CN103323599B

CN103323599B - 一种狂犬病毒核蛋白时间分辨免疫荧光检测试剂盒及其制备方法

Info

Publication number: CN103323599B
Application number: CN201310119932.3A
Authority: CN
Inventors: 方浩霖; 刘洁萍; 何春辉
Original assignee: GUANGZHOU PROMISE BIOLOGICAL PRODUCTS CO Ltd
Current assignee: Guangzhou Baiyunshan Biological Products Co.,Ltd.
Priority date: 2013-04-09
Filing date: 2013-04-09
Publication date: 2015-07-15
Anticipated expiration: 2033-04-09
Also published as: CN103323599A

Abstract

本发明公开了一种狂犬病毒核蛋白时间分辨免疫荧光检测试剂盒及其制备方法，利用了双抗体夹心法和时间分辨免疫荧光的原理定量检测样品中狂犬病毒核蛋白的含量。该检测试剂盒包括标准品、包被反应板、镧系元素离子标记的抗狂犬病毒核蛋白单克隆抗体、分析缓冲液、洗涤液、荧光增强液，包被反应板上吸附有第一抗狂犬病毒核蛋白单克隆抗体，镧系元素离子标记第二抗狂犬病毒核蛋白单克隆抗体。将待测样品加入包被反应板中孵育，洗涤后加入镧系元素离子标记的第二抗狂犬病毒核蛋白单克隆抗体孵育，洗涤后加入荧光增强液，在时间分辨荧光检测仪上进行测定。本发明具有灵敏度高、特异性强、操作简单、检测范围宽等优点。

Description

一种狂犬病毒核蛋白时间分辨免疫荧光检测试剂盒及其制备方法

技术领域

本发明涉及病毒蛋白免疫分析技术领域，尤其涉及一种狂犬病毒核蛋白时间分辨免疫荧光检测试剂盒及其制备方法。

背景技术

狂犬病毒（Rabies Virus，RV）属于弹状病毒科,狂犬病毒属，形态呈子弹状，长180nm，直径75nm，其头部为半球形，末端常为平端，病毒颗粒由外壳和核心两部分组成。狂犬病毒基因组由11928～11932个核苷酸组成，为单链、不分节段的负链RNA，含5个大的开放阅读框，编码5种结构蛋自。基因组从3’端至5’端的排列顺序为N、P、M、G和L基因，分别编码病毒核蛋白（nucleoprotein，NP）、磷蛋白（phosphoprotein，NS）、膜基质蛋白（matrix protein，MP）、糖蛋白（glycoprotein，GP）和转录大蛋白（polymerase，LP）。近年来的研究表明，狂犬病毒疫苗诱导机体产生中和抗体的免疫应答反应主要与糖蛋白和核蛋白有关。核蛋白在病毒颗粒中数量众多，占病毒蛋白总量的36％。核蛋白基因序列相对恒定，是狂犬病毒中最稳定的蛋白，可用于检测抗原。核蛋白能诱导保护性免疫，是诱导狂犬病细胞免疫的主要成分。此外，核蛋白还能促进中和抗体的产生，抑制狂犬病毒在细胞间的传播和在细胞内的繁殖。因此，核蛋白是狂犬病毒疫苗组分中不可缺少的成分之一，是评价疫苗活力的一个重要指标。

狂犬病毒核蛋白含量是狂犬病疫苗的主要质量指标之一,在狂犬病疫苗的研制过程中常需要及时进行抗原含量的检测,现有技术中主要用NIH法（狂犬病疫苗效价测定法）测定。该方法测定周期长, 操作繁琐，还受到国际动物保护协会对实验动物使用的制约，不适用于狂犬病疫苗提纯过程中各步骤的监测。利用酶联免疫吸附（ELISA）方法检测狂犬病毒核蛋白已有报道，但ELISA试剂盒只能进行定性或半定量检测，不能提供精确的定量。因此，寻求能够精确定量的实验方法来替代NIH法或ELISA法势在必行。

