JP2018523119A - Ｔａｓｅｌｉｓｉｂを用いた治療方法 - Google Patents

Ｔａｓｅｌｉｓｉｂを用いた治療方法 Download PDF

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Abstract

Ｔａｓｅｌｉｓｉｂ（ＧＤＣ−００３２）は、突然変異−ｐ１１０アルファタンパク質の分解を誘導する。ｔａｓｅｌｉｓｉｂによる治療のための、突然変異ＰＩ３Ｋ腫瘍を有する患者を選択するための方法が記載される。【選択図】図１

Description

関連出願
３７ ＣＦＲ １．５３（ｂ）の下に出願された本非仮特許出願は、２０１５年６月２９日出願の米国仮特許出願第６２／１８６２３６号の米国特許法１１９（ｅ）に基づく利益を主張し、この仮出願の全体は引用により本明細書に包含される。
発明の分野
本発明は、概してＰＩ３Ｋ阻害化合物であるｔａｓｅｌｉｓｉｂ（ＧＤＣ−００３２）によるがんの治療に関する。本発明はまた、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｉｎ ｓｉｔｕ、及びｉｎ ｖｉｖｏでの哺乳動物細胞又は関連する病的状態の診断又は治療のためのｔａｓｅｌｉｓｉｂの使用方法に関する。
ホスホイノシチド３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）／Ａｋｔシグナル伝達経路の上方制御は、多くのがんに共通の特徴である（Yuan and Cantley （2008） Oncogene 27:5497-510）。経路内の遺伝的偏差は、多くのヒトがんに検出されており（Osaka et al （2004）Apoptosis 9:667-76）、主に細胞の増殖、移動及び生存を刺激するように作用する。点突然変異の活性化又はｐ１１０ａ ＰＩ３ＫアイソフォームをコードするＰＩＫ３ＣＡ遺伝子の増幅に続いて経路の活性化が起こる（Samuels et al （2004）Science 304:554; Hennessy et al （2005） Nat. Rev. Drug Discov. 4 （988-1004）。腫瘍抑制因子ＰＴＥＮ（ＰＩ３Ｋとは反対の機能を有するホスファターゼ）内の遺伝子欠失又は機能欠損の突然変異も、ＰＩ３Ｋ経路のシグナル伝達を増加させる（Zhang and Yu （2010）Clin. Cancer Res. 16 （4325-30）。
これら異常は、Ａｋｔ及びｍＴＯＲといったキナーゼによる下流でのシグナル伝達の増加を招き、ＰＩ３Ｋ経路の活性亢進は、がん治療に対する耐性の特徴として提言されている（Opel et al （2007）Cancer Res. 67:735-45; Razis et al （2011） Breast Cancer Res. Treat. 128:447-56）。
ホスファチジルイノシトール３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）シグナル伝達経路は、ホルモン受容体（ＨＲ）陽性転移性乳がん（ｍＢＣ）において最も調整不全の経路の一つである（Bachman KE, et al. Cancer Biol Ther. 2004; 3:772-775; Stemke-Hale K, et al. Cancer Res. 2008; 68:6084-6091; Koboldt DC, et al. Nature 2012; 490:61-70）。ホスファチジルイノシトール−４，５−ビホスフェート３−キナーゼ、触媒サブユニットアルファ（ＰＩＫ３ＣＡ）は、ＰＩ３Ｋ触媒サブユニットのＰＩ３Ｋαアイソフォーム（ｐ１１０）をコードし（Samuels Y, et al. Science 2004; 304:554）、ＨＲ陽性ＢＣの〜４０％にこの遺伝子内に突然変異が検出されている（Arthur LM, et al. Breast Cancer Res Treat. 2014; 147:211）。
ホスファチジルイノシチド３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）は、リンパ腫の重要な生存及び増殖シグナルのための主要なシグナル伝達リンパ節であり、ホスファターゼＰＴＥＮの活性に対抗する。ＰＩ３Ｋ経路は、侵襲型のリンパ腫において調整不全である（Abubaker （2007）Leukemia 21:2368-2370）。ＤＬＢＣＬ（びまん性大Ｂ細胞型リンパ腫）がんの八パーセントがＰＩ３ＫＣＡ（ホスファチジルイノシトール−３キナーゼ触媒サブユニットアルファ）ミスセンス突然変異を有し、免疫組織化学試験では３７％がＰＴＥＮ陰性である。
ホスファチジルイノシトールは、細胞膜に見られる複数のリン脂質の一つであり、細胞内シグナル伝達に関与する。３'−リン酸化ホスホイノシチドを介した細胞シグナル伝達は、様々な細胞プロセス、例えば、悪性形質転換、増殖因子シグナル伝達、炎症、及び免疫に関与していた（Rameh et al （1999）J. Biol Chem. 274:8347-8350）。これらリン酸化シグナル伝達産物を生成する酵素であるホスファチジルイノシトール３−キナーゼ（ＰＩ ３−キナーゼ又はＰＩ３Ｋとも呼ばれる）は、最初にウイルス性腫瘍性タンパク質及びホスファチジルイノシトール（ＰＩ）及びそのリン酸化誘導体をイノシトール環の３'−ヒドロキシルにおいてリン酸化する成長因子受容体チロシンキナーゼとして同定された（Panayotou et al （1992） Trends Cell Biol 2:358-60）。ホスホイノシチド３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）は、イノシトール環の３−ヒドロキシル残基において脂質をリン酸化する脂質キナーゼである（Whitman et al （1988）Nature, 332:664）。ＰＩ３−キナーゼによって生成される３−リン酸化リン脂質（ＰＩＰ３）は、Ａｋｔ及びＰＤＫ１（ホスホイノシチド依存性キナーゼ−１）といった、脂質結合ドメイン（プレクストリン相同（ＰＨ）ドメインを含む）を有するキナーゼを補充するセカンドメッセンジャーとして機能する（Vivanco et al （2002）Nature Rev. Cancer 2:489; Phillips et al （1998） Cancer 83:41）。
ＰＩ３キナーゼファミリーは、構造相同性によって小分類される少なくとも１５の異なる酵素を含み、配列相同性及び酵素の触媒により形成される産物に基づいて３のクラスに分けられる。クラスＩのＰＩ３キナーゼは、２のサブユニット、即ち１１０ｋｄの触媒サブユニットと８５ｋｄの調節サブユニットからなる。調節サブユニットは、ＳＨ２ドメインを含み、チロシンキナーゼ活性を有する成長因子受容体又は癌遺伝子産物によってリン酸化されたチロシン残基に結合し、それによりその脂質基質をリン酸化するｐ１１０触媒サブユニットのＰＩ３Ｋ活性を誘導する。クラスＩのＰＩ３キナーゼは、サイトカイン、インテグリン、増殖因子及び免疫受容体といった重要なシグナル伝達イベントに関与し、このことは、この経路の制御が細胞増殖及び癌形成の調節といった重要な治療効果に繋がりうることを示唆する。クラスＩ ＰＩ３Ｋは、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）、ホスファチジルイノシトール−４−ホスフェート、及びホスファチジルイノシトール−４，５−ビホスフェート（ＰＩＰ２）をリン酸化して、それぞれホスファチジルイノシトール−３−ホスフェート（ＰＩＰ）、ホスファチジルイノシトール−３，４−ビスホスホネート及びホスファチジルイノシトール−３，４，５−トリホスフェートを生成することができる。クラスＩＩのＰＩ３Ｋは、ＰＩ及びホスファチジルイノシトール−４−ホスフェートをリン酸化する。クラスＩＩＩのＰＩ３Ｋは、ＰＩのみをリン酸化することができる。がんにおいて重要なＰＩ３−キナーゼアイソフォームは、ｐ１１０αにおける再発性がん遺伝子突然変によって示されるクラスＩ ＰＩ３−キナーゼ、ｐ１１０αである（Samuels et al （2004）Science 304:554；ＵＳ ５８２４４９２；米国特許第５８４６８２４号；米国特許第６２７４３２７号）。他のアイソフォームが、がんにおいて重要である場合があり、心血管性及び免疫炎症性疾患にも関与している（Workman P （2004）Biochem Soc Trans 32:393-396; Patel et al （2004） Proc. Am. Assoc. of Cancer Res. （Abstract LB-247） 95th Annual Meeting, March 27-31, Orlando, Florida, USA; Ahmadi K and Waterfield MD （2004） “Phosphoinositide 3-Kinase: Function and Mechanisms” Encyclopedia of Biological Chemistry （Lennarz W J, Lane M D eds） Elsevier/Academic Press）。
Ｒａｓの後、ＰＩ３Ｋが、がんにおいて変異の度合いが二番目に大きいがん遺伝子である。ｐ１１０アルファのがん遺伝子突然変異は、結腸、***、脳、肝臓、卵巣、胃、肺、及び頭頚部の固形腫瘍に高い頻度で観られた。約３５〜４０％のホルモン受容体陽性（ＨＲ＋）乳がん腫瘍がＰＩＫ３ＣＡ突然変異を有している。ＰＴＥＮの異常は、膠芽細胞腫、メラノーマ、前立腺がん、子宮内膜がん、卵巣がん、乳がん、肺がん、頭頚部のがん、肝細胞がん、及び甲状腺がんにも見られた。ホスファターゼ・テンシンホモログ（ＰＴＥＮ）は、ヒトにおいて、ＰＴＥＮ遺伝子によってコードされるタンパク質である（Steck PA, et al （1997） Nat. Genet. 15 （4） （356-62）。この遺伝子の突然変異は、多くのがんの発生の一段階である。ＰＴＥＮは、そのホスファターゼタンパク質産物の作用により腫瘍抑制因子遺伝子として作用する。このホスファターゼは、細胞周期の制御に関与しており、細胞の増殖及び速すぎる分割を妨げる（Chu EC, et al （2004） Med. Sci. Monit. 10 （10） RA235-41）。
ＰＩ３キナーゼは、ｐ８５及びｐ１１０サブユニットからなるヘテロ二量体である（Otsu et al （1991）Cell 65:91-104; Hiles et al （1992） Cell 70:419-29）。各々が別個の１１０ｋＤａの触媒サブユニット及び調節サブユニットからなる四つの異なるクラスＩ ＰＩ３Ｋアイソフォームが同定され、ＰＩ３Ｋα（アルファ）、β（ベータ）、δ（デルタ）、及びγ（ガンマ）と命名された。触媒サブユニットのうちの三つ、即ち、ｐ１１０アルファ、ｐ１１０ベータ及びｐ１１０デルタは、各々が同じ調節サブユニット、ｐ８５と相互作用し、ｐ１１０ガンマは別個の調節サブユニット、ｐ１０１と相互作用する。ヒト細胞及び組織におけるこれらＰＩ３Ｋの各々の発現パターンは異なる。ＰＩ３Ｋアルファ、ベータ、及びデルタアイソフォームサブタイプの各々において、ｐ８５サブユニットは、標的タンパク質内において、そのＳＨ２ドメインとリン酸化チロシン残基（適切な配列関係内に存在する）との相互作用によりＰＩ３キナーゼを原形質膜に局在化させるように作用する（Rameh et al （1995）Cell, 83:821-30; Volinia et al （1992） Oncogene, 7:789-93）。
バイオマーカーのレベル（例えば、血漿中分泌タンパク質の発現レベル又は機能タンパク質レベル）を測定することは、例えば、化学療法剤による治療を含む特定の療法に応答する患者及び患者集団を同定するための有効な手段である。がんのような過剰増殖性疾患を有するどのような患者が、化学療法剤によるどのような治療に応答すると思われるかを決定するため、及び化学療法剤が単剤として使用されるか又は他の薬剤と組み合わせて使用されるかに関係なく、そのような決定を患者のためのさらに有効な治療レジメンに組み込むための、さらに有効な手段に対する需要が存在する。
細胞の生存、成長、及び代謝の重要なメディエーターであるホスホイノシチド３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）シグナル伝達カスケードは、ヒトのがんにおいてしばしば変性する。ＰＩ３Ｋのα−触媒サブユニットをコードする遺伝子であるＰＩＫ３ＣＡにおける突然変異の活性化は、乳がんの約３０％に起こる。このような突然変異は、酵素の恒常的活性をもたらし、がん遺伝子である。管腔***内皮における突然変異ＰＩＫ３ＣＡ Ｈ１０４７Ｒの発現は、管腔及び基底マーカーを発現し、エストロゲン受容体について陽性である異種腫瘍を引き起こす。ＰＩＫ３ＣＡ Ｈ１０４７Ｒがん遺伝子は、多分化能前駆細胞を標的とし、ＰＩＫ３ＣＡ Ｈ１０４７Ｒによりヒト***腫瘍の特徴を再現する（Meyer et al （2011）. Cancer es; 71（13）:4344-51）。ＰＩ３Ｋの過剰活性化は、ＰＩ３Ｋのｐ１１０αサブユニットをコードする遺伝子であるＰＩＫ３ＣＡにおける体細胞突然変異の結果として起こる。ＨＥＲ２ がん遺伝子は、すべての乳がんの２５％において増幅され、これら腫瘍の一部はＰＩＫ３ＣＡ突然変異も有している。ＰＩ３Ｋは、形質転換を亢進し、ＨＥＲ２指向療法への耐性を付与しうる。さらにＨＥＲ２を過剰発現するＭＣＦ１０Ａヒト***上皮細胞に導入されたＰＩ３Ｋ突然変異Ｅ５４５Ｋ及びＨ１０４７Ｒは、ＭＣＦ１０Ａ／ＨＥＲ２細胞に機能の獲得をもたらした。Ｅ５４５Ｋ ＰＩ３Ｋを発現しないＨ１０４７Ｒ ＰＩ３Ｋの発現は、ＨＥＲ３／ＨＥＲ４リガンドへレグリン（ＨＲＧ）を著しく上方制御した（Chakrabarty et al （2010） Oncogene 29（37）:5193-5203）。
ＰＩ３キナーゼ／Ａｋｔ／ＰＴＥＮ経路は、がんの薬の開発にとって、このような薬剤には細胞増殖を阻害し、がん細胞の生存及び化学的抵抗を提供する間質細胞由来のシグナルを抑え、アポトーシスの抑制を逆転させ、且つ細胞傷害性剤に対するがん細胞の固有耐性に打ち勝つことが期待されるため、魅力的な標的である。特定のチエノピリミジン化合物は、ｐ１１０アルファ結合、ＰＩ３キナーゼ阻害活性を有し、がん細胞の増殖を阻害する（Wallin et al （2011）Mol. Can. Ther. 10（12）:2426-2436; Sutherlin et al （2011） Jour. Med. Chem. 54:7579-7587；米国特許出願公開第２００８／０２０７６１１号；米国特許第７８４６９２９号；米国特許第７７８１４３３号；米国特許出願公開第２００８／００７６７５８号；米国特許第７８８８３５２号；米国特許出願公開第２００８／０２６９２１０号）。ＧＤＣ−０９４１（ピクチリシブ、ＣＡＳ Ｒｅｇ．Ｎｏ．９５７０５４‐３０‐７、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ Ｉｎｃ．）は、有望な薬物動態学的及び製薬的特性を有するＰＩ３Ｋの、選択的で、経口投与される生体利用可能な阻害剤であり（Folkes et al （2008）Jour. of Med. Chem. 51（18）:5522-5532；米国特許第７７８１４３３号；米国特許第８３２４２０６号；Belvin et al, American Association for Cancer Research Annual Meeting 2008, 99th:April 15, Abstract 4004; Folkes et al, American Association for Cancer Research Annual Meeting 2008, 99th:April 14, Abstract LB-146; Friedman et al, American Association for Cancer Research Annual Meeting 2008, 99th:April 14, Abstract LB-110; Wallin et al （2012） Clin. Cancer Res.18:3901-3911; Yuan et al （2013） Oncogene 32:318-326; O'Brien et al （2010） Clin Cancer Res. 16:3670-3683; Salphati et al （2010） Drug Metab. and Disp. 38（9）:1436-1442; Edgar et al （2010） Cancer Res. 70:1164-1172）、固体腫瘍細胞株に対して特定の化学療法剤との組み合わせにおいてｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏで相乗的活性を示す（米国特許第８２４７３９７号；米国特許第８６０４０１４号；米国特許第８５３６１６１号）。
