CN103153302A

CN103153302A - 针对用于治疗疾病的mdm2抑制剂的生物标记

Info

Publication number: CN103153302A
Application number: CN2011800285960A
Authority: CN
Inventors: S.王; S.马利克; J.龙; P.维利特
Original assignee: University of Michigan
Current assignee: University of Michigan
Priority date: 2010-04-09
Filing date: 2011-04-05
Publication date: 2013-06-12
Also published as: EP2563360A4; RU2012147597A; AR080872A1; WO2011127058A8; AU2011237782A1; WO2011127058A2; MX2012011600A; SG184288A1; US20110251252A1; TN2012000450A1; KR20130050938A; CA2800519A1; WO2011127058A9; JP2013523820A; IL222234A0; EP2563360A2

Abstract

本发明提供对患有白血病的受试者进行选择和治疗的方法，其中由于受试者的细胞含有FLT3-ITD突变而选择所述受试者进行治疗并用MDM2抑制剂治疗。

Description

针对用于治疗疾病的MDM2抑制剂的生物标记

对相关申请的交叉引用

本申请要求2010年4月9日提交的在审美国临时专利申请61/322,592和2011年3月11日提交的在审美国临时专利申请61/451,956的优先权，将其全部内容引入到本申请中作为参考。

技术领域

本申请提供用MDM2抑制剂对患有白血病的受试者进行鉴别和治疗的方法。

背景技术

进攻型癌细胞表型是导致细胞内信号传导途径失调的多种遗传变异和后生变异的结果。然而，所有癌细胞的共同点是它们不能执行细胞凋亡程序且由于正常细胞凋亡机制的缺陷而导致的适当细胞凋亡的缺乏是癌症的标志。因此，癌细胞由于正常细胞凋亡机制的缺陷而不能执行细胞凋亡程序的性质通常与对化学疗法、放射疗法或免疫疗法所引起的细胞凋亡的抗性增加相关。不同原因的人类癌症由于细胞凋亡缺陷而对目前治疗方案的原发性或获得性抗性是目前癌症疗法中的主要问题。因此，目前和将来的努力方向是设计和开发新的分子靶标特异性抗癌疗法以提高癌症患者的存活和生命质量，所述努力必须包括以下策略：特异性地靶向于癌细胞对细胞凋亡的抗性。就此而言，靶向于在直接抑制癌细胞的细胞凋亡中发挥核心作用的关键负性调节蛋白，这代表了新的抗癌药物设计中非常有前景的治疗策略。

p53肿瘤抑制基因在控制细胞周期进程和细胞凋亡中发挥核心作用且其是抗癌药物设计中引人关注的治疗靶标，这是因为其肿瘤抑制基因活性可被刺激以消灭癌细胞(Vogelstein等人,Nature 408:307(2000))。刺激p53活性的方法如下进行：使用非肽小分子抑制剂对p53与蛋白质MDM2的相互作用进行抑制。MDM2和p53是自调节反馈回路中的一部分且MDM2被p53所转录激活，然后MDM2通过至少三种机制来抑制p53的活性(Wu等人,Genes Dev.7:1126(1993)。第一种机制，MDM2蛋白直接与p53反式激活域结合并由此抑制p53所介导的反式激活。第二种机制，MDM2蛋白含有核输出信号序列且一经与p53结合即诱导p53的核输出，这阻止p53与所靶向的DNA结合。第三种机制，MDM2蛋白是E3泛素连接酶且一经与p53结合即能够促进p53的降解。因此，MDM2通过作为p53活性的强效内源性细胞抑制剂而发挥作用来有效地抑制p53所介导的细胞凋亡、细胞周期停滞和DNA修复。因此，与MDM2结合并阻断MDM2和p53之间的相互作用的小分子抑制剂可在具有功能性p53的细胞中促进p53的活性并刺激p53所介导的细胞作用例如细胞周期停滞、细胞凋亡或DNA修复(Chene,Nat.Rev.Cancer 3:102(2003)；Vassilev等人,Science 303:844(2004))。

目前正在寻求设计靶向于p53-MDM2相互作用的非肽小分子抑制剂，其是抗癌药物设计中引人关注的策略(Chene,Nat.Rev.Cancer 3:102(2003)；Vassilev等人,Science 303:844(2004))。已通过X射线晶体学确定了该相互作用的结构基础(Kussie等人,Science 274:948(1996))。

fms样酪氨酸激酶(FTL3)是造血***所涉及的第III类受体酪氨酸激酶(RTK)中的一种蛋白质(Rosnet,O.等人,Genomics 9:380-385(1991))。RTK在结构上具有含有五个免疫球蛋白样结构域的胞外区、一个近膜区(JM结构域)、被激酶***域(KI结构域)所间隔的两个酪氨酸结构域(TK1和TK2)和C-末端结构域。FLT3的配体由骨髓中的基质细胞表达且以膜结合形式或可溶性形式存在。该配体独立地或与其它细胞因子一起刺激干细胞(Hannum,C.等人,Nature 368:643-648(1994))。因此，FL和FLT3之间的配体-受体相互作用被认为在造血***中发挥重要作用。通过FLT3抑制剂FI-700对突变体FLT3进行的抑制和同时通过MDM2抑制剂Nutlin-3对p53进行的激活所实现的细胞凋亡作用已被报道(Kojima,K.等人,Leukemia 24:33-43(2010))。

在来自患有急性髓细胞性白血病(AML)或急性淋巴细胞性白血病(ALL)的患者的大多数样本中观察到高水平的FLT3表达。在患有慢性髓细胞性白血病(CML)的患者中也发现高水平的FLT3表达。已知与AML细胞相比，FL较显著地刺激AML细胞的增殖(Piacibello,W.等人,Blood86:4105-4114(1995))。

在AML患者中发现FLT3的体细胞突变(Nakao,M.等人,Leukemia10:1911-1918(1996))。就这些突变体而言，在FLT3基因对JM结构域进行编码的区域中发现内部串联重复(ITD)。重复的序列主要含有外显子11/12(现为外显子14-15)和内含子20(尽管每种样品在长度上是变化的)且它们通常具有延长的JM结构域，而延长的JM结构域由于延长的框内可读框而在蛋白质中是可翻译的。在23%的AML患者中发现FLT3内部串联重复(FLT3-ITD)突变(Kottaridis,P.D.等人,Blood 98:1752(2010))。

成人AML中的治疗结果仍不是令人满意的且需要新颖的治疗方法来改善患病患者的预后。一种有前景的方法涉及通过使用对p53与MDM2的结合产生干扰的药物(MDM2抑制剂)对p53进行化学激活即一种诱导癌细胞凋亡的非遗传毒性方法。直接对p53与MDM2的结合产生干扰的多种化合物包括已开发出来的Nutlin类和MI系列的MDM2抑制剂(Shangary,S.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.105:3933-3938(2008)；Vassilev,L.T.,Trends Mo.lMed.13:23-31(2007)；Vassilev，L.T.等人,Science 303:844-848(2004)；Ding,K.等人,J.Med.Chem.49:3432-34352006；和Shangary,S.等人,Clin.Cancer Res.14:5318-5324(2008))。目前可得到的证据表明，通过用Nutlin类或MI系列化合物抑制MDM2而对p53进行的诱导导致p53蛋白质水平的升高，随后导致p53所介导的细胞凋亡或p53/p21所介导的细胞周期停滞(Vassilev,L.T.等人,Science 303:844-848(2004)；Kruse,J.P.等人,Cell.137:609-622(2009)；Haupt,Y.等人,Nature 387:296-299(1997)；Kubbutat,M.H.等人,Nature387:299-303(1997)；和Kussie,P.H.等人,Science 274:948-953(1996))。

非癌细胞由于在很大程度上仍是未知的原因而对MDM2抑制剂所介导的细胞凋亡是相对具有抗性的并通常经历短暂的细胞周期停滞(Secchiero,P.等人,Blood(2006)；Stuhmer,T.等人,Blood 106:3609-3617(2005))。同样不清楚的是各种p53网络/效应子分子的性质及其对MDM2抑制剂所诱导的细胞凋亡的确切贡献，因此仍不知晓单独的p53效应子基因或信号传导途径对于发生MDM2抑制剂所诱导的细胞凋亡是否是绝对必需的(Kruse,J.等人,Cell137:609-622(2009)；Tovar,C.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.103:1888-1893(2006)；Levine,A.J.等人,Nat.Rev.Cancer 9:749-758(2009)；Villunger,A.等人,Science 302:1036-1038(2003)；Shibue,T.等人,Genes Dev.17:2233-2238(2003))。

已提供证据表明在MDM2抑制剂所诱导的细胞凋亡中涉及内在和外在的细胞凋亡途径及p53蛋白对线粒体细胞凋亡分子具有直接作用且因此可能的是，MDM2抑制剂所介导的细胞凋亡在功能上利用冗余的细胞凋亡途径(Vaseva,A.V.等人,Cell Cycle 8:1711-1719(2009)；Morselli,E.等人,CellCycle 8:1647-1648(2009)；Du,W.等人,J.Biol.Chem.284:26315-26321(2009)；Kojima,K.等人,Blood 108:993-1000(2006)；Kojima,K.等人,Blood106:3150-3159(2005)；Vousden,K.H.等人,Cell 137:413-431(2009)；Saddler,C.等人,Blood 111：1584-1593(2008))。

在多种细胞***中就对MDM2抑制剂的抗性机制进行的研究已表明，完整的p53对于发生MDM2抑制剂所诱导的细胞凋亡可能是必需的(Secchiero,P.等人,Blood 107:4122-4129(2006)；Saddler,C.等人,Blood111:1584-1593(2008)；Coll-Mulet,L.等人,Blood 107:4109-4114(2006))。不大清楚的是，野生型p53状态以什么样的频率和在什么样的细胞环境下足以独自作为敏感性的预测因子或其它什么样的敏感性/抗性决定因素是可操控的(Secchiero,P.等人,Blood 113:4300-4308(2009)；Kitagawa,M.等人,Oncogene27:5303-5314(2008)；Kitagawa,M.等人,Mol.Cell.29:217-231(2008))。p53所介导的细胞凋亡的两种可能调节子是MDM2和MDMX且高水平的这些蛋白质已被证实在多种实验条件下影响MDM2抑制剂敏感性。然而，支持这些蛋白质的关键作用的可用证据既不是结论性的且在各个实验***之间也不是一致的，因此仍可能的是，这些p53调节分子就MDM2抑制剂在所有人类肿瘤中的有效性而言不是关键的决定因素(Laurie,N.A.等人,Nature444:61-66(2006)；Hu,B.等人,J.Biol.Chem.281:33030-33035(2006)；Francoz,S.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.103:3232-3237(2006))。

仍需要能够预测哪些白血病患者可能受益于MDM2抑制剂疗法。

发明内容

本申请提供对人类受试者进行选择以治疗白血病的方法。在一些实施方案中，所述方法包括(a)确定所述受试者的细胞是否含有FLT3-ITD突变，和(b)若所述细胞含有所述突变，则选择所述受试者以治疗白血病。

本申请还提供治疗白血病的方法。在一些实施方案中，所述方法包括向患有白血病的人类受试者给药MDM2抑制剂，其中所述受试者的细胞含有FLT3-ITD突变。

本申请还提供对人类受试者进行选择以治疗白血病的方法。在一些实施方案中，所述方法包括测试所述受试者的细胞是否存在FLT3-ITD突变。

本申请还提供在患有白血病的人类受试者中预测治疗结果的方法。在一些实施方案中，向具有FLT3-ITD突变的受试者给药MDM2抑制剂将在所述受试者中增加产生有利治疗应答的可能性。

附图说明

图1A和1B为线形图，其描绘了AML胚细胞对MDM2抑制剂MI-219(图1A)和MI-63(图1B)的抗性。通过阴性选择将109个(MI-219)和60个(MI-63)AML样品富集至胚细胞纯度>90%且与各种浓度的MI-219或MI-63一起孵育40小时。准备样品以供膜联蛋白-V和PI染色且通过流式细胞仪来分析并通过与未经处理的对照等分液进行比较来计算每种浓度下剩余的活的和非凋亡的细胞分数。A.MI-219测定结果。红色：p53序列突变体；绿色：缺乏p53mRNA的病例；黑色：野生型p53状态。B.MI-63测定结果。红色：p53序列突变体；绿色：缺乏p53mRNA的病例；黑色：野生型p53状态。

图2为线形图，其描绘了19种AML细胞系对MI-219的敏感性。

图3A和3B为免疫印迹，其描绘了用MI-219、Nutlin-3或外部照射处理后原发性AML胚细胞中野生型和突变型p53的水平。通过阴性选择对AML胚细胞进行纯化并不经处理或用MI-219(5μM)或Nutlin-3(5μM)处理8小时或用一次外部照射(5Gy)进行处理。8小时后，将细胞溶解并通过SDS-PAGE对蛋白质进行分级。每份凝胶还负载有MOLM 13AML细胞系溶胞产物的等分液作为内标(负载量分别为1.25、2.5和5μg经MI-219处理的溶胞产物或5μg未经处理的溶胞产物(UT))。将蛋白质转移到膜上并准备以供用抗p53和抗肌动蛋白抗体进行免疫印迹。将针对二者即p53和肌动蛋白的膜一起显影。MI-219的IC₅₀值示于括号内。

图4A和4B为点形图，其描绘了用MI-219处理的AML胚细胞中MDM2mRNA(图4A)和MDMX mRNA(图4B)的水平。在由经FACS分类的AML胚细胞的RNA制备的cDNA中测量MDM2mRNA和MDMX mRNA的归一化表达水平。显示了ΔCt值(Ct平均MDM2或MDMX-Ct平均PGK1)，其如所示那样按MI-219IC₅₀值来分组。红色菱形表示具有突变的p53的AML胚细胞。

图5A和5B为免疫印迹，其描绘了AML患者口腔样品(图5A)和胚细胞样品(图5B)中的p53水平。图5C为LOH分析。图5D为描述p53突变分析的表格。图5E为点形图，其通过QPCR而描绘了p53的表达。将通过使用Affymetrix Program Genotyping Console针对所有患者而生成的文档输入到使用软件工具PLUT的LOH工具(版本2)中且将口腔DNA和所配对的肿瘤DNA之间所有单独的LOH位置绘制为跨越染色体长度的蓝色记号标记。如所述那样通过dChipSNP来得到就所有患者的所有SNP位置所进行的拷贝数估计且表示为跨越染色体的长度。拷贝的丢失用蓝色表示，拷贝的增加用红色表示。A和B：染色体拷贝数在17p的变化的基于SNP 6.0阵列绘图的热图显示。蓝色：拷贝丢失；红色：拷贝增加。A：口腔DNA；B：AML胚细胞DNA。C：在17p对所配对的胚细胞和口腔DNA进行比较的LOH分析。红色编号：拷贝中性LOH(获得性单亲二体)；黑色：拷贝丢失的LOH。D：p53外显子5-9突变分析结果。E：AML胚细胞中经归一化的p53mRNA表达，其如所示那样按MI-219IC₅₀来分组。红色菱形表示具有突变的p53的AML胚细胞。