时间分辨免疫荧光分析（TRFIA）是以稀土离子配合物标记抗原或抗体、核酸探针和细胞等为特征的新型的非放射性免疫标记技术。在传统的荧光免疫分析中，高背景的问题一直无法很好的解决。背景主要来自两部分，第一是散射光，包括分析所用固相材料表面的散射、溶剂分子的瑞利及拉曼散射等;第二是样品中各种共存物质产生的非特异荧光，包括血清蛋白的荧光、血清化合物如胆红素的荧光，上述这些背景荧光的寿命都在1-10ns之间。稀土配合物与普通有机荧光标记物相比的一个最突出的特征是它极长的荧光寿命(100us以上)，所以采用时间分辨荧光测定技术，只测定长寿命荧光物质发出的荧光，而不测定短寿命荧光物质发出的荧光，就可以很好地消除背景，极大地提高测定灵敏度。时间分辨荧光测定克服了ELISA酶标记物不稳定、酶容易失活、灵敏度不高等缺点，使非特异性信号降低到可以忽略的程度，达到极高的信噪比，从而大大地超过了放射性同位素所能达到的灵敏度。TRFIA还具有标记物制备简便、储存时间长、无放射性污染、检测重复性好、操作流程短、标准曲线范围宽、不受样品自然荧光干扰和应用范围十分广泛等优点，成为继放射免疫分析之后标记物发展的一个新里程碑，已成为生物医学研究和临床超微量生化检验中最有发展前景的分析手段之一。尚无现有技术报道利用TRFIA法定量检测狂犬病毒核蛋白。

发明内容

针对上述现有技术中的缺陷，本发明所解决的技术问题在于提供一种狂犬病毒核蛋白时间分辨免疫荧光检测试剂盒及其制备方法，该试剂盒能够定量检测狂犬病毒核蛋白，检测灵敏度高，操作简单，操作流程短。

为了解决上述技术问题，一方面，本发明提供了一种狂犬病毒核蛋白时间分辨免疫荧光检测试剂盒，包括标准品、包被反应板、镧系元素离子标记的抗狂犬病毒核蛋白单克隆抗体、分析缓冲液、洗涤液、荧光增强液；

所述包被反应板为吸附有第一抗狂犬病毒核蛋白单克隆抗体的微孔板；

所述镧系元素离子标记的抗狂犬病毒核蛋白单克隆抗体为镧系元素离子标记的第二抗狂犬病毒核蛋白单克隆抗体；

所述分析缓冲液用于稀释和稳定所述镧系元素离子标记的抗狂犬病毒核蛋白单克隆抗体。

其中，所述第一抗狂犬病毒核蛋白单克隆抗体采用杂交瘤细胞株F022制备而成，杂交瘤细胞株F022的保藏号为CCTCC NO:C201244；所述第二抗狂犬病毒核蛋白单克隆抗体采用杂交瘤细胞株F028制备而成，杂交瘤细胞株F028的保藏号为CCTCC NO:C201245。

优选地，所述分析缓冲液由50mmol/L Tris-HCl、 1.5% PEG6000、 0.2% BSA、 0.1% Proclin300、 0.02% 牛IgG、 0.1% Tween 20和0.84% NaCl组成，pH为7.8。

优选地，所述洗涤液由1.25mmol/L Tris-HCl、2.5% Tween 20和21%NaCl组成，pH为7.8，使用时稀释25倍。

优选地，所述荧光增强液含有β-二酮类化合物或芳香胺类化合物。更优地，所述荧光增强液由β-二酮类、三辛基氧化磷、Triton X-200、醋酸和邻苯二甲酸氢钾组成，pH 为2. 0～3. 2。

