1、第一次循环利用：以湿菌泥：步骤B中剩余的废酸的质量比＝1:8的比例称取含水率85％的湿菌泥24.6kg加入反应釜中，搅拌混匀。将减压蒸馏后的热水经水浴加热槽再加热后通入反应釜夹层，控制温度100℃，搅拌处理90min后重复步骤B。
C2、第二次循环利用：以湿菌泥：步骤C1中剩余的废酸的质量比＝1:4的比例称取含水率85％的湿菌泥54.5kg加入反应釜中，搅拌混匀。将减压蒸馏后的热水经水浴加热槽再加热后通入反应釜夹层，控制温度100℃，搅拌处理90min后重复步骤B。
C3、第三次循环利用：以湿菌泥：步骤C2中剩余的废酸的质量比＝1:2.5的比例称取含水率85％的湿菌泥105.7kg加入反应釜中，搅拌混匀。将减压蒸馏后的热水经水浴加热槽再加热后通入反应釜夹层，控制温度100℃，搅拌处理100min后重复步骤B。
收集所提取的四个批次的毛油并称重，共得到20.6kg毛油。毛油经本领域公知的技术进行脱臭-碱炼-脱色处理得到精炼油。与Bligh-Dyer法相比本方法最终获得油脂的相对提取率为115.8±2.1％。
实施例17
本实施例的裂壶藻培养同实施例12。
提取的工艺步骤如下：
A、裂解破壁
将培养好的裂壶藻发酵液经过离心获得湿菌泥，称取40千克含水率90％的湿菌泥加入反应釜中，按湿菌泥：浓盐酸的质量比＝1：1.5的比例向反应釜中加入质量浓度为37％的浓盐酸60kg，稍加搅拌使酸液与湿菌泥充分混匀，通入热水加热，并搅拌，控制温度70℃，裂解反应50min。反应结束后迅速释放热水浴，并通入冷却水使反应釜内的温度降至室温。
B、萃取
向反应釜内加入100L石油醚，按实施例2所述的步骤进行萃取及有机溶剂循环利用操作。
C、废酸的循环利用
C1、第一次循环利用：以湿菌泥：步骤B中剩余的废酸的质量比＝1:1.3的比例称取含水率90％的湿菌泥73.8kg加入反应釜中，搅拌混匀。将减压蒸馏后的热水经水浴加热槽再加热后通入反应釜夹层，控制温度75℃，搅拌处理60min后重复步骤B。
C2、第二次循环利用：以湿菌泥：步骤C1中剩余的废酸的质量比＝1:1.5的比例称取含水率90％的湿菌泥162.5kg加入反应釜中，搅拌混匀。将减压蒸馏后的热水经水浴加热槽再加热后通入反应釜夹层，控制温度90℃，搅拌处理90min后重复步骤B。
C3、第三次循环利用：以湿菌泥：步骤C2中剩余的废酸的质量比＝1:2的比例称取含水率90％的湿菌泥205.8kg加入反应釜中，搅拌混匀。将减压蒸馏后的热水经水浴加热槽再加热后通入反应釜夹层，控制温度90℃，搅拌处理90min后重复步骤B。
收集所提取的四个批次的毛油并称重，共得到30.6kg毛油。毛油经本领域公知的技术进行脱臭-碱炼-脱色处理得到精炼油。与Bligh-Dyer法相比本方法最终获得油脂的相对提取率为109.6±2.3％。
实施例18
本实施例所用菌种为高山被孢霉MortierellaalpinaATCC16266。
种子液培养：以30g/L葡萄糖、10g/L酵母提取物、0.1g/L磷酸二氢钾、0.1g/L硫酸镁为种子液培养基，pH＝6.5-7.0，在28℃、120rpm的摇床中培养，制备种子液。
发酵培养：以60g/L葡萄糖、20g/L酵母膏、2g/L磷酸二氢钾、0.5g/L硫酸镁为发酵培养基，于发酵罐中进行发酵培养，发酵温度28℃、转速150rpm，期间补糖3次，共培养12天。
提取油脂的工艺步骤如下：
A、裂解破壁
将培养好的发酵液经过离心获得湿菌泥，称取50千克含水率90％的湿菌泥加入反应釜中，按湿菌泥：浓盐酸的质量比＝1：1.5的比例向反应釜中加入质量浓度为37％的浓盐酸75kg，稍加搅拌使酸液与湿菌泥充分混匀，通入热水加热，并搅拌，控制温度70℃，裂解反应10min。反应结束后迅速释放热水浴，并通入冷却水使反应釜内的温度降至室温。
B、萃取
向反应釜内加入100L正己烷，按实施例2所述的步骤进行萃取及有机溶剂循环利用操作。
C、废酸的循环利用
C1、第一次循环利用：以湿菌泥：步骤B中剩余的废酸的质量比＝1:3.3的比例称取含水率90％的湿菌泥36.4kg加入反应釜中，搅拌混匀。将减压蒸馏后的热水经水浴加热槽再加热后通入反应釜夹层，控制温度90℃，搅拌处理30min后重复步骤B。