图6为点形图，其描绘了具有各种p53突变的AML胚细胞对MDM2抑制剂MI-219的敏感性。MI-219IC₅₀值的显示如下分类：1)p53突变状态，ii)存在FLT3-ITD，和iii)所有其它病例。平均IC₅₀值在FLT3-ITD+和所有其它病例之间的差异是显著的(p=0.02)。

具体实施方式

大多数患有急性髓性白血病(AML)的患者的存活仍是很差的且需要新颖的治疗方法来改善结果。本申请描述了就白血病细胞对MDM2抑制剂的敏感性而言进行详细表征的结果。在一个实施方案中，所述白血病为急性淋巴细胞性白血病(ALL)。在一个实施方案中，所述白血病为慢性髓细胞性白血病(CML)。在另一个实施方案中，所治疗的白血病为急性髓细胞性白血病(AML)。

本申请使用的术语“急性髓细胞性白血病(AML)”和“急性髓性白血病”是同义的。

在另一个实施方案中，所述急性髓细胞性白血病为M0型(分化甚微的急性成髓细胞性白血病)。在另一个实施方案中，所述急性髓细胞性白血病为M1型(急性成髓细胞性白血病且不伴有成熟)。在另一个实施方案中，所述急性髓细胞性白血病为M2型(急性成髓细胞性白血病且伴有粒细胞成熟)。在另一个实施方案中，所述急性髓细胞性白血病为M3型(早髓细胞性或急性早髓细胞性白血病)。在另一个实施方案中，所述急性髓细胞性白血病为M4型(急性髓单核细胞性白血病)。在另一个实施方案中，所述急性髓细胞性白血病为M4eo型(髓单核细胞性白血病且伴有骨髓嗜酸性粒细胞增多)。在另一个实施方案中，所述急性髓细胞性白血病为M5a型(急性成单核细胞性白血病)。在另一个实施方案中，所述急性髓细胞性白血病为M5b型(急性单核细胞性白血病)。在另一个实施方案中，所述急性髓细胞性白血病为M6型(急性红细胞性白血病)。在另一个实施方案中，所述急性髓细胞性白血病为M6a型(红白血病)。在另一个实施方案中，所述急性髓细胞性白血病为M6b型(非常罕见的红细胞性白血病)。在另一个实施方案中，所述急性髓细胞性白血病为M7型(急性成巨核细胞性白血病)。在另一个实施方案中，所述急性髓细胞性白血病为M8型(急性嗜碱性粒细胞性白血病)。在另一个实施方案中，所述急性髓细胞性白血病为急性嗜碱性粒细胞性白血病。在另一个实施方案中，所述急性髓细胞性白血病为急性嗜酸性粒细胞性白血病。在另一个实施方案中，所述急性髓细胞性白血病为肥大细胞性白血病。在另一个实施方案中，所述急性髓细胞性白血病为急性髓树突细胞性白血病。在另一个实施方案中，所述急性髓细胞性白血病为急性全骨髓增生伴有骨髓纤维化。在另一个实施方案中，所述急性髓细胞性白血病为髓样肉瘤。

在一个实施方案中，所述细胞为白血病细胞。在另一个实施方案中，所述细胞为急性髓细胞性白血病细胞。

在一个方面，本发明涉及用于白血病患者的个体化给药方案且包括针对个体白血病患者选择最有可能得到成功结果的治疗选项。在另一个方面，本发明涉及在患有白血病的患者中使用对治疗结果(例如实现有利的应答或成功治疗的可能性)进行预测的测定。

本申请提供对患者(例如人类受试者)进行选择以用MDM2抑制剂治疗白血病的方法，所述方法包括由所述患者得到生物样品(例如血细胞)，测试来自所述患者的生物样品是否存在生物标记(例如具有激活突变的FLT3)，和若所述生物样品含有具有激活突变的FLT3，则选择所述患者进行治疗。在一个实施方案中，所述方法还包括若所述生物样品含有FLT3激活突变，则向所述患者给药治疗有效量的MDM2抑制剂。FLT3激活突变的实例包括例如FLT3-ITD(内部串联重复)和FTL3-KD(酪氨酸激酶结构域)突变。

本申请提供在患有白血病的患者中预测治疗结果的方法，所述方法包括由所述患者得到生物样品，测试来自所述患者的生物样品是否存在具有激活突变的FLT3，其中激活突变的检出表明所述患者将对给药治疗有效量的MDM2抑制剂产生有利的应答。有利的应答包括但不限于血液学应答，例如患者中血细胞即白细胞、红细胞和血小板计数的正常化(可通过简单的血液测试来检测)；细胞遗传学应答，例如患者中费城染色体阳性细胞数目的减少或消失(可通过标准实验室方法来检测)；和/或分子应答，例如患者中异常BCR-ABL蛋白数量的减少或消失(可通过PCR测定来检测)。

本申请提供治疗白血病的方法，所述方法包括向患有白血病的患者(例如人类受试者)给药治疗有效量的MDM2抑制剂，其中所述患者的细胞含有具有激活突变的FLT3。在一个实施方案中，在已确定所述患者的细胞含有FLT3-ITD突变后，选择所述患者以用MDM2抑制剂进行治疗。在一个实施方案中，对患有白血病的患者进行治疗的方法包括由所述患者得到生物样品，确定所述生物样品是否含有具有激活突变的FLT3，和若所述生物样品含有具有激活突变的FLT3，则向所述患者给药治疗有效量的MDM2抑制剂，例如表1中的化合物。

在另一个实施方案中，本申请提供的方法还包括确定所述患者的细胞是否含有p53突变。

本申请使用的术语“生物标记”是指可在患者体内或在由患者得到的样品中检测和/或定量的任意生物化合物，例如蛋白质、蛋白质片段、肽、多肽、核酸等。另外，生物标记可为完整无缺的分子或其可为所述分子的部分或片段。在一个实施方案中，对生物标记的表达水平进行测量。生物标记的表达水平可例如通过检测生物标记的蛋白质水平或RNA(例如mRNA)水平来测量。在一些实施方案中，生物标记的部分或片段可例如通过抗体或其它特异性结合试剂来检测或测量。在一些实施方案中，生物标记的可测量方面与患者的给定状态例如癌症的具体阶段相关。对于以蛋白质水平或RNA水平进行测量的生物标记，所述可测量方面可包括例如生物标记在患者或由所述患者得到的样品中的存在、缺乏或浓度(即表达水平)。对于以核酸水平进行检测的生物标记，所述可测量方面可包括例如生物标记的等位体或生物标记的突变类型、突变率和/或突变程度(在本申请中也称作突变状态)。

对于以蛋白质表达水平或RNA表达水平为基础进行检测的生物标记，例如若生物标记在不同组中的平均或中值表达水平经计算是统计学上显著的，则可认为在不同的表型状态之间测量到的表达水平是不同的。用于统计学显著性的常见检验包括t-检验、ANOVA、Kruskal-Wallis检验、Wilcoxon检验、Mann-Whitney检验、微阵列显著性分析、优势比等。单独或组合的生物标记提供了对受试者属于哪种表型状态的相对可能性的测量。因此，它们可尤其用作疾病的标志物和表明具体治疗性处置方案将可能带来有益患者结果的指标物。

在本发明一个实施方案中，所述生物标记为FLT3受体(在本申请中也称作FLT3)。在本发明一个实施方案中，所述FLT3受体的可测量方面为突变状态。在本发明一个实施方案中，所述突变状态为导致FLT3受体酪氨酸激酶活性增加和/或导致FLT3受体酪氨酸激酶组成性激活的一种突变状态。所述突变包括例如近膜结构域中的一个或多个内部串联重复(ITD)和/或酪氨酸激酶结构域(TKD)中的一种或多种突变。

因此，在本发明一些方面，所述生物标记为FLT3，与另一种表型状态(例如未患病的正常患者或患有癌症但不具有携带突变的细胞的患者)相比，所述FLT3差异性地存在于一种表型状态的受试者(例如患有癌症(例如白血病)且具有携带突变的细胞的患者)中。

除单独的生物化合物(例如FLT3或p53)外，本申请使用的术语“生物标记”还意在包括多种生物化合物的组或群。例如，FLT3和p53的组合可为生物标记。因此，“生物标记”可包含一种、两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种、十种、十五种、二十种、二十五种、三十种或更多种生物化合物。

生物标记在患者中的表达水平或突变状态可使用本领域已知的多种方法中的任意一种来确定。本领域已知用于在患者或生物样品中对特异性蛋白质进行定量和/或对FLT3和/或p53突变进行检测的任意方法可用在本发明方法中。实例包括但不限于PCR(聚合酶链反应)或RT-PCR、Northern印迹、Western印迹、ELISA(酶联免疫吸附测定)、RIA(放射免疫测定)、对RNA表达进行的基因芯片分析、免疫组织化学或免疫荧光(参见例如Slagle等人,Cancer 83:1401(1998))。本发明一些实施方案包括确定生物标记RNA表达(转录)的方法。本发明其它实施方案包括确定生物样品中蛋白质表达的方法。参见例如Harlow等人,Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring HarborLaboratory,Cold Spring Harbor,NY，(1988)和Ausubel等人,Current Protocols inMolecular Biology,John Wiley&Sons,New York 3rd Edition,(1995)。对于Northern印迹或RT-PCR分析，使用不含有RNA酶的技术从肿瘤组织样品中分离RNA。所述技术是本领域公知的。

当在患者体内进行定量时，蛋白质例如FLT3或其变体的表达水平可如下确定：给药与FLT3特异性结合的抗体(参见例如美国公开申请2006/0127945)并确定结合程度。所述抗体可用放射性同位素例如碳-11、氮-13、氧-15和氟-18可检测地标记。然后所述标记可通过正电子发射断层扫描术(PET)来检测。

在本发明一个实施方案中，由患者得到生物样品并对活检用样品中的细胞进行测定以确定生物标记的表达或突变状态。

在本发明一个实施方案中，PET成像用于确定生物标记的表达。

在本发明另一个实施方案中，对肿瘤细胞样品中生物标记的转录进行Northern印记分析。Northern分析是检测和/或定量样品中mRNA水平的标准方法。首先从样品中分离RNA以使用Northern印记分析进行测定。在所述分析中，首先RNA样品在琼脂糖凝胶中在变性条件下通过电泳按尺寸分离。然后将RNA转移到膜上，交联并用经标记的探针进行杂化。通常，Northern杂化涉及使经放射性或非同位素标记的DNA在体外发生聚合或产生寡核苷酸作为杂化探针。通常，承载RNA样品的膜在探针杂化前被预杂化或阻断以防止所述探针包覆所述膜，由此减小非特异性背景信号。杂化后，未杂化的探针通常通过在几种变化的缓冲液中进行洗涤来除去。洗涤和杂化条件的严格程度可由本领域技术人员来设计、选择和实施。使用经可检测地标记的探针和适当的检测方法来进行检测。经放射性标记和经非放射性标记的探针及其用途是本领域公知的。所测定的生物标记的存在和/或相对的表达水平可使用例如密度测定法来定量。

在本发明另一个实施方案中，生物标记的表达和/或突变状态使用RT-PCR来确定。RT-PCR允许实时检测目标基因的PCR扩增过程。设计对本发明生物标记的表达和/或突变状态进行检测所需要的引物和探针在本领域技术人员的知识范围内。RT-PCR可用于确定肿瘤组织样品中对本发明生物标记进行编码的RNA的水平。在本发明一个实施方案中，RNA在不含有RNA酶的条件下从生物样品中分离，然后通过用逆转录酶处理而转化成DNA。用逆转录酶将RNA转化成DNA的方法是本领域公知的。关于PCR的描述参见以下参考文献：Mullis等人,Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.51:263(1986)；EP 50,424；EP 84,796；EP 258,017；EP 237,362；EP 201,184；美国专利4,683,202；美国专利4,582,788；美国专利4,683,194。

RT-PCR探针取决于针对PCR所使用的DNA聚合酶的5’-3’核酸酶活性，其水解与目标扩增子(生物标记基因)杂化的寡核苷酸。RT-PCR探针为寡核苷酸，其具有与5’末端连接的荧光报道子染料和与3’末端连接的淬灭剂部分(或反之亦然)。这些探针被设计成与PCR产物的内部区域杂化。在未杂化的状态下，荧光分子与淬灭分子的邻近阻止对来自探针的荧光信号进行检测。在PCR扩增期间，当聚合酶对结合有RT-PCR探针的模板进行复制时，聚合酶的5’-3’核酸酶活性使探针裂解。这使荧光和淬灭染料解偶联且不再发生FRET。因此，在每个周期中，荧光按与探针裂解量成比例的方式增强。可使用商购设备和常规惯用技术来随时间测量和跟踪反应所发出的荧光信号。

在本发明另一个实施方案中，生物标记所编码的蛋白质的表达通过Western印迹分析来检测。Western印迹(也称作免疫印迹)是在所给定的组织匀浆或萃取物样品中检测蛋白质的方法。其使用凝胶电泳以按质量分离变性的蛋白质。然后将蛋白质从凝胶中转移出来并置于膜(例如硝基纤维素或聚偏氟乙烯(PVDF))上，其中使用与所述蛋白质特异性结合的第一抗体对它们进行检测。然后所结合的抗体通过缀合有可检测的标记(例如生物素、辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶)的第二抗体来检测。第二标记信号的检出表明所述蛋白质的存在。

在本发明另一个实施方案中，生物标记所编码的蛋白质的表达通过酶联免疫吸附测定(ELISA)来检测。在本发明一个实施方案中，“夹心式ELISA”包括板用捕捉抗体涂覆；加入样品，其中所存在的任意抗原与捕捉抗体结合；加入也与所述抗原结合的检测抗体；加入与检测抗体结合的酶联第二抗体；且加入底物，其被所述第二抗体上的酶转化成可检测的形式。来自第二抗体的信号的检出表明生物标记抗原蛋白的存在。

在本发明另一个实施方案中，生物标记的表达通过使用基因芯片或微阵列来评价。所述技术在本领域技术人员的知识范围内。

本申请使用的术语“生物样品”是指来自患者的适于对生物标记例如FLT3-ITD突变状态进行检测的任意组织或流体。有用的生物样品的实例包括但不限于活检用组织和/或细胞，例如实体瘤、淋巴腺、发炎组织、病症或疾病所涉及的组织和/或细胞、血液、血浆、浆液、脑髓液、唾液、尿液、淋巴、脑脊髓液等。其它适当的生物样品将是相关领域技术人员所熟悉的。可使用本领域已知的任意技术就生物标记的表达和/或突变对生物样品进行分析且生物样品可使用临床从业人员所公知的技术来得到。在本发明一个实施方案中，所述生物样品包括血细胞。