优选地，所述镧系元素离子为Eu³⁺、Tb³⁺、Sm³⁺、Dy³⁺中的至少一种。

另一方面，本发明还提供了一种制备狂犬病毒核蛋白时间分辨免疫荧光检测试剂盒的方法，其特征在于包括如下步骤：

a.制备包被反应板：将用包被缓冲液稀释的第一抗狂犬病毒核蛋白单克隆抗体加到微孔板上，低温放置后除去所述的包被缓冲液，加入封闭液，低温封闭后除去所述封闭液，洗涤所述的微孔板，真空抽干，冷冻保存；

b.制备镧系元素离子标记的第二抗狂犬病毒核蛋白单克隆抗体:将第二抗狂犬病毒核蛋白单克隆抗体加入到镧系元素离子标记试剂中，混匀，分装，真空冷冻干燥保存；

c.制备校准品：用缓冲液配制0、10、20、50、100、500 mEU/ml系列浓度的狂犬病疫苗效力国家标准品；

d.配制分析缓冲液、洗涤液、荧光增强液。

优选地，步骤b所述的第二抗狂犬病毒核蛋白单克隆抗体与所述镧系元素离子的质量比为5:1。

作为对上述技术方案的改进，对步骤b中镧系元素离子标记的第二抗狂犬病毒核蛋白单克隆抗体进行纯化，并稀释至选择线性好、灵敏度较低的稀释度。

另外，本发明还提供了一种狂犬病毒核蛋白时间分辨免疫荧光检测试剂盒的使用方法，其特征在于包括如下步骤：

a.使用检测试剂盒1小时前，将镧系元素离子标记的抗狂犬病毒核蛋白单克隆抗体用去离子水溶解，然后用分析缓冲液进行稀释，制成标记工作液；

b.在包被反应板孔内依次加入标准品和待测样品，室温振动孵育1 h，去除上清，用洗涤液多次洗涤，拍干；

c.加入步骤a中制备好的标记工作液，室温振动孵育1 h，去除上清，用洗涤液多次洗涤，拍干；

d.加入荧光增强液，避光缓慢水平摇动5 min；

e.在时间分辨荧光检测仪上按所编程序进行测定。

上述技术方案中提到的包被缓冲液、封闭液、微孔板等没有进行具体说明，可采用本技术领域公知的现有技术。

本发明利用了双抗体夹心法和时间分辨免疫荧光的原理定量检测样品中狂犬病毒核蛋白的含量，包被反应板上吸附有第一抗狂犬病毒核蛋白单克隆抗体，镧系元素离子标记第二抗狂犬病毒核蛋白单克隆抗体。本发明可实现狂犬病毒核蛋白的定量检测，且检测试剂盒制作简便、储存时间长、检测灵敏度高、操作流程短，可广泛应用于狂犬病毒相关样品的定量检测。

附图说明

图1为实施例3基于本发明一种狂犬病毒核蛋白时间分辨荧光免疫检测试剂盒标准品的标准曲线。

图2为实施例4基于本发明一种狂犬病毒核蛋白时间分辨荧光免疫检测试剂盒与国产ELISA试剂盒测定结果的相关性比较图。

具体实施方式

狂犬病毒核蛋白时间分辨免疫荧光检测试剂盒是应用双抗体夹心免疫荧光分析法，采用一株抗狂犬病毒核蛋白单克隆抗体包被的反应板，加入标准品和待测样品，样品中的核蛋白与已包被的单克隆抗体结合成抗体-核蛋白复合物，再加入镧系元素离子标记的另一株抗狂犬病毒核蛋白单克隆抗体和镧系元素离子的螯合剂即荧光增强液，形成抗体-核蛋白-抗体-螯合剂-镧系离子复合物。当镧系元素离子在荧光增强液中从核蛋白单克隆抗体上解离后发出强的荧光，荧光强度与样品中的核蛋白浓度成正比，对照标准曲线即可确定样品中抗原核蛋白的量。

本发明的狂犬病毒核蛋白时间分辨免疫荧光检测试剂盒包括：

1) 标准品

2) 包被反应板

3) 镧系元素离子标记的抗狂犬病毒核蛋白单克隆抗体

4) 分析缓冲液

5) 洗涤液

6) 荧光增强液

上述标准品为配制的系列浓度的狂犬病毒疫苗效力国家标准品。在本发明的实施例中，标准品采用如下方法制备：用由2 g/L BSA（牛血清白蛋白）、1 g/L NaN₃和50 mmol/l Tris-Hcl 组成的，pH为7.8的缓冲液，将狂犬病疫苗效力国家标准品（第7批）配制成0、10、20、50、100及500 mEU/ml系列浓度的标准品溶液。