Ｔａｓｅｌｉｓｉｂ（ＧＤＣ−００３２、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ Ｉｎｃ．，Ｒｏｃｈｅ ＲＧ７６０４、ＣＡＳ Ｒｅｇ．Ｎｏ．１２８２５１２−４８−４）は、２−（４−（２−（１−イソプロピル−３−メチル−１Ｈ−１，２，４−トリアゾール−５−イル）−５，６−ジヒドロベンゾ［ｆ］イミダゾ［１，２−ｄ］［１，４］オキサゼピン−９−イル）−１Ｈ−ピラゾール−１−イル）−２−メチルプロパンアミドと命名され、選択的且つ強力な、経口投与により生体利用可能なＰＩ３Ｋアルファ（α）の阻害剤であり、Ｋｉ＝０．２ｎＭであり、且つＰＩ３Ｋベータ（β）に対するその阻害活性は低い（Ndubaku et al （2013）Jour. Med. Chem. 56（11）:4597-4610; Staben et al （2013） Bioorg. Med. Chem. Lett. 23 2606-2613；国際公開第２０１１／０３６２８０号；米国特許第８２４２１０４号；米国特許第８３４３９５５号；米国特許第８５８６５７４号；米国特許出願公開第２０１４／００４４７０６号）。Ｔａｓｅｌｉｓｉｂは、局所的に進行した固形腫瘍又は転移性固形腫瘍を有する患者において研究されている。この選択的プロファイルと、優良な薬物動態学的及び製薬的特性は、ＰＩＫ３ＣＡ突然変異異種移植片において、ｐａｎクラスＩ ＰＩ３Ｋ阻害剤、ＧＤＣ−０９４１（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ Ｉｎｃ．、ピクチリシブ）と比較して、最大耐量でｉｎ ｖｉｖｏでの有効性を高めることを可能にした。ホスホイノシチド−３キナーゼアルファアイソフォーム（ＰＩＫ３ＣＡ）の突然変異は、乳がんに多く、ＰＩ３Ｋシグナル伝達経路を活性化した（Kang et al （2005）Cell Cycle 4（4）:578-581）。突然変異は、ｐ８５サブユニットとの阻害性相互作用を弱めることによりヘリックス突然変異が活性化する脂質結合を増大させる（Zhao and Vogt （2008）Oncogene 27（41）:5486-5496）。キナーゼドメイン突然変異は、タンパク質立体配座を変化させることにより活性化する（Burke et al （2012）Proc. Natl. Acad. Sci. 109（38）,15259-15264）。明らかに、ＧＤＣ−００３２は、野生型ＰＩ３Ｋを有する細胞と比較して、ＰＩＫ３ＣＡ突然変異細胞を優先的に阻害する。ＧＤＣ−００３２は、ＰＩ３Ｋの下流でシグナル伝達を強力に阻害し、乳がん細胞株及びＰＩＫ３ＣＡ突然変異を有する異種移植モデルに低濃度でアポトーシスを誘導する。ＧＤＣ−００３２の突然変異バイアスは、突然変異アイソフォームに対する細胞力価及び受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）シグナル伝達の減少を含むＧＤＣ−００３２に固有の特性とリンクしている。
Ｔａｓｅｌｉｓｉｂは、クラスＩのＰＩ３Ｋα、−δ、及び−γアイソフォームの強力で選択的な阻害剤であり、野生型ＰＩ３Ｋαよりも突然変異ＰＩ３Ｋαアイソフォームに対して高い選択性を呈する（Olivero A, et al. American Association for Cancer Research annual meeting, Washington, DC, USA, April 6-10, 2013; Wallin J, et al. 36th San Antonio Breast Cancer Symposium, San Antonio, TX, USA, December 10-14, 2013）。ＰＩＫ３ＣＡ突然変異乳がん（ＢＣ）モデルでは、ｔａｓｅｌｉｓｉｂは、ＥＲアンタゴニストフルベストラントを含む標準治療療法の有効性を強化した（Sampath D, et al, 36th San Antonio Breast Cancer Symposium （SABCS）, San Antonio, TX, USA, Dec. 10-14, 2013）。ＰＩＫ３ＣＡ突然変異は、乳がん（ＢＣ）に最も多いゲノム異常であり、エストロゲン受容体（ＥＲ）陽性、ＨＥＲ２陰性***腫瘍の約４０％に存在している。ＰＩＫ３ＣＡの突然変異は、腫瘍の成長及び増殖を促進し、ＢＣの内分泌療法に対する耐性を媒介する。Ｔａｓｅｌｉｓｉｂは、野生型ＰＩ３Ｋα（アルファ）より突然変異 ＰＩ３Ｋαに対して大きな選択性を呈する。Ｔａｓｅｌｉｓｉｂは、ＰＩＫ３ＣＡ突然変異乳がん細胞株に対抗する活性を強化するもので、臨床データには、単剤としての又はフルベストラントとの組み合わせでのｔａｓｅｌｉｓｉｂで治療したＰＩＫ３ＣＡ突然変異ＢＣ患者に部分寛解が確認されたことが含まれている。
Ｔａｓｅｌｉｓｉｂ（ＧＤＣ−００３２、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ Ｉｎｃ．，Ｒｏｃｈｅ ＲＧ７６０４、ＣＡＳ Ｒｅｇ．Ｎｏ．１２８２５１２−４８−４）は、２−（４−（２−（１−イソプロピル−３−メチル−１Ｈ−１，２，４−トリアゾール−５−イル）−５，６−ジヒドロベンゾ［ｆ］イミダゾ［１，２−ｄ］［１，４］オキサゼピン−９−イル）−１Ｈ−ピラゾール−１−イル）−２−メチルプロパンアミド）と命名されて、突然変異ｐ１１０アルファタンパク質の分解を誘導する。ＰＩ３Ｋ阻害剤のｐ１１０分解能は、臨床応答と相関している。ｐ１１０アルファタンパク質の枯渇は、ｔａｓｅｌｉｓｉｂによる治療に応答する患者を同定しうる。
ＧＤＣ−００３２（ｔａｓｅｌｉｓｉｂ）
Ｔａｓｅｌｉｓｉｂは、用量、時間、ユビキチン及びプロテアソーム依存性に、突然変異ｐ１１０アルファサブユニットの分解を特異的に促進する。これまでに試験されたすべてのｐ１１０突然変異について観察されたこのような効果は、ｐ１１０−ｐ８５相互作用の不安定化により媒介されていると思われる。
野生型ＰＩ３Ｋタンパク質には起こらない突然変異ＰＩ３Ｋタンパク質の分解は、ＲＴＫ駆動ＰＩ３Ｋ経路の再活性化を防けると思われ、ＰＩ３Ｋ阻害剤の使用の治療濃度域を広げることができると考えられる。
本発明の一態様は、ｔａｓｅｌｉｓｉｂによる治療のための患者を選択する方法であり、この方法は：
（ａ）ｔａｓｅｌｉｓｉｂを用いた患者から得られた生物学的試料を処理すること；及び
（ｂ）ｐ１１０アルファタンパク質の枯渇を検出すること；
を含み、生物学的試料におけるｐ１１０アルファタンパク質の枯渇が、ｔａｓｅｌｉｓｉｂによる治療に応答するであろう患者を同定する。ｐ１１０アルファタンパク質の枯渇は、化合物に対する患者の治療的応答性を示し、抗ｐ１１０アルファ抗体への結合により測定されうる。試料中のｐ１１０アルファタンパク質に対する抗ｐ１１０アルファ抗体の結合は、ウェスタンブロット分析、酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、免疫組織化学（ＩＨＣ）、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）、又は逆相タンパク質アレイにより決定される。
本発明の一態様は：
（ａ）患者から得られた生物学的試料を、Ｈ１０４７Ｒ、Ｃ４２０Ｒ、Ｈ１０４７Ｌ、Ｅ５４２Ｋ、Ｅ５４５Ｋ及びＱ５４６Ｒから選択される突然変異を含むＰＩＫ３ＣＡ突然変異状態について試験すること；
（ｂ）ＰＩＫ３ＣＡ突然変異を有する患者由来の生物学的試料をｔａｓｅｌｉｓｉｂと接触させ、ｐ１１０アルファアイソフォームの枯渇を検出すること；及び
（ｃ）ｔａｓｅｌｉｓｉｂを、ＰＩＫ３ＣＡ突然変異を有する患者に投与すること
を含む、患者の治療法である。生物学的試料は循環性腫瘍細胞でもよい。ｔａｓｅｌｉｓｉｂと組み合わせて、患者には、５−ＦＵ、ドセタキセル、エリブリン、ゲムシタビン、ＧＤＣ−０９７３、ＧＤＣ−０６２３、パクリタキセル、タモキシフェン、フルベストラント、デキサメタゾン、ペルツズマブ、トラスツズマブエムタンシン、トラスツズマブ及びレトロゾールから選択される化学療法剤が投与されうる。患者は、ＨＥＲ２発現乳がん又はエストロゲン受容体陽性（ＥＲ＋）乳がんに罹患している場合もある。がんは転移性でありうる。Ｔａｓｅｌｉｓｉｂは、アジュバント設定において患者に投与されてよい。
本発明の一態様は、ｔａｓｅｌｉｓｉｂによる治療のための、ＰＩＫ３ＣＡ突然変異を有する患者を選択する方法であり、この方法は：
（ａ）患者から得られた生物学的試料中のＰＩＫ３ＣＡ突然変異を検出すること；
（ｂ）ｔａｓｅｌｉｓｉｂの投与に先立って患者から得られた生物学的試料中のｐ１１０アルファのレベルと、ｔａｓｅｌｉｓｉｂの投与後に患者から得られた生物学的試料中のｐ１１０アルファのレベルとを比較すること
を含み、ｔａｓｅｌｉｓｉｂの投与後に患者から得られた生物学的試料中のｐ１１０アルファのレベルの枯渇が、ｔａｓｅｌｉｓｉｂによる治療に応答するであろう患者を同定する。
本発明の一態様は：
（ａ）ｔａｓｅｌｉｓｉｂの投与に先立ってがん患者から得られた生物学的試料中のｐ１１０アルファのレベルと、ｔａｓｅｌｉｓｉｂの投与後に患者から得られた生物学的試料中のｐ１１０アルファのレベルとを比較すること、及び
（ｂ）患者に投与されるｔａｓｅｌｉｓｉｂ療法の投薬量、投与頻度、又は過程を変更すること
を含む、がんの治療方法である。
本発明の一態様は、がん患者における治療有効性の監視方法であり、この方法は：
（ａ）患者にｔａｓｅｌｉｓｉｂを投与すること；
（ｂ）ｔａｓｅｌｉｓｉｂの投与後に患者から得られた生物学的試料中のｐ１１０アルファを測定すること；及び
（ｃ）患者に投与されるｔａｓｅｌｉｓｉｂ療法の投薬量、投与頻度、又は過程を変更すること
を含む。
本発明の一態様は、がんを有すると診断された患者のための治療レジメンを選択する方法であり、この方法は、患者のがん細胞を有効量のｔａｓｅｌｉｓｉｂと接触させること、及びｔａｓｅｌｉｓｉｂに応答したｐ１１０アルファのレベルを検出することを含み、ｐ１１０アルファの枯渇の検出が、がんがｔａｓｅｌｉｓｉｂによる治療に感受性であることを示し、治療レジメンは、がんがｔａｓｅｌｉｓｉｂによる治療に感受性であると決定された場合に患者にｔａｓｅｌｉｓｉｂを投与することを含む。
がん細胞は、ＰＩＫ３ＣＡの突然変異がん細胞でありうる。
本発明の一態様は：
ａ）患者にｔａｓｅｌｉｓｉｂを投与すること；
ｂ）患者から得られた生物学的試料中のｐ１１０アルファのレベル又はｐ１１０アルファのレベルと相関するバイオマーカーにおける変化を測定すること；及び
ｃ）患者から得られた生物学的試料中にｐ１１０アルファの枯渇を示す患者に投与されるｔａｓｅｌｉｓｉｂ療法の投薬量、投与頻度、又は過程を選択すること
を含む、がんの治療方法である。ｐ１１０アルファのレベルの変化はｐ１１０アルファのレベルの枯渇とすることができる。
本発明の一態様は、がんの治療においてｔａｓｅｌｉｓｉｂに対する応答性を監視するためのバイオマーカーを同定する方法であり、この方法は：
（ａ）少なくとも一用量のｔａｓｅｌｉｓｉｂを投与された患者から得られた生物学的試料中のｐ１１０アルファのレベルと相関するバイオマーカーの発現、変調、又は活性を検出すること；及び
（ｂ）バイオマーカーの発現、変調、又は活性を、ｔａｓｅｌｉｓｉｂの投与に先立って患者から得られた生物学的試料である基準試料中のバイオマーカーの状態と比較すること；
を含み、基準試料と比較して、バイオマーカーの変化が少なくとも２分の１への低下又は少なくとも２倍への増加に相当する変調が、ｔａｓｅｌｉｓｉｂに対する応答性を監視するために有用なバイオマーカーとして同定される。がんはＨＥＲ２発現乳がんでありうる。
本発明の一態様は、患者に治療的有効量のｔａｓｅｌｉｓｉｂを投与することを含む、患者のがんの治療方法であり、治療は、患者から得られた生物学的試料中のｐ１１０アルファのレベルと相関するバイオマーカーを検出することに基づいている。生物学的試料は、腫瘍生検試料又は循環性腫瘍細胞とすることができる。
ｔａｓｅｌｉｓｉｂによるｐ１１０ａタンパク質分解のウェスタンブロット分析が用量依存性であり、且つＰＩ３Ｋａ突然変異細胞に特異的であることを示している。この作用機序により、ｔａｓｅｌｉｓｉｂは、そうでなければ抗腫瘍活性を弱めてしまうＲＴＫによるフィードバックの影響を減少させることができる。 ｔａｓｅｌｉｓｉｂ、ピクチリシブ（ＧＤＣ−０９４１、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、及びアルペリシブ（ＢＹＬ７１９、Ｎｏｖａｒｔｉｓ ＣＡＳ＃：１２１７４８６（−６１−７）で２４時間処理したＨＣＣ１９５４細胞（ＰＩＫ３ＣＡ Ｈ１０４７Ｒ）のウェスタンブロット分析を示している。臨床開発中の他の経口ＰＩ３Ｋ阻害剤であるピクチリシブ及びアルペリシブは、突然変異ｐ１１０ａタンパク質を分解しない。 ｔａｓｅｌｉｓｉｂで処理したＰＩＫ３ＣＡ野生型ＨＤＱＰ１乳がん細胞及び突然変異ＨＣＣ１９５４（ＰＩＫ３ＣＡ Ｈ１０４７Ｒ）乳がん細胞のウェスタンブロット分析を示している。ｔａｓｅｌｉｓｉｂは、ｐ８５のレベルに影響を及ぼすことなくＰＩＫ３ＣＡの突然変異細胞株中のｐ１１０ａを枯渇させる。 様々な濃度、即ち０．２μＭ、１μＭ、５μＭのｔａｓｅｌｉｓｉｂとコントロール（ＤＭＳＯビヒクル）とを用いた、ＳＷ４８親ＰＩＫ３ＣＡ野生型，突然変異同質遺伝子的ＳＷ４８Ｅ５４５Ｋヘテロ接合体（ｈｅｔ）、及びＰＩＫ３ＣＡの突然変異同質遺伝子的ＳＷ４８Ｈ１０４７Ｒヘテロ接合体細胞を含むＳＷ４８同質遺伝子株のウェスタンブロット分析を示している。 １８Ｓコントロールに対する相対的ｐ１１０アルファｍＲＮＡ発現レベルにより測定した細胞内ｐ１１０アルファｍＲＮＡ発現のグラフである。薬物は、ｐ１１０ａのｍＲＮＡ発現を変化させない。 ＣＲＩＳＰＲ（クラスター化された規則的に間隔を空けた短いパンドローム反復）生成ＳＷ４８Ｅ５４５Ｋヘミ接合株（重複する二つのクローン）のウェスタンブロット分析を示している。このウェスタンブロットは、ＳＷ４８Ｅ５４５Ｋヘテロ接合株と比較して有意に低下した突然変異ｐ１１０ａのレベルを示し、このことは、突然変異ｐ１１０ａの安定性がＷＴ ｐ１１０ａより低いことを示唆している。レーンは、左から右へ、ＳＷ４８Ｅ５４５Ｋヘミ接合クローン１、ＳＷ４８Ｅ５４５Ｋヘミ接合クローン２、ＳＷ４８親、ＳＷ４８Ｅ５４５Ｋヘテロ接合、ＳＷ４８Ｅ５４５Ｋヘテロ接合である。 １μＭ及び５μＭのｔａｓｅｌｉｓｉｂとコントロール（ＤＭＳＯビヒクル）で処理したＰＩＫ３ＣＡの突然変異ＨＣＣ１９５４（ＰＩＫ３ＣＡ Ｈ１０４７Ｒ）乳がん細胞のウェスタンブロット分析を示している。Ｐ１１０アルファ（ｐ１１０ａ）は、時間依存性に枯渇する。 ｔａｓｅｌｉｓｉｂ（ＧＤＣ００３２）で処理したＨＣＣ１９５４野生型（左）及びＨ１０４７Ｒ突然変異（右）の、１８Ｓコントロールに対するｐ１１０アルファ細胞の相対的ＲＮＡレベルの測定における リアルタイムＱＰＣＲの結果を示している。 ｔａｓｅｌｉｓｉｂ（ＧＤＣ００３２）で処理したＨＣＣ１９５４ｐ１１０アルファ野生型（左）及びｐ１１０アルファＨ１０４７Ｒ突然変異（右）ｐ１１０アルファ細胞の、ＲＰＬ１９コントロールに対するｐ１１０ａ ｍＲＮＡ発現の測定における、リアルタイムＱＰＣＲの結果を示す。 アルペリシブ（ＢＹＬ−７１９）で処理したＨＣＣ１９５４ｐ１１０アルファ野生型（左）及びｐ１１０アルファＨ１０４７Ｒ突然変異（右）ｐ１１０アルファ細胞のＲＰＬ１９コントロールに対するｐ１１０ａ ｍＲＮＡ発現の測定における、リアルタイムＱＰＣＲの結果を示している。 図示の時間にわたって１．６μＭのｔａｓｅｌｉｓｉｂで処理した突然変異ＨＣＣ１９５４（ＰＩＫ３ＣＡ Ｈ１０４７Ｒ）乳がん細胞のウェスタンブロット分析を示している。回収の４時間前に、１０μＭのＭＧ１３２を加えた（右レーン）。 図示の時間にわたって１．６μＭのｔａｓｅｌｉｓｉｂで処理した突然変異ＨＣＣ１９５４（ＰＩＫ３ＣＡ Ｈ１０４７Ｒ）乳がん細胞の溶解物のウェスタンブロット分析を示している。回収の４時間前に、１０μＭのＭＧ１３２（中央レーン）及び１０μＭのＵＡＥ１阻害剤を加えた。 図示の時間にわたって１．６μＭのｔａｓｅｌｉｓｉｂで処理した突然変異ＨＣＣ１９５４（ＰＩＫ３ＣＡ Ｈ１０４７Ｒ）乳がん細胞のウェスタンブロット分析を示している。回収の４時間前に、１０μＭのＭＧ１３２を加えた（右レーン）。 図示の時間にわたって１．６μＭのｔａｓｅｌｉｓｉｂで処理した突然変異ＨＣＣ１９５４（ＰＩＫ３ＣＡ Ｈ１０４７Ｒ）乳がん細胞のウェスタンブロット分析を示している。回収の４時間前に、１０μＭのＭＧ１３２を加えた（右レーン）。 図示の時間にわたって１．６μＭのｔａｓｅｌｉｓｉｂで処理した突然変異ＨＣＣ１９５４（ＰＩＫ３ＣＡ Ｈ１０４７Ｒ）乳がん細胞のウェスタンブロット分析を示している。回収の４時間前に、１０μＭのＭＧ１３２、クロロキン、又は塩化アンモニウム（右レーン）を加えた。 動物細胞が経路特異的阻害剤によりタンパク質を分解する際の二つの異なる機序を説明する、ｐ１１０をユビキチン化するための経路図である。 ｔａｓｅｌｉｓｉｂ及びアルペリシブ（ＢＹＬ７１９）で処理したＰＩ３Ｋ野生型細胞及びＢＲＡＦ突然変異ＳＷ９８２細胞のウェスタンブロット分析を示している。Ｔａｓｅｌｉｓｉｂはｐ１１０デルタを分解することも枯渇させることもない。 Ｇ−１０２（表１、米国特許第８２４２１０４号）及びＧＤＣ−００３２（ｔａｓｅｌｉｓｉｂ）で処理したＰＩ３Ｋ野生型細胞、Ｂ細胞リンパ腫ＳＵ−ＤＨＬ−１０細胞のウェスタンブロット分析を示している。 様々な濃度、即ち１００ｎＭ、１μＭ、５μＭのＰＩ３Ｋ阻害剤とコントロール（ＤＭＳＯビヒクル）によりＰＩ３Ｋを阻害したＰＩＫ３ＣＡ野生型ＨＤＱＰ１乳がん細胞の、１時間及び２４時間経過時点でのウェスタンブロット分析を示している。 様々な濃度、即ち３ｎＭ、１６ｎＭ、６０ｎＭ、４００ｎＭ、２μＭのＧ−１０２（表１）とコントロール（ＤＭＳＯビヒクル）によりＰＩ３Ｋを阻害したＭＤＡ−ＭＢ ４５３（Ｈ１０４７Ｒ）細胞の、１時間及び２４時間経過時点でのウェスタンブロット分析を示している。 様々な濃度、即ち３ｎＭ、１６ｎＭ、６０ｎＭ、４００ｎＭ、２μＭのｔａｓｅｌｉｓｉｂ（ＧＤＣ−００３２）とコントロール（ＤＭＳＯビヒクル）によりＰＩ３Ｋを阻害したＭＤＡ−ＭＢ ４５３（Ｈ１０４７Ｒ）細胞の、１時間及び２４時間経過時点でのウェスタンブロット分析を示している。 様々な濃度、即ち１ｎＭ、１０ｎＭ、１００ｎＭのｔａｓｅｌｉｓｉｂ（ＧＤＣ−００３２）及びＧ−１０２（表１）とコントロール（ＤＭＳＯビヒクル）によりＰＩ３Ｋを阻害したＳＷ４８Ｈ１０４７Ｒ細胞の、１時間及び２４時間経過時点でのウェスタンブロット分析を示している。 様々な濃度、即ち１ｎＭ、１０ｎＭ、１００ｎＭのｔａｓｅｌｉｓｉｂ（ＧＤＣ−００３２）及びＧ−１０２（米国特許第８２４２１０４号）とコントロール（ＤＭＳＯビヒクル）によるＰＩ３Ｋ阻害で処理した、増殖因子リガンドＮＲＧを含む及び含まない、ＳＷ４８ ＰＩＫ３ＣＡ Ｈ１０４７Ｒ細胞のウェスタンブロット分析を示している。 親／突然変異選択性のＥＣ５０値を確立するために、様々な濃度のＧ−１８１での２４時間経過時の、同質遺伝子的突然変異（Ｅ５４５Ｋ、Ｈ１０４７Ｒ）におけるｐＰＲＡＳ４０のｉｎ ｖｉｔｒｏでの細胞増殖を野生型親ＰＩ３Ｋ細胞との対比で示している。 親／突然変異選択性のＥＣ５０値を確立するために、様々な濃度のＧＤＣ−００３２での２４時間経過時の、同質遺伝子的突然変異（Ｅ５４５Ｋ、Ｈ１０４７Ｒ）におけるｐＰＲＡＳ４０のｉｎ ｖｉｔｒｏでの細胞増殖を野生型親ＰＩ３Ｋ細胞との対比で示している。 