本申请使用的“MDM2抑制剂”是干扰MDM2活性的化合物。MDM2抑制剂是本领域技术人员公知的。例如，参见Shangary,S.等人,Annual ReviewOf Pharmacology and Toxicology 49:223-241(2009)；和Weber，L.ExpertOpinion On Therapeutic Patents 20:179-191(2010)。

在另一个实施方案中，MDM2抑制剂为螺-羟吲哚化合物。本申请使用的术语“螺-羟吲哚MDM2抑制剂”是指例如在美国专利申请61/260,685、61/263,662、61/413,094、61/451,968、11/360,485(US 2006/0211757A1)、11/848,089(US 2008/0125430A1)或12/945,511或国际专利申请PCT/US2006/0062(WO 2006/091646)或PCT/US2007/019128(WO2008/036168)中公开的化合物。在一个具体实施方案中，所述螺-羟吲哚MDM2抑制剂为表1中的化合物。在另一个具体实施方案中，所述螺-羟吲哚MDM2抑制剂为表2中的化合物。在以荧光极化为基础的生物化学结合测定中，就具有野生型p53的肿瘤细胞而言，表1中的化合物以高亲和力与人MDM2蛋白结合，有效地激活p53并诱导细胞生长抑制和细胞死亡。显著的是，这些化合物能够在人类癌症的异种移植物模型中抑制肿瘤生长，这表明这些化合物有希望成为新的抗癌药物。

表1

在另一个实施方案中，MDM2抑制剂为顺式-咪唑啉化合物。本申请使用的术语“顺式-咪唑啉MDM2抑制剂”是指例如在美国专利6,617,346、6,734,302、7,132,421、7,425,638或7,579,368或美国专利申请公开文本2005/0288287或2009/0143364中公开的化合物。顺式-咪唑啉MDM2抑制剂通常被称作“nutlin”。在一个具体实施方案中，所述顺式-咪唑啉为Nutlin-1、Nutlin-2或Nutlin-3(表3；参见Vassilev,L.T.等人,Science 303:844-848(2004))。

表3：Nutlin MDM2抑制剂

在另一个实施方案中，MDM2抑制剂为取代的哌啶化合物。本申请使用的术语“取代的哌啶MDM2抑制剂”是指例如在美国专利7,060,713或7,553,833中公开的化合物。

在另一个实施方案中，MDM2抑制剂为螺二氢吲哚酮化合物。本申请使用的术语“螺二氢吲哚酮MDM2抑制剂”是指例如在美国专利6,916,833、7,495,007或7,638,548中公开的化合物。

在另一个实施方案中，MDM2抑制剂为羟吲哚化合物。本申请使用的术语“羟吲哚MDM2抑制剂”是指例如在US 7,576,082中公开的化合物。

在另一个实施方案中，MDM2抑制剂为二苯基-二氢-咪唑并吡啶酮化合物。本申请使用的术语“二苯基-二氢-咪唑并吡啶酮MDM2抑制剂”是指例如在US 7,625,895中公开的化合物。

在另一个实施方案中，MDM2抑制剂为咪唑并噻唑化合物。本申请使用的术语“咪唑并噻唑MDM2抑制剂”是指例如在US 2009/0312310中公开的化合物。

在另一个实施方案中，MDM2抑制剂为脱氮黄素(deazaflavin)化合物。本申请使用的术语“脱氮黄素MDM2抑制剂”是指例如在美国专利申请公开文本2006/0211718或2010/0048593中公开的化合物。

在另一个实施方案中，MDM2抑制剂为苯并二氮杂

化合物。本申请使用的术语“苯并二氮杂

MDM2抑制剂”是指例如在US 2005/0227932中公开的化合物。

在另一个实施方案中，MDM2抑制剂为异二氢吲哚-1-酮化合物。本申请使用的术语“异二氢吲哚-1-酮MDM2抑制剂”是指例如在US 2008/0261917中公开的化合物。

在另一个实施方案中，MDM2抑制剂为硼酸。本申请使用的术语“硼酸MDM2抑制剂”是指例如在美国专利申请公开文本2009/0227542或2008/0171723中公开的化合物。

在另一个实施方案中，MDM2抑制剂为肽或多肽。本申请使用的术语“肽类MDM2抑制剂”是指例如在US 7,083,983、US 2006/0211757A1、US2005/0137137、US 2002/0132977、US 2009/0030181或WO 2008/106507中公开的化合物。

在另一个实施方案中，MDM2抑制剂为在以下任意一篇文献中公开的化合物：Shangary,S等人,Proc.Natl.Acad.Sci.U S A.105:3933-3938(2008)；Vassilev,L.T.,Trends Mol.Med.13:23-31(2007)；Vassilev,L.T.等人,Science303:844-848(2004)；Ding,K.等人,J.Med.Chem.49:3432-34352006；Shangary,S.等人,Clin.Cancer Res.14:5318-5324(2008)；Chene,P.,Molecular CancerResearch 2:20-28(2004)；Pazgier等人,Proc.Natl.Acad.Sci.U S A.106:4665-4670(2009)；US 2008/0280769；US 008/0039472；US 2009/0149493；或US 2004/0171035。

在另一个实施方案中，MDM2抑制剂为在以下任意一篇文献中公开的化合物：WO 2009/151069A1；WO 2009/037343A1(美国申请12/678,680)；WO 2008/125487A1(美国专利7,625,895)；WO 2008/119741A2(美国申请12/593,721)；和WO 2009/156735A2。

在一个具体实施方案中，MDM2抑制剂为式I化合物：

其中

R^1a、R^1b、R^1c和R^1d独立选自氢、卤素、羟基、氨基、硝基、氰基、烷氧基、芳基氧基、任选取代的烷基、卤代烷基、任选取代的环烷基、任选取代的烯基、任选取代的环烯基、任选取代的芳基、任选取代的杂芳基、氨甲酰基和氨磺酰基；

R²选自任选取代的芳基和任选取代的杂芳基；

R³选自任选取代的烷基、任选取代的(环烷基)烷基、任选取代的环烷基、任选取代的烯基、任选取代的环烯基、任选取代的芳基和任选取代的杂芳基；

R⁴选自氢和任选取代的烷基；

R⁵为氢、任选取代的烷基[包括但不限于羟基烷基、二羟基烷基、(环烷基)烷基和(杂环基)烷基]、任选取代的环烷基、任选取代的杂环基或

其中

R^6a和R^6b各自独立选自氢和任选取代的C₁-C₆烷基；

R⁷选自氢、任选取代的C₁-C₆烷基和任选取代的环烷基；

R^8a和R^8b各自独立选自氢、任选取代的C₁-C₆烷基和任选取代的环烷基；或

R^8a和R^8b与它们所连接的碳一起形成3至8元任选取代的环烷基；

W¹选自-OR^9a和-NR^9bR^9c；

R^9a为氢；

R^9b选自氢、任选取代的烷基、任选取代的环烷基、任选取代的芳基、任选取代的杂芳基、-SO₂R^9d和-CONR^9eR^9f；

R^9c选自氢、任选取代的烷基、任选取代的环烷基、任选取代的芳基和任选取代的杂芳基；或

R^9b和R^9c与它们所连接的氮原子一起形成4至8元任选取代的杂环基；

R^9d选自任选取代的烷基和任选取代的环烷基；

R^9e和R^9f各自独立选自氢、任选取代的烷基和任选取代的环烷基；或

R^9e和R^9f与它们所连接的氮原子一起形成4至8元任选取代的杂环基；

W²选自-OR¹⁰和-NR^11aR^11b；

R¹⁰为氢；或

R^9a和R¹⁰中的一个为氢且另一个为可代谢裂解的基团；

R^11a选自氢、任选取代的烷基、任选取代的环烷基、任选取代的芳基、任选取代的杂芳基、-SO₂R^11c和-CONR^11dR^11e；

R^11b选自氢、任选取代的烷基、任选取代的环烷基、任选取代的芳基和任选取代的杂芳基；或

R^11a和R^11b与它们所连接的氮原子一起形成4至8元任选取代的杂环基；

R^11c选自任选取代的烷基和任选取代的环烷基；

R^11d和R^11e各自独立选自氢、任选取代的烷基和任选取代的环烷基；或

R^11d和R^11e与它们所连接的氮原子一起形成4至8元任选取代的杂环基；

n为1、2、3、4或5；

R^12a、R^12b、R^12c和R^12d各自独立选自氢和任选取代的C₁-C₆烷基；

R¹³选自氢和任选取代的C₁-C₆烷基；

R¹⁴选自氢、任选取代的C₁-C₆烷基和任选取代的环烷基；

Z选自-OR¹⁵和-NR^16aR^16b；或

Z和R¹⁴一起形成羰基即C=O基团；

R¹⁵选自氢和可代谢裂解的基团；

R^16a选自-SO₂R^16c和-CONR^16dR^16e；

R^16b选自氢和任选取代的烷基；

R^16c选自任选取代的烷基、任选取代的环烷基、任选取代的芳基和任选取代的杂芳基；

R^16d和R^16e各自独立选自氢、任选取代的烷基、任选取代的环烷基、任选取代的芳基和任选取代的杂芳基；或

R^16d和R^16e与它们所连接的氮原子一起形成4至8元杂环基；

o为1、2或3；

p为0、1、2或3；

R^17a、R^17b、R^17c和R^17d各自独立选自氢和任选取代的C₁-C₆烷基；

R¹⁸选自氢和任选取代的C₁-C₆烷基；

R¹⁹选自氢、任选取代的C₁-C₆烷基和任选取代的环烷基；

R²⁰选自氢、任选取代的C₁-C₆烷基和任选取代的环烷基；

R^21a和R^21b各自为氢；或

R^21a和R^21b中的一个为氢且另一个为可代谢裂解的基团；

q为0、1、2或3；

r为1、2或3；

R^22a、R^22b、R^22c和R^22d各自独立选自氢和任选取代的C₁-C₆烷基；

R²³选自氢和任选取代的C₁-C₆烷基；

R²⁴选自-SO₂R^24a和-CONR^24bR^24c；

R^24a选自任选取代的烷基、任选取代的环烷基、任选取代的芳基和任选取代的杂芳基；

R^24b和R^24c各自独立选自氢、任选取代的环烷基、任选取代的芳基和任选取代的杂芳基；或

R^24b和R^24c与它们所连接的氮原子一起形成4至8元杂环基；

s和t各自独立为1、2或3；

X选自O、S和NR’；

Y选自O、S和NR”；

R’选自氢、任选取代的烷基、芳烷基和任选取代的环烷基；和

R”选自氢、任选取代的烷基、芳烷基和任选取代的环烷基；或

R⁴和R⁵与它们所连接的氮一起形成4至8元任选取代的杂环基；

或其立体异构体、药用盐、溶剂化物或前药。

在另一个具体实施方案中，MDM2抑制剂为式II化合物或其药用盐、溶剂化物或前药：

其中R^1a、R^1b、R^1c、R^1d、R²、R³、R⁴、R⁵、X和Y具有以上就式I所述的含义。

在另一个具体实施方案中，MDM2抑制剂为式II化合物，其中

X和Y各自为NH；

R^1a、R^1b、R^1c和R^1d各自独立选自氢、氯和氟；

R²为苯基，其任选取代有氯或氟；

R³为C₁-C₆烷基；

R⁴为氢；和

R⁵选自：

包括其立体异构体例如对映异构体，其中

R⁷选自氢和任选取代的C₁-C₄烷基；

R^9a和R¹⁰各自为氢；或

R^9a和R¹⁰中的一个为氢且另一个为可代谢裂解的基团；

R^9d选自任选取代的烷基和任选取代的环烷基；

R^11c选自任选取代的烷基和任选取代的环烷基；

R¹⁴选自氢、C₁-C₄烷基或C₃-C₆环烷基；

R¹⁵为氢或可代谢裂解的基团；

R^16a选自-SO₂R^16c和-CONR^16dR^16e；

R^16b选自氢和任选取代的烷基；

R^16d和R^16e与它们所连接的氮原子一起形成4至8元杂环基；

R¹⁹选自氢、任选取代的C₁-C₆烷基和任选取代的环烷基；

R²⁰选自氢、任选取代的C₁-C₆烷基和任选取代的环烷基；

R^21a和R^21b各自为氢；或

R^21a和R^21b中的一个为氢且另一个为可代谢裂解的基团；

R²⁴选自-SO₂R^24a和-CONR^24bR^24c；

R^24a选自任选取代的烷基、任选取代的环烷基、任选取代的芳基和任选取代的杂芳基；和

R^24b和R^24c各自独立选自氢、任选取代的环烷基、任选取代的芳基和任选取代的杂芳基，或

R^24b和R^24c与它们所连接的氮原子一起形成4至8元杂环基；

或其药用盐、溶剂化物或前药。

在一个具体实施方案中，MDM2抑制剂为选自以下的化合物：

在另一个具体实施方案中，MDM2抑制剂为式IIa化合物或其药用盐、溶剂化物或前药：

其中R^1a、R^1b、R^1c、R^1d、R²、R³、R⁴、R⁵、X和Y具有与以上就式I所述相同的含义。

在另一个具体实施方案中，MDM2抑制剂为式IIa化合物，其中

R^1a、R^1b、R^1c和R^1d各自独立选自氢、氟和氯；

R²为：

其中

R^25a、R^25b、R^25c、R^25d和R^25e各自独立选自氢、氟和氯；

R³为任选取代的C₁-C₈烷基；

R⁴选自氢和任选取代的C₁-C₆烷基；

R⁵选自：

其中

R¹⁴选自氢和任选取代的C₁-C₄烷基；

X选自O、S和NR’；

Y选自O、S和NR”；

R’选自氢和任选取代的C₁-C₄烷基；和

R”选自氢和任选取代的C₁-C₄烷基；

其中所述化合物基本不含有一种或多种其它立体异构体；

或其药用盐、溶剂化物或前药。

在另一个具体实施方案中，MDM2抑制剂为式IIa化合物或其药用盐、溶剂化物或前药，其中R⁴为氢。

在另一个具体实施方案中，MDM2抑制剂为式IIa化合物或其药用盐、溶剂化物或前药，其中X为NH。

在另一个具体实施方案中，MDM2抑制剂为式IIa化合物或其药用盐、溶剂化物或前药，其中Y为NH。

在另一个具体实施方案中，MDM2抑制剂为式IIa化合物或其药用盐、溶剂化物或前药，其中R³为-CH₂C(CH₃)₃。

在另一个具体实施方案中，MDM2抑制剂为式IIa化合物或其药用盐、溶剂化物或前药，其中R⁵选自：

在另一个具体实施方案中，MDM2抑制剂为式IIa化合物或其药用盐、溶剂化物或前药，其中

R^1a为氢；

R^1b、R^1c和R^1d各自独立选自氢、氟和氯；

R³为C₄-C₈烷基；

R⁴为氢；

R⁵选自：

X和Y为NH。

在另一个具体实施方案中，MDM2抑制剂选自：

或其药用盐、溶剂化物或前药。

在另一个具体实施方案中，MDM2抑制剂为：

或其药用盐、溶剂化物或前药。

在一个具体实施方案中，MDM2抑制剂为在US 6,734,302中描述的任意一种抑制剂。例如，MDM2抑制剂为式III化合物或其药用盐或酯：

其中

R为-C=OR¹；

其中R¹选自C₁-C₄烷基、-C=CHCOOH、-NHCH₂CH₂R²、-N(CH₂CH₂OH)CH₂CH₂OH、-N(CH₃)CH₂CH₂NHCH₃、-N(CH₃)CH₂CH₂N(CH₃)CH₃、4、5和6元饱和环及含有至少一个选自S、N和O的杂原子并任选取代有选自以下的基团的5和6元饱和和不饱和环，所述基团为低级烷基、-C=O-R⁵、-OH、取代有羟基的低级烷基、取代有-NH2的低级烷基、N-低级烷基、-SO₂CH₃、=O、-CH₂C=OCH₃和含有至少一个选自S、N和O的杂原子的5和6元饱和环；