上述包被反应板为吸附有第一抗狂犬病毒核蛋白单克隆抗体的微孔板。具体实现时，本发明实施例中的包被反应板采用如下方法制备：用pH 9.6、50 mmol/L的碳酸盐缓冲液将一株抗狂犬病毒核蛋白的单克隆抗体（本公司采用传统杂交瘤方法自制，编号为：F022 保藏号为：CCTCC NO:C201244，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏日期：2012年4月5日）包被在微孔板中，用封闭液封闭后真空抽干。

上述镧系元素离子标记的抗狂犬病毒核蛋白单克隆抗体为镧系元素离子标记的第二抗狂犬病毒核蛋白单克隆抗体。镧系元素离子标记的抗狂犬病毒核蛋白抗体采用如下方法制备：选用另一株抗狂犬病毒核蛋白的单克隆抗体（本公司采用传统杂交瘤方法自制，编号为：F028 保藏号为：CCTCC NO:C201245，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏日期：2012年4月5日）进行镧系元素离子标记，单克隆抗体与镧系元素离子标记物的质量比为5:1。标记率太高，影响被标记单克隆抗体的免疫活性；标记率太低，信号强度不够，降低检测灵敏度。

上述分析缓冲液用于稀释和稳定所述镧系元素离子标记的抗狂犬病毒核蛋白单克隆抗体。其中，分析缓冲液由50mmol/L Tris-HCl、1.5% PEG6000（聚乙二醇6000）、 0.2% BSA、 0.1% Proclin300（防腐剂300）、 0.02% 牛IgG、 0.1% Tween 20（吐温20）和0.84% NaCl组成，pH为7.8。

上述洗涤液用于洗涤加入包被反应板孔内孵育后的样品和被镧系元素离子标记的第二抗狂犬病毒核蛋白单克隆抗体。其中，洗涤液(25x)由 1.25mmol/L Tris-HCl、2.5% Tween 20和21%NaCl组成，pH为7.8，使用时稀释25倍。

上述荧光增强液为镧系元素离子的螯合物，镧系元素离子与其螯合剂，如

β-二酮体酮类或芳香胺类配体形成配合物后，可吸收紫外光，然后发出很强的金属离子特征荧光。优选地，荧光增强剂由β-二酮体、三辛基氧化磷(TOPO)、Triton200（曲拉通200）、醋酸和邻苯二甲酸氢钾组成，pH 为2. 0～3. 2。

目前，TRFIA利用镧系金属的三价离子及其螯合物作为荧光标记，常有的镧系元素为铕(Eu)、铽(Tb)、钐(Sm)、和镝(Dy)，最常用的是Eu、Tb，镧系元素标记物比较稳定，可以保存1~2年，克服了同位素、酶标等不稳定的缺点。

上述狂犬病毒核蛋白时间分辨免疫荧光检测试剂盒的使用方法为：

1）在包被反应板孔内依次加入标准品和待测样品，室温振动孵育1 h，去除上清，用洗涤液洗涤多次，拍干；

2）再加入以分析缓冲液稀释的镧系元素离子标记的抗狂犬病毒核蛋白单克隆抗体，室温振动孵育1 h，用洗涤液洗涤多次；

3）在孔内加入荧光增强液，缓慢水平摇动5 min；

4）在时间分辨荧光检测仪上按所编程序测定。

下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明。

1.本发明检测试剂盒的制备

（1）包被反应板的制备用pH9.6、50 mmol/L的碳酸盐缓冲液将一株抗核蛋白单克隆抗体（本公司采用传统杂交瘤方法自制，编号为：F022 保藏号为：CCTCC NO:C201244）稀释至3μg/ml，然后每孔100μl加入到96微孔板中，4℃过夜，吸掉包被液，加入由15%蔗糖、10%小牛血清、PBS缓冲液组成的封闭液（pH为7.0），4℃封闭过夜，吸掉封闭液，洗涤后真空抽干，－20℃冷冻保存。