親／突然変異選択性のＥＣ５０値を確立するために、様々な濃度のＧ−１０２での２４時間経過時の、同質遺伝子的突然変異（Ｅ５４５Ｋ、Ｈ１０４７Ｒ）におけるｐＰＲＡＳ４０のｉｎ ｖｉｔｒｏでの細胞増殖を野生型親ＰＩ３Ｋ細胞との対比で示している。 ＳＷ４８同質遺伝子的野生型及び突然変異（Ｅ５４５Ｋ、Ｈ１０４７Ｒ）細胞株と、ｔａｓｅｌｉｓｉｂ及びｐａｎ−ＰＩ３Ｋ阻害剤であるピクチリシブ（ＧＤＣ−０９４１）の用量滴定による処理とに関するｉｎ ｖｉｔｒｏでの細胞増殖データを示すグラフである。 ＰＩＫ３ＣＡの突然変異細胞株に対する４日間の細胞増殖（Ｃｅｌｌ−Ｔｉｔｅｒ ＧｌｏＲ、Ｐｒｏｍｅｇａ）アッセイにおけるピクチリシブ（ＧＤＣ−０９４１）、ＢＫＭ１２０（ブパリシブ、Ｎｏｖａｒｔｉｓ ＡＧ、ＣＡＳ Ｒｅｇ．Ｎｏ．９４４３９６−０７−０）、ｔａｓｅｌｉｓｉｂ（ＧＤＣ−００３２）及びＢＹＬ７１９（アルペリシブ、Ｎｏｖａｒｔｉｓ ＣＡＳ＃：１２１７４８６−６１−７）の有効性（ＩＣ５０マイクロモル）を示すグラフである。各点は異なるがん細胞株を表す。 細胞死−ヌクレオソームＥＬＩＳＡ検出による７２時間の試験における、ＰＩＫ３ＣＡ野生型細胞株及び突然変異（Ｅ５４５Ｋ、Ｈ１０４７Ｒ）細胞株と、ｔａｓｅｌｉｓｉｂ、及びＰＩ３Ｋアルファの選択的阻害剤であるＧＤＣ−０３２６（米国特許第８２４２１０４号）、及びＢＹＬ７１９の用量滴定による処理とに関するｎ ｖｉｔｒｏでの細胞増殖データを示すグラフである。 ビヒクル（ＭＣＴ；０．５％のメチルセルロース／０．２％のＴｗｅｅｎ ８０）、１５０ｍｇ／ｋｇのピクチリシブ（ＧＤＣ−０９４１）、及び２５ｍｇ／ｋｇのｔａｓｅｌｉｓｉｂ（ＧＤＣ−００３２）を、一日一回１００マイクロリットル（ｕｌ）でＰＯ（経口）を投与された、ＰＩＫ３ＣＡ Ｈ１０４７Ｒ（ＰＩ３Ｋa）に突然変異を有するＨＣＣ１９５４．ｘ１***腫瘍異種移植片保有の８〜１０匹の免疫不全マウスのコホートにおける、２１日間にわたる腫瘍体積の変化のフィッティングを示している。用語ｕＬはマイクロリットルを意味する。 ビヒクル（ＭＣＴ；０．５％のメチルセルロース／０．２％のＴｗｅｅｎ ８０）、４０ｍｇ／ｋｇのアルペリシブ（ＢＹＬ−７１９）、及び１５ｍｇ／ｋｇのｔａｓｅｌｉｓｉｂ（ＧＤＣ−００３２）を、一日一回１００マイクロリットル（ｕｌ）でＰＯ（経口）投与された、ＰＩＫ３ＣＡ Ｈ１０４７Ｒ（ＰＩ３Ｋ）に突然変異を有するＨＣＣ１９５４．ｘ１***腫瘍異種移植片保有の８〜１０匹の免疫不全マウスのコホートにおける、２１日間にわたる腫瘍体積の変化のフィッティングを示している。 ビヒクル（ＭＣＴ；０．５％のメチルセルロース／０．２％のＴｗｅｅｎ ８０）、及び１５ｍｇ／ｋｇのｔａｓｅｌｉｓｉｂ（ＧＤＣ−００３２）を、一日一回１００マイクロリットル（ｕｌ）でＰＯ（経口）投与された、ＰＩＫ３ＣＡ Ｅ５４２Ｋ（ＰＩ３Ｋ）に突然変異を有するＷＨＩＭ２０ホルモン受容体陽性患者由来の***腫瘍異種移植片保有の８〜１０匹の免疫不全マウスのコホートにおける、２８日間にわたる腫瘍体積の変化のフィッティングを示している。 ビヒクル（ＭＣＴ；０．５％のメチルセルロース／０．２％のＴｗｅｅｎ ８０）、４０ｍｇ／ｋｇのアルペリシブ（ＢＹＬ−７１９）、及び２．５、５．０、１５ｍｇ／ｋｇのｔａｓｅｌｉｓｉｂ（ＧＤＣ−００３２）を、一日一回１００マイクロリットル（ｕｌ）でＰＯ（経口）投与された、ＰＩＫ３ＣＡ Ｈ１０４７Ｒ（ＰＩ３Ｋ）に突然変異を有するＨＣＩ−００３ホルモン受容体陽性患者由来の***腫瘍異種移植片保有の８〜１０匹の免疫不全マウスのコホートにおける、２７日間にわたる腫瘍体積の変化のフィッティングを示している。 様々な濃度、即ち１６ｎＭ、８０ｎＭ、４００ｎＭのｔａｓｅｌｉｓｉｂとコントロール（ＤＭＳＯビヒクル）で処理した突然変異ＨＣＣ１９５４（ＰＩＫ３ＣＡ Ｈ１０４７Ｒ）乳がん細胞のウェスタンブロット分析を示している。 Ｈ０１４７Ｒ突然変異ｐ１１０アルファＰＩ３Ｋアイソフォームのキナーゼドメインの立体配座のモデルを示している。 ＰＩＫ３ＣＡの突然変異を有する細胞株パネルに対する四日間の生存率アッセイにおけるＧＤＣ−００３２力価（ＩＣ５０）を示すグラフである。データは、ＰＩＫ３ＣＡ内の突然変異の位置に従って示されている。 ｐ１１０ａ及びｐ１１０ａに並行なレベルを用いたｐ８５免疫共沈降法（Ｃｏ−ＩＰ）のウェスタンブロット（ＷＢ）分析を示しており、これは、安定なｐ１１０ａがｐ８５との複合体であり、有意な用量依存性のｐ１１０ａ分解がｔａｓｅｌｉｓｉｂによって誘導されることを示唆している。 定常状態のｐ１１０ａ ｍＲＮＡ発現を示している。 実施例７による野生型ＰＩＫ３ＣＡ ＨＣＣ−１９５４（上）及びＰＩＫ３ＣＡ ＨＣＣ−１９５４を発現するＨ１０４７Ｒ突然変異（下）のトリプシン切断を示している。 実施例７による、消化後の野生型ＰＩＫ３ＣＡ ＨＣＣ−１９５４（左）及びＰＩＫ３ＣＡ ＨＣＣ−１９５４を発現するＨ１０４７Ｒ突然変異（右）に対する液体クロマトグラフィー−タンデム質量分析（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）の分析と、ｐ１１０アルファ（ＰＩＫ３ＣＡ）タンパク質免疫沈降法とを示している。
本発明の特定の実施態様に関する言及がここで詳細になされる。その実施態様の例は、付随する構造及び式において示される。本発明は、多数の実施態様と組み合わせて記載されるが、本発明をそれらの実施態様に限定することは意図されない。むしろ、本発明は、すべての代替例、変形例、等価物を網羅することが意図され、これらは特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲内に包含されうる。当業者は、本明細書に記載の方法及び材料と類似もしくは等価である多くの方法及び材料を認識するであろうし、それらは本発明の実施に使用可能であろう。本発明は、記載されている方法及び材料に決して限定されない。一又は複数の引用文献、特許及び類似材料が、限定されないが、本願の用語の定義、用法、説明されている技術などと相違又は矛盾する場合、本願が優先される。
定義
用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ、ｉｎｃｌｕｄｅ）」は、本明細書及び特許請求の範囲で使用する場合、記載される特徴、完全体、成分、又は工程の存在を特定することを意図してるのであって、一つ以上の他の特徴、完全体、成分、工程若しくはそれらの群の存在又は付加を排除するものではない。
用語「治療」及び「処置」は、治療的処置及び予防的処置の両方を含み、その目的は、がんの増殖、発生又は転移などの望ましくない生理学的変化又は障害を予防する、又は遅延させる（軽減する）ことである。本発明の目的のために、有益な又は所望の臨床結果は、限定しないが、症候の緩和、疾患の範囲の縮小、疾患の状態の安定（即ち、悪化以外）、疾患進行の遅延又は速度低下、病態の改善又は緩和、及び寛解（部分的又は完全な）を含み、検出可能であるか否かを問わない。「治療」はまた、治療を受けない場合に予想される生存期間と比較した、生存期間の延長を意味することができる。治療を必要とする者には、既にその状態若しくは障害を有している者、並びに、その状態若しくは障害を有し易い者、又はその状態若しくは障害を予防すべき者が含まれる。
「治療的に有効な量（治療的有効量）」という表現は、本明細書に記載の（ｉ）特定の疾患、状態、又は障害を治療する、（ｉｉ）特定の疾患、状態、又は障害の一又は複数の症候を軽減、改善又は排除する、又は（ｉｉｉ）特定の疾患、状態、又は障害の一又は複数の症候の開始を防止する又は遅らせる、本発明の化合物の量を意味する。がんの場合、治療的有効量の薬物は、がん細胞数を減少させ；腫瘍の大きさを縮小させ；末梢器官へのがん細胞浸潤を阻害し（即ち、ある程度遅らせ、好ましくは停止させる）；腫瘍転移を阻害し（即ち、ある程度遅らせ、好ましくは停止させる）；腫瘍増殖をある程度阻害し；及び／又はがんに関連する一又は複数の症候をある程度緩和することができる。薬剤は、既存のがん細胞の増殖を防ぎ、及び／又は既存のがん細胞を死滅させうる範囲で、細胞増殖抑制性及び／又は細胞毒性でありうる。がん治療については、例えば、無増悪期間（ＴＴＰ）を評価すること及び／又は奏効率（ＲＲ）を決定することによって効果を測定することができる。
用語「生物学的試料」は、動物又はヒトから採取された組織、細胞及び体液のすべての試料を含む。
医薬及び類似のものによる治療に対する患者の「有効な応答」又は患者の「応答性」という表現は、がんなどの疾患又は障害の危険を有する又はそのような疾患又は障害に罹患している患者にもたらされる臨床的又は治療的恩恵を指す。一実施態様では、このような恩恵は、生存期間の延長（全生存及び無増悪生存期間を含む）、客観的応答結果（完全寛解又は部分寛解を含む）、又はがんの徴候若しくは症候の改善のうちのいずれか一つ又は複数を含む。一実施態様では、バイオマーカー（例として、例えばＩＨＣを用いて決定された突然変異ｐ１１０アルファ）を用いて、バイオマーカーを発現しない患者と比較して、薬物、例えばｔａｓｅｌｉｓｉｂ（ＧＤＣ−００３２）による治療への応答可能性の上昇が予測される患者が同定される。一実施態様では、ＩＨＣを用いて決定されるバイオマーカーを用いて、同じレベルのバイオマーカーを発現しない患者と比較して、薬物による治療への応答可能性の上昇が予測される患者が同定される。一実施態様では、バイオマーカーの存在を用いて、バイオマーカーの存在を有さない患者と比較して、薬物による治療への応答可能性の高い患者が同定される。別の実施態様では、バイオマーカーの存在を用いて、バイオマーカーの存在を有さない患者と比較して、薬物による治療の恩恵の可能性が大きいであろう患者が決定される。
がん（例えば***又はＮＳＣＬＣ）患者の臨床的恩恵の増大に関連してバイオマーカーの「量」又は「レベル」という場合、バイオマーカーのレベルが患者の臨床的恩恵の増大に関連付けられている生物学的試料中の検出可能なレベルに言及している。これらは、当業者に既知の、発明によっても開示される方法により測定することができる。評価されるバイオマーカーの発現レベル又は量は、治療に対する応答を決定するために使用することができる。いくつかの実施態様では、バイオマーカーの量又はレベルは、ＩＨＣ（例えば、生検又は血液由来の患者の腫瘍試料の）を用いて決定される。いくつかの実施態様では、がん患者の臨床的恩恵の増大に関連付けられるバイオマーカーの量又はレベルは、ＩＨＣスコア２、ＩＨＣスコア３、又はＩＨＣスコア２若しくは３である。いくつかの実施態様では、がん患者の臨床的恩恵の増大に関連付けられるｃ−ｍｅｔバイオマーカーの量又はレベルは、中程度の染色強度、中程度の染色強度／高い染色強度の組み合わせ又は高い染色強度を有する腫瘍細胞の５０％以上である。いくつかの実施態様では、がん患者の臨床的恩恵の増大に関連付けられるバイオマーカーの量又はレベルは、中程度又は高い染色強度を有する腫瘍細胞の５０％以上である。
用語「検出」は、直接的及び間接的な検出を含む検出する任意の手段を含む。
用語「診断」は、本明細書では、分子又は病理学的状態、疾患又は病態の同定又は分類を意味するために用いられる。例えば、「診断」は、特定の種類のがん、例えば肺がんの同定を指す。「診断」は、例えば、組織学による（例えば、非小細胞肺癌）、分子の特徴による（例えば、特定の遺伝子又はタンパク質におけるヌクレオチド及び／又はアミノ酸の変異により特徴付けられる肺がん）、又はそれら両方による、特定の種類のがんの分類を指すこともある。
本明細書において用語「予後」は、例えば、がんのような腫瘍性疾患の再発、転移性の広がり、及び薬物耐性を含む、がんに起因する死又は進行の可能性の予測を指すために用いられる。
本明細書において用語「予測」（及び予測するなどの変形）は、一つの薬物又は薬物の組に対して患者が好ましい応答又は好ましくない応答を有する可能性を指すために用いられる。一実施態様において、予測はこうした応答の程度に関する。別の実施態様では、予測は、患者が、以下の治療、例えば特定の治療剤及び／又は原発腫瘍の外科的除去、及び／又は化学療法の後で、がんの再発なしに生存するかどうか、及び／又は生存する可能性に関する。本発明の予測方法は、任意の特定の患者のために最も適切な治療法を選択することによって治療決定を行うために臨床的に使用されうる。本発明の予測方法は、患者が、例えば所定の治療剤の投与又は併用、外科手術、化学療法などを含む所定の治療法、例えば所与の治療レジメンに対して好ましい応答をしそうかどうか、又は治療レジメンの後に患者の長期生存がありそうかどうかを予測する上で貴重なツールである。
特定の治療剤又は治療選択に対する「耐性の上昇」という用語は、本発明に従って用いられるとき、標準用量の薬物、又は標準的な治療プロトコールに対する応答の減少を意味する。
特定の治療剤又は治療選択に対する「感受性の低下」という用語は、本発明に従って用いられるとき、標準用量の薬物、又は標準的な治療プロトコールに対する応答の減少を意味し、応答の減少は、薬剤の用量、又は治療の強度を増加させることにより（少なくとも部分的に）補償することができる。
「患者の応答」は、限定されないが、（１）腫瘍成長の、減速及び完全な成長停止を含む、ある程度の阻害；（２）腫瘍細胞の数の減少；（３）腫瘍サイズの縮小；（４）腫瘍細胞の近隣末梢器官及び／又は組織への浸潤の阻害（例えば、低減、減速又は完全停止）；（５）転移の阻害（例えば、低減、減速又は完全停止）；（６）必須ではないが腫瘍の退縮や拒絶をもたらしうる抗腫瘍免疫応答の亢進；（７）腫瘍に関連付けられる一又は複数の症候のある程度の軽減；（８）治療後の生存期間の延長；及び／又は（９）治療後の所定の時点での死亡率低下を含む、患者の恩恵を示す任意のエンドポイントを用いて評価することができる。
「バイオマーカー」は、客観的に測定され、正常な生物学的プロセス、病原性プロセス、又は治療的介入に対する薬理的応答の指標として評価される。バイオマーカーには、予測、予後、又は薬力学（ＰＤ）という複数の種類がある。予測バイオマーカーは、特定の療法に応答する又は特定の療法の恩恵を受けると思われる患者を予測する。予後バイオマーカーは、患者の疾患に予想される過程を予測し、治療のガイドとなりうる。薬力学バイオマーカーは、薬物活性を確認し、用量及び投与スケジュールを最適化することができる。
ｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏで発生するＰＩＫ３ＣＡ突然変異又はＰＩＫ３ＣＡ突然変異の組を含むバイオマーカーの状態の「変化」又は「変調」は、薬力学（ＰＤ）を確立するうえで一般に採用される一又は複数の方法を用いる生物学的試料の分析により検出され、そのような方法には：（１）生物学的試料のゲノムＤＮＡ又は逆転写ＰＣＲ産物を配列決定し、それにより一又は複数の突然変異を検出すること；（２）メッセージレベルの定量化又はコピー数の評価により遺伝子発現レベルを評価すること；及び（３）免疫組織化学、免疫細胞化学、ＥＬＩＳＡ、又は質量分析によるタンパク質の分析により、リン酸化又はユビキチン化といったタンパク質の分解、安定化、又は翻訳後修飾を検出することが含まれる。
用語「がん」及び「がん性」とは、無秩序な細胞増殖によって典型的に特徴付けられる、哺乳動物における生理学的状態を指す。「腫瘍」は、一又は複数のがん細胞を含む。がんの例は、限定されないが、癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫及び白血病及びリンパ性腫瘍を含む。このようながんのより具体的な例には、扁平上皮細胞がん（例えば、上皮性扁平上皮細胞がん）、小細胞肺がんを含む肺がん、非小細胞肺がん（「ＮＳＣＬＣ」）、肺の腺癌及び肺の扁平上皮癌、腹膜のがん、肝細胞がん、消化管がんを含む胃（ｇａｓｔｒｉｃ又はｓｔｏｍａｃｈ）がん、膵がん、神経膠芽腫、子宮頸がん、卵巣がん、肝がん、膀胱がん、ヘパトーマ、乳癌、大腸がん、直腸がん、結腸直腸がん、子宮内膜又は子宮癌腫、唾液腺癌腫、腎臓（ｋｉｄｎｅｙ又はｒｅｎａｌ）がん、前立腺がん、外陰部がん、甲状腺がん、肝癌、肛門癌腫、陰茎癌、及び頭頸部がんが含まれる。本明細書で使用される胃（ｇａｓｔｒｉｃ）がんは、胃のあらゆる部位に発生しうる胃（ｓｔｏｍａｃｈ）がんを含み、これは胃全体及び他の器官、特に食道、肺、リンパ節及び肝臓に広がる可能性がある。
用語「造血器悪性腫瘍」は、白血球、リンパ球、ナチュラルキラー細胞、形質細胞、及び骨髄細胞、例えば好中球及び単球といった細胞に関与する、造血中に生じるがん又は過剰増殖性障害を指す。造血性悪性腫瘍には、非ホジキンリンパ腫、びまん性大造血性リンパ腫、濾胞性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、慢性リンパ球性白血病、多発性骨髄腫、急性骨髄性白血病、及び骨髄細胞白血病が含まれる。リンパ性白血病（又は「リンパ芽球性」）には、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）及び慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）が含まれる。骨髄性白血病（「骨髄」又は「非リンパ球性」とも）には、急性骨髄性（又は骨髄芽球性）白血病（ＡＭＬ）及び慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）が含まれる。
「化学療法剤」は、作用機序に関係なくがんの治療に有用な生物学的（大分子）又は化学的（小分子）化合物である。
用語「哺乳動物」には、限定されないが、ヒト、マウス、ラット、モルモット、サル、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ブタ、及びヒツジが含まれる。
「添付文書」という用語は、このような治療製品の使用に関する、指示、使用法、用量、投与、禁忌及び／又は注意事項についての情報を含む、治療製品の商品包装に通例含まれる説明書を指すために使用される。