其中R⁵选自H、低级烷基、-NH₂、-N-低级烷基、取代有羟基的低级烷基和取代有NH₂的低级烷基；

其中R²选自-N(CH₃)CH₃、-NHCH₂CH₂NH₂、-NH₂、吗啉基和哌嗪基；

X₁、X₂和X₃独立选自-OH、C₁-C₂烷基、C₁-C₅烷氧基、-Cl、-Br、-F、-CH₂OCH₃和-CH₂OCH₂CH₃；或

X₁、X₂或X₃中的一个为H且另两个独立选自羟基、低级烷基、低级烷氧基、-Cl、-Br、-F、-CF₃、-CH₂OCH₃、-CH₂OCH₂CH₃、-OCH₂CH₂R³、-OCH₂CF₃和-OR⁴；或

X₁、X₂或X₃中的一个为H且另两个与来自它们所取代的苯环中的两个碳原子及其之间的键一起形成5或6元饱和环，所述5或6元饱和环含有至少一个选自S、N和O的杂原子，其中R³选自-F、-OCH₃、-N(CH₃)CH₃及含有至少一个选自S、N和O的杂原子的5和6元不饱和环；

其中R⁴为3至5元饱和环；和

Y₁和Y₂各自独立选自-Cl、-Br、-NO₂、-C≡N和-C≡CH。

在一个具体实施方案中，MDM2抑制剂为选自以下的化合物：

包括其立体异构体例如对映异构体。

在一个具体实施方案中，MDM2抑制剂为在WO 2009/156735A2中描述的任意一种抑制剂。例如，MDM2抑制剂为式IV或V化合物或其药用盐：

其中在式IV和V中：

X选自O、N或S；

R¹选自氢、取代或未取代的烷基、取代或未取代的羟基烷基、取代或未取代的烷基胺、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、取代或未取代的芳烷基和取代或未取代的杂芳烷基；

R²选自氢、取代或未取代的烯基、取代或未取代的炔基、取代或未取代的支链羟基烷基、取代或未取代的具有6个或更多个环碳原子的环烷基、取代或未取代的环烯基、羟基烷基芳烷基、羟基烷基杂芳烷基和含有羧酸的基团；

R³选自氢、取代或未取代的烷基、取代或未取代的羟基烷基、取代或未取代的烷基胺、取代或未取代的烷氧基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、取代或未取代的芳烷基和取代或未取代的杂芳烷基；和

R⁴-R⁷表示基团R⁴、R⁵、R⁶和R⁷，其独立选自氢、卤素、羟基、取代或未取代的烷基、取代或未取代的羟基烷基、取代或未取代的烯基、取代或未取代的炔基、取代或未取代的杂芳基、取代或未取代的杂芳烷基、取代或未取代的烷基胺、取代或未取代的烷氧基、三氟甲基、氨基、硝基、羧基、羰基甲基砜、三氟甲基砜、氰基和取代或未取代的氨磺酰基；

其中当R²为取代或未取代的支链羟基烷基时，X为O或S；和

其中当R²为氢时，R⁴-R⁷中的至少一个不是氢且R³不是苯并咪唑衍生物或苯并咪唑啉衍生物；和其中在式V中，所述6元环可具有0、1或2个C=C双键。

在一个具体实施方案中，MDM2抑制剂为在WO 2009/1511069A1中描述的任意一种抑制剂。例如，MDM2抑制剂为式VI化合物或其药用盐：

取代基的可能实例包括其中

Ar₁和Ar₂各自独立选自任选取代的芳基和任选取代的杂芳基；

R¹选自氢、任选取代的烷基和-COR^1a；

R^1a选自氢、任选取代的烷基、任选取代的环烷基和任选取代的芳基；

R²和R³各自独立选自氢和任选取代的烷基；或

R²和R³一起形成3至6元任选取代的环烷基或杂环基；

R⁴和R⁵各自独立选自氢、任选取代的烷基、任选取代的环烷基和任选取代的芳基；

W选自：

其中

R⁶和R⁷各自独立选自氢、羟基和任选取代的烷基；或

R⁶和R⁷一起形成3至6元任选取代的环烷基或氧代即C=O；

R⁸选自氢或任选取代的烷基；

R⁹和R¹⁰各自独立选自氢或任选取代的烷基；或

R⁹和R¹⁰一起形成3至6元任选取代的环烷基或杂环基；和

X为碳原子。

在一个具体实施方案中，MDM2抑制剂为式VI化合物，其中取代基的可能实例包括其中

Ar₁和Ar₂各自独立选自任选取代的苯基和任选取代的吡啶基；

R¹选自氢、任选取代的C₁-C₆烷基和-COR^1a；

R^1a选自氢和任选取代的C₁-C₆烷基；

R²和R³各自独立选自氢和任选取代的C₁-C₆烷基；或

R²和R³一起形成3至6元任选取代的环烷基；

R⁴和R⁵各自独立选自氢和任选取代的C₁-C₆烷基；

W为

其中

R⁶和R⁷各自独立选自氢和任选取代的C₁-C₆烷基；或

R⁶和R⁷一起形成3至6元任选取代的环烷基或氧代。

本申请使用的术语“可代谢裂解的基团”是指可通过代谢过程而从母体分子中裂解且可被氢代替的基团。含有可代谢裂解的基团的一些化合物可为前药，即它们是药理学上无活性的。含有可代谢裂解的基团的一些其它化合物可为p53和MDM2之间的相互作用的拮抗剂。在所述情况下，这些化合物与母体分子相比可具有较大、较小或相等的活性。可代谢裂解的基团的实例包括衍生自氨基酸的那些基团(参见例如US 2006/0241017A1；US2006/0287244A1；和WO 2005/046575A2)或衍生自含磷化合物的那些基团(参见例如US 2007/0249564A1)，如方案1所示。

方案1

本申请使用的术语“药用盐”是指本申请化合物的任意盐(例如通过与酸或碱反应来得到)，其在目标动物(例如哺乳动物)中是生理学上耐受的。本申请化合物的盐可衍生自无机酸和无机碱或有机酸和有机碱。酸的实例包括但不限于盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、高氯酸、富马酸、马来酸、磷酸、羟乙酸、乳酸、水杨酸、琥珀酸、对甲苯磺酸、酒石酸、乙酸、枸橼酸、甲磺酸、乙磺酸、甲酸、苯甲酸、丙二酸、磺酸、萘-2-磺酸、苯磺酸等。其它酸例如草酸，尽管本身不是药用的，但可用于制备可在得到本发明化合物包括其药用酸加成盐的过程中用作中间体的盐。

碱的实例包括但不限于碱金属(例如钠)氢氧化物、碱土金属(例如镁)氢氧化物、氨和式NW₄ ⁺化合物，其中W为C_1-4烷基等。

盐的实例包括但不限于乙酸盐、己二酸盐、海藻酸盐、天冬氨酸盐、苯甲酸盐、苯磺酸盐、硫酸氢盐、丁酸盐、枸橼酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、环戊烷丙酸盐、二葡糖酸盐、十二烷基硫酸盐、乙磺酸盐、富马酸盐、葡糖庚酸盐、甘油磷酸盐、半硫酸盐、庚酸盐、己酸盐、盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、2-羟基乙磺酸盐、乳酸盐、马来酸盐、甲磺酸盐、甲磺酸盐、萘-2-磺酸盐、烟酸盐、草酸盐、棕榈酸盐、果胶酸盐、过硫酸盐、苯基丙酸盐、苦味酸盐、特戊酸盐、丙酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、硫氰酸盐、甲苯磺酸盐、十一烷酸盐等。盐的其它实例包括与适当的阳离子例如N_a ⁺、NH₄ ⁺和NW₄ ⁺(其中W为C_1-4烷基)等化合的本申请化合物的阴离子。对于治疗用途，本申请化合物的盐应该是药用的。然而，非药用酸和碱的盐也可用在例如药用化合物的制备或纯化中。

本申请使用的术语“溶剂化物”是指本申请化合物与一个或多个溶剂分子(不论是有机的还是无机的)的物理性缔合。该物理性缔合通常包括氢键。在一些情况下，溶剂化物是可分离的，例如当一个或多个溶剂分子结合到结晶固体的晶格中时。“溶剂化物”既包括溶液相，又包括可分离的溶剂化物。示例性溶剂化物包括水合物、乙醇合物和甲醇合物。

本申请使用的术语“一价药用阳离子”是指无机阳离子例如但不限于碱金属离子例如Na⁺和K₊及有机阳离子例如但不限于铵根和取代的铵根离子例如NH₄ ⁺、NHMe₃ ⁺、NH₂Me₂ ⁺、NHMe₃ ⁺和NMe₄ ⁺。

本申请使用的术语“二价药用阳离子”是指无机阳离子例如但不限于碱土金属阳离子例如Ca²⁺和Mg²⁺。

一价和二价药用阳离子的实例参见例如Berge等人,J.Pharm.Sci.,66:1-19(1997)。

本申请使用的术语“治疗有效量”是指治疗剂足以使障碍的一种或多种症状得以缓解或预防障碍的恶化或使障碍得以消退的量。例如，就治疗癌症例如白血病而言，在一个实施方案中，治疗有效量是指治疗剂引起治疗性应答的量，所述治疗性应答为例如血细胞计数的正常、肿瘤生长速率的放缓、肿瘤质量的降低、转移数目的减少、肿瘤进展时间的延长和/或存活时间的增加，其程度为至少5%、至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少100%或更多。

术语“药用载体”或“药用媒介物”包括任意一种标准的药物载体、溶剂、表面活性剂或媒介物。适当的药用媒介物包括水性媒介物和非水性媒介物。标准的药物载体及其配制参见Remington’s Pharmaceutical Sciences,MackPublishing Co.,Easton,PA,19th ed.1995。

本申请单独或作为另一个基团中的一部分使用的术语“烷基”是指具有一至十八个碳或指定碳数(例如C₁-C₁₈是指1至18个碳)的直链或支链饱和脂族烃。在一个实施方案中，烷基为C₁-C₁₀烷基。在另一个实施方案中，烷基为C₁-C₆烷基。在另一个实施方案中，烷基为C₁-C₄烷基。示例性烷基包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、异丁基、叔丁基、正戊基、正己基、异己基、正庚基、4,4-二甲基戊基、正辛基、2,2,4-三甲基戊基、壬基、癸基等。

本申请单独或作为另一个基团中的一部分使用的术语“任选取代的烷基”是指如上定义的烷基为未取代的或取代有一个、两个或三个独立选自以下的取代基：羟基(即-OH)、硝基(即-NO₂)、氰基(即-CN)、任选取代的环烷基、任选取代的杂芳基、任选取代的杂环基、烷氧基、芳基氧基、芳烷基氧基、烷基硫基、氨甲酰基或氨磺酰基。在一个实施方案中，任选取代的烷基取代有两个取代基。在另一个实施方案中，任选取代的烷基取代有一个取代基。在另一个实施方案中，取代基选自羟基(即羟基烷基)、任选取代的环烷基(即(环烷基)烷基)或氨基(即氨基烷基)。示例性任选取代的烷基包括-CH₂OCH₃、-CH₂CH₂NH₂、-CH₂CH₂NH(CH₃)、-CH₂CH₂CN、-CH₂SO₂CH₃、羟基甲基、羟基乙基、羟基丙基等。

本申请单独或作为另一个基团中的一部分使用的术语“亚烷基”是指二价烷基，其含有一个、两个、三个、四个或更多个连接在一起的亚甲基。示例性亚烷基包括-(CH₂)-、-(CH₂)₂-、-(CH₂)₃-、-(CH₂)₄-等。

本申请单独或作为另一个基团中的一部分使用的术语“任选取代的亚烷基”是指如上定义的亚烷基为未取代的或取代有一个、两个、三个或四个独立选自以下的取代基：任选取代的C₁-C₆烷基、任选取代的环烷基、任选取代的芳基和任选取代的杂芳基。在一个实施方案中，任选取代的C₁-C₆烷基为甲基。在一个实施方案中，任选取代的芳基为任选取代有一个或两个卤素基团的苯基。示例性任选取代的亚烷基包括-CH(CH₃)-、-C(CH₃)₂-、-CH₂CH(CH₃)-、-CH₂CH(CH₃)CH₂-、-CH₂CH(Ph)CH₂-、-CH(CH₃)CH(CH₃)-等。

本申请单独或作为另一个基团中的一部分使用的术语“卤代烷基”是指具有一至六个卤素取代基的如上定义的烷基。在一个实施方案中，卤代烷基具有一个、两个或三个卤素取代基。示例性卤代烷基包括三氟甲基、-CH₂CH₂F等。

本申请单独或作为另一个基团中的一部分使用的术语“羟基烷基”是指具有一个羟基取代基的如上定义的烷基。示例性羟基烷基包括羟基甲基、羟基乙基、羟基丙基等。

本申请单独或作为另一个基团中的一部分使用的术语“二羟基烷基”是指具有两个羟基取代基的如上定义的烷基。示例性二羟基烷基包括-CH₂CH₂CCH₃(OH)CH₂OH、-CH₂CH₂CH(OH)CH(CH₃)OH、-CH₂CH(CH₂OH)₂、-CH₂CH₂CH(OH)C(CH₃)₂OH、-CH₂CH₂CCH₃(OH)CH(CH₃)OH等，包括其立体异构体。