（2）铕标记的抗狂犬病毒核蛋白单克隆抗体的制备

抗体浓缩：将0.5mg另一株抗狂犬病毒核蛋白单克隆抗体（本公司采用传统杂交瘤方法自制，编号为：F028 保藏号为：CCTCC NO:C201245）加入0.2ml标记缓冲液（50mmol/L Na2CO3, pH 9.0），混匀后，用Millipore公司带有滤膜的G-50离心管10000rpm离心5min，再重复洗涤5次，加入50μl标记缓冲液，静置2min，倒转离心收集抗体，体积控制在50μl左右；

抗体标记：加0.1mg Eu³⁺标记试剂（PerKin Elmer公司产品，编号：1244-302）到浓缩好的抗狂犬病毒核蛋白单克隆抗体中，充分混匀，25℃振荡过夜；

标记抗体纯化：将标记好的抗体用Sephadex G-50层析柱（1x30cm）进行分离纯化, 洗脱液（含0.9% NaCl的50mmol/l Tris-HCl溶液）洗脱后，收集洗脱液（1ml/管），逐管测量吸光度（A280nm）, 合并峰管，测蛋白含量并计算标记率；

确定稀释度：对并管后的标记抗体进行稀释度摸索，选择线性较好，灵敏度较低的稀释度；用连续加样枪分装标记抗体，1.0 ml/瓶，真空冷冻干燥，2℃- 8℃保存。

（3）标准品制备

用含2 g/L BSA及1 g/L NaN₃的50 mmol/l Tris-Hcl缓冲液（pH7.8），将狂犬病疫苗效力国家标准品（第7批）配制成0、10、20、50、100及500 mEU/ml系列浓度的标准溶液。

（4）制备分析缓冲液

配制由50mmol/L Tris-HCl、 1.5% PEG6000、 0.2% BSA、 0.1% Proclin300、 0.02% 牛IgG、 0.1% Tween 20和0.84% NaCl组成的分析缓冲液，pH为7.8。

（5）配制洗涤液

配制由1.25mmol/L Tris-HCl、2.5% Tween 20和21%NaCl组成的洗涤液(25x)，pH为7.8。

（6）配制荧光增强液

配制由15 μmol/L β-萘甲酰三氟丙酮(β-NTA)、50 μmol/L三辛基氧化磷(TOPO)、0.1% Triton X-100、0.6%醋酸组成的荧光增强液，用适量邻苯二甲酸氢钾调整其pH为pH 2. 0～3. 2。

2.本发明检测试剂盒的使用方法

(1)试剂的准备

工作洗涤液：将50 mL洗涤液(25x)和1200 mL去离子水混合，作为洗涤液；

标记抗体工作液：使用前一小时将每瓶标记抗体用1 mL去离子水溶解，用分析缓冲液以1:100倍的比例稀释，作为标记抗体工作液。

(2)操作步骤

1) 向包被反应板每孔中依次加入100μl参考标准品或待测样品（待测样品可以是含狂犬病毒抗原成分的培养物、狂犬病疫苗中间品及成品、怀疑被狂犬病毒感染的动物分泌物或组织提取物），室温振动孵育1 h，吸弃上清，用工作洗涤液洗涤4次，拍干；

2) 每孔种加入100μl稀释好的标记抗体工作液，室温振动孵育1 h，吸弃上清，用洗涤液洗涤6次，拍干；

3) 每孔加入100μl荧光增强液，水平缓慢摇动5 min；

4)在时间分辨荧光检测仪上按所编程序测定。

3.本发明检测试剂盒的方法学检定

按照本领域中常规的制造和检定规程对实施例中制备成的检测试剂盒进行检定，结果如下：

1）准确度

将样品1、样品2、样品3分别按1:200，1:400，1:800 和1:1600的比例稀释，每个样品稀释度作3复孔，重复测定3次，n=3×3，计算其测定值、真实值和准确度。

表1 试剂盒准确度试验结果（n=3*3）

2)灵敏度和线性范围分析

以零参考标准品当作样品测量8次，计算其荧光值及标准差。以其荧光测定平均值加2倍标准差所得的荧光值代入标准曲线方程计算得出的浓度值为其灵敏度，经测定本实施例分析灵敏度为1.0 mEU/ml。将标准品稀释成不同浓度进行测定，测得标准曲线线性范围为5～1000mEU/ml。