C2、第二次循环利用：以湿菌泥：步骤C1中剩余的废酸的质量比＝1:1的比例称取含水率90％的湿菌泥152.7kg加入反应釜中，搅拌混匀。将减压蒸馏后的热水经水浴加热槽再加热后通入反应釜夹层，控制温度90℃，搅拌处理90min后重复步骤B。
C3、第三次循环利用：以湿菌泥：步骤C2中剩余的废酸的质量比＝1:2的比例称取含水率90％的湿菌泥145.1kg加入反应釜中，搅拌混匀。将减压蒸馏后的热水经水浴加热槽再加热后通入反应釜夹层，控制温度90℃，搅拌处理90min后重复步骤B。
D、制备副产物
萃取结束后将步骤C3剩余的废酸液取出用活性炭吸附脱色，存于废酸液槽中，在搅拌过程中加入石灰石，制备氯化钙。
收集所提取的四个批次的毛油并称重，共得到15.5kg毛油。毛油经本领域公知的技术进行脱臭-碱炼-脱色处理得到精炼油。通过Bligh-Dyer法测得的细胞总脂含量为36.3±1.7％，与Bligh-Dyer法相比本方法最终获得油脂的相对提取率为111.3±1.8％。
Claims (18)
1.一种从含有产油微生物细胞的发酵液中提取油脂的方法，其特征在于包括如下工艺步骤：
A、裂解破壁
将含有产油微生物的发酵液经固液分离后得到含水质量百分含量为70-90％的湿菌泥,向湿菌泥中加入裂解液，升温裂解破壁后将反应物冷却，所述的裂解液选用浓盐酸、浓硫酸或浓磷酸中的一种；
B、萃取精炼
向步骤A中冷却后的反应物中加入有机溶剂后得到有机相和废酸水相，将有机相经过滤后减压蒸馏获得毛油和有机溶剂蒸汽，将毛油精炼得到精炼油；
C、废酸的循环利用
将步骤B中产生的废酸液作为裂解液循环利用到步骤A中。
2.根据权利要求1所述的从含有产油微生物细胞的发酵液中提取油脂的方法，其特征在于所述的步骤A中湿菌泥：裂解液的质量比＝1:0.6-10。
3.根据权利要求1所述的从含有产油微生物细胞的发酵液中提取油脂的方法，其特征在于所述的步骤A中升温裂解的条件为温度40-120℃，时间10-100分钟。
4.根据权利要求1所述的从含有产油微生物细胞的发酵液中提取油脂的方法，其特征在于各工艺步骤的工艺条件如下：
A、裂解破壁
将经过培养的产油微生物发酵液经固液分离得到含水质量百分含量为70-90％的湿菌泥,按湿菌泥：裂解液的质量比＝1:1-4.5的比例向湿菌泥中加入裂解液，在40-80℃下反应进行10-90分钟裂解破壁后将反应物冷却，裂解液选用质量百分比浓度为37％的浓盐酸；
B、萃取精炼
向步骤A中冷却后的反应物中加入有机溶剂后得到有机相和废酸水相，将有机相经过滤后减压蒸馏获得毛油和有机溶剂蒸汽，将毛油精炼得到精炼油；
C、废酸的循环利用
C1、第一次循环利用：按湿菌泥：废酸液质量比＝1:1.3-3.3向湿菌泥中加入步骤B剩余的废酸液，在40-90℃下进行裂解破壁反应10-90分钟后重复步骤B；
C2、第二次循环利用：按湿菌泥：废酸液质量比＝1:1-2.5向湿菌泥中加入步骤C1剩余的废酸液，在50-90℃下进行裂解破壁反应20-90分钟后重复步骤B；
C3、第三次循环利用：按湿菌泥：废酸液质量比＝1:1.5-2向湿菌泥中加入步骤C2剩余的废酸液，在75-90℃下进行裂解破壁反应60-90分钟后重复步骤B。
5.根据权利要求1所述的从含有产油微生物细胞的发酵液中提取油脂的方法，其特征在于各工艺步骤的工艺条件如下：
A、裂解破壁
将经过培养的产油微生物发酵液经固液分离得到含水质量百分含量为70-90％的湿菌泥,按湿菌泥：裂解液的质量比＝1:0.6-1的比例向湿菌泥中加入裂解液，在40-70℃下反应进行10-90分钟裂解破壁后将反应物冷却，裂解液选用质量百分比浓度为98％的浓硫酸；
B、萃取精炼
向步骤A中冷却后的反应物中加入有机溶剂后得到有机相和废酸水相，将有机相经过滤后减压蒸馏获得毛油和有机溶剂蒸汽，将毛油精炼得到精炼油；
C、废酸的循环利用
C1、第一次循环利用：按湿菌泥：废酸液质量比＝1:2-3.5向湿菌泥中加入步骤B剩余的废酸液，在40-90℃下进行裂解破壁反应10-90分钟后重复步骤B；