本申请单独或作为另一个基团中的一部分使用的术语“羟基环烷基”是指具有至少一个例如一个或两个羟基取代基的如下定义的任选取代的环烷基。示例性羟基环烷基包括

等，包括其立体异构体。

本申请单独或作为另一个基团中的一部分使用的术语“任选取代的(环烷基)烷基”是指具有任选取代的环烷基(如下定义)取代基的如上定义的任选取代的烷基。示例性任选取代的(环烷基)烷基包括

等，包括其立体异构体。

本申请单独或作为另一个基团中的一部分使用的术语“芳烷基”是指具有一个、两个或三个任选取代的芳基取代基的如上定义的任选取代的烷基。在一个实施方案中，芳烷基具有两个任选取代的芳基取代基。在另一个实施方案中，芳烷基具有一个任选取代的芳基取代基。在另一个实施方案中，芳烷基为芳基(C₁-C₄烷基)。在另一个实施方案中，芳基(C₁-C₄烷基)具有两个任选取代的芳基取代基。在另一个实施方案中，芳基(C₁-C₄烷基)具有一个任选取代的芳基取代基。示例性芳烷基包括例如苄基、苯基乙基、(4-氟苯基)乙基、苯基丙基、二苯基甲基(即Ph₂CH-)、二苯基乙基(Ph₂CHCH₂-)等。

本申请单独或作为另一个基团中的一部分使用的术语“环烷基”是指饱和和部分不饱和(含有一个或两个双键)环状烃基，其含有一至三个环且具有三至十二个碳原子(即C₃-C₁₂环烷基)或指定碳数。在一个实施方案中，环烷基具有一个环。在另一个实施方案中，环烷基为C₃-C₆环烷基。示例性环烷基包括环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基、环辛基、降莰烷基、萘烷基、金刚烷基等。

本申请单独或作为另一个基团中的一部分使用的术语“任选取代的环烷基”是指如上定义的环烷基是未取代的或取代有一个、两个或三个独立选自以下的取代基：卤素、硝基、氰基、羟基、氨基、任选取代的烷基、卤代烷基、羟基烷基、氨基烷基、芳烷基、任选取代的环烷基、任选取代的烯基、任选取代的炔基、任选取代的芳基、任选取代的杂芳基、任选取代的杂环基、烷氧基、芳基氧基、芳烷基氧基、烷基硫基、氨甲酰基或氨磺酰基。术语“任选取代的环烷基”还指如上定义的环烷基可与任选取代的芳基稠合。示例性任选取代的环烷基包括

等。

本申请单独或作为另一个基团中的一部分使用的术语“烯基”是指含有一个、两个或三个碳-碳双键的如上定义的烷基。在一个实施方案中，烯基具有一个碳-碳双键。示例性烯基包括-CH=CH₂、-CH₂CH=CH₂、-CH₂CH₂CH=CH₂、-CH₂CH₂CH=CHCH₃等。

本申请单独或作为另一个基团中的一部分使用的术语“任选取代的烯基”是指如上定义的烯基为未取代的或取代有一个、两个或三个独立选自以下的取代基：卤素、硝基、氰基、羟基、氨基、任选取代的烷基、卤代烷基、羟基烷基、芳烷基、任选取代的环烷基、任选取代的烯基、任选取代的炔基、任选取代的芳基、任选取代的杂芳基、任选取代的杂环基、烷氧基、芳基氧基、芳烷基氧基、烷基硫基、氨甲酰基或氨磺酰基。示例性任选取代的烯基包括-CH=CHPh、-CH₂CH=CHPh等。

本申请单独或作为另一个基团中的一部分使用的术语“环烯基”是指含有一个、两个或三个碳-碳双键的如上定义的环烷基。在一个实施方案中，环烯基具有一个碳-碳双键。示例性环烯基包括环戊烯、环己烯等。

本申请单独或作为另一个基团中的一部分使用的术语“任选取代的环烯基”是指如上定义的环烯基为未取代的或取代有一个、两个或三个独立选自以下的取代基：卤素、硝基、氰基、羟基、氨基、任选取代的烷基、卤代烷基、羟基烷基、芳烷基、任选取代的环烷基、任选取代的烯基、任选取代的炔基、任选取代的芳基、任选取代的杂芳基、任选取代的杂环基、烷氧基、芳基氧基、芳烷基氧基、烷基硫基、氨甲酰基或氨磺酰基。

本申请单独或作为另一个基团中的一部分使用的术语“炔基”是指含有一至三个碳-碳叁键的如上定义的烷基。在一个实施方案中，炔基具有一个碳-碳叁键。示例性炔基包括-C≡CH、-C≡CCH₃、-CH₂C≡CH、-CH₂CH₂C≡CH和-CH₂CH₂C≡CCH₃。

本申请单独或作为另一个基团中的一部分使用的术语“任选取代的炔基”是指如上定义的炔基为未取代的或取代有一个、两个或三个独立选自以下的取代基：卤素、硝基、氰基、羟基、氨基、任选取代的烷基、卤代烷基、羟基烷基、芳烷基、任选取代的环烷基、任选取代的烯基、任选取代的炔基、任选取代的芳基、任选取代的杂芳基、任选取代的杂环基、烷氧基、芳基氧基、芳烷基氧基、烷基硫基、氨甲酰基或氨磺酰基。示例性任选取代的炔基包括-C≡CPh、-CH₂C≡CPh等。

本申请单独或作为另一个基团中的一部分使用的术语“芳基”是指具有六至十四个碳原子(即C₆-C₁₄芳基)的单环或二环芳族环系，例如苯基(缩写为Ph)、萘-1-基和萘-2-基等。

本申请单独或作为另一个基团中的一部分使用的术语“任选取代的芳基”是指如上定义的芳基为未取代的或取代有一至五个独立选自以下的取代基：卤素、硝基、氰基、羟基、氨基、任选取代的烷基、卤代烷基、羟基烷基、芳烷基、任选取代的环烷基、任选取代的烯基、任选取代的炔基、任选取代的芳基、任选取代的杂芳基、任选取代的杂环基、烷氧基、芳基氧基、芳烷基氧基、烷基硫基、氨甲酰基或氨磺酰基。在一个实施方案中，任选取代的芳基为任选取代的苯基。在一个实施方案中，任选取代的苯基具有四个取代基。在另一个实施方案中，任选取代的苯基具有三个取代基。在另一个实施方案中，任选取代的苯基具有两个取代基。在另一个实施方案中，任选取代的苯基具有一个取代基。示例性取代的芳基包括2-甲基苯基、2-甲氧基苯基、2-氟苯基、2-氯苯基、2-溴苯基、3-甲基苯基、3-甲氧基苯基、3-氟苯基、3-氯苯基、4-甲基苯基、4-乙基苯基、4-甲氧基苯基、4-氟苯基、4-氯苯基、2,6-二氟苯基、2,6-二氯苯基、2-甲基-3-甲氧基苯基、2-乙基-3-甲氧基苯基、3,4-二甲氧基苯基、3,5-二氟苯基、3,5-二甲基苯基、3,5-二甲氧基-4-甲基苯基、2-氟-3-氯苯基、3-氯-4-氟苯基等。术语“任选取代的芳基”意在包括具有任选取代的稠合环烷基环和任选取代的稠合杂环基环的基团。实例包括

等。

本申请单独或作为另一个基团中的一部分使用的术语“杂芳基”是指具有五至十四个碳原子(即C₅-C₁₄杂芳基)和一个、两个、三个或四个独立选自氧、氮和硫的杂原子的单环和二环芳族环系。在一个实施方案中，杂芳基具有三个杂原子。在一个实施方案中，杂芳基具有两个杂原子。在一个实施方案中，杂芳基具有一个杂原子。示例性杂芳基包括1-吡咯基、2-吡咯基、3-吡咯基、2-咪唑基、4-咪唑基、吡嗪基、2-噁唑基、4-噁唑基、5-噁唑基、3-异噁唑基、4-异噁唑基、5-异噁唑基、2-噻唑基、4-噻唑基、5-噻唑基、2-呋喃基、3-呋喃基、2-噻吩基、3-噻吩基、2-吡啶基、3-吡啶基、4-吡啶基、2-嘧啶基、4-嘧啶基、嘌呤基、2-苯并咪唑基、4-苯并咪唑基、5-苯并咪唑基、2-苯并噻唑基、4-苯并噻唑基、5-苯并噻唑基、5-吲哚基、3-吲唑基、4-吲唑基、5-吲唑基、1-异喹啉基、5-异喹啉基、2-喹喔啉基、5-喹喔啉基、2-喹啉基、3-喹啉基、6-喹啉基等。术语“杂芳基”意在包括可能的N-氧化物。示例性N-氧化物包括吡啶基N-氧化物等。

本申请单独或作为另一个基团中的一部分使用的术语“任选取代的杂芳基”是指如上定义的杂芳基为未取代的或取代有一至四个取代基，通常取代有一个或两个取代基，所述取代基独立选自卤素、硝基、氰基、羟基、氨基、任选取代的烷基、卤代烷基、羟基烷基、芳烷基、任选取代的环烷基、任选取代的烯基、任选取代的炔基、任选取代的芳基、任选取代的杂芳基、任选取代的杂环基、烷氧基、芳基氧基、芳烷基氧基、烷基硫基、氨甲酰基或氨磺酰基。在一个实施方案中，任选取代的杂芳基具有一个取代基。在另一个实施方案中，取代基为任选取代的芳基、芳烷基或任选取代的烷基。在另一个实施方案中，取代基为任选取代的苯基。任意可用的碳原子或氮原子可被取代。示例性任选取代的杂芳基包括

等。

本申请单独或作为另一个基团中的一部分使用的术语“杂环基”是指饱和和部分不饱和(含有一个或两个双键)环状基团，其含有一至三个环且具有两至十二个碳原子(即C₂-C₁₂杂环基)和氧原子、硫原子或氮原子中的一个或两个。杂环基可任选通过碳原子或氮原子而与分子中的剩余部分连接。示例性杂环基包括

等。

本申请单独或作为另一个基团中的一部分使用的术语“任选取代的杂环基”是指如上定义的杂环基为未取代的或取代有一至四个独立选自以下的取代基：卤素、硝基、氰基、羟基、氨基、任选取代的烷基、卤代烷基、羟基烷基、芳烷基、任选取代的环烷基、任选取代的烯基、任选取代的炔基、任选取代的芳基、任选取代的杂芳基、任选取代的杂环基、烷氧基、芳基氧基、芳烷基氧基、烷基硫基、氨甲酰基、氨磺酰基、-COR^c、-SO₂R^d、-N(R^e)COR^f、-N(R^e)SO₂R^g或-N(R^e)C=N(R^h)-氨基，其中R^c为氢、任选取代的烷基、任选取代的芳基或任选取代的杂芳基；R^d为任选取代的烷基、任选取代的芳基或任选取代的杂芳基；R^e为氢、任选取代的烷基、任选取代的芳基或任选取代的杂芳基；R^f为氢、任选取代的烷基、任选取代的芳基或任选取代的杂芳基；R^g为任选取代的烷基、任选取代的芳基或任选取代的杂芳基；和R^h为氢、-CN、任选取代的烷基、任选取代的芳基或任选取代的杂芳基。取代可发生在任意可用的碳原子或氮原子处。示例性取代的杂环基包括

等。任选取代的杂环基可与芳基稠合以得到如上所述的任选取代的芳基。

本申请单独或作为另一个基团中的一部分使用的术语“烷氧基”是指与末端氧原子连接的卤代烷基、任选取代的烷基、任选取代的环烷基、任选取代的烯基或任选取代的炔基。示例性烷氧基包括甲氧基、叔丁氧基、-OCH₂CH=CH₂等。

本申请单独或作为另一个基团中的一部分使用的术语“芳基氧基”是指与末端氧原子连接的任选取代的芳基。示例性芳基氧基包括苯氧基等。

本申请单独或作为另一个基团中的一部分使用的术语“芳烷基氧基”是指与末端氧原子连接的芳烷基。示例性芳烷基氧基包括苄基氧基等。

本申请单独或作为另一个基团中的一部分使用的术语“烷基硫基”是指与末端硫原子连接的卤代烷基、芳烷基、任选取代的烷基、任选取代的环烷基、任选取代的烯基或任选取代的炔基。示例性烷基硫基包括-SCH₃等。

本申请单独或作为另一个基团中的一部分使用的术语“卤代”或“卤素”是指氟、氯、溴或碘。在一个实施方案中，卤素为氟或氯。

本申请单独或作为另一个基团中的一部分使用的术语“氨基”是指具有式-NR^aR^b的基团，其中R^a和R^b独立为氢、卤代烷基、芳烷基、任选取代的烷基、任选取代的环烷基、任选取代的杂环基、任选取代的芳基或任选取代的杂芳基；或R^a和R^b与它们所连接的氮原子一起形成四至七元任选取代的杂环基。示例性氨基包括-NH₂、-N(H)CH₃、-N(CH₃)₂、N(H)CH₂CH₃、N(CH₂CH₃)、-N(H)CH₂Ph等。

本申请单独或作为另一个基团中的一部分使用的术语“氨甲酰基”是指具有式-CO-氨基的基团。示例性氨甲酰基包括-CONH₂、-CON(H)CH₃、-CON(H)Ph、-CON(H)CH₂CH₂Ph、-CON(CH₃)₂、CON(H)CHPh₂等。

本申请单独或作为另一个基团中的一部分使用的术语“氨磺酰基”是指具有式-SO₂-氨基的基团。示例性氨磺酰基包括-SO₂NH₂、-SO₂N(H)CH₃、-SO₂N(H)Ph等。

本申请使用的术语“约”包括所述数字±10%。因此，“约10”是指9至11。

一些MDM2抑制剂可按立体异构体包括光学异构体的形式存在。本申请提供的方法和组合物包括使用所有立体异构体，所述立体异构体既可呈纯单独立体异构体制品形式，又可呈每种立体异构体的富含制品形式且所述立体异构体既可呈所述立体异构体的外消旋混合物形式，又可呈单独非对映异构体和对映异构体形式，其可根据本领域技术人员公知的方法来分离。

本申请使用的术语“基本不含有”是指化合物包含小于约25%的其它立体异构体例如非对映异构体和/或对映异构体，其中使用本领域技术人员惯用的常规分析方法来确定。在一些实施方案中，其它立体异构体的量小于约24%、小于约23%、小于约22%、小于约21%、小于约20%、小于约19%、小于约18%、小于约17%、小于约16%、小于约15%、小于约14%、小于约13%、小于约12%、小于约11%、小于约10%、小于约9%、小于约8%、小于约7%、小于约6%、小于约5%、小于约4%、小于约3%、小于约2%、小于约1%或小于约0.5%。