本明細書で使用される用語「薬学的に許容される塩」は、本発明の化合物の薬学的に許容される有機塩又は無機塩を指す。例示的な塩には、限定されないが、硫酸塩、クエン酸塩、酢酸塩、シュウ酸塩、塩化物、臭化物、ヨウ化物、硝酸塩、重硫酸塩、リン酸塩、酸フォスフェート、イソニコチン酸塩、乳酸塩、サリチル酸塩、クエン酸、酒石酸塩、オレイン酸塩、タンニン酸塩、パントテン酸塩、酸性酒石酸塩、アスコルビン酸塩、コハク酸塩、マレイン酸塩、ゲンチアニン酸塩、フマル酸塩、グルコン酸塩、グルクロン酸塩、サッカラート、ギ酸塩、ベンゾエート、グルタミン酸塩、スルホン酸塩「メシラート」、エタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホナート、ｐ−トルエンスルホナート、及びパモ酸塩（即ち、１，１'−メチレン−ビス−（２−ヒドロキシ−３−ナフトエ酸））塩が含まれる。薬学的に許容される塩は、酢酸イオン、コハク酸イオン又は他の対イオンなどの別の分子の包含を伴ってもよい。対イオンは、親化合物の電荷を安定化する任意の有機又は無機部分でありうる。さらに、薬学的に許容される塩は、その構造内に複数の荷電原子を有することができる。複数の荷電原子が薬学的に許容される塩の一部である場合、複数の対イオンを有することができる。したがって、薬学的に許容される塩は、一又は複数の荷電原子及び／又は一又は複数の対イオンを有することができる。
所望の薬学的に許容される塩は、当技術分野で利用可能な任意の適切な方法により調製することができる。例えば、遊離塩基の、無機酸、例えば塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、メタンスルホン酸、リン酸などによる処理、或いは有機酸、例えば酢酸、マレイン酸、コハク酸、マンデル酸、フマル酸、マロン酸、ピルビン酸、シュウ酸、グリコール酸、サリチル酸、ピラノシジル酸（ｐｙｒａｎｏｓｉｄｙｌ ａｃｉｄ）、例えば、グルクロン酸又はガラクツロン酸、アルファヒドロキシ酸、例えばクエン酸又は酒石酸、アミノ酸、例えば、アスパラギン酸又はグルタミン酸、芳香族酸、例えば、安息香酸又はケイ皮酸、スルホン酸、例えば、ｐ−トルエンスルホン酸又はエタンスルホン酸などによる処理。塩基性薬学的化合物からの薬学的に有用な又は許容可能な塩の形成に適性と一般に考慮される酸は、例えば、P. Stahl et al, Camille G. （eds.） Handbook of Pharmaceutical Salts. Properties, Selection and Use. （2002） Zurich: Wiley-VCH; S. Berge et al, Journal of Pharmaceutical Sciences （1977） 66（1） 1 19; P. Gould, International J. of Pharmaceutics （1986） 33 201 217; Anderson et al, The Practice of Medicinal Chemistry （1996）, Academic Press, New York; Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th ed., （1995） Mack Publishing Co., Easton PA; and in The Orange Book （Food & Drug Administration, Washington, D.C. on their website）によって議論されている。これら開示は、それらへの言及により本明細書に包含される。
「薬学的に許容される」という表現は、物質又は組成物が、製剤を構成する他の配合成分と、及び／又はそれにより治療される哺乳動物と、化学的に及び／又は毒物学的に適合性でなければならないことを示す。
本明細書で使用される用語「相乗的」は、二つ以上の単剤の加算的効果より有効性の高い治療的組み合わせを指す。突然変異選択的、ＰＩ３Ｋ結合化合物、又はその薬学的に許容される塩、及び一又は複数の化学療法剤間の相乗的相互作用の決定は、本明細書に記載されるアッセイから得られる結果に基づいていてよい。これらアッセイの結果を、Ｃｈｏｕ及びＴａｌａｌａｙの組み合わせ法と、ＣａｌｃｕＳｙｎソフトウェアによる用量−効果分析を用いて分析することにより、コンビネーションインデックスを得ることができる（Chou and Talalay、1984, Adv. Enzyme Regul. 22:27-55）。併用療法は、「相乗作用」を提供することができ、「相乗的」である、即ち活性成分を一緒に使用したときに達成される効果が、化合物を別々に使用することにより得られる効果の和を上回ることが証明される。相乗効果は、活性成分が：（１）共処方されて投与されるか又は組み合せた単位投与製剤において同時に送達されるとき；（２）別個の製剤として交互に又は並行して送達されるとき；又は（３）他の何らかの投与計画によって、得られる可能性がある。交互療法で送達される場合、化合物が例えば別個の注射器での異なる注射によって又は別個の丸薬若しくは錠剤において順次的に投与又は送達されるときにも、相乗効果が得られる可能性がある。一般に、交互療法の間には、各活性成分の有効投薬量は順次的に、即ち連続して投与され、併用療法では、二以上の活性成分の有効投与量は一緒に投与される。また、組合わせ効果が、ＢＬＩＳＳ独立モデルと最大単剤（ＨＳＡ）モデル（Lehar et al. 2007, Molecular Systems Biology 3:80）を用いて評価されうる。
「ＥＬＩＳＡ」（酵素結合免疫吸着法）は、液体試料又は湿潤試料中の物質の存在を検出する異種固相酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）の一つのサブタイプを使用する「ウェットラボ」型解析的生化学アッセイの一般的フォーマットである（Engvall E, Perlman P （1971）. "Enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA）. Quantitative assay of immunoglobulin G". Immunochemistry 8 （9）: 871-4; Van Weemen BK, Schuurs AH （1971）. "Immunoassay using antigen-enzyme conjugates". FEBS Letters 15 （3）: 232-236）。ＥＬＩＳＡは、この方法の一般的な使用及び開発の歴史により名称に元の「免疫」を含んでいるが、厳密に「免疫」のアッセイの代わりに他の形態のリガンド結合アッセイを実施することができる。この技術は本質的に、固体相に固定化することのできるいずれかの結紮試薬を、特異的に結合し、適切に定量化することの可能なシグナルを生成する酵素を使用する検出試薬と併せて必要とする。洗浄の間に、リガンドとその特異的結合対応物とは、特異的に結合したままであるか、又は抗原−抗体相互作用により固体相に「免疫吸着」されたままであるが、非特異的又は未結合成分は洗い流される。洗浄後に同じ反応ウェル（例えばキュベット）を再使用できる他の分光光度的ウェットラボアッセイのフォーマットとは異なり、ＥＬＩＳＡプレートは、プレートの一部である固体相に免疫吸着した反応生成物を有し、したがって容易に再使用されない。ＥＬＩＳＡを実施することは、特定の抗原に対する特異性を有する少なくとも一の抗体を使用する。不明な量の抗原を有する試料は、非特異的に（表面への吸着により）又は特異的に（「サンドイッチ」ＥＬＩＳＡにおいて同じ抗原に特異的な別の抗体による捕捉により）、固体支持体（通常はポリスチレンマイクロタイタープレート）に固定化される。抗原が固定化された後、検出抗体を加え、抗原との複合体を形成する。検出抗体は、酵素に共有結合的に結合することができるか、又はそれ自体が生体共役反応により酵素に結合する二次抗体により検出可能である。各工程の間に、プレートは通常弱い洗剤溶液で洗浄され、特異的に結合しないすべての抗体又はタンパク質は除去される。最終洗浄工程の後、酵素的基質を加え、試料中の抗原の量を示す可視シグナルを生成することにより、プレートを発色させる。
「免疫組織化学」（ＩＨＣ）は、生物学的組織中の抗原に特異的に結合する抗体の原理を利用することによる、組織切片の細胞中の抗原（例えば、タンパク質）検出の方法を指す。免疫組織化学的染色は、がん性腫瘍に見られるもののような異常細胞の診断に広く使用されている。特異的分子マーカーは、増殖又は細胞死（アポトーシス）といった特定の細胞事象の特徴である。また、ＩＨＣは、バイオマーカーの分布及び局在化と、生物学的組織の異なる部分に差次的に発現するタンパク質を理解するために広く使用されている。抗体−抗原相互作用の可視化は、複数の方法で達成されうる。最も一般的には、抗体は、発色反応を触媒することのできる、ペルオキシダーゼなどの酵素にコンジュゲートする（免疫ペルオキシダーゼ染色参照）。或いは、抗体は、フルオレセイン又はローダミン（免疫蛍光参照）といったフルオロフォアにタグ付けすることもできる。
「免疫細胞化学」（ＩＣＣ）は、細胞中の特異的なペプチド又はタンパク質抗原を特異的エピトープを介して標的化する抗体を用いる一般的な試験室技術である。これら結合抗体は、次いでいくつかの異なる方法を用いて検出することができる。ＩＣＣは、特定の試料中の細胞が問題の抗原を発現するか否かを評価することができる。免疫陽性のシグナルが見つかった場合、ＩＣＣは、いずれの細胞内区画が抗原を発現しているかも決定する。
「同質遺伝子的」細胞株及びヒト疾患モデルは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ（人工的環境における「実験室内での」）で特定の患者集団の遺伝学的特質を正確にモデル化するために選択又は操作される細胞のファミリーである。それらは遺伝的にマッチした「正常細胞」を備え、疾患生物学及び新規治療剤を研究するための同質遺伝子的系を提供する（Bardelli A, et al （2003） Science 300 （5621）: 949）。同質遺伝子的細胞株は、遺伝的基礎を有する任意の疾患をモデル化するために使用することができる。がんは、同質遺伝子的ヒト疾患モデルが広く使用されてきたそのような疾患の一つである。同質遺伝子的細胞株は、相同的遺伝子標的化と呼ばれる方法を介して生成される。相同的組み換えを利用する標的化ベクトルは、試験対象の突然変異又はＳＮＰ（一塩基多型）を生じさせる所望の疾患をノックイン又はノックアウトするために使用されるツール又は技術である。疾患突然変異はがん患者から直接回収することができるが、これら細胞は通常、対象の特異的突然変異に加えて多数のバックグラウンド突然変異を含んでおり、マッチした正常細胞株は典型的には取得されない。その後、標的化ベクトルは、特徴付けされたヒトがん細胞株において、正常からがん性への遺伝子型のスイッチ、又はその逆の両方向のスイッチを可能にする遺伝子突然変異を「ノックイン」又は「ノックアウト」するために使用される。
用語「アジュバント」及び「アジュバント設定」は、一次的治療、主要な治療、又は最初の治療に加えて行われるケア又は治療を指す。外科手術及び複合治療レジメンががん療法に用いられることにより、この用語は主にアジュバントがん治療を説明するために使用されるようになった。アジュバント療法の一例は通常、すべての検出可能な疾患が除去されたものの、潜在的疾患に起因する再発の統計的リスクが残っている、外科手術の後に実施される追加的治療である。既知の疾患が外科手術後に残る場合、さらなる治療は技術的にアジュバントではない。例えば、乳がんの外科手術後には、放射線療法又は全身療法がアジュバント療法として一般に行われる。全身療法は、化学療法、免疫療法若しくは生物学的応答修飾剤、又はホルモン療法からなる。がん専門医は、特定のアジュバント療法を決める前に、疾患再発の危険を評価するために統計的証拠を使用する。アジュバント療法の目的は、疾患に特異的な症候及び全生存を改善することである。治療は本質的に、証明可能な疾患ではなくリスクのためであるので、アジュバント療法を受ける患者の一部が一次的な外科手術により既に治癒済みであることも許容される。アジュバント全身療法と放射線療法は、多くの種類のがんについて外科手術後に行われることが多い。
用語「野生型ＰＩ３Ｋ ｐ１１０アルファアイソフォーム」は、突然変異がＰＩ３Ｋ ｐ１１０アルファ遺伝子に存在しないことを意味する。
用語「突然変異ＰＩ３Ｋ ｐ１１０アルファアイソフォーム」は、一又は複数の活性化突然変異がＰＩ３Ｋ ｐ１１０アルファの対立遺伝子内に存在することを意味する。
パラメーター「ＩＣ５０」は、最大阻害濃度の半分を意味し、特定の生物学的又は生化学的機能を阻害するうえでの物質の有効性の物差しである。この定量的物差しは、どの程度の特定の薬物又は他の物質（阻害剤）が、所与の生物学的過程（又は過程の成分、即ち酵素、細胞、細胞受容体又は微生物）を半分だけ阻害するために必要かを示す。一般に、これは、薬理的研究においてアンタゴニスト薬の力価の物差しとして使用される。ＩＣ５０は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの５０％阻害に必要な薬物の濃度を表し、アゴニスト薬のＥＣ５０に相当する。ＥＣ５０は、ｉｎ ｖｉｖｏで最大効果の５０％を得るために必要な血漿濃度も表す。パラメーターＫｉは、ＩＣ５０と相関している（Cer RZ et al （2009） Nucl. Acids Res. 37:W441-W445）。Ｋｉは阻害剤の結合親和性であり、ＩＣ５０は阻害剤の機能的強度である。
ＴＡＳＥＬＩＳＩＢによるｐ１１０アルファの枯渇
ｔａｓｅｌｉｓｉｂによるｐ１１０アルファ（ｐ１１０ａ）の分解は、用量依存性、時間依存性、プロテアソーム依存性、及びユビキチン依存性に起こる。ｔａｓｅｌｉｓｉｂによる分解は、ＰＩＫ３ＣＡの突然変異細胞中のｐ１１０ａに特異的であり；ｐ８５、ｐ１１０デルタアイソフォーム、又はｐ１１０ａは野生型細胞において観察されない。フィードバックに直面した経路抑制の予期されていなかった驚くべき恩恵は、１及び２４時間経過時のｐＡＫＴ及びｐＰＲＡＳ４０のレベルにより測定される。これらの相関的観察は、ｔａｓｅｌｉｓｉｂによる治療選択の治療濃度域を広げうる（治療指数の上昇）。
ｔａｓｅｌｉｓｉｂによるｐ１１０ａの分解は、ｔａｓｅｌｉｓｉｂの漸増用量の存在下において、ｐ１１０のｐ８５／ウェスタンブロットの免疫沈降法（ＩＰ）、又はその逆により試験することができる。無視できるｐ１１０の分解が治療２時間目に起こるため、これは、解釈を複雑にする有意なｐ１１０の分解なしでｐ１１０／ｐ８５の解離を評価し、それによりｔａｓｅｌｉｓｉｂによる治療に応答するであろうがん患者を予測する診断機会を提供する妥当な濃度域である。
突然変異と野生型のｐ１１０アルファの分解の定量化は、突然変異及び野生型細胞株におけるｔａｓｅｌｉｓｉｂのオフレート、野生型及び突然変異タンパク質の半減期の確定、及びユビキチン化部位及び細胞機構の同定を含むプロテオミクス手法により実施されうる。このように、ｐ１１０ａの分解は、ｐ１１０ａの枯渇として測定されうる。
Ｔａｓｅｌｉｓｉｂは、突然変異ｐ１１０ａタンパク質を特異的に分解するため、突然変異細胞において他のＰＩ３Ｋ阻害剤より有効である。図１は、ｔａｓｅｌｉｓｉｂによるｐ１１０ａタンパク質分解のウェスタンブロット分析が、用量依存性であり、ＰＩ３Ｋａ突然変異細胞に特異的であることを示している。本発明はいずれか特定の作用機序によって限定されないが、活性に関するこの理論的根拠は、ｔａｓｅｌｉｓｉｂが、そうでなければ抗腫瘍活性を弱めてしまうＲＴＫによるフィードバックの影響を縮小することを可能にする。図２は、ｔａｓｅｌｉｓｉｂ、ピクチリシブ（ＧＤＣ−０９４１、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、及びアルペリシブ（ＢＹＬ７１９、Ｎｏｖａｒｔｉｓ ＣＡＳ＃：１２１７４８６−６１−７）で２４時間処理したＨＣＣ１９５４細胞（ＰＩＫ３ＣＡ Ｈ１０４７Ｒ）のウェスタンブロット分析を示している。臨床開発中の他の経口ＰＩ３Ｋ阻害剤であるピクチリシブ及びアルペリシブは、突然変異ｐ１１０ａタンパク質を分解しない。
Ｔａｓｅｌｉｓｉｂは、ｐ８５のレベルに影響を及ぼすことなくＰＩＫ３ＣＡの突然変異細胞株中のｐ１１０ａを枯渇させる。このことは、ｐ１１０ａモノマー分解をもたらすｐ１１０ａ／ｐ８５の解離の機序と一貫性を有する（図３）。ｐ１１０アルファがｐ８５から解離するとき、モノマーとしてｐ１１０アルファは不安定であり、急速に転倒する（Yu et al （1998） Mol. Cell Bio. 18:1379-1387; Wu et al （2009） Proc. Natl. Acad. Sci. 106（48）,20258-20263）。ｐ１１０ａの半減期は約１時間である一方、ｐ１１０ａ／ｐ８５ダイマーはそれよりも有意に安定性が高く、約５時間の半減期を有する。
突然変異ｐ１１０ａは、ｔａｓｅｌｉｓｉｂによる分解に対し、野生型より感受性である。図４は、様々な濃度、即ち０．２μＭ、１μＭ、５μＭのｔａｓｅｌｉｓｉｂとコントロール（ＤＭＳＯビヒクル）とを用いた、ＳＷ４８親ＰＩＫ３ＣＡ野生型，突然変異同質遺伝子的ＳＷ４８Ｅ５４５Ｋヘテロ接合体（ｈｅｔ）、及びＰＩＫ３ＣＡ突然変異同質遺伝子的ＳＷ４８Ｈ１０４７Ｒヘテロ接合体細胞を含むＳＷ４８同質遺伝子株のウェスタンブロット分析を示している。
ｐ１１０ａ Ｅ５４５Ｋ突然変異タンパク質は、野生型タンパク質より安定性が低いと思われる（図５Ａ及び５Ｂ）。突然変異ｐ１１０アルファのＲＮＡ発現は、Ｅ５４５Ｋ操作細胞において変化しない。図５Ａは、１８Ｓに対する相対的ｐ１１０アルファｍＲＮＡ発現ＲＮＡレベルにより測定した細胞内ｐ１１０アルファｍＲＮＡ発現のグラフである。薬物は、ｐ１１０ａのｍＲＮＡ発現を変化させない。図５Ｂは、ＣＲＩＳＰＲ（クラスター化された規則的に間隔を空けた短いパンドローム反復）生成ＳＷ４８Ｅ５４５Ｋヘミ接合株（重複する二つのクローン）のウェスタンブロット分析を示している。このウェスタンブロットは、ＳＷ４８Ｅ５４５Ｋヘテロ接合株と比較して有意に低下した突然変異ｐ１１０ａのレベルを示し、このことは、突然変異ｐ１１０ａの安定性がＷＴ ｐ１１０ａより低いことを示唆している。レーンは、左から右へ、ＳＷ４８Ｅ５４５Ｋヘミ接合クローン１、ＳＷ４８Ｅ５４５Ｋヘミ接合クローン２、ＳＷ４８親、ＳＷ４８Ｅ５４５Ｋヘテロ接合、ＳＷ４８Ｅ５４５Ｋヘテロ接合である。