C2、第二次循环利用：按湿菌泥：废酸液质量比＝1:1.5-2.5向湿菌泥中加入步骤C1剩余的废酸液，在50-90℃下进行裂解破壁反应20-90分钟后重复步骤B；
C3、第三次循环利用：按湿菌泥：废酸液质量比＝1:0.8-1.5向湿菌泥中加入步骤C2剩余的废酸液，在75-90℃下进行裂解破壁反应60-90分钟后重复步骤B。
6.根据权利要求1所述的从含有产油微生物细胞的发酵液中提取油脂的方法，其特征在于各工艺步骤的工艺条件如下：
A、裂解破壁
将经过培养的产油微生物发酵液经固液分离得到含水质量百分含量为70-90％的湿菌泥,按湿菌泥：裂解液的质量比＝1:4.5-10的比例向湿菌泥中加入裂解液，在70-120℃下反应进行20-100分钟裂解破壁后将反应物冷却，裂解液选用质量百分比浓度为85％的浓磷酸；
B、萃取精炼
向步骤A中冷却后的反应物中加入有机溶剂后得到有机相和废酸水相，将有机相经过滤后减压蒸馏获得毛油和有机溶剂蒸汽，将毛油精炼得到精炼油；
C、废酸的循环利用
C1、第一次循环利用：按湿菌泥：废酸液质量比＝1:4-12向湿菌泥中加入步骤B剩余的废酸液，在90-120℃下进行裂解破壁反应50-100分钟后重复步骤B；
C2、第二次循环利用：按湿菌泥：废酸液质量比＝1:2-4向湿菌泥中加入步骤C1剩余的废酸液，在90-120℃下进行裂解破壁反应70-100分钟后重复步骤B；
C3、第三次循环利用：按湿菌泥：废酸液质量比＝1:1-2.5向湿菌泥中加入步骤C2剩余的废酸液，在100-120℃下进行裂解破壁反应90-100分钟后重复步骤B。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的从含有产油微生物细胞的发酵液中提取油脂的方法，其特征在于所述的步骤A中产油微生物选自微藻、酵母菌、霉菌。
8.根据权利要求1-6中任一项所述的从含有产油微生物细胞的发酵液中提取油脂的方法，其特征在于所述的步骤A中固液分离方法选用絮凝沉淀、过滤、离心、膜脱水的一种或其结合。
9.根据权利要求1-6中任一项所述的从含有产油微生物细胞的发酵液中提取油脂的方法，其特征在于在步骤A后还包括一步骤A1，该步骤是将步骤A中升温用的热量循环利用到步骤B的减压蒸馏中。
10.根据权利要求1、4-6中任一项所述的从含有产油微生物细胞的发酵液中提取油脂的方法，其特征在于所述步骤B中减压蒸馏的温度为35-75℃。
11.根据权利要求1、4-6中任一项所述的从含有产油微生物细胞的发酵液中提取油脂的方法，其特征在于所述的步骤B中有机溶剂选用正己烷、石油醚、6号溶剂中的一种或其结合。
12.根据权利要求1、4-6中任一项所述的从含有产油微生物细胞的发酵液中提取油脂的方法，其特征在于所述的步骤B所述有机相过滤时使用孔径为0.5-30微米的有机系滤膜、陶瓷滤膜或砂板滤器。
13.根据权利要求1、4-6中任一项所述的从含有产油微生物细胞的发酵液中提取油脂的方法，其特征在于在步骤B后还包括一步骤B1，该步骤是将步骤B中的有机溶剂蒸汽经加压冷凝液化形成有机溶剂，循环利用到步骤B的萃取中。
14.根据权利要求1、4-6中任一项所述的从含有产油微生物细胞的发酵液中提取油脂的方法，其特征在于步骤C中废酸液的质量百分比浓度不低于4％。
15.根据权利要求1、4-6中任一项所述的从含有产油微生物细胞的发酵液中提取油脂的方法，其特征在于在步骤C后还包括一步骤D，该步骤是将步骤C中的循环利用后剩余的废酸液经脱色后用于制取副产物。
16.根据权利要求15所述的从含有产油微生物细胞的发酵液中提取油脂的方法，其特征在于在步骤D中的废酸液脱色采用吸附法，吸附剂选用活性炭、膨润土、活性白土、硅藻土、硅胶中的一种或其结合。
17.根据权利要求15所述的从含有产油微生物细胞的发酵液中提取油脂的方法，其特征在于所述的步骤D中制取副产物为向脱色后的废酸液中加入生石灰、石灰石或石灰乳用于制备氯化钙、硫酸钙、磷酸钙、磷酸二氢钙。
18.根据权利要求1、4-6中任一项所述的从含有产油微生物细胞的发酵液中提取油脂的方法，其特征在于所述的步骤B中毛油精炼依次包括脱色、碱炼、脱臭处理。
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