确定受试者的细胞是否含有FLT3的激活突变并由此测试所述突变是否为阳性的方法是本领域技术人员公知的。例如，参见Kiyoi等人,美国专利No.7,125,659；Kottaridis,P.D.等人,Blood 98:1752(2010)；Sawyers,C.L.,ColdSpring Harbor Symposia On Quantitative Biology LXX:479(2005)；和VandeWoude,G.F.等人,Clinical Cancer Research 10:3897(2004)。

确定受试者的细胞在p53基因中是否含有至少一种突变并由此测试所述突变是否为阳性的方法也是本领域技术人员公知的。例如，参见Flaman,J.-M.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92:3963-3967(1995)。在一个实施方案中，所述突变通过直接对所述基因进行测序来检测。在另一个实施方案中，所述突变通过PCR来检测。

确定受试者的细胞是否含有具有激活突变的FLT3(例如FLT3-ITD)或p53基因突变的团队可与对接受白血病治疗的受试者进行选择的团队相同或不同。在一个实施方案中，单一的团队确定受试者的细胞是否含有FLT3或p53基因突变并对接受白血病治疗的受试者进行选择。在另一个实施方案中，一个团队例如分析测定机构确定受试者的细胞是否含有FLT3-ITD或p53基因突变且另一个团队例如医生或保健专家对接受白血病治疗的受试者进行选择，例如通过查阅由分析测定机构提供的结果。

本申请使用的术语“抗癌药物”是指在治疗癌症中(例如在哺乳动物中例如在人类中)使用的任意治疗剂(例如化疗用化合物和/或分子治疗用化合物)、反义疗法、放射疗法或手术介入。用于治疗白血病的抗癌药物包括但不限于磷酸氟达拉滨(fludarabine phosphate)、克拉屈滨(cladribine)、氯法拉滨(clofarbine)、拉罗莫司汀(laromustine)和阿糖胞苷(ara-C)(Grant,S.,Best Pract.Res.Clin.Haematol.22:501-507(2009))。抗癌药物是本领域技术人员公知的(参见任意指导手册且包括但不限于Physician’s Desk Reference和Goodmanand Gilman’s“Pharmaceutical Basis of Therapeutics”tenth edition,Eds.Hardman等人,2002)。

在一个实施方案中，白血病通过给药MDM2抑制剂和至少一种其它抗癌药物来治疗。在一个实施方案中，所述其它抗癌药物为FLT3抑制剂。在另一个实施方案中，所述FLT3抑制剂为FI-700。在另一个实施方案中，所述FLT3抑制剂为semaxinib、舒尼替尼(sunitinib)(SU11248)、来他替尼(lestaurtinib)(CEP-701)、米哚妥林(midostaurin)(PKC412)、索拉非尼(sorafenib)、坦度替尼(tandutinib)、KW-2449、AC220、AG1295、AG1296、AGL2043、D64406、SU5416、SU5614、MLN518、GTP-14564、Ki23819和CHIR-258(参见例如Small,D.,Hematology Am.Soc.Hematol.Educ.Program178-84(2006)和Grant,S.,Best Pract.Res.Clin.Haematol.22:501-507(2009))。

本申请详细表征了在来自109名患者的AML胚细胞中对用MDM2抑制剂MI-219进行离体治疗的敏感性和抗性。与先前的观察结果一致的是，所有具有突变的p53的AML病例对MI-219是具有抗性的。重要的是，具有未突变的p53的AML病例中的~30%也表现出对MI-219的原发性抗性。在具有野生型p53的AML胚细胞中对与MI-219抗性相关的潜在机制进行的分析揭示了独特的分子缺陷，包括在MDM2抑制剂处置或外部照射后很低水平的p53蛋白质诱导或没有引起p53蛋白质诱导。另外，另一小组抗性胚细胞在MI-219处置后表现出强势的p53蛋白质诱导，这表明缺陷性p53蛋白功能或在细胞凋亡性p53网络中存在缺陷。最后，对非常敏感的AML病例进行的分析揭示了与突变的Flt3状态(FLT3-ITD)强烈且显著的相关性，这首次鉴别了可特别受益于MDM2抑制剂治疗的AML临床高风险组。

在本申请提供的方法的一个实施方案中，在以下一种或多种条件下向受试者给药MDM2抑制剂和任选的一种或多种其它抗癌药物：以不同的周期、以不同的持续时间、以不同的浓度、通过不同的给药途径等。在另一个实施方案中，在给药其它抗癌药物前给药MDM2抑制剂，例如在给药其它抗癌药物前0.5、1、2、3、4、5、10、12或18小时、1、2、3、4、5或6天或1、2、3或4周给药MDM2抑制剂。在另一个实施方案中，在给药其它抗癌药物后给药MDM2抑制剂，例如在给药其它抗癌药物后0.5、1、2、3、4、5、10、12或18小时、1、2、3、4、5或6天或1、2、3或4周后给药MDM2抑制剂。

在另一个实施方案中，MDM2抑制剂和任选的另一种抗癌药物同时但以不同时间安排来给药，例如MDM2抑制剂每天给药一次，而另一种抗癌药物每周、每两周、每三周或每四周给药一次。在另一个实施方案中，MDM2抑制剂每周给药一次，而另一种抗癌药物每天、每周、每两周、每三周或每四周给药一次。

本申请提供的组合物包括所有组合物，其中本申请化合物以有效实现其预期目的的量存于。尽管个体需要是变化的，但可如本申请描述的那样来确定每种组分的最佳有效量范围。通常，就对诱导细胞凋亡具有应答的障碍而言，可将MDM2抑制剂以0.0025至50mg(或等价量的其药用盐)/kg所治疗的哺乳动物体重/日的剂量口服给药于哺乳动物例如人类。在一个实施方案中，口服给药约0.01至约25mg/kg以治疗、缓解或预防所述障碍。对于肌内注射，剂量通常为口服剂量的约一半。例如，适当的肌内剂量可为约0.0025至约25mg/kg或约0.01至约5mg/kg。

单位口服剂量可包含约0.01至约1000mg例如约0.1至约100mg的MDM2抑制剂。单位剂量可按一个或多个片剂或胶囊剂的形式每天给药一次或多次，每个所述片剂或胶囊剂含有约0.1至约10mg且通常为约0.25至50mg的所述化合物或其溶剂化物。

对于局部用制剂，MDM2抑制剂可按约0.01至100mg/克载体的浓度存在。在一个实施方案中，MDM2抑制剂按约0.07-1.0mg/ml例如约0.1-0.5mg/ml且在一个实施方案中为约0.4mg/ml的浓度存在。

除按原料化学品的形式给药MDM2抑制剂外，MDM2抑制剂还可作为药物制剂中的一部分来给药，所述药物制剂含有适当的药用载体，包括有助于将化合物加工成药用制剂的赋形剂和辅料。制剂，特别是可口服或局部给药且可用于一种给药类型(例如片剂、糖锭剂、缓释锭剂和胶囊剂、口腔清洗剂和口腔洗涤剂、凝胶剂、液体混悬剂、毛发清洗剂、毛发凝胶剂、洗发水、可直肠给药的制剂例如栓剂及适于静脉内输注、注射、局部或口服给药的溶液剂)的那些制剂，含有约0.01至99%且在一个实施方案中为约0.25至75%的活性化合物及赋形剂。

可将本申请公开的化合物和药物组合物给药于可获得所述化合物有益作用的任意患者。所述患者中最重要的是哺乳动物例如人类，尽管本申请提供的方法和组合物不限于此。其它患者包括家畜动物(牛、羊、猪、马、狗、猫等)。

所述化合物及其药物组合物可通过能够实现它们预期目的的任意方式来给药。例如，给药可通过胃肠外途径、皮下途径、静脉内途径、肌内途径、腹膜内途径、透皮途径、含服途径、鞘内途径、颅内途径、鼻内途径或局部途径来进行。可选择地或同时地，给药可通过口服途径来进行。所给药的剂量将取决于接受者的年龄、健康情况和体重、并行治疗的种类、治疗频率(若涉及)和所期望的作用性质。

本申请提供的药物制剂以本身已知的方式来制备，例如通过常规的混合、制粒、包糖衣、溶解或冻干操作。因此，口服用药物制剂可如下得到：将活性化合物与固体赋形剂合并，任选在按需加入适当的辅料后研磨所得混合物和对颗粒混合物进行加工以得到片剂或锭芯。

具体地，适当的赋形剂为填充剂(例如糖类(例如乳糖或蔗糖)、甘露醇或山梨醇、纤维素制品和/或磷酸钙类(例如磷酸钙或磷酸氢钙)及粘合剂(例如淀粉糊(使用例如玉米淀粉、小麦淀粉、大米淀粉或马铃薯淀粉)、明胶、西黄蓍胶、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠和/或聚乙烯基吡咯烷酮)。可按需加入崩解剂，例如上述淀粉及羧甲基淀粉、交联聚乙烯基吡咯烷酮、琼脂或海藻酸或其盐(例如海藻酸钠)。助剂包括流动调节剂和润滑剂，例如硅胶、滑石、硬脂酸或其盐(例如硬脂酸镁或硬脂酸钙)和/或聚乙二醇。为锭芯提供适当的包衣，其按需对胃液具有抗性。出于该目的，可使用浓糖溶液，其可任选含有***胶、滑石、聚乙烯基吡咯烷酮、聚乙二醇和/或二氧化钛、漆溶液和适当的有机溶剂或溶剂混合物。为了得到对胃液具有抗性的包衣，使用适当的纤维素制品例如邻苯二甲酸乙酰基纤维素或邻苯二甲酸羟丙基甲基纤维素的溶液。可将染料或色素加到片剂包衣或糖锭剂包衣中以鉴别或表征活性化合物剂量的组合。

可口服使用的其它药物制剂包括由明胶制造的推入配合式胶囊剂及由明胶和增塑剂(例如甘油或山梨醇)制造的密封软胶囊剂。推入配合式胶囊剂可含有呈颗粒形式的活性化合物，所述活性化合物可与填充剂(例如乳糖)、粘合剂(例如淀粉)和/或润滑剂(例如滑石或硬脂酸镁)及任选的稳定剂混合。对于软胶囊剂，在一个实施方案中，将活性化合物溶解或混悬在适当的液体例如脂肪油或液体石蜡中。另外，可加入稳定剂。

可直肠使用的可能药物制剂包括例如栓剂，其由一种或多种活性化合物与栓剂基质的组合构成。适当的栓剂基质为例如天然或合成的甘油三酯或烷烃。另外，还可使用直肠用明胶胶囊剂，其由活性化合物与基质的组合构成。可能的基质物质包括例如液体甘油三酯、聚乙二醇或烷烃。

适于胃肠外给药的制剂包括呈水溶性形式的活性化合物(例如水溶性盐)的水性溶液剂和碱性溶液剂。另外，可给药活性化合物的混悬剂，其呈适当油性注射用混悬剂的形式。适当的亲脂性溶剂或媒介物包括脂肪油(例如芝麻油)或合成性脂肪酸酯(例如油酸乙酯或甘油三酯)或聚乙二醇-400。水性注射用混悬剂可含有使混悬剂的粘度得以增加的物质，包括例如羧甲基纤维素钠、山梨醇和/或葡聚糖。任选地，混悬剂还可含有稳定剂。

在一个实施方案中，通过选择适当的载体将本申请提供的局部用组合物配制成油状物、乳膏剂、洗剂、软膏剂等形式。适当的载体包括植物油或矿物油、白矿脂(白软石蜡)、支链脂肪或油、动物脂肪和高分子量醇(大于C₁₂)。载体可为活性成分可溶于其中的那些载体。还可按需包括乳化剂、稳定剂、润湿剂和抗氧化剂及赋予颜色或香味的试剂。另外，在这些局部用制剂中可使用透皮渗透促进剂。所述促进剂的实例可参见美国专利3,989,816和4,444,762。

软膏剂可如下配制：将活性成分于植物油例如杏仁油中的溶液与温热的软石蜡混合并使混合物冷却。所述软膏剂的典型实例为按重量计包含约30%杏仁油和约70%白软石蜡的软膏剂。洗剂通常可如下制备：将活性成分溶解在适当的高分子量醇例如丙二醇或聚乙二醇中。

以下实施例是对本申请提供的方法和组合物的说明而非限制。对各种条件和参数进行其它适当的改变和调整是在临床治疗中经常遇到的且对于本领域技术人员是显而易见的，这在本申请提供的方法和组合物的主旨和范围内。

作为竭力研究MDM2抑制剂在血液恶性肿瘤(其特征通常在于仅小部分病例具有突变的p53)中的治疗潜力的一部分，已在多于100份的人AML样品中对离体细胞凋亡诱导进行了研究。通过以下详述的研究，已鉴别了先前未受怀疑的大部分原发性人AML样品，其不论是否具有野生型p53外显子5-9基因状态，都表现出对MDM2抑制剂的原发性抗性。对该现象进行的最初研究为多种不同的抗性机制提供了证据：一种集中于p53蛋白质诱导的不足且另一种集中于p53蛋白的缺陷或由p53调节的效应子途径的缺陷。这些新的发现在很大程度上使MDM2抑制剂向临床AML应用的过渡变得复杂并促进进一步的研究以实现这些药物在临床条件下的最佳有效性。最后，通过相关性分析，已首次鉴别了突变的Flt3状态(存在FLT3-ITD)和对MDM2抑制剂的高度敏感性之间显著且强烈的关联，由此在AML中为MDM2抑制剂的试验设计、患者小组的选择和试验数据的诠释提供了新颖且实用的理论。

实施例1

方法

患者

在2005年3月至2009年10月在密歇根大学综合癌症中心(University ofMichigan Comprehensive Cancer Center)招募了在该研究中进行分析的109名AML病例。所述研究得到了密歇根大学制度审查委员会(University ofMichigan Institutional Review Board)的批准(IRBMED#2004-1022)且在招募前得到所有患者的书面知情同意。

细胞纯化

来自AML患者的外周血单核细胞通过Ficoll梯度离心(GE Healthcare)来分离，等分到含有10%DMSO的FCS中并冷藏在液氮中。为了通过阴性选择来纯化AML胚细胞，对冷藏的来自AML患者的PBMC进行洗涤并通过离心来回收，然后根据制造商的推荐用抗人CD3(MiltenyiBiotec#130-050-101)、抗人CD14微珠(若胚细胞的CD14表达为阴性；MiltenyiBiotec#130-050-201)、抗人CD19(若胚细胞的CD19表达为阴性；MiltenyiBiotec#130-050-301)和抗人CD235a(Miltenyi Biotec#130-050-501)进行处理。为了阴性富集AML胚细胞，使细胞混悬液通过Miltenyi MACS分离LS柱(#130-042-401)。所有胚细胞制品的纯度通过细胞离心涂片器来分析。该方案总是得到纯度大于90%的胚细胞。