Ｐ１１０アルファは、時間依存性に枯渇する。図６は、１μＭ及び５μＭのｔａｓｅｌｉｓｉｂで処理した突然変異ＨＣＣ１９５４（ＰＩＫ３ＣＡ Ｈ１０４７Ｒ）乳がん細胞のウェスタンブロット分析を示している。ｔａｓｅｌｉｓｉｂは、患者試料から測定した場合に約４０時間という長い臨床的薬物動態学的半減期を有するため、突然変異ｐ１１０ａの分解は腫瘍中で起こっているはずである。
Ｔａｓｅｌｉｓｉｂは、ｐ１１０ａ ＲＮＡを減少させないが、タンパク質は減少する。図７Ａは、ＨＣＣ１９５４野生型及び突然変異ｐ１１０アルファ細胞の相対的ＲＮＡレベル対１８Ｓコントロールの測定におけるリアルタイムＱＰＣＲの結果を示している。ＤＭＳＯ対ＧＤＣ−００３２処理細胞のｐ１１０ａ ｍＲＮＡレベルに差異は検出されなかった。突然変異対立遺伝子の発現は約８倍高かった。ＰＩＫ３ＣＡのＤＮＡコピー数は４〜５であり、ＷＴは１、及び突然変異対立遺伝子は３〜４である（エクソーム配列）。突然変異と野生型ＲＮＡの比率により、薬物に誘導されるｐ１１０ａ分解の量が予測される。ｐ１１０ａの減少は、転写段階では起こらない。図７Ｂは、ｔａｓｅｌｉｓｉｂ（ＧＤＣ００３２）で処理したＨＣＣ１９５４ｐ１１０アルファ野生型（左）及びｐ１１０アルファＨ１０４７Ｒ突然変異（右）ｐ１１０アルファ細胞の、ＲＰＬ１９コントロールに対するｐ１１０ａ ｍＲＮＡ発現の測定における、リアルタイムＱＰＣＲの結果を示す。図７Ｃは、アルペリシブ（ＢＹＬ−７１９）で処理したＨＣＣ１９５４ｐ１１０アルファ野生型（左）及びｐ１１０アルファＨ１０４７Ｒ突然変異（右）ｐ１１０アルファ細胞の、ＲＰＬ１９コントロールに対するｐ１１０ａ ｍＲＮＡ発現の測定における、リアルタイムＱＰＣＲの結果を示している。野生型及び突然変異細胞におけるｍＲＮＡレベルの比率は、ｐ１１０ａの減少が転写段階で起こらないことを確認するものである。
ｔａｓｅｌｉｓｉｂによるｐ１１０ａの枯渇は、プロテアソーム媒介性であり（図８Ａ−８Ｅ）、Ｅ１ユビキチン活性化酵素を必要とする（図８Ｆに示す）。図８Ａは、図示の時間にわたって１．６μＭのｔａｓｅｌｉｓｉｂで処理した突然変異ＨＣＣ１９５４（ＰＩＫ３ＣＡ Ｈ１０４７Ｒ）乳がん細胞のウェスタンブロット分析を示している。回収の４時間前に、１０μＭのプロテアソーム阻害剤ＭＧ１３２（Ｎ−（ベンシルオキシカルボニル）ｌｅｕｃｉｎｙｌｌｅｕｃｉｎｙｌｌｅｕｃｉｎａｌ Ｚ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−ａｌ、ＣＡＳ Ｒｅｇ．Ｎｏ．１３３４０７−８２−６）を加えた（右レーン）。ＭＧ−１３２プロテアソーム阻害剤は、ｔａｓｅｌｉｓｉｂ（ＧＤＣ−００３２）によるｐ１１０ａの分解を救済する。プロテアソーム阻害剤を２４時間経過時点で加えることは、薬物により誘導される分解からの保護には遅すぎる。
Ｐ１１０アルファの枯渇は、プロテアソーム媒介性であり、Ｅ１ユビキチン活性化酵素を必要とする。図８Ｂは、図示の時間にわたって１．６μＭのｔａｓｅｌｉｓｉｂで処理した突然変異ＨＣＣ１９５４（ＰＩＫ３ＣＡ Ｈ１０４７Ｒ）乳がん細胞の溶解物のウェスタンブロット分析を示している。回収の４時間前に、１０μＭのＭＧ１３２（中央レーン）、１０μＭのＵＡＥ１阻害剤である、以下の構造：
を有する（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（６−（（（Ｓ）−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インデン−１−イル）アミノ）−９Ｈ−プリン−９−イル）−３，４−ジヒドロキシテトラヒドロフラン−２−イル）メチル スルファメート、ＣＡＳ Ｒｅｇ．Ｎｏ．９０５５７８−７７−０を加えた。
図８Ｃは、図示の時間にわたって１．６μＭのｔａｓｅｌｉｓｉｂで処理した突然変異ＨＣＣ１９５４（ＰＩＫ３ＣＡ Ｈ１０４７Ｒ）乳がん細胞のウェスタンブロット分析を示している。回収の４時間前に、１０μＭのＭＧ１３２を加えた（右レーン）。Ｔａｓｅｌｉｓｉｂは、ｐ１１０ａのポリユビキチン化を媒介し、ポリユビキチン化されたｐ１１０ａはＭＧ１３２で蓄積する。Ｅ１阻害剤（ＵＡＥ１阻害剤）による処理（図８Ｅ参照）は、オートラジオグラムの高分子量帯を崩壊させた。このことは抗体の特異性を確認するものである。
図８Ｄも、図示の時間にわたって１．６μＭのｔａｓｅｌｉｓｉｂで処理した突然変異ＨＣＣ１９５４（ＰＩＫ３ＣＡ Ｈ１０４７Ｒ）乳がん細胞のウェスタンブロット分析を示している。回収の４時間前に、１０μＭのＭＧ１３２を加えた（右レーン）。細胞膜及びサイトゾルに基づいて行われた測定値の比較により、ｐ１１０ａのユビキチン化が主に膜において起こることが実証された。膜関連ｐ１１０ａは、ｔａｓｅｌｉｓｉｂによりサイトゾルのｐ１１０ａより効率的にユビキチン化される。Ｔａｓｅｌｉｓｉｂは素早く原形質膜における突然変異ｐ１１０ａの分解を媒介する。膜関連ｐ１１０ａの分解速度は、サイトゾルｐ１１０ａの分解よりはるかに速い。ｔａｓｅｌｉｓｉｂによる細胞の短期処理は、膜の用量依存性の分解を媒介するが、サイトゾルｐ１１０ａについては媒介しない。これと比較して、アルペリシブ（ＢＹＬ−７１９）のみは膜において弱い効果を有し、溶解物全体では効果を有さない。アルペリシブは、膜において弱い初期応答を示したが、ｐ１１０ａの経時的分解を引き起こさなかった。Ｔａｓｅｌｉｓｉｂは、アルペリシブより優れたｐ１１０ａのディグレーダーである。
図８Ｅは、図示の時間にわたって１．６μＭのｔａｓｅｌｉｓｉｂで処理した突然変異ＨＣＣ１９５４（ＰＩＫ３ＣＡ Ｈ１０４７Ｒ）乳がん細胞のウェスタンブロット分析を示している。回収の４時間前に、１０μＭのＭＧ１３２、クロロキン、又は塩化アンモニウムを加えた（右レーン）。Ｔａｓｅｌｉｓｉｂによって媒介されたｐ１１０ａの枯渇はリソソーム阻害剤による影響を受けず、このことは、ｐ１１０ａの分解がエンドソーム／リソソーム媒介性でないことを示唆している。プロテアソーム阻害剤ＭＧ１３２はポジティブコントロールである。
図８Ｆは、ｐ１１０アルファのユビキチン化までの経路図であり、経路特異的阻害剤で動物細胞がタンパク質を分解する二つの異なる機序を説明する（Jadhav, T. et al （2009） “Defining an Embedded Code for Protein Ubiquitination” J. Proteomics Bioinform, Vol 2（7）:316-333; Wang, G. et al （2012） （“K63-linked ubiquitination in kinase activation and cancer” Frontiers in Oncology, Vol 2（5）:1-13）。プロテアソーム阻害剤ＭＧ１３２はｐ１１０ａの分解を助けることができたが、リソソーム阻害剤であるクロロキン又は塩化アンモニウムＮＨ４Ｃｌはそれができなかったため、ＧＤＣ−００３２媒介性のｐ１１０ａ分解は、リソソーム分解装置依存性というよりはむしろ、ユビキチンプロテアソーム依存性の分解経路である。
したがって、ｔａｓｅｌｉｓｉｂ媒介性のｐ１１０ａタンパク質分解は、時間依存性且つ用量依存性で、非転写、突然変異細胞に特異的且つユビキチン依存性であり、プロテアソームによって媒介され、膜関連ｐ１１０ａの場合に速い。
ｔａｓｅｌｉｓｉｂもアルペリシブも膜の肝臓ｐ１１０ａに影響を及ぼさない。
Ｔａｓｅｌｉｓｉｂはｐ１１０デルタを分解することも枯渇させることもない（図９Ａ及び９Ｂ）。図９Ａは、ｔａｓｅｌｉｓｉｂ及びアルペリシブ（ＢＹＬ７１９、Ｎｏｖａｒｔｉｓ、ＣＡＳ＃：１２１７４８６−６１−７，（Ｓ）−Ｎ１−（４−メチル−５−（２−（１，１，１−トリフルオロ−２−メチルプロパン−２−イル）ピリジン−４−イル）チアゾール−２−イル）ピロリジン−１，２−ジカルボキシアミド）で処理したＰＩ３Ｋ野生型細胞及びＢＲＡＦ突然変異ＳＷ９８２細胞のウェスタンブロット分析を示している。Ｔａｓｅｌｉｓｉｂはｐ１１０デルタを分解することも枯渇させることもない。図９Ｂは、ｔａｓｅｌｉｓｉｂ及びＧ−１０２（表１、米国特許第８２４２１０４号）で処理したＰＩ３Ｋ野生型細胞、Ｂ細胞リンパ腫ＳＵ−ＤＨＬ−１０細胞のウェスタンブロット分析を示している。
ＰＩ３Ｋシグナル伝達経路において、ＰＩ３Ｋ阻害剤は、負のフィードバックを軽減し、再活性化のための経路を準備する。負のフィードバックがブロックされると、ホスホ−ＲＴＫ（ＥｒｂＢ２、ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ３）活性が増大し、ＰＩ３Ｋ阻害の有効性が低下し、ｐＡＫＴが増大する。図１０は、様々な濃度、即ち１００ｎＭ、１μＭ、５μＭのＰＩ３Ｋ阻害剤とコントロール（ＤＭＳＯビヒクル）によりＰＩ３Ｋを阻害したＰＩＫ３ＣＡ野生型ＨＤＱＰ１細胞の、１時間及び２４時間経過時点でのウェスタンブロット分析を示している。
Ｔａｓｅｌｉｓｉｂは、遅い時点でのシグナル伝達の抑制の維持において別のＰＩ３Ｋ阻害剤Ｇ−１０２（米国特許第８２４２１０４号）より優れている。図１１Ａは、様々な濃度、即ち３ｎＭ、１６ｎＭ、６０ｎＭ、４００ｎＭ、２μＭのＧ−１０２とコントロール（ＤＭＳＯビヒクル）によりＰＩ３Ｋを阻害したＭＤＡ−ＭＢ ４５３（Ｈ１０４７Ｒ）細胞の、１時間及び２４時間経過時点でのウェスタンブロット分析を示している。図１１Ｂは、様々な濃度、即ち３ｎＭ、１６ｎＭ、６０ｎＭ、４００ｎＭ、２μＭのｔａｓｅｌｉｓｉｂ（ＧＤＣ−００３２）とコントロール（ＤＭＳＯビヒクル）によりＰＩ３Ｋを阻害したＭＤＡ−ＭＢ ４５３（Ｈ１０４７Ｒ）細胞の、１時間及び２４時間経過時点でのウェスタンブロット分析を示している。
Ｔａｓｅｌｉｓｉｂは、ＲＴＫ駆動経路の再活性化からの保護を行う。１時間経過時点において、ｐＡｋｔノックダウンは両ＰＩ３Ｋ阻害剤についてほぼ同等である。２４時間経過時点では、ｐＲＴＫが増加していた。Ｔａｓｅｌｉｓｉｂは、２４時間経過時のシグナル伝達の抑制について、非ディグレーダーＰＩ３Ｋ阻害剤であるＧ−１０２より優れている。図１２は、様々な濃度、即ち１ｎＭ、１０ｎＭ、１００ｎＭのｔａｓｅｌｉｓｉｂ（ＧＤＣ−００３２）及びＧ−１０２とコントロール（ＤＭＳＯビヒクル）によりＰＩ３Ｋを阻害したＳＷ４８Ｈ１０４７Ｒ細胞の、１時間及び２４時間経過時点でのウェスタンブロット分析を示している。
増殖因子リガンドで刺激した細胞において、ｔａｓｅｌｉｓｉｂは、シグナル伝達の抑制について非ディグレーダーＧ−１０２より優れている。この効果の理論的根拠は、ｐＲＴＫが増加するとき、突然変異ＰＩ３Ｋａの分解に対する感受性がより高いことである。ｐＲＴＫの結合はｐ１１０αに対してｐ８５をシフトさせると考えられ、これによりｐ１１０α（アルファ）がさらに活性化する。ホットスポットｐ１１０α突然変異がｐ１１０αとｐ８５の間の接触面で起こることがあり、ｐ８５／ｐ１１０相互作用を緩和させうる。図１３は、様々な濃度、即ち１ｎＭ、１０ｎＭ、１００ｎＭのｔａｓｅｌｉｓｉｂ（ＧＤＣ−００３２）及びＧ−１０２とコントロール（ＤＭＳＯビヒクル）によるＰＩ３Ｋ阻害で処理した、増殖因子リガンドＮＲＧを含む及び含まない、ＳＷ４８ ＰＩＫ３ＣＡ Ｈ１０４７Ｒ細胞のウェスタンブロット分析を示している。
ｉｎ ｖｉｔｒｏでの細胞増殖、同質遺伝子的突然変異細胞と野生型細胞のｐＰＲＡＳ４０を２４時間経過時点で測定することは、分解アッセイにおいてＰＩ３Ｋ阻害化合物を選択するために有用である。図１４Ａ〜Ｃは、親／突然変異選択性のＥＣ５０値を確立するために、Ｇ−１８１、ＧＤＣ−００３２及びＧ−１０２の様々な濃度における２４時間経過時の、同質遺伝子的突然変異（Ｅ５４５Ｋ、Ｈ１０４７Ｒ）におけるｐＰＲＡＳ４０のｉｎ ｖｉｔｒｏでの細胞増殖を、野生型親ＰＩ３Ｋ細胞との対比で示している。
突然変異ＰＩ３Ｋａノックイン細胞において、ｐａｎ−ＰＩ３Ｋ阻害剤であるピクチリシブ（ＧＤＣ−０９４１）に対するｔａｓｅｌｉｓｉｂの細胞力価の増大が観察される。図１５は、ＳＷ４８同質遺伝子的野生型及び突然変異（Ｅ５４５Ｋ、Ｈ１０４７Ｒ）細胞株とｔａｓｅｌｉｓｉｂ及びピクチリシブの用量滴定による処理とに関するｉｎ ｖｉｔｒｏでの細胞増殖データを示すグラフである。
Ｔａｓｅｌｉｓｉｂは、ＰＩＫ３ＣＡの突然変異がん株において力価の増強を有する。図１６は、ＰＩＫ３ＣＡの突然変異細胞株に対する４日間の細胞増殖（Ｃｅｌｌ−Ｔｉｔｅｒ ＧｌｏＲ、Ｐｒｏｍｅｇａ）アッセイにおける、ピクチリシブ（ＧＤＣ−０９４１）、ＢＫＭ１２０（ブパリシブ、Ｎｏｖａｒｔｉｓ ＡＧ、ＣＡＳ Ｒｅｇ．Ｎｏ．９４４３９６−０７−０、５−（２，６−ジモルホリノピリミジン−４−イル）−４−（トリフルオロメチル）ピリジン−２−アミン）、ｔａｓｅｌｉｓｉｂ（ＧＤＣ−００３２）及びＢＹＬ７１９（アルペリシブ、Ｎｏｖａｒｔｉｓ ＣＡＳ＃：１２１７４８６−６１−７）の有効性（ＩＣ５０マイクロモル）を示すグラフである。各点は異なるがん細胞株を表す。ピクチリシブ、ＢＫＭ１２０（ブパリシブ、Ｎｏｖａｒｔｉｓ ＡＧ、ＣＡＳ Ｒｅｇ．Ｎｏ．９４４３９６−０７−０）、及びＢＹＬ７１９は、ＰＩ３Ｋの非ディグレーダーである。
Ｔａｓｅｌｉｓｉｂはアポトーシスアッセイにおいて力価の増強を有する。図１７は、細胞死−ヌクレオソームＥＬＩＳＡ検出による７２時間の試験における、ＰＩＫ３ＣＡ野生型及び突然変異（Ｅ５４５Ｋ、Ｈ１０４７Ｒ）細胞株と、ｔａｓｅｌｉｓｉｂ、及びＰＩ３Ｋアルファの選択的阻害剤であるＧＤＣ−０３２６（米国特許第８２４２１０４号）、及びＢＹＬ７１９の用量滴定による処理とに関するｉｎ ｖｉｔｒｏでの細胞増殖データを示すグラフである。
Ｔａｓｅｌｉｓｉｂは、マウスのＰＩ３Ｋα突然変異異種移植片において、他の非ディグレーダーより大きな最大ｉｎ ｖｉｖｏ 有効性を有する。最大耐量（ＭＴＤ）において、ｔａｓｅｌｉｓｉｂは腫瘍を縮小させることができる。図１８Ａは、ビヒクル（ＭＣＴ；０．５％のメチルセルロース／０．２％のＴｗｅｅｎ ８０）、１５０ｍｇ／ｋｇのピクチリシブ（ＧＤＣ−０９４１）、及び２５ｍｇ／ｋｇのｔａｓｅｌｉｓｉｂ（ＧＤＣ−００３２）を、一日一回１００マイクロリットル（ｕｌ）でＰＯ（経口）投与された、ＰＩＫ３ＣＡ Ｈ１０４７Ｒ（ＰＩ３Ｋa）突然変異を有するＨＣＣ１９５４．ｘ１***腫瘍異種移植片保有の８〜１０匹の免疫不全マウスのコホートにおける、２１日間にわたる腫瘍体積の変化のフィッティングを示している。用語ｕＬはマイクロリットルを意味する。両方の薬物の最大耐量において、ＧＤＣ−００３２はＧＤＣ−０９４１より効果的であり、腫瘍縮小を誘導する。したがって、ＧＤＣ−００３２は、ＰＩ３Ｋ突然変異異種移植モデルにおいて非突然変異選択的ＰＩ３Ｋa阻害剤より効果的である。図１８Ｂは、ビヒクル（ＭＣＴ；０．５％のメチルセルロース／０．２％のＴｗｅｅｎ ８０）、４０ｍｇ／ｋｇのアルペリシブ（ＢＹＬ−７１９）、及び１５ｍｇ／ｋｇのｔａｓｅｌｉｓｉｂ（ＧＤＣ−００３２）を、一日一回１００マイクロリットル（ｕｌ）でＰＯ（経口）投与された、ＰＩＫ３ＣＡ Ｈ１０４７Ｒ（ＰＩ３Ｋa）突然変異を有するＨＣＣ１９５４．ｘ１***腫瘍異種移植片保有の８〜１０匹の免疫不全マウスのコホートにおける、２１日間にわたる腫瘍体積の変化のフィッティングを示している。２１日間ＧＤＣ−００３２を毎日経口投与した結果、治療（Ｒｘ）期間にわたって腫瘍が縮小した。その代わりに、２１日間非突然変異選択的ＰＩ３Ｋa阻害剤であるＢＹＬ−７１９を毎日経口投与した結果、腫瘍の停滞が誘導された。したがって、ＧＤＣ−００３２は、ＰＩ３Ｋ突然変異異種移植モデルにおいて、非突然変異選択的ＰＩ３Ｋａ阻害剤より効果的である。ＧＤＣ−００３２及びＢＹＬ−７１９による治療は、ビヒクルコントロールと比較したときの又は研究開始からのマウス体重における最小変化に基づいて、良好な耐容性を示した。
アルペリシブとして知られる化合物（ＢＹＬ７１９、Ｎｏｖａｒｔｉｓ、ＣＡＳ＃：１２１７４８６−６１−７）は、ＰＩ３Ｋアルファアイソフォームの選択的経口阻害剤であり、臨床治験において、セカンドラインのホルモン受容体陽性、ＨＥＲ２−進行性転移性乳がん用のフルベストラントと組み合わせた第ＩＩＩ相試験を含む、様々な腫瘍種類の治療可能性を有する（Furet, P. et al （2013） Bioorg. Med. Chem. Lett. 23:3741-3748；米国特許第８２２７４６２号；米国特許第８４７６２６８号；米国特許第８７１００８５号）。アルペリシブは、（Ｓ）−Ｎ１−（４−メチル−５−（２−（１，１，１−トリフルオロ−２−メチルプロパン−２−イル）ピリジン−４−イル）チアゾール−２−イル）ピロリジン−１，２−ジカルボキシアミド）という名称と、以下の構造を有する。
アルペリシブ（ＢＹＬ−７１９）
図１８Ｃは、ビヒクル（ＭＣＴ；０．５％のメチルセルロース／０．２％のＴｗｅｅｎ ８０）、及び１５ｍｇ／ｋｇのｔａｓｅｌｉｓｉｂ（ＧＤＣ−００３２）を、一日一回１００マイクロリットル（ｕｌ）でＰＯ（経口）投与された、ＰＩＫ３ＣＡ Ｅ５４２Ｋ（ＰＩ３Ｋ）に突然変異を有するＷＨＩＭ２０ホルモン受容体陽性患者由来の***腫瘍異種移植片保有の８〜１０匹の免疫不全マウスのコホートにおける、２８日間にわたる腫瘍体積の変化のフィッティングを示している。２８日間ＧＤＣ−００３２を毎日経口投与した結果、投薬終了後に持続された治療（Ｒｘ）期間にわたって腫瘍が縮小した。ＧＤＣ−００３２による治療は、ビヒクルコントロールと比較したときの又は研究開始からのマウス体重における最小変化に基づいて、良好な耐容性を示した。
図１８Ｄは、ビヒクル（ＭＣＴ；０．５％のメチルセルロース／０．２％のＴｗｅｅｎ ８０）、４０ｍｇ／ｋｇのアルペリシブ（ＢＹＬ−７１９）、及び２．５、５．０、１５ｍｇ／ｋｇのｔａｓｅｌｉｓｉｂ（ＧＤＣ−００３２）を、一日一回１００マイクロリットル（ｕｌ）でＰＯ（経口）投与された、ＰＩＫ３ＣＡ Ｈ１０４７Ｒ（ＰＩ３Ｋ）に突然変異を有するＨＣＩ−００３ホルモン受容体陽性患者由来の***腫瘍異種移植片保有の８〜１０匹の免疫不全マウスのコホートにおける、２７日間にわたる腫瘍体積の変化のフィッティングを示している。２７日間ＧＤＣ−００３２を毎日経口投与した結果、治療（Ｒｘ）期間にわたって腫瘍縮小が用量依存性に亢進した。その代わりに、２７日間非突然変異選択的ＰＩ３Ｋa阻害剤であるＢＹＬ−７１９を毎日経口投与した結果、腫瘍の停滞が誘導された。したがって、ＧＤＣ−００３２は、ＰＩ３Ｋ突然変異異種移植モデルにおいて、非突然変異選択的ＰＩ３Ｋａ阻害剤より効果的である。ＧＤＣ−００３２及びＢＹＬ−７１９による治療は、ビヒクルコントロールと比較したときの又は研究開始からのマウス体重における最小変化に基づいて、良好な耐容性を示した。