3) 精密度（CV%）

用本实施例中的检测试剂盒对标准品A-F 6个点进行测定，各设10个复孔。结果本实施例试剂盒的批内变异系数(CV%)为2.7%～9.3%，批间变异系数(CV%)为3.5%～12.2%，符合试剂盒检定规程要求，精密度良好。

表2 批内精密度测试结果（n=10）

表3 批间精密度测试结果（三批，n=3*10 ）

4) 特异性

将不同浓度的蔗糖、人血清蛋白、牛血清蛋白、明胶、PBS溶液当作待测样品，用本实施例试剂盒测定，结果表明均无反应。

4.本实施例检测试剂盒与国产ELISA试剂盒测定结果比较

用本实施例的试剂盒和武汉生物制品研究所制备的ELISA（核蛋白）试剂盒同时对30份样本进行检测。以本实施例试剂盒测定的结果为横坐标，武汉生物制品研究所制备的ELISA（核蛋白）试剂盒测定的结果为纵坐标做回归分析，相关方程为：Y= 0.732X+0.655，相关系数r=0.962（如图2所示）。结果表明本实施例试剂盒测定结果与武汉生物制品研究所制备的ELISA（核蛋白）试剂盒测定结果具有高度相关性。

以上所揭露的仅为本发明的较佳实施例而已，对于本领域的一般技术人员，依据本发明内容的思想，在具体实施方式及应用范围上均会有改变之处。综上所述，本说明书内容不应理解为对本发明的限制，凡依本发明设计思想所作的任何改变都在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种狂犬病毒核蛋白时间分辨免疫荧光检测试剂盒，包括标准品、包被反应板、镧系元素离子标记的抗狂犬病毒核蛋白单克隆抗体、分析缓冲液、洗涤液、荧光增强液；

所述分析缓冲液用于稀释和稳定所述镧系元素离子标记的抗狂犬病毒核蛋白单克隆抗体;

所述第一抗狂犬病毒核蛋白单克隆抗体采用杂交瘤细胞株F022制备而成，杂交瘤细胞株F022的保藏号为CCTCC NO:C201244；所述第二抗狂犬病毒核蛋白单克隆抗体采用杂交瘤细胞株F028制备而成，杂交瘤细胞株F028的保藏号为CCTCC NO:C201245。

2.如权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于：所述分析缓冲液由50mmol/L Tris-HCl、 1.5% PEG6000、 0.2% BSA、 0.1% Proclin300、 0.02% 牛IgG、 0.1% Tween 20和0.84% NaCl组成，pH为7.8；所述洗涤液由1.25mmol/L Tris-HCl、2.5% Tween 20和21%NaCl组成，pH为7.8，使用时稀释25倍。

3.如权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于：所述荧光增强液含有β-二酮类化合物或芳香胺类化合物。

4.如权利要求3所述的检测试剂盒，其特征在于：所述荧光增强液由β-二酮体、三辛基氧化磷、Triton X-200、醋酸和邻苯二甲酸氢钾组成，pH 为2. 0～3. 2。

5.如权利要求1到4任一项所述的检测试剂盒，其特征在于：所述镧系元素离子为Eu³⁺、Tb³⁺、Sm³⁺、Dy³⁺中的至少一种。

6.一种制备如权利要求1所述的狂犬病毒核蛋白时间分辨免疫荧光检测试剂盒的方法，其特征在于包括如下步骤：

d.配制分析缓冲液、洗涤液、荧光增强液。

7.如权利要求6所述的制备狂犬病毒核蛋白时间分辨免疫荧光检测试剂盒的方法，其特征在于：步骤b所述的第二抗狂犬病毒核蛋白单克隆抗体与所述镧系元素离子的质量比为5:1。

8.如权利要求6所述的制备狂犬病毒核蛋白时间分辨免疫荧光检测试剂盒的方法，其特征在于：对步骤b中镧系元素离子标记的第二抗狂犬病毒核蛋白单克隆抗体进行纯化，并稀释至选择线性较好、灵敏度较低的稀释度。