用于SNP 6.0绘图的AML胚细胞DNA从如下进一步纯化的样品中提取：对经历Miltenyi柱后的样品进行洗涤并用缀合有FITC的抗CD33、缀合有PE的抗CD13和缀合有APC的抗CD45(所有抗体：eBioscience,SanDiego,CA)进行染色。最终洗涤后，加入碘化丙锭(PI)至浓度为1μg/ml以区分死亡的细胞。用FACS-ARIA高速流式细胞仪(Becton Dickinson,MountainView，CA)对细胞进行分类。通过鉴别对CD45具有中等强度的染色且具有低至中等强度的侧散射的那些细胞对活细胞(PI阴性)进行胚细胞门控(Borowitz,M.J.等人,Am.J.Clin.Pathol.100:534-540(1993))。然后使用CD33和CD13以进一步区分胚细胞与红细胞系和成熟髓细胞系细胞。

离体AML胚细胞MDM2抑制剂细胞凋亡测定

在补充有血清的RPMI介质中在各种浓度(范围为0.625-20μM)的MDM2抑制剂MI-219和MI-63存在下将使用以上详述的方法富集至纯度>90%的胚细胞以2.5×10⁵个细胞/100μl最终体积孵育40小时。使用基于膜联蛋白-V/PI FACS的读数器对每份经处理的胚细胞等分液的细胞凋亡和坏死进行测量，然后根据公式(存活%=经处理的样品的平均存活%/所配对的未经处理的样品的平均存活%)相对于未经处理的平行培养物的自发死亡率对值进行归一化。

离体后生AML胚细胞和MDM2抑制剂细胞凋亡测定

将使用以上详述的方法富集至纯度>90%的胚细胞与DMSO或0.5μM 5-氮杂胞苷(A2385,Sigma-Aldrich,Saint Louis,MO)一起孵育48小时(每24小时补充一次5-氮杂胞苷)。在孵育的最后12小时期间，将胚细胞进一步等分并用0.3μM曲古抑菌素A(#9950,Cell Signaling Technology,Danvers,MA)或DMSO进行处理。48小时孵育结束后，四组经不同处理的胚细胞小组中的每组用最终浓度为0、2.5、5和10μM的MI-219处理40小时，然后细胞凋亡通过基于膜联蛋白-V/PI FACS的分析来分析。将并行的胚细胞等分液在48孔板中在1ml培养基中以10⁶个细胞/孔培养并用10μM MI-219或溶剂处理8小时。收集胚细胞、溶胞并制备用于所述免疫印迹的蛋白质。

使用Q-PCR来测量p53、MDM2和MDMX mRNA表达

RNA使用Trizol试剂由来自AML病例的经FACS分类的胚细胞来制备并重新混悬在50μl经DEPC处理的水中。20μl互补DNA使用Superscript III第一链合成试剂盒(Invitrogen)和随机引物法由~50ng RNA来制备。引物和基于TaqMan的探针购自Applied Bio-systems(按需引物)。引物/探针混合物包括p53(Hs_00153349_m1)、MDM2(Hs_01066930_m1)、MDM4(Hs_00159092_m1)和Hu PGK1。

双倍扩增反应混合物在20μl反应体积中包含引物/探针、

2×Universal PCR Master Mix、No AmpErase UNG和1μl cDNA。在ABI 7900HT机器上进行反应。对感兴趣的基因的mRNA的相对拷贝数估计值进行归一化，其中PGK1的Ct值作为参照(感兴趣的基因的Ct平均值-PGK1的Ct平均值)。通过扣除归一化的Ct值的平均值，在AML小组之间进行比较。

离体AML胚细胞处理和免疫印迹操作

根据MI-219的IC₅₀值对具有野生型p53外显子5-9的原发性AML病例进行评级且选择15个具有高IC₅₀值(IC₅₀>10μM)的病例和15个具有低IC₅₀值(IC₅₀值<2μM)的病例用于进一步分析。胚细胞如上所述来纯化，然后与10μM MI-219、10μM Nutlin-3或溶剂一起培养8小时或用5Gy电离辐射处理。处理后，收集细胞，在去污剂溶胞缓冲液(50mM Tris pH7.5、100mM NaCl、2mM EDTA、2mM EGTA、1%Triton X-100、20mM NaF、1mM原钒酸钠(#13721-39-6Alfa Aesar)、1mM苯甲磺酰氟(Pierce)、磷酸酶抑制剂混合物I(P2850,Sigma-Aldrich)和蛋白酶抑制剂混合物(P8340,Sigma-Aldrich))中溶胞，对蛋白质进行分级并准备以供用针对p53的抗体(Ab-6,克隆DO-1,Calbiochem)和针对肌动蛋白的抗体(AC-15,Sigma-Aldrich,Saint Louis,MO)进行的免疫印迹。阳性对照溶胞产物由用10μM MI-219处理8小时的AML细胞系MOLM-13来得到并使这些溶胞产物的等分液与原发性病例的溶胞产物在每个免疫印迹上并排运行。因此，这些MOLM-13溶胞产物作为印迹间条带强度比较的内标。然后对来自这些实验的剩余溶胞产物进行准备以供使用针对人MDMX的抗体(A300-287A,Bethyl Laboratories,Montgomery,TX)、针对MDM2的抗体(Ab-1,克隆IF2,Calbiochem)、针对p21的抗体(克隆SX118,BD Biosciences)和针对肌动蛋白的抗体而进行的免疫印迹。

对AML胚细胞DNA和所配对的口腔DNA进行的SNP 6.0阵列分析

SNP 6.0测定按照制造商推荐的方案来进行。使用针对初始质量控制的Affymetrix Genotyping Console软件对每种胚细胞和口腔样品的AffymetrixCEL文档进行分析，然后使用Affymetrix“Birdseed”算法来生成文本格式的用制表符定位的SNP检出文档(call file)。该报告所包括的整组样品的检出率(call rate)为94.93%至99.45%，其中平均检出率为98.33%。通过使用免费软件dChip(Lin,M.,Bioinformatics 20:1233-1240(2004))(经调整而适于64位操作***环境)由CEL文档得到样品拷贝数热图显示结果。为了生成LOH的功能性和实用性显示结果，使用分两步的内部开发的基于Java的软件分析***。Pre-LOH Unification Tool(PLUT)用于在输入到LOH工具(版本2,LOH工具的能够适应Affy 6.0SNP阵列数据的更新版本(Ross,C.W.等人,Clin.Cancer Res.13:4777-4785(2007))前使所有个体患者的SNP检出与他们各自的dbSNP rs ID号和基因物理位置匹配。对于在配对样品之间进行的LOH分析，使用LOH工具(版本2)中的过滤设置，其允许以LOH的形式对单独配对的SNP检出进行可视化，只要在另一个该检出的3000个碱基对中存在。该步骤滤出了由于平台噪音而产生的多个零星分布的单一错误检出。

对NPM1、Flt3、p53、N-ras和K-ras进行外显子重新测序

使用引物3程序(http://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3www.cgi)来设计以下引物和相邻的基因内序列，所述引物用于对人NPM1的外显子12、人Flt3的外显子13-15和20、N-ras和K-ras的外显子2和3及人p53的外显子5-9进行扩增和测序。PCR产物使用来自高纯度胚细胞的Repli-g(Qiagen)-扩增的DNA作为模板来生成。扩增使用Taq聚合酶来进行。制备PCR扩增子以用内嵌测序引物进行直接测序，其中使用外切核酸酶/虾碱性磷酸酶法(USB)。Mutation Surveyor(SoftGenetics LLC,State College,PA)软件用于对实验序列与Refseq GenBank序列或基因组序列进行比较及对序列描记图进行视觉观察。突变使用所配对的患者口腔DNA作为模板来证实。

统计学方法

使用对数优势比对二元分类之间(例如药物敏感性和基因突变状态之间)的关联进行评价。使用两样品t-检验对样品组之间的平均IC₅₀值进行比较。将所有统计学检验的结果报道为Z-评分和双侧p-值。

实施例2

患者特征

在该研究中进行分析的109名AML患者的特征总结在表1中。对于所分析的109名AML病例，在招募参予研究时，90名(83%)患者先前未接受过治疗且19名(17%)患者先前接受过治疗(复发)。70%为原发性AML、14%为继发性AML和16%为与治疗相关的AML(tAML)且12名病例具有p53外显子5-9突变。

*17个样本的FAB分类未被指出。

**基于SWOG S0106分类。

实施例3

对MDM2抑制剂治疗的原发性抗性在成年AML中是常见的

为了在离体AML胚细胞中评价MDM2抑制剂所介导的凋亡性细胞杀灭作用的效力，将来自109个AML样品(外显子5-9外显子序列分析表明97个AML样品具有野生型p53和12个AML样品具有突变体p53)的胚细胞纯化至纯度>90%且将细胞等分液与浓度渐增的MDM2抑制剂MI-219(N=109)和MI-63(N=60)一起孵育40小时。然后经处理的样品中的凋亡细胞部分通过基于膜联蛋白V-PI的FACS分析来定量并相对于所配对的未经处理的细胞的测量结果进行归一化。如图1A和1B所示，所有具有突变体p53外显子5-9(红色)或缺乏p53mRNA表达(绿色)的AML病例都表现出对MDM2抑制剂处置的抗性，这与先前的发现是一致的(Kojima,K.等人,Blood106:3150-3159(2005)；Saddler,C.等人,Blood 111:1584-1593(2008)。

尽管多个具有野生型p53外显子5-9(黑色)的AML病例对MI-219或MI-63是非常敏感(IC₅₀<2μM;32/97=33%)或敏感(IC₅₀≥2μM至<5μM;33/97=34%)的，但具有野生型p53的病例中相当大的一部分表现出不同的抗性水平(MI-219分别就病例中的32/97=33%而言IC₅₀>5μM且就病例中的21/97=22%而言IC₅₀>10μM)。因此，与CLL中的情况不同，这些数据表明，具有野生型p53外显子5-9序列的AML病例中相当大的一部分表现出对MDM2抑制剂的离体原发性抗性。

另外，在原发性AML、继发性AML和tAML中(不包括具有p53外显子5-9突变的病例)，MI-219的平均IC₅₀值分别为6.1μM、7.9μM和4.8μM。在先前未接受过治疗的AML病例和复发的AML病例中(不包括具有p53外显子5-9突变的病例)，MI-219的平均IC₅₀值分别为6.6μM和4.4μM。

实施例4

在AML细胞系中对MDM2抑制剂不同程度的敏感性和抗性

接下来在来自19名AML患者的细胞系中对MI-219诱导细胞凋亡的能力进行评价。数据总结在图2和表2中。

如图2所示，所有具有突变体p53(红色)的AML细胞系都对MI-219具有抗性，而具有野生型p53(黑色)的细胞系对MI-219表现出不同程度的敏感性/抗性，这再现了上述在原发性AML胚细胞中的发现结果。

实施例5

关于在具有野生型p53外显子5-9的AML中

对MDM2抑制剂的原发性抗性的不同机制的证据

考虑到完整的p53对于MDM2抑制剂敏感性的核心重要性，对原发性AML胚细胞中的p53蛋白质表达水平进行分析。根据MI-219的IC₅₀值对具有野生型p53外显子5-9的所有原发性AML病例进行评级并选择具有高IC₅₀值(IC₅₀>10μM)的15名病例和具有低IC₅₀值(IC₅₀值<2μM)的15名病例以供进一步分析。经纯化的胚细胞未经处理或用MI-219(10μM)或Nutlin-3(10μM)处理8小时或用一次剂量即5Gy的外部照射进行处理。由这些胚细胞制备的溶胞产物被准备以供用抗p53抗体和抗肌动蛋白抗体进行免疫印迹。另外，在每个印迹上对来自用MI-219处理的AML细胞系MOLM13的溶胞产物的等分液进行分析以对条带强度进行印迹间比较。

如图3A所示，所有敏感性AML胚细胞在MDM2抑制剂处理或外部照射后都表现出p53蛋白的诱导，尽管绝对水平是不同的。重要的是，对抗性胚细胞中p53蛋白质水平进行的分析(图3B)揭示了两个小组：i)在MDM2抑制剂处理或外部照射后缺乏p53表达或p53表达非常低的胚细胞，和ii)基线p53水平和所诱导的p53水平与在敏感性胚细胞中测量的水平基本相等的胚细胞。因此，具有野生型p53外显子5-9的AML中对MDM2抑制剂的抗性与至少两种不同的分子缺陷相关：i)低p53蛋白质表达/缺乏p53蛋白质表达，或ii)在p53蛋白质水平正常的情况下，细胞凋亡性p53网络存在缺陷(包括异常p53蛋白的可能性)。

为了进一步研究低p53表达/缺乏p53表达在抗性AML胚细胞中的机制，对从经FACS分类的AML胚细胞样品中纯化的总RNA中经归一化的p53mRNA水平进行测量。该分析表明，处于基线的少数AML病例显示出p53mRNA的缺乏(图5E；AML病例号7、80和120)。因此，一小部分AML胚细胞中对MDM2抑制剂的抗性是由于缺乏p53转录并暗示了获得性p53基因缺陷。然而，大部分具有低p53蛋白/缺乏p53蛋白的抗性AML胚细胞不表达p53mRNA(AML病例号98、138、191、36、40、101和100)，因此暗示了低p53蛋白质水平的转录后机制。

实施例6

使用曲古抑菌素A和氮杂胞苷对缺乏p53表达的抗性胚细胞进行的处理

没有诱导p53的表达

为了得到关于缺乏p53mRNA表达的AML中后生p53基因沉默的证据，基于缺乏p53mRNA或p53mRNA非常低的冷藏细胞对于进一步分析的可用性而选择四名AML病例且经纯化的胚细胞用曲古抑菌素A和氮杂胞苷(单独或组合)处理，然后用MI-219处理。针对这些实验所读取的是发生细胞凋亡的胚细胞分数和处理后的p53蛋白质水平。如图1所示，在这些细胞中没有发现关于可逆性后生p53基因沉默的证据。