ＧＤＣ−００３２の有効性を、ＰＩＫ３ＣＡ Ｅ５４２Ｋホットスポット突然変異を有するＷＨＩＭ２０ホルモン受容体陽性患者由来の乳がん異種移植モデルにおいて評価した。２８日間ＧＤＣ−００３２を毎日経口投与した結果、投薬終了後に持続された治療（Ｒｘ）期間にわたって腫瘍が縮小した。ＧＤＣ−００３２による治療は、ビヒクルコントロールと比較したときの又は研究開始からのマウス体重における最小変化に基づいて、良好な耐容性を示した。
ＧＤＣ−００３２の有効性を、ＰＩＫ３ＣＡ Ｈ１０４７Ｒホットスポット突然変異を有するＨＣＩ−００３ホルモン受容体陽性患者由来の乳がん異種移植モデルにおいて評価した。２７日間ＧＤＣ−００３２を毎日経口投与した結果、治療（Ｒｘ）期間にわたって腫瘍縮小が用量依存性に亢進した。その代わりに、２７日間非突然変異選択的ＰＩ３Ｋａ阻害剤であるＢＹＬ−７１９を毎日経口投与した結果、腫瘍の停滞が誘導された。したがって、ＧＤＣ−００３２は、ＰＩ３Ｋ突然変異異種移植モデルにおいて非突然変異選択的ＰＩ３Ｋａ阻害剤より効果的である。ＧＤＣ−００３２及びＢＹＬ−７１９による治療は、ビヒクルコントロールと比較したときの又は研究開始からのマウス体重における最小変化に基づいて、良好な耐容性を示した。
ｔａｓｅｌｉｓｉｂで処理した突然変異ＨＣＣ１９５４（ＰＩＫ３ＣＡ Ｈ１０４７Ｒ）乳がん細胞において、シグナル伝達はｔａｓｅｌｉｓｉｂのウォッシュアウト後素早く正常に戻り、ｐ１１０ａレベルは８〜２４時間後に戻り始める。図１９は、様々な濃度、即ち１６ｎＭ、８０ｎＭ、４００ｎＭのｔａｓｅｌｉｓｉｂとコントロール（ＤＭＳＯビヒクル）で処理した突然変異ＨＣＣ１９５４（ＰＩＫ３ＣＡ Ｈ１０４７Ｒ）乳がん細胞のウェスタンブロット分析を示している。
一実施態様では、ｐ１１０アルファタンパク質の枯渇は、細胞増殖、細胞シグナル伝達、又はアポトーシスレベルによって測定することができる。
一実施態様では、ｐ１１０アルファタンパク質の枯渇は、患者から採取された生物学的試料由来の測定可能なバイオマーカーと相関している。ｐ１１０アルファタンパク質の枯渇は、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｉｍｐｌｅ ＩＥＦ（等電点電気泳動法）技術により臨床設定において検出されうる。十分に利用可能な患者組織を用いて、ウェスタンブロット分析、又は質量分析法によりｐ１１０アルファタンパク質レベルを測定することができる。質量分析は、ユビキチン化の検出を含め、単一細胞のプロテオムの照合を可能にする。ＮＭＲ（核磁気共鳴）分光法は、ｐ１１０アルファ及びｐ８５の解離又はｐ１１０アルファの分解を検出及び測定するための、別の生物物理学的ツールである。
別法として、特異的抗ｐ１１０アルファ抗体が免疫組織化学（ＩＨＣ）又は免疫蛍光（ＩＦ）に基づく試験において有用でありうる。
ＰＩ３Ｋタンパク質の免疫沈降法（ＩＰ）及びタンパク質の局在化によりｐ８５及びｐ１１０アルファの解離の変化を検出することができるか、又はｐ１１０アルファがｔａｓｅｌｉｓｉｂによる処置の前及び後のいつ分解されるかにより患者の応答を同定及び予測することができる。
突然変異同質遺伝子的ＰＩ３Ｋ細胞株におけるｔａｓｅｌｉｓｉｂの活性は、野生型同質遺伝子的ＰＩ３Ｋ細胞株における活性より大きい。同質遺伝子的ＰＩ３Ｋ突然変異細胞株は、Ｈ１０４７Ｒ、Ｃ４２０Ｒ、Ｈ１０４７Ｌ、Ｅ５４２Ｋ、Ｅ５４５Ｋ及びＱ５４６Ｒから選択される突然変異を有しうる。
Ｔａｓｅｌｉｓｉｂは、ＡＴＰ−Ｋｍ、ＰＩＰ２−Ｋｍ、ＰＩＰ２からＰＩＰ３への変換の比率若しくは範囲、膜局在化、脂質膜親和性、及び受容体チロシンキナーゼ結合により測定又は検出した場合、突然変異ｐ８５／ｐ１１０アルファ複合体のＡＴＰ−Ｋｍと比較して、野生型ｐ８５／ｐ１１０アルファ複合体に差次的に影響する。
Ｔａｓｅｌｉｓｉｂは、突然変異ｐ８５／ｐ１１０アルファ複合体と比較して、野生型ｐ８５／ｐ１１０アルファ複合体の立体構造の変化を差次的に誘導する。立体構造の変化には、ｔａｓｅｌｉｓｉｂと野生型ｐ８５／ｐ１１０アルファ複合体の間に存在しない突然変異ｐ８５／ｐ１１０アルファ複合体との結合相互作用が含まれる。
一実施態様では、ｔａｓｅｌｉｓｉｂは、単離されたＰＩ３Ｋアルファの突然変異形態に選択的に結合し、突然変異ＰＩ３Ｋアルファに対する結合のＩＣ５０は、野生型ＰＩ３Ｋアルファに対する結合のＩＣ５０より小さい。
一実施態様では、ｔａｓｅｌｉｓｉｂは、ＰＩ３Ｋアルファ同質遺伝子的がん細胞株の野生型形態の阻害より、突然変異−ＰＩ３Ｋアルファ同質遺伝子的がん細胞株の阻害において高い活性を有する。
一実施態様では、ｔａｓｅｌｉｓｉｂは、Ｈ１０４７Ｒ、Ｃ４２０Ｒ、Ｈ１０４７Ｌ、Ｅ５４２Ｋ、Ｅ５４５Ｋ及びＱ５４６Ｒから選択される突然変異ＰＩ３Ｋのアルファ−サブユニットに対する結合について選択的であり、突然変異ＰＩ３Ｋ ｐ１１０アルファアイソフォーム細胞株においてＩＣ５０によって測定した場合、野生型ＰＩ３Ｋ ｐ１１０アルファアイソフォーム細胞株におけるｔａｓｅｌｉｓｉｂのＩＣ５０阻害活性より低い阻害活性を有する。突然変異ＰＩ３Ｋ ｐ１１０アルファアイソフォームは、Ｈ１０４７Ｒ、Ｃ４２０Ｒ、Ｈ１０４７Ｌ、Ｅ５４２Ｋ、Ｅ５４５Ｋ及びＱ５４６Ｒから選択される。
トリプシン切断及び質量分析法によるＰ１１０アルファ枯渇の検出
ｔａｓｅｌｉｓｉｂによって処理した生物学的試料におけるｐ１１０アルファの枯渇を検出及び測定するための上記方法に加えて、質量分析により直接的な検出を達成することができる。野生型及びＨ１０４７Ｒ突然変異型ｐ１１０ａタンパク質の混合物を発現するＨＣＣ１９５４乳がん細胞を、ＤＭＳＯ中５００ｎＭのｔａｓｅｌｉｓｉｂ（ＧＤＣ−００３２）で２４時間処理した。ｐ１１０アルファタンパク質の免疫沈降法をを実施し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離されてクーマシー染色されたタンパク質を補足した。ｐ１１０アルファを含むＧｅｌブレンドを、ゲル内トリプシン消化に供し、分析用のトリプシンペプチドを生成した。ＤＭＳＯ（コントロール）又はｔａｓｅｌｉｓｉｂで処理した細胞由来のトリプシンペプチドは、対応する７４９．８２８２ｍ／ｚ（＋／−１０ｐｐｍ）イオンの定量化に基づき、同等のレベルのＱＭ（ｏｘ）ＮＤＡＨＨＧＧＷＴＴＫペプチド配列（配列番号７）を示した。ｔａｓｅｌｉｓｉｂ処理した細胞由来のトリプシンペプチドは、ＤＭＳＯ処理細胞と比較して、３９３．６９８３ｍ／ｚ（＋／− １０ｐｐｍ）のイオンによって特徴づけられる、突然変異特異的ペプチドＨＧＧＷＴＴＫ（配列番号８）の欠損を示した。したがって、ｐ１１０ａ Ｈ１０４７Ｒといった突然変異腫瘍に特異的なネオトリプシンペプチドを使用して、野生型形態と比較した場合の突然変異ｐ１１０ａの枯渇を実証することができる。
野生型トリプシンペプチド ＱＭ（ｏｘ）ＮＤＡＨＨＧＧＷＴＴＫ （配列番号７）
突然変異トリプシンペプチド ＨＧＧＷＴＴＫ （配列番号８）
図２４Ａは、実施例７による野生型ＰＩＫ３ＣＡ ＨＣＣ−１９５４（上）及びＰＩＫ３ＣＡ ＨＣＣ−１９５４を発現するＨ１０４７Ｒ突然変異（下）のトリプシン切断を示している。
図２４Ｂは、実施例７による、消化後の野生型ＰＩＫ３ＣＡ ＨＣＣ−１９５４（左）及びＰＩＫ３ＣＡ ＨＣＣ−１９５４を発現するＨ１０４７Ｒ突然変異（右）に対する液体クロマトグラフィー−タンデム質量分析（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）の分析と、ｐ１１０アルファ（ＰＩＫ３ＣＡ）タンパク質免疫沈降法とを示している。
突然変異の選択性
表１は複数のＰＩ３Ｋ結合化合物の生物学的特性をまとめたものである。ＧＤＣ−００３２（Ndubaku et al(2013)Jour. Med. Chem. 56(11):4597-4610;Staben et al(2013)Bioorg. Med. Chem. Lett. 23 2606-2613；国際公開第２０１１／０３６２８０号；米国特許第８２４２１０４号；米国特許第８３４３９５５号）は、ｐａｎ−ＰＩ３Ｋ阻害化合物 ＧＤＣ−０９４１よりＰＩ３Ｋアルファ突然変異がん細胞に対して強力である（Folkes et al(2008)Jour. of Med. Chem. 51(18):5522-5532；米国特許第７７８１４３３号；米国特許第８３２４２０６号）。表１の四つのＰＩ３Ｋ阻害剤は、ＰＩ３Ｋアルファに対する結合の生化学的力価（Ｋｉ値）及びＰＩ３Ｋの四つの野生型クラス１アイソフォームに対する相対的力価において異なっている。ＧＤＣ−０３２６は、アルファ選択的ＰＩ３Ｋ阻害化合物であり、ベータ、デルタ、及びガンマアイソフォームに弱く結合する（米国特許第８２４２１０４号）。ＧＤＣ−０９４１は、四つすべてのアイソフォームに対して比較的よく結合する「ｐａｎ」阻害剤である。ＧＤＣ−００３２は、アルファ、デルタ、及びガンマアイソフォームによく結合し、ベータに弱く結合する「ベータ節約型」である。
表１ ＰＩ３Ｋ結合化合物の活性
Ｇ−１０２
ＧＤＣ−０３２６
ＧＤＣ−００３２（ｔａｓｅｌｉｓｉｂ）
ＧＤＣ−０９４１（ピクチリシブ）
突然変異ＰＩ３Ｋアルファのノックインは、ＳＷ４８同質遺伝子株、ＰＩ３Ｋアルファ野生型（親）及びヘリカルドメイン突然変異Ｅ５４５Ｋとキナーゼドメイン突然変異Ｈ１０４７Ｒに示すように、ｔａｓｅｌｉｓｉｂ（ＧＤＣ−００３２）に関する細胞力価を上昇させるが、ＧＤＣ−０９４１はそのような突然変異選択的効果を示さない。ＧＤＣ−００３２の突然変異タンパク質との相互作用は、ＧＤＣ−０９４１とは異なっていると推定される。このような予想外の結果は、特定の強力なＰＩ３Ｋ阻害剤の固有の結合機序又はモードを示唆するが、他については示さない。ＧＤＣ−００３２の突然変異選択特性は、ＧＤＣ−０９４１にはないものであり、これによりＧＤＣ−００３２は、ＰＩ３Ｋアルファ突然変異異種移植片腫瘍モデルであるキナーゼドメインのＨ１０４７Ｒ突然変異を有するＨＣＣ１９５４乳がんにおいて、ＧＤＣ−０９４１より大きな最大有効性を有する。２１日間にわたる毎日の経口投与の後、最大耐量２５ｍｇ／ｋｇでＧＤＣ−００３２は腫瘍の縮小を誘導し、最大耐量１５０ｍｇ／ｋｇでＧＤＣ−０９４１は腫瘍増殖を阻害した。
ｉｎ ｖｉｔｒｏでの腫瘍細胞増殖を、ＧＤＣ−００３２、ＧＤＣ−０３２６（米国特許第８２４２１０４号）又はＧＤＣ−０９４１で処理したがん細胞株において測定した。ＧＤＣ−００３２は、低濃度でＰＩ３Ｋ突然変異細胞にアポトーシスを誘導する。ＧＤＣ−００３２の突然変異の力価の上昇は、野生型ＰＩ３Ｋアルファに対する生化学的結合力価と相関していない。ＰＩ３Ｋ阻害化合物によるＰＩ３Ｋ突然変異細胞株及び腫瘍に対する力価の上昇は、物理化学的又は浸透性特性、細胞内レベル、アイソフォーム選択性、及び野生型ｐ１１０アルファ又は野生型ｐ１１０ デルタに対する絶対力価により影響されうる。細胞生存率アッセイでは、ｐ１１０アルファ選択的阻害剤ＧＤＣ−０３２６（表１）の強度は、Ｈ１０４７Ｒ ｐ１１０アルファ細胞株であるＨＣＣ１９５４に対し、ＧＤＣ−００３２より弱く、その６分の１であった。ＧＤＣ−００３２は、ベータ、ガンマ、及びデルタアイソフォームに対し、ＧＤＣ−０３２６（米国特許第８２４２１０４号）より低いアルファ選択性を有する。突然変異ＰＩ３Ｋアルファのノックインは、突然変異選択的ＧＤＣ−００３２に関して細胞力価の細胞力価を上昇させるが、Ｇ−１０２のようなＰＩ３Ｋアルファ特異的阻害剤に関しては上昇させない。同様の細胞生存率アッセイにより、ｐ１１０デルタの阻害がＰＩ３Ｋ突然変異細胞株の生存率を低下させないことが決定された。また、それに相当するＧＤＣ−００３２の細胞内レベルを、様々な野生型及びＰＩ３Ｋ突然変異細胞において測定した（ｐｍｏｌ／ｍｇ）。結果は、細胞内の蓄積ではＧＤＣ−００３２の突然変異力価の上昇が説明されないことを示すものである。
ＧＤＣ−００３２、ＧＤＣ−０３２６又はＧＤＣ−０９４１で処理した突然変異同質遺伝子的ＳＷ４８ ＰＩ３ＫアルファＨ１０４７Ｒ細胞株及び野生型ＳＷ４８親細胞由来の、放射標識した溶解物のゲル電気泳動のオートラジオグラフィーは、ウェスタンブロット分析により、切断されたＰＡＲＰ、ｐＳ６（Ｓ２３５／２３６）、ｐＡＫＴＴ３０８、ｐＡＫＴＳ４７３、ベータ−アクチン及びＧＡＰＤＨを測定した。ＰＩ３Ｋ経路のノックダウンは、アポトーシスの誘発と用量依存性に相関する。Ｔａｓｅｌｉｓｉｂは、極めて低い化合物濃度においてＰＩ３Ｋ突然変異を有する細胞にアポトーシスを誘導する。同様の効果が、ＭＣＦ１０Ａ***細胞株及びＨＣＣ１９５４、ＰＩ３ＫアルファＨ１０４７Ｒ乳がん細胞株由来の同質遺伝子的細胞に見られた。同等の化合物特性にも関わらず、経路ノックダウンは、非突然変異選択的ＧＤＣ−０３２６よりも、突然変異選択的ＧＤＣ−００３２に強力である。ＧＤＣ−００３２の突然変異の力価の上昇は、野生型ＰＩ３Ｋアルファに対する生化学的力価によって説明されない。
これらアッセイにより、ＰＩ３Ｋアルファ突然変異の選択性に対する構造的変化の影響を試験するために、化合物を評価することができる。特定領域における大きさ及び水素結合能の変化は、選択性の向上と相関しうる。
予備臨床治験データは、ＰＩＫ３ＣＡ突然変異腫瘍を有する十名の患者のうち五名において、及びＰＩＫ３ＣＡ突然変異***腫瘍を有する五名の患者のうち四名において、ｔａｓｅｌｉｓｉｂが部分寛解を達成したことを示した（Olivero and Juric （2013） AACR）。
ＴＡＳＥＬＩＳＩＢとＰＩ３Ｋの相互作用
Ｔａｓｅｌｉｓｉｂ（ＧＤＣ−００３２）は、ＰＩ３Ｋ野生型アイソフォームとの相互作用とは異なるＰＩ３Ｋアルファ突然変異アイソフォームとの重要な相互作用に起因して、ＰＩ３Ｋ野生型アイソフォームよりＰＩ３Ｋアルファ突然変異アイソフォームについて高い選択性を有し、ＰＩ３Ｋアルファ突然変異アイソフォームの重要な突然変異特異的特徴と相互作用するための、原子及び官能基の精確な位置づけ及び配置を含みうる。このような相互作用は、ＰＩ３Ｋアルファ突然変異アイソフォームタンパク質との水素結合−ドナー、水素結合−アクセプター及び／又はファンデルワース力パートナーとして作用する官能基によって達成される（Staben et al （2013）Bioorg. Med. Chem. Lett. 23:2606-2613; Ndubaku et al （2013） Jour. Med. Chem. 56（11）,4597-4610）。Ｔａｓｅｌｉｓｉｂは、低エネルギー立体構造での結合トポロジーに適合することができ、リガンド結合部位に効率的な極性及びファンデルワース相互作用をつくることができる。
ＰＩＫ３ＣＡの突然変異が脂質の結合及びＰＩ３Ｋの基礎活性を増大させることが確立された（Burke et al （2012）Proc. Natl. Acad. Sci. 109:15259-15264）。突然変異は、ＰＩ３Ｋアルファの閉環したサイトゾルの不活性形態を不安定にし、脂質結合の増大を促進する。突然変異選択的な本発明のＰＩ３Ｋ結合化合物は、ＰＩ３Ｋアルファの閉環形態の安定を増大させ、脂質結合を増大させる立体構造の変化を妨げる。ホットスポット突然変異は、Ｈ１０４７Ｒ突然変異の水素−重水素交換においてキナーゼドメインの領域のさらなる重水素化を誘導し、このことは、そのような突然変異がより動的（不安定化されている）で交換のために利用可能であることを示している。このような変化は、脂質膜に対する親和性の上昇を伴っており、活性化及び下流でのシグナル伝達の増大を説明しうる。このような動的な領域である残基８４８〜８５９（図２０）は、本発明の化合物に重要な結合相互作用を提供しうる。
図２１は、ＰＩＫ３ＣＡ内での突然変異の位置による、ＰＩＫ３ＣＡの突然変異を有する細胞株におけるＧＤＣ−００３２生存率の結合力価を示すグラフである。ＧＤＣ−００３２は、突然変異の位置に関わらず、ＰＩ３Ｋ突然変異を有する細胞株に対して有効である。細胞株のいくつかは、耐性マーカーとしてＢ−Ｒａｆ及びＲａｓといった追加の突然変異を有する。
図２２は、ｐ１１０ａ及びｐ１１０ａに並行なレベルを用いたｐ８５免疫共沈降法（Ｃｏ−ＩＰ）のウェスタンブロット（ＷＢ）分析を示しており、これは、安定なｐ１１０ａがｐ８５との複合体であり、有意な用量依存性のｐ１１０ａ分解がｔａｓｅｌｉｓｉｂによって誘導されることを示唆している。細胞を、その時点でｐ１１０ａが明らかに分解している２４時間にわたってＧＤＣ−００３２で処理した。代替的実験では、もっと短い時点（２時間、４時間など）でサンプリングした細胞を処理してよく、その時点でｐ１１０アルファはまだ分解されていないが、ｐ８５から解離している。ｔａｓｅｌｉｓｉｂによる治療の後に、ｐ８５からは突然変異の解離が検出されるが野生型ｐ１１０アルファの解離は検出されないことは、ｔａｓｅｌｉｓｉｂによる治療に応答すると思われる突然変異ＰＩ３Ｋ腫瘍保有患者の予測バイオマーカーでありうる。
図２３は、定常状態のｐ１１０ａ ｍＲＮＡ発現を示している。ＧＤＣ００３２によるｐ１１０ａの分解に最も感受性である細胞株は、ＷＴ ｐ１１０ａよりＨ１０４７Ｒ突然変異を多く有する。突然変異とＷＴ ｐ１１０ａ対立遺伝子の比率は、ＧＤＣ−００３２媒介性のｐ１１０ａの分解に対する感受性を決定しうる。
ＰＩ３Ｋベータ（Zhang, X. et al （2011） Mol. Cell 41:567-5789）, PI3Kアルファ （Huang, C.-H. et al （2007） Science 318:1744）, PI3Kテ゛ルタ （Berndt, A. et al （2010） Nat. Chem. Biol. 6:11）、及びＰＩ３Ｋガンマ（"Structural determinants of phosphoinositide 3-kinase inhibition by wortmannin, LY294002, quercetin, myricetin, and staurosporine", Walker, E.H. et al （2000） Mol.Cell 6:909）のＸ線構造が報告されている。注意すべき一つの違いは、すべてのアイソフォーム（アルファ−Ｔｒｐ７８０、ベータ−Ｔｒｐ７８１、デルタ−Ｔｒｐ７６０、ガンマ−ＴＲＰ８１２）中に存在するトリプトファン残基の立体配座である。これは、阻害剤による隣接残基の「誘導適合」又は特異的相互作用の結果としてＰＩ３Ｋデルタに対するアイソフォーム特異性を取得するために重要と考えられる同じトリプトファン残基である。このＴｒｐ残留物のインドールの立体配座は、ＰＩ３Ｋベータにおいて特有であり、ＰＩ３Ｋベータに対する低度且つ弱い結合を有する「ベータ節約型」ＰＩ３Ｋ阻害剤の設計の基礎を提供しうる。ベータ−Ｔｒｐ７８１のＣα−Ｃβに沿った回転は、別の配向を提示する。第２のシェル残基の差異は、ＰＩ３ＫベータにおいてこのＴｒｐの特有の配向を促進する。第１に、インドールＮ−Ｈは、結合部位の同様の領域を占めるがＰＩ３Ｋベータ又はデルタには存在しないＰＩ３Ｋアルファ（Ｇｌｕ７９８）及びＰＩ３Ｋガンマ（Ｇｌｕ８１４）の両方において、酸性残基にＨ結合を供与する。このような相互作用は、これらアイソフォーム中のインドールに観察される配向に有利でありうる。Ｇｌｕ８１４の代わりに、ＰＩ３Ｋベータ及びデルタは、非極性の側鎖を有する中性の残基（それぞれベータ−Ｖａｌ７８３及びデルタ−Ｍｅｔ７６２）を有し、したがってインドールは他のエネルギー的に好ましい配向を占有することができる。ＰＩ３Ｋベータの分枝状バリン残基が、アルファ、デルタ及びガンマに観察されるものと同様の配向に不利である可能がある；Ｃガンマメチルが代わりにインドール４／５位置までファンデルワース距離に接近する。構造−活性関係（ＳＡＲ）のこのような解釈の下に、この特有の立体配座では、Ｔｒｐ側鎖が、阻害剤の立体容積による損傷を受け易い。さらに注意すべきは、ベータと比較した場合にＰＩ３Ｋアルファ、デルタ及びガンマ中のインドールによるパイスタッキングのために提示された差次的角度及び原子である。トリプトファン環と芳香族アミノ酸側鎖（Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｈｉｓ）との間のパイ相関のＰＤＢ分析については：Samanta, U. et al （1999） Biol. Crystallogr., D55:1421を参照されたい。このような観察は、同じ領域内の非芳香族置換により分子の全体的選択性がＰＩ３Ｋｂより低くなる理由を部分的に説明しうる（Staben et al （2013）Bioorg. Med. Chem. Lett. 23:2606-2613）。
突然変異Ｐ１１０アルファのバイオマーカー検出
特定の実施態様では、試料中のバイオマーカータンパク質の存在及び／又は発現レベル／量が、免疫組織化学（ＩＨＣ）及び染色プロトコールを用いて試験される。組織切片のＩＨＣ染色は、試料中のタンパク質の存在を決定又は検出する信頼性の高い方法であることが示された。方法、アッセイ及び／又はキットのいずれかのいくつかの実施態様では、関連のバイオマーカーは突然変異ｐ１１０アルファタンパク質である。いくつかの実施態様では、突然変異ｐ１１０アルファは免疫組織化学により検出される。いくつかの実施態様では、個体由来の試料中における突然変異ｐ１１０アルファバイオマーカーの発現の増大は、タンパク質発現の増大であり、さらなる実施態様では、ＩＨＣを用いて決定される。一実施態様では、バイオマーカーの発現レベルは、（ａ）抗体を用いて試料（例えば対象のがん試料）のＩＨＣ分析を実施すること；及びｂ）試料中のバイオマーカーの発現レベルを決定することを含む方法を用いて決定される。いくつかの実施態様では、ＩＨＣ染色強度は基準との比較において決定される。いくつかの実施態様では、基準は参照値である。いくつかの実施態様では、基準は基準試料（例えば、コントロール細胞株染色試料又は非がん性患者由来の組織試料）である。
ＩＨＣは、形態染色及び／又は蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションといった追加的技術と組み合わせて実施されうる。ＩＨＣの二つの一般的方法、即ち直接的及び間接的アッセイが利用可能である。第１のアッセイによれば、標的抗原に対する抗体の結合が直接的に決定される。この直接的アッセイは、さらなる抗体相互作用なしで可視化することが可能な、標識された試薬、例えば蛍光性タグ又は酵素標識された一次抗体を用いる。典型的な間接的アッセイでは、非コンジュゲート一次抗体が抗原に結合し、次いで標識された二次抗体が一次抗体に結合する。二次抗体が酵素標識にコンジュゲートしている場合、抗原を可視化するために発色性又は発蛍光性基質が付加される。複数の二次抗体が一次抗体上の異なるエピトープと反応しうるため、シグナル増幅が起こる。ＩＨＣのために使用される一次及び／又は二次抗体は、典型的に、検出可能部分を用いて標識される。多数の標識が利用可能であり、それらは一般に以下のカテゴリーに分類される：（ａ）放射性同位体、例えば３５Ｓ、１４Ｃ、１２５Ｉ、３Ｈ、及び１３１Ｉ；（ｂ）コロイド金粒子；（ｃ）限定されないが、希土類キレート（ユーロピウムキレート）、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ、ローダミン、フルオレセイン、ダンシル、リサミン、ウンベリフェロン、フィコエリトリン（ｐｈｙｃｏｃｒｙｔｈｅｒｉｎ）、フィコシアニン、又は市販のフルオロフォア、例えばＳＰＥＣＴＲＵＭ ＯＲＡＮＧＥ７及びＳＰＥＣＴＲＵＭ ＧＲＥＥＮ７及び／又は上記のいずれか一つ又は複数の誘導体を含む蛍光標識；（ｄ）様々な酵素−基質標識が利用可能である（米国特許第４２７５１４９号；米国特許第４３１８９８０号）。酵素標識の例には、ルシフェラーゼ類（例えば、ホタルルシフェラーゼ及び細菌ルシフェラーゼ（米国特許第４７３７４５６号）、ルシフェリン、２，３−ジヒドロフタラジンジオン類、マレートデヒドロゲナーゼ、ウレアーゼ、セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰＯ）などのペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ベータガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、サッカリドオキシダーゼ類（例えば、グルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ及びグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ）、複素環式オキシダーゼ（ウリカーゼ及びキサンチンオキシダーゼなど）、ラクトペルオキシダーゼ、ミクロペルオキシダーゼなどが含まれる。酵素−基質の組み合わせの例には、例えば、基質として水素ペルオキシダーゼを有するホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰＯ）；発色性基質としてパラ−ニトロフェニル ホスフェートを有するアルカリホスファターゼ（ＡＰ）；及び発色性基質（例えば、ｐ−ニトロフェニル−．ベータ．−Ｄ−ガラクトシダーゼ）又は発蛍光性基質（例えば、４−メチルウンベリフェリル−．ベータ．−Ｄ−ガラクトシダーゼ）を有するベータ−Ｄ−ガラクトシダーゼ（ベータ−Ｄ−Ｇａｌ）が含まれる。方法のいずれかのいくつかの実施態様では、突然変異ｐ１１０アルファタンパク質といったバイオマーカーは、抗突然変異ｐ１１０アルファ診断用抗体（即ち、一次抗体）を用いる免疫組織化学によって検出される。いくつかの実施態様では、抗突然変異ｐ１１０アルファ診断用抗体は、ヒト突然変異ｐ１１０アルファに特異的に結合する。いくつかの実施態様では、抗突然変異ｐ１１０アルファ抗体は、ラット、マウス、又はウサギ抗体といった非ヒト抗体である。いくつかの実施態様では、抗突然変異ｐ１１０アルファ診断用抗体はモノクローナル抗体である。いくつかの実施態様では、抗突然変異ｐ１１０アルファ診断用抗体は直接的に標識される。
このように調製された標本は取り付けられてカバーで覆われうる。次いで、スライドの評価が、例えば顕微鏡を用いて決定され、当技術分野で常套的に使用される染色強度基準が利用されうる。一実施態様では、腫瘍由来の細胞及び／又は組織がＩＨＣを用いて試験されるとき、染色は一般的に、腫瘍細胞及び／又は組織において（試料中に存在しうる間質又は周囲組織とは対照的に）決定又は評価されると理解される。いくつかの実施態様では、腫瘍由来の細胞及び／又は組織がＩＨＣを用いて試験されるとき、染色は、腫瘍内又は腫瘍周囲の免疫細胞を含め、免疫細胞に浸潤する腫瘍において決定すること又は評価することを含む。いくつかの実施態様では、突然変異ｐ１１０アルファバイオマーカーの存在が、試料の＞０％、少なくとも試料の１％、少なくとも試料の５％、少なくとも試料の１０％において、ＩＨＣによって検出される。いくつかの実施態様では、突然変異ｐ１１０アルファバイオマーカーは、腫瘍細胞において、ＩＨＣによって検出される。
代替的方法では、患者由来の生物学的試料、例えば腫瘍生検又は循環性腫瘍細胞を、バイオマーカーに特異的な抗体と、抗体−バイオマーカー複合体が形成されるために十分な条件下で接触させ、次いで前記複合体を検出する。バイオマーカーの存在は、複数の方法で、例えば血漿又は血清を含む多種多様の組織及び試料をアッセイするためのウェスタンブロット法及びＥＬＩＳＡ手順により検出可能である。このようなアッセイフォーマットを用いる幅広いイムノアッセイ技術が利用可能であり（米国特許第４０１６０４３号；米国特許第４４２４２７９号；米国特許第４０１８６５３号）、これには、非競合タイプの単一部位及び二部位又は「サンドイッチ」アッセイ、並びに伝統的な競合結合アッセイが含まれる。これらアッセイは、標的バイオマーカーに対する標識化抗体の直接的結合も含む。組織又は細胞試料中の選択されたバイオマーカーの存在及び／又は発現レベル／量は、機能アッセイ又は活性に基づくアッセイによっても試験することができる。例えば、バイオマーカーが酵素である場合、当技術分野で既知のアッセイを実施して、組織又は細胞試料中の所与の酵素活性の存在を決定又は検出することができる。
抗突然変異ｐ１１０アルファ抗体又はその抗原結合断片は、当技術分野において既知の方法、例えば発現に適した形態の先述の抗突然変異ｐ１１０アルファ抗体又は抗原結合断片のいずれかをコードする核酸を含む宿主細胞を、そのような抗体又は断片を生成するために適した条件下で培養すること、及び抗体又は断片を回収することを含む方法により、作製することができる。
治療の方法
Ｔａｓｅｌｉｓｉｂ（ＧＤＣ−００３２）は、がんを含む過剰増殖性疾患の治療において有用である。一実施態様では、突然変異ＰＩ３Ｋ腫瘍を有する患者がｔａｓｅｌｉｓｉｂで治療される。突然変異ＰＩ３Ｋ腫瘍は、***腫瘍、肺腫瘍、又は他の器官に見られる腫瘍である。
本発明の一実施態様は、患者にｔａｓｅｌｉｓｉｂを投与することを含むがんの治療のための方法であり、突然変異同質遺伝子的ＰＩ３Ｋ細胞株におけるｔａｓｅｌｉｓｉｂの活性は、野生型同質遺伝子的ＰＩ３Ｋ細胞株におけるｔａｓｅｌｉｓｉｂの活性より大きい。
本発明の別の実施態様によれば、患者にｔａｓｅｌｉｓｉｂを投与することを含むがんの治療のための方法では、突然変異ＰＩ３Ｋ ｐ１１０アルファアイソフォームに対するｔａｓｅｌｉｓｉｂのＩＣ５０結合活性は、野生型ＰＩ３Ｋ ｐ１１０アルファアイソフォームに対するｔａｓｅｌｉｓｉｂのＩＣ５０結合活性より低い。
一実施態様では、ＰＩ３Ｋ ｐ１１０アルファアイソフォーム突然変異は、Ｈ１０４７Ｒ、Ｈ１０４７Ｌ、Ｅ５４２Ｋ、Ｅ５４５Ｋ及びＱ５４６Ｒより選択される。
一実施態様では、ｔａｓｅｌｉｓｉｂの投与に先立って患者から得られた生物学的試料は、ＰＩＫ３ＣＡ又はＰＴＥＮ突然変異状態について試験されおり、ここでＰＩＫ３ＣＡ又はＰＴＥＮ突然変異状態は、ｔａｓｅｌｉｓｉｂに対する患者の治療的応答性を示す。
一実施態様では、突然変異状態には、Ｈ１０４７Ｒ、Ｈ１０４７Ｌ、Ｃ４２０Ｒ、Ｅ５４２Ｋ、Ｅ５４５Ｋ又はＱ５４６Ｒより選択される突然変異を検出することが含まれる。
一実施態様では、過剰増殖性疾患は、ＨＥＲ２発現乳がん又はエストロゲン受容体陽性（ＥＲ＋）乳がんであり、乳がんは転移性でありうる。
一実施態様では、ｔａｓｅｌｉｓｉｂはアジュバント設定において患者に投与される。
一実施態様では、患者は以前にタモキシフェン、フルベストラント、又はレトロゾールで治療されたことがある。
本発明の方法はさらに：
・バイオマーカーの同定に基づく診断の方法；
・患者がｔａｓｅｌｉｓｉｂ、又はｔａｓｅｌｉｓｉｂと化学療法剤の組み合わせに応答すると思われるかどうかを決定する方法；
・ｔａｓｅｌｉｓｉｂ、又はｔａｓｅｌｉｓｉｂと化学療法剤の組み合わせの除去を監視することにより治療有効性を最適化する方法；
・治療抵抗性突然変異の発生を監視することによりｔａｓｅｌｉｓｉｂ、又はｔａｓｅｌｉｓｉｂと化学療法剤の組み合わせの治療レジメンを最適化する方法；及び
・ｔａｓｅｌｉｓｉｂ又はｔａｓｅｌｉｓｉｂと化学療法剤療法の組み合わせによる治療から最大の恩恵を受けるであろう患者を同定し、ｔａｓｅｌｉｓｉｂ又はｔａｓｅｌｉｓｉｂと化学療法剤療法の組み合わせによる治療に対する感受性及び応答性について患者を監視するための方法
を含む。
本発明の方法は、哺乳動物（例えば、ヒト患者）において、異常な細胞増殖を阻害するため又はがんなどの過剰増殖性疾患を治療するために有用である。例えば、方法は、哺乳動物（例えば、ヒト）の多発性骨髄腫、リンパ腫、白血病、前立腺がん、乳がん、肝細胞癌、膵臓がん，及び／又は結腸直腸がんを診断、監視、及び治療するために有用である。
（１）ｔａｓｅｌｉｓｉｂと（２）化学療法剤の治療的組み合わせは、ＰＩ３キナーゼ経路の活性化によって特徴づけられるものを含むがそれに限定されない疾患、状態及び／又は障害を治療するために有用である。したがって、この発明の別の態様は、ＰＩ３Ｋを含む脂質キナーゼを阻害することにより治療することのできる疾患又は状態を治療する方法を含む。一実施態様では、固形腫瘍又は造血性悪性腫瘍の治療のための方法は、組み合わせ製剤として又は交換によりｔａｓｅｌｉｓｉｂを含む治療的組み合せを哺乳動物に投与することを含み、この治療的組み合わせは、治療的有効量のｔａｓｅｌｉｓｉｂと、治療的有効量の、５−ＦＵ、ドセタキセル、エリブリン、ゲムシタビン、コビメチニブ（ＧＤＣ−０９７３、ＸＬ−５１８、ＣＡＳ Ｒｅｇ．Ｎｏ．９３４６６０−９３−２）、ＧＤＣ−０６２３（ＣＡＳ Ｒｅｇ．Ｎｏ．１１６８０９１−６８−６）、パクリタキセル、タモキシフェン、フルベストラント、デキサメタゾン、ペルツズマブ、トラスツズマブエムタンシン、トラスツズマブ及びレトロゾールより選択される一又は複数の化学療法剤とを含む。（１）ｔａｓｅｌｉｓｉｂと（２）化学療法剤の治療的組み合わせは、前悪性及び非腫瘍性又は非悪性過剰増殖性疾患と共に、造血性悪性腫瘍、腫瘍、がん、及び腫瘍性組織を含む、過剰増殖性疾患又は障害の治療のために使用されうる。一実施態様では、ヒト患者は、治療的組み合わせと薬学的に許容される担体、アジュバント、又はビヒクルで治療され、前記治療的組み合わせのｔａｓｅｌｉｓｉｂ、又はその代謝物は、ＰＩ３キナーゼ活性を検出可能に阻害する量で存在する。
造血性悪性腫瘍には、非ホジキンリンパ腫、びまん性大造血性リンパ腫、濾胞性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、慢性リンパ球性白血病、多発性骨髄腫、ＡＭＬ、及びＭＣＬが含まれる。
この発明の別の態様は、本明細書に記載される疾患又は状態に罹患した哺乳動物、例えばヒトにおける、そのような疾患又は状態の治療に使用される薬学的組成物又は治療的組み合わせを提供する。さらに提供されるのは、本明細書に記載される疾患又は状態に罹患した恒温動物、例えばヒトなどの哺乳動物におけるそのような疾患の治療のための医薬の調製における薬学的組成物の使用である。
この発明の別の態様は、治療対象の患者がＰＩＫ３ＣＡ突然変異を有する、がんの治療に使用されるｔａｓｅｌｉｓｉｂを提供し、この場合突然変異は、Ｈ１０４７Ｒ、Ｃ４２０Ｒ、Ｈ１０４７Ｌ、Ｅ５４２Ｋ、Ｅ５４５Ｋ及びＱ５４６Ｒより選択される突然変異を含む。
この発明の別の態様は、治療対象の患者が、ｔａｓｅｌｉｓｉｂとＰＩＫ３ＣＡ突然変異状態を有する生物学的試料とを接触させた後にｐ１１０アルファアイソフォームの枯渇を伴うＰＩＫ３ＣＡ突然変異を有する、がんの治療に使用されるｔａｓｅｌｉｓｉｂを提供し、この場合突然変異はＨ１０４７Ｒ、Ｃ４２０Ｒ、Ｈ１０４７Ｌ、Ｅ５４２Ｋ、Ｅ５４５Ｋ及びＱ５４６Ｒより選択される突然変異を含む。
この発明の別の態様は、治療対象がＰＩＫ３ＣＡ突然変異を有する、がんの治療のための医薬の製造におけるｔａｓｅｌｉｓｉｂの使用を提供する。
この発明の別の態様は、治療対象の患者が、ｔａｓｅｌｉｓｉｂとＰＩＫ３ＣＡ突然変異状態を有する生物学的試料とを接触させた後にｐ１１０アルファアイソフォームの枯渇を伴うＰＩＫ３ＣＡ突然変異を有する、がんの治療のための医薬の製造におけるｔａｓｅｌｉｓｉｂの使用を提供し、この場合突然変異はＨ１０４７Ｒ、Ｃ４２０Ｒ、Ｈ１０４７Ｌ、Ｅ５４２Ｋ、Ｅ５４５Ｋ及びＱ５４６Ｒより選択される突然変異を含む。
この発明の別の態様は、患者がｔａｓｅｌｉｓｉｂとの接触後にｐ１１０アルファアイソフォームの枯渇を有するがんの治療に使用されるｔａｓｅｌｉｓｉｂを提供する。
この発明の別の態様は、ｔａｓｅｌｉｓｉｂに対する応答性を決定する方法を提供し、この方法は：
ａ）ｔａｓｅｌｉｓｉｂを投与すること；及び
ｂ）患者から得られた生物学的試料中のｐ１１０アルファのレベルと相関したｐ１１０アルファ又はバイオマーカーのレベルの変化を測定すること
を含む。
本発明の別の態様は、上述に記載される発明を提供する。
薬学的組成物及び製剤
本発明の化合物の薬学的組成物又は製剤は、ｔａｓｅｌｉｓｉｂと、薬学的に許容される担体、流動促進剤、希釈剤、及び賦形剤のうちの一又は複数とを含む。
本発明の化合物の薬学的組成物又は製剤は、第２の化学療法剤をさらに含む。
本発明の突然変異選択的なＰＩ３Ｋ結合化合物及び化学療法剤は、非溶媒和形態で存在しても、水、エタノールなどの薬学的に許容される溶媒を用いた溶媒和形態で存在してもよく、本発明は溶媒和形態及び非溶媒和形態の両方を含むことが意図される。