实施例7

不同表达水平的MDM2和MDMX

不是AML中对MDM2抑制剂具有抗性的原因

MDM2和MDMX(即p53蛋白的两种关键调节因子)的表达水平可能是具有野生型p53外显子5-9的AML中就MDM2抑制剂处理的IC₅₀值所观察到的差异的原因和就p53蛋白质水平所观察到的差异的原因。为了验证该假设，首先对整个AML组中经归一化的MDM2和MDMX mRNA水平进行测量。然后将这些mRNA水平与具有野生型p53外显子5-9的所有AML病例中MDM2抑制剂所介导的细胞凋亡的IC₅₀值关联起来(图4A和4B)。

如图4A和4B所示，MDMX的水平或MDM2的水平都不与MI-219的IC₅₀值相关。例如，对于具有野生型p53且MI-219IC₅₀值>10μM的AML病例，平均ΔCt平均MDMX-PGK1值为5.2且对于具有野生型p53且MI-219IC₅₀值<10μM的AML病例，平均ΔCt平均MDMX-PGK1值为4.4，这表明与具有较小抗性或具有敏感性的胚细胞相比，具有抗性的胚细胞中的MDMX水平是稍微较低的(约1.7-倍)。

就MDM2而言，对于具有野生型p53且MI-219IC₅₀值>10μM的AML病例，平均ΔCt平均MDM2-PGK1值为3.1且对于具有野生型p53且MI-219IC₅₀值<10μM的AML病例，平均ΔCt平均MDM2-PGK1值为3.2，这表明与具有较小抗性或具有敏感性的胚细胞相比，具有抗性的胚细胞中的MDM2mRNA水平是相等的。

接下来在来自图3所示实验的胚细胞的溶胞产物中测量MDMX、MDM2和p21蛋白质水平。如图2和3所示，MDMX、MDM2或p21的蛋白质水平都没有显示出与MI-219的IC₅₀值的明确相关。

实施例8

获得性单亲二体(拷贝中性LOH)在AML中是常见的

且通常与p53突变或p53表达缺乏相关

为了得到关于AML中p53基因状态的更多信息，使用超高密度Affymetrix 6.0SNP阵列就获得性染色体拷贝数变异和LOH而言对来自110名AML病例的超纯AML胚细胞群的DNA样品和所配对的口腔DNA进行分析。

图5显示了在17p的亚染色体拷贝数状态(A组为口腔DNA且B组为来自AML胚细胞的DNA；p53在17p上位于~7.5Mb物理位置处)、在17p的LOH(C组)、p53外显子5-9序列数据(D组)和经归一化的p53mRNA数据(E组)。由此可知，17/110=15%的AML病例表现出LOH，所述LOH涉及跨越p53基因座的17p中的一部分或全部。重要的是，对拷贝丢失进行的配对分析揭示这些病例中的近一半(8)处于2N状态(红色编号)：在17p的拷贝中性LOH或获得性单亲二体(aUPD)的实例。应该注意的是，拷贝中性LOH是不可使用常规核型或CGH来检测的，因此在常规临床实践中被遗漏。考虑到拷贝中性LOH通常与基因突变相关，将LOH数据与p53序列数据和p53mRNA数据进行比较并发现这些与17p相关的aUPD病例中的6/8(红色)表现出纯合的p53突变(AML#12、41、88、117、153和157，组D)和1/8的病例(#120)具有非常少的p53mRNA表达。因此，获得性拷贝中性LOH在p53基因座是常见的，与大多数病例中的p53零状态相关且与对MDM2抑制剂处理的抗性相关。对p53基因和p53启动子进行的高分辨拷贝数分析在AML中没有鉴别出纯合缺失。

实施例9

FLT3-ITD与AML中对MDM2抑制剂处理的敏感性提高相关

上述对MDM2抑制剂离体敏感性的分析揭示了很多病例对MDM2抑制剂所介导的细胞凋亡是非常敏感的。致力于鉴别与MDM2抑制剂敏感性增加相关的标志物。就Flt3和NPM1(AML中两种最常见的突变基因)而言，首先在具有野生型p53外显子5-9的所有AML中，Flt3-ITD或NPM1外显子12突变的存在或不存在与MI-219的IC₅₀值是相关的。将AML组在第25个或第50个百分位数处(分别对应于大小为1.78μM和3.2μM的IC₅₀阈值)反复对分并分别针对突变的Flt3(FLT3-ITD)或NPM1的存在来确定Z-评分。通过该分析，Flt3-ITD显示出在敏感性AML病例中是显著富集的，其中第25个和第50个百分位数分析的Z-评分分别为1.91(p=0.06)和Z=2.26(p=0.02)。19个Flt3-ITD突变AML病例中的11个(58%)和19个Flt3-ITD突变AML病例中的13个(68%)分别具有<2μM和<2.25μM的MDM2抑制剂IC₅₀值。

进行类似的分析以对FLT3-ITD阳性病例与所有其他病例(N=90；包括p53外显子5-9突变病例)进行比较。通过该分析，Flt3-ITD再次显示出在敏感性AML病例中是显著富集的，其中第25个和第50个百分位数分析的Z-评分分别为2.42(p=0.02)和Z=(p=0.01)。

以三个互相排他的类别图解性地显示了全部109个AML病例的IC₅₀：1)存在p53外显子5-9突变，2)存在Flt3-ITD，和3)所有其它病例(参见图6)。如图6所示，大多数Flt3-ITD阳性AML病例表现出非常低的IC₅₀值和与野生型Flt3和野生型p53组相比显著较低的平均IC₅₀值(p=0.02)。因此，大多数具有Flt3-ITD突变的AML胚细胞对MDM2抑制剂处理是高度敏感的。因此，该分析第一次鉴别了针对MDM2抑制剂敏感性的临床相关基因组生物标记。

该报告总结了关于原发性AML胚细胞(N=109)中的分子决定因素和它们对MDM2抑制剂离体处理敏感性或抗性的影响的详细研究。该研究的一个发现是对AML中MDM2抑制剂原发性抗性的描述和定量分析。该研究表明：i)如所预期的那样，p53的突变赋予对MI-219的抗性，ii)在没有p53外显子5-9突变的情况下，p53的低表达或不表达存在于AML胚细胞小组中且与MDM2抑制剂抗性相关，和iii)不论是野生型p53还是MDM2抑制剂处理或辐射后强烈的p53蛋白质诱导，对MDM2抑制剂的抗性都存在于AML小组中，由此暗示了凋亡性p53网络中或p53蛋白中的缺陷。另外，对于全部AML病例中的约三分之一，各种AML胚细胞内在缺陷导致对MDM2抑制剂的原发性抗性；该分数比先前所认识到的大得多。

对于抗性AML胚细胞中的p53基因状态有多个发现：i)p53外显子5-9突变的频率为10%，这与先前所估计的一致(Fenaux,P.等人,Blood78:1652-1657(1991)；Stirewalt,D.L.等人,Blood 97:3589-3595(2001))且不足以解释大多数AML病例中对MDM2抑制剂的抗性，ii)在AML中，当在17p具有获得性UPD时，常常(所有p53突变中的~50%)出现p53突变，iii)一些具有跨越p53的17p缺失的AML病例携带野生型p53且对MI-219是敏感的，和iv)一些具有跨越p53的17p缺失的AML病例缺乏p53mRNA表达并因此对MI-219是具有抗性的。因此，对于AML，在p53基因状态中存在大量组合性分子多样性，其对MDM2抑制剂引起凋亡性AML胚细胞死亡的能力具有直接作用(Kojima,K.等人,Blood 106:3150-3159(2005)；Seifert,H.等人,Leukemia 23:656-663(2009))。

对于具有野生型p53外显子5-9并存在p53mRNA的抗性AML病例，有两个小组表现出以下情况：i)低p53蛋白或缺乏p53蛋白，或ii)保留的p53蛋白质水平。对于AML胚细胞小组中低p53蛋白的分子基础，最初进行的分析没有找到针对可逆性后生变化的支持证据。可能的是，缺陷性p53基因(包括启动子的改变或逆向对抗药理学尝试的后生变化)破坏了p53mRNA翻译或降低了独立于MDM2或MDMX水平的p53蛋白稳定性(Naski,N.等人,Cell Cycle 8:31-34(2009)；Ofir-Rosenfeld,Y.等人,Mol.Cell.32:180-189(2008)；MacInnes,A.W.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.105:10408-10413(2008)；Takagi,M.等人,Cell 123:49-63(2005)；Asher，G.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.99:3099-3104(2002)；Leng.R.P.等人,Cell 112:779-791(2003)；Dornan,D.等人,Nature 429:86-92(2004))。

考虑到原始材料的不足，没有对其进行进一步研究，但提出了关于p53状态和p53蛋白质水平之间的关联的疑问，这应该在进一步的研究中被评价。对于在MDM2抑制剂处理或外部照射后具有强烈p53蛋白质诱导的AML胚细胞，两种主要的分子缺陷是：i)缺陷性p53蛋白，其可能是由于p53的异常翻译后修饰，这导致p53激活细胞凋亡性信号传导途径的能力发生改变(Knights,C.D.等人,J.Cell.Biol.173:533-544(2006)；Di Giovanni,S.等人,EMBO J.25:4084-4096(2006)；Murray-Zmijewski,F.等人,Bat.Rev.Mol.Cell.Biol.9:702-712(2008))，或ii)p53所调节的细胞凋亡性网络存在缺陷。对于后一种可能性即p53细胞凋亡性网络存在缺陷，着重要注意的是，对各种p53诱导性基因在p53诱导后的细胞凋亡性应答中的相对重要性进行的定量分析是不可用的。在用RITA(而不是Nutlin)对细胞进行处理的情况下，最近已表明p21的下调在p53所诱导的细胞凋亡和细胞周期停滞之间提供开关(Enge,M.等人,Cancer Cell 15:171-183(2009))。

对用Nutlin或MI-219进行处理前和用Nutlin或MI-219进行处理后的p21蛋白质水平进行的分析也没有为MDM2抑制剂处理后p21在AML胚细胞命运抉择中的唯一作用提供明确的证据。对MI-219处理后敏感性胚细胞和抗性胚细胞中基因表达的变化进行的最初分析(未显示)鉴别了对一小组经典的p53应答性基因的差异诱导，但对该数据的解释被以下事实所阻碍：对白血病中p53所介导的细胞凋亡具有重要性的关键基因是未知的。因此，可能有除经典的p53应答性基因外的基因参与产生对MDM2抑制剂的抗性且对该基因的进一步分析对于充分理解MDM2抑制剂对髓细胞性白血病胚细胞的作用是重要的。

该分析的一个结果是离体鉴别了对MI-219非常敏感的AML胚细胞。约三分之一的AML病例对MI-219表现出<2μM的IC₅₀值。对该高度敏感性的决定因素所进行的鉴别揭示了与突变的FLT3(存在FLT3-ITD)频繁且显著的关联。例如，所有具有FLT3-ITD的AML样品(N=19)中的58%和84%分别表现出<2μM和<5μM的MI-219IC₅₀值。因此，激活的Flt3似乎使AML胚细胞对MDM2抑制剂所介导的细胞凋亡是敏感的，该发现可开发MDM2抑制剂在AML中的临床应用。

综上，该唯一的数据集(基于对>100名原发性AML病例进行的分析)定量地描述了在AML中对MDM2抑制剂的原发性抗性并为多种不同的分子机制提供了证据。因此，这些预料不到的发现在相当大的程度上使将MDM2抑制剂转变成对AML的治疗变得复杂并为对AML中的抗性机制进行进一步深入的临床前研究提供了理论基础。这些研究还为在对MDM2抑制剂具有原发性抗性的AML中进行联合靶向治疗以试图克服抗性提供了理论基础(Kojima,K.等人,Leukemia 22:1728-1736(2008))。

相反地，基于所公开的发现(Kojima,K.等人,Leukemia 24:33-43(2010))不能预期以下发现即突变的FLT3(FLT3-ITD)与对MDM2抑制剂的高度敏感性是相关的且该发现对于AML疗法可能是重要的，这是因为：i)FLT3-ITDAML病例倾向于具有短的消退期，ii)使用FLT3抑制剂单一疗法对FLT3进行的治疗性阻断还未对患者产生程度相当大的临床益处，和iii)MDM2抑制剂在具有突变的Flt3和完整的p53的AML中的应用将提供临床益处(Bacher,U.等人,Blood 111:2527-2537(2008))。因此，对MDM2抑制剂敏感性的基因组生物标记进行的描述引入了“MDM2抑制剂增敏子基因突变”这一概念并表明目前对具有类似作用的其它基因正在进行的研究是合理的。最后，所述MDM2抑制剂增敏子突变也将解释赘生细胞对MDM2抑制剂处理的高度敏感性。

实施例10

对MV4-11和MOLM-13AML细胞系的细胞生长抑制和细胞毒性作用

对表3中的化合物对两种AML细胞系即MV4-11和MOLM-13(来自TheDSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH,编号分别为DSMZ ACC554和DSMZ ACC102)的细胞生长抑制和细胞毒性作用进行评价。这两种细胞系都具有FLT3-ITD突变(Quentmeier,H.等人,Leukemia 17:120-124(2003))。对于生长抑制测定，以96孔模式将细胞与表2中的化合物一起孵育96小时。对细胞接种条件进行调整以在该测定模式下实现显著的细胞生长。生长抑制测定使用Celltiter-Glo发光试剂盒(Promega)来进行。计算两种化合物在两种AML细胞系中的IC₅₀值(生长抑制百分比等于测试化合物最大抑制作用的一半时的浓度)且范围为10nM至100nM。

对于细胞毒性测定，以6孔模式将细胞与表2中的化合物一起孵育96小时。对细胞接种条件进行调整以在该测定模式下实现显著的细胞生长。细胞毒性作用使用锥虫蓝染色法来进行。浮游的细胞和附着的细胞都用锥虫蓝染色。通过既确定细胞浓度又确定活细胞百分比的Vi-

细胞活力分析仪(Beckmann-Coulter)来定量。对于表2中浓度接近IC₉₀浓度(生长抑制百分比等于测试化合物最大抑制作用的90%时的浓度)的两种化合物，活细胞百分比与未经处理的细胞相比是显著降低的且在MV4-11细胞系中至多为50至70%且就MOLM-13细胞系而言低于50%。

本申请提供的方法和组合物的宽度和范围不应该被限于上述任意示例性实施方案，而是仅应该根据所附权利要求书及其等同形式来定义。

上述具体实施方案如此充分地揭示了本申请提供的方法和组合物的一般性质以致于其他人可通过应用本领域技术知识而容易地就各种应用对所述具体实施方案进行改变和/或调整而不进行过度的实验且不背离本申请提供的方法和组合物的一般概念。因此，根据本申请提供的教导和指导，所述调整和改变在所公开的实施方案的等同形式的定义和范围内。应该理解的是，本申请措辞和术语出于描述而非限制目的，因此根据所述教导和指导，本说明书中的术语和措辞是能被本领域技术人员所理解的。

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