本発明の化合物は、異なる互変異性形態で存在してもよく、すべてのそのような形態は本発明の範囲内に包含される。用語「互変異性体」又は「互変異性形態」は、低いエネルギー障壁を介して相互変換可能な、異なるエネルギーの構造異性体を指す。例えば、プロトン互変異性体（プロトン移動互変異性体としても知られる）は、プロトンの移動を介する相互変換、例えば、ケト−エノール及びイミン−エナミン異性化反応を含む。原子価互変異性体は、結合電子のうちのいくつかの再編成による相互変換を含む。
薬学的組成物は、突然変異選択的なＰＩ３Ｋ結合化合物と、本明細書に記載される追加的薬剤のリストより選択される化学療法剤とを、薬学的に不活性の任意の賦形剤、希釈剤、担体、又は流動促進剤と共に含む複数の（例えば二つの）薬学的に活性の薬剤から構成される、バルク組成物及び個々の投薬単位の両方を包含する。バルク組成物と各個別投薬単位は、固定量の前記薬学的に活性な薬剤を含有することができる。バルク組成物は、個別投薬単位に未だ成形されていない物質である。一の例示的投薬単位は、錠剤、ピル、カプセルなどといった経口投薬単位である。同様に、薬学的組成物を投与することにより患者を治療する方法は、バルク組成物及び個別投薬単位の投与を包含することも意図している。
薬学的組成物は、本明細書において引用されるものと同一であるが、但し一又は複数の原子が、自然界に通常みられる原子質量又は質量数とは異なる原子質量又は質量数を有する原子によって置き換えられている、本発明の同位体標識された化合物も含む。特定される任意の特定の原子又は元素のすべての同位体は、本発明の化合物、及びそれらの使用の範囲内と考慮される。本発明の化合物に包含することができる例示的同位体には、水素、炭素、窒素、酸素、リン、硫黄、フッ素、塩素及びヨウ素の同位体、例えば２Ｈ、３Ｈ、１１Ｃ、１３Ｃ、１４Ｃ、１３Ｎ、１５Ｎ、１５Ｏ、１７Ｏ、１８Ｏ、３２Ｐ、３３Ｐ、３５Ｓ、１８Ｆ、３６Ｃｌ、１２３Ｉ及び１２５Ｉが含まれる。特定の同位体標識された本発明の化合物（例えば、３Ｈ及び１４Ｃで標識されたもの）は、化合物及び／又は基質組織分散アッセイにおいて有用である。トリチウム化（３Ｈ）及び炭素−１４（１４Ｃ）同位体は、それらの調製容易性及び検出可能性のために有用である。さらに、重水素（２Ｈ）といったもっと重い同位体による置換は、代謝安定性の向上（例えば、ｉｎ ｖｉｖｏでの半減期の延長又は投薬関連要件の低減）に起因する特定の治療上の利益を提供し、したがって状況によっては好まれうる。１５Ｏ、１３Ｎ、１１Ｃ及び１８Ｆといった陽電子放出同位体は、基質受容体占有状態を調べるためのポジトロン断層撮影（ＰＥＴ）の研究において有用である。同位体標識された本発明の化合物は、一般に、以下の実施例に記載されるものと類似の手順に従って、同位体標識された試薬で非同位体標識試薬を置換することにより、調製することができる。
Ｔａｓｅｌｉｓｉｂは、ヒトを含む哺乳動物の過剰増殖障害の治療的処置（予防的処置を含む）のための治療的組み合わせにおいて使用される、標準の薬務に従って製剤設計される。本発明は、一又は複数の薬学的に許容される担体、流動促進剤、希釈剤、添加剤、又は賦形剤と併せて突然変異選択的なＰＩ３Ｋ結合化合物を含む薬学的組成物を提供する。
好適な担体、希釈剤、添加剤、及び賦形剤は当業者に周知であり、例えば、炭水化物、ワックス、水溶性及び／又は膨潤性ポリマー、親水性又は疎水性材料、ゼラチン、油、溶媒、水などの材料を含む。使用される特定の担体、希釈剤又は賦形剤は、本発明の化合物が適用される手段および目的に依存するであろう。溶媒は、哺乳動物に投与することが安全であると当業者によって認識されている（ＧＲＡＳ）溶媒に基づいて通常選択される。一般に、安全な溶媒は非毒性の水性溶媒、例えば水、及び水に可溶性又は混和性である他の非毒性溶媒である。適切な水性溶媒は、水、エタノール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール（例えば、ＰＥＧ ４００、ＰＥＧ ３００）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、クレモホール（例えばクレモホールＥＬ（登録商標）、ＢＡＳＦ）、及びこれらの混合物を含む。製剤は、薬物（すなわち、本発明の化合物又はその薬学的組成物）を見栄え良く提供するため又は薬学的製品（すなわち、医薬）の製造を補助するための、一又は複数のバッファー、安定剤、界面活性剤、湿潤剤、平滑剤、乳化剤、懸濁化剤、保存料、酸化防止剤、不透明化剤、流動促進剤、加工助剤、着色料、甘味料、香料、香味料及びその他既知の添加剤も含みうる。
本発明の化合物の薬学的製剤は、種々の投与経路及び投与タイプのために調製されうる。例えば、所望の純度を有する突然変異選択的なＰＩ３Ｋ結合化合物は、凍結乾燥製剤、破砕紛体、又は水溶液の形態において、任意選択的に、薬学的に許容される希釈剤、担体、賦形剤又は安定剤と混合することができる（Remington's Pharmaceutical Sciences （1995） 18th edition, Mack Publ. Co., Easton, PA）。
本発明の薬学的製剤は、医学行動規範に則った様式、即ち、量、濃度、予定、過程、ビヒクル及び投与経路で投薬及び投与される。
一用量当たりの経口又は非経口投与されるｔａｓｅｌｉｓｉｂの初期薬学的有効量は、約０．０１〜１０００ｍｇ／ｋｇの範囲、即ち患者の体重１ｋｇ当たり一日約０．１から２０ｍｇであり、使用される化合物の典型的な初期範囲は０．３から１５ｍｇ／ｋｇ／日である。投与されるｔａｓｅｌｉｓｉｂの用量と化学療法剤の用量は、それぞれについて単位投与形態当たり約１ｍｇから約１０００ｍｇ、又は単位投与形態当たり約１０ｍｇから約１００ｍｇの範囲とすることができる。ｔａｓｅｌｉｓｉｂと化学療法剤の用量は、重量で約１：５０から約５０：１の比率で、又は重量で１：１０から約１０：１の比率で投与されうる。
許容可能な希釈剤、担体、賦形剤及び安定剤は、用いられる投与量及び濃度でレシピエントに対して非毒性であり、リン酸塩、クエン酸塩及び他の有機酸のようなバッファー；アスコルビン酸及びメチオニンを含む抗酸化剤；防腐剤（例えば、オクタデシルジメチオルベンジルアンモニウムクロリド；ヘキサメトニウムクロリド；ベンザルコニウムクロリド、ベンゼトニウムクロリド；フェノール、ブチル又はベンジルアルコール；アルキルパラベン、例えば、メチル又はプロピルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；及びｍ−クレゾール）；低分子量（約１０残基未満）のポリペプチド；タンパク質、例えば血清アルブミン、ゼラチン又は免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えばポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えばグリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン又はリジン；グルコース、マンノース又はデキストリンを含む、単糖類、二糖類及び他の炭水化物；キレート剤、例えばＥＤＴＡ；糖類、例えばスクロース、マンニトール、トレハロース又はソルビトール；塩形成対イオン、例えばナトリウム；金属錯体（例えばＺｎ−タンパク質錯体）；及び／又はＴＷＥＥＮＴＭ、ＣＲＥＭＯＰＨＯＲ ＥＬ（登録商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳＴＭ若しくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤を含む。活性薬剤成分はまた、例えば、コアセルベーション技術又は界面重合により調製したマイクロカプセル、例えば、それぞれ、コロイド状薬物送達系（例えばリポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子及びナノカプセル）において又はマクロエマルジョンにおいて、ヒドロキシメチルセルロース又はゼラチンのマイクロカプセル及びポリ−（メチルメタクリラート）マイクロカプセル中に封入されてもよい。このような技術はRemington's Pharmaceutical Sciences 18th edition, （1995） Mack Publ. Co., Easton, PAに開示されている。
ｔａｓｅｌｉｓｉｂ及び化学療法化合物の徐放性調製物を調製することができる。徐放性調製物の好適な例は、ｔａｓｅｌｉｓｉｂを含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスを含み、このマトリックスは成形品、例えばフィルム又はマイクロカプセルの形態である。徐放性マトリックスの例には、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）、又はポリ（ビニルアルコール））、ポリラクチド（米国特許第３７７３９１９号）、Ｌ−グルタミン酸とガンマ−エチル−Ｌ−グルタメートとの共重合体、非分解性エチレン−酢酸ビニル、ＬＵＰＲＯＮ ＤＥＰＯＴＴＭ（乳酸−グリコール酸共重合体及び酢酸ロイプロリドからなる注射可能なミクロスフェア）のような分解性乳酸−グリコール酸共重合体、並びにポリ−Ｄ−（−）３−ヒドロキシ酪酸が含まれる。
薬学的製剤は、本明細書に詳述される投与経路に適したものを含む。製剤は、好都合には、単位投与形態で提供され、薬学分野で周知の任意の方法によって調製することができる。技術及び製剤は、一般に、Remington' Pharmaceutical Sciences 18th Ed. （1995） Mack Publishing Co., Easton, PAに見出される。このような方法は、活性成分を、一又は複数の副成分を構成する担体と会合させることを含む。一般に、製剤は、活性成分を、液体の担体、又は微細に分割された固体の担体、又はそれら両方と均一に及び緊密に会合させ、次いで必要に応じて製品を成形することにより調製される。
経口投与に適したｔａｓｅｌｉｓｉｂ及び／又は化学療法剤の製剤は、ピル、硬性若しくは軟性（例えば、ゼラチン）のカプセル、カシェ剤、トローチ、ロゼンジ、水性若しくは油性の懸濁液、分散可能な粉末又は顆粒、乳剤、シロップ剤又はエリキシル剤といった個別の単位として調製することができ、これらの各々は所定量のｔａｓｅｌｉｓｉｂ及び／又は化学療法剤を含有する。ｔａｓｅｌｉｓｉｂの量と化学療法剤の量は、組み合わせ製剤としてピル、カプセル、溶液又は懸濁液に製剤化することができる。代替的に、ｔａｓｅｌｉｓｉｂ及び化学療法剤は、交互に投与するためのピル、カプセル、溶液又は懸濁液に別々に製剤化されてもよい。
製剤は、薬学的組成物の製造のための当技術分野で既知の任意の方法に従って調製することができ、このような組成物は、口触りのよい調製物を提供するために、甘味剤、香味剤、着色剤及び保存剤を含む一又は複数の薬剤を含有することができる。圧縮錠剤は、結合剤、潤滑剤、不活性希釈剤、防腐剤、表面活性剤又は分散剤と任意選択的に混合された、粉末又は顆粒といった易流動性形態に、例えば、好適な機械において活性成分を圧縮することにより、調製される。成形錠剤は、不活性液体希釈剤で湿らせた粉末状の活性成分の混合物を、適切な機械において成形することにより製造することができる。これらの錠剤は、任意選択的にコーディングされても刻み目を入れられてもよく、任意選択的に錠剤からの活性成分の徐放又は制御放出をもたらすように製剤化される。
本発明の薬学的製剤の錠剤型賦形剤には：錠剤を形成する粉末薬のバルク体積を増加させるための充填剤（又は希釈剤）；摂取されて薬物の急速な分解及び吸収を促進するとき、錠剤を、小さな断片、理想的には個々の薬物粒子に分解することを助ける崩壊剤；顆粒と錠剤が必要な機械的強度を有するように形成されて、圧密化後に錠剤を一体に保持することにより、包装、輸送及び常套的取扱い中にその成分粉末に分解することを確実に防止できるようにするための結合剤；製造の間に錠剤を形成する粉末の流動性を改善するための流動促進剤；錠剤成形用粉末が、製造の間に錠剤をプレス加工するために使用される機器に付着することを確実に防ぐための潤滑剤が含まれうる。これら錠剤賦形剤は、プレス機を通る粉末混合物の流れを改善して、完成した錠剤が機器から送出される際の摩擦及び損傷を最小化するもので；流動促進剤の機能と同様の機能を有する抗被着材は、錠剤を形成する粉末と、製造の間に錠剤の形状を穿孔するために使用される機械との接着を低減し；香味剤は、味をさらに良くするか、又は不快な味を隠すために錠剤に取り込まれ；着色剤は識別及び患者のコンプライアンスを補助する。
錠剤の製造に適した薬学的に許容される非毒性の賦形剤を含む混合剤中に活性成分を含有する錠剤は許容可能である。これら賦形剤は、例えば、炭酸カルシウム又は炭酸ナトリウム、ラクトース、リン酸カルシウム又はリン酸ナトリウムなどの不活性希釈剤；トウモロコシでんぷん又はアルギン酸などの造粒剤及び崩壊剤；でんぷん、ゼラチン又はアカシアなどの結合剤；及びステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸又はタルクなどの潤滑剤であってもよい。錠剤はコーティングされていなくてもよいが、胃腸管内の崩壊及び吸着を遅延させ、それによってより長期間にわたる持続的作用を提供するために、マイクロカプセル化を含む既知の技術によってコーティングされていてもよい。例えば、モノステアリン酸グリセリル又はジステアリン酸グリセリルなどの時間遅延材料が、単独で又はワックスとともに用いられてもよい。
薬学的組成物は、滅菌注射用水性又は油性懸濁液といった、無菌注射用製剤の形態であってもよい。この懸濁液は、従来技術に従い、上述した好適な分散剤又は湿潤剤及び懸濁化剤を用いて製剤化することができる。無菌注射用製剤は、例えば１，３−ブタンジオール中の溶液など、非経口投与可能な非毒性の希釈剤又は溶媒中の溶液又は懸濁液であるか、又は凍結乾燥粉末から調製されてよい。使用されうる許容可能なビヒクル及び溶媒には、水、リンゲル液及び等張食塩水がある。さらに、滅菌不揮発性油が、溶媒又は懸濁媒として一般に用いられうる。この目的のために、合成モノグリセリド又は合成ジグリセリドを含め、任意の無刺激不揮発性油を用いることができる。さらに、オレイン酸などの脂肪酸を、同様に注射物の調製に用いることができる。
製剤は、単位用量又は複数用量の容器、例えばシールされたアンプル及びバイアルの中に包装することができ、注射のためには使用直前に滅菌された液体担体、例えば水を添加するだけでよいフリーズドライ（凍結乾燥）状態で貯蔵することができる。即席の注射溶液及び懸濁液は、前述の種類の滅菌粉末、顆粒及び錠剤から調製される。好ましい単位投与製剤は、本明細書において上述の、一日の用量若しくはサブ用量（ｓｕｂ−ｄｏｓｅ）、又はその適切な部分用量の活性成分を含有するものである。
本発明は、上に定義した少なくとも一の活性成分を、そのための獣医学用担体とともに含む、獣医学的組成物をさらに提供する。獣医学的担体は、組成物を投与する目的に有用な物質であり、それ以外の場合に不活性であるか又は獣医学の分野で許容される、活性成分と適合性の固体、液体又は気体物質とすることができる。これら獣医学的組成物は、非経口、経口で、又は他のいずれかの所望の経路によって投与することができる。
併用療法
Ｔａｓｅｌｉｓｉｂは、前悪性及び非腫瘍性又は非悪性の過剰増殖性疾患と共に、固形腫瘍又は造血性悪性腫瘍を含む過剰増殖性疾患の治療のための特定の化学療法剤と組み合わせて用いることができる。特定の実施態様では、ｔａｓｅｌｉｓｉｂは、組み合わせの同時投与のための単一の錠剤、ピル、カプセル、又は溶液として、化学療法剤と単剤に組み合わせられる。他の実施態様では、ｔａｓｅｌｉｓｉｂと化学療法剤は、投薬レジメン又は治療法の過程に従って、ｔａｓｅｌｉｓｉｂと、５−ＦＵ、ドセタキセル、エリブリン、ゲムシタビン、ＧＤＣ−０９７３、ＧＤＣ−０６２３、パクリタキセル、タモキシフェン、フルベストラント、デキサメタゾン、ペルツズマブ、トラスツズマブエムタンシン、トラスツズマブ及びレトロゾールより選択される化学療法剤との順次的投与のための、別個の錠剤、ピル、カプセル、又は溶液としての別個の製剤で投与される。化学療法剤は、抗過剰増殖特性を有するか、又は過剰増殖性疾患の治療に有用である。ｔａｓｅｌｉｓｉｂと化学療法剤の組み合わせは、相乗的特性を有しうる。薬学的組み合わせ製剤又は投与レジメンの化学療法剤は、好ましくは、互いに悪影響を与えないような、ｔａｓｅｌｉｓｉｂを補完する活性を有する。治療的組み合わせのこのような化合物は、意図した目的に有効な量で投与される。一実施態様では、この発明の薬学的製剤は、ｔａｓｅｌｉｓｉｂと本明細書に記載されるような化学療法剤とを含む。別の実施態様では、治療的組み合わせは、治療的有効量のｔａｓｅｌｉｓｉｂが一日二回から三週毎（ｑ３ｗｋ）の範囲で投与され、治療的有効量の化学療法剤が、一日二回から三週毎の範囲で別個に、交互に投与される投与レジメンにより投与される。
本発明の治療的組み合わせは、過剰増殖性疾患の治療における別個の、同時の又は順次的使用のための、ｔａｓｅｌｉｓｉｂと、５−ＦＵ、ドセタキセル、エリブリン、ゲムシタビン、ＧＤＣ−０９７３、ＧＤＣ−０６２３、パクリタキセル、タモキシフェン、フルベストラント、デキサメタゾン、ペルツズマブ、トラスツズマブエムタンシン、トラスツズマブ及びレトロゾールより選択される化学療法剤とを含む。
併用療法は、同時の又は順次的な投与レジメンとして投与されてよい。順次的に投与される場合、組み合わせは、二回以上の投与において投与されうる。併用投与には、別個の製剤又は単一の薬学的製剤を使用する同時投与、及び任意の順序での連続投与が含まれ、その際、両方の（又はすべての）活性剤がそれらの生物学的活性を同時に発揮する期間があることが好ましい。
上記の同時投与される任意の薬剤の好適な投与量は、現在使用されているものであり、新たに同定される薬剤及び他の化学療法剤、又は例えば治療インデックスを上昇させる又は毒性若しくは他の副作用又は結果を軽減するための、他の化学療法剤治療の複合作用（相乗効果）により減じられる可能性がある。
抗がん療法の特定の実施態様では、治療的組み合わせは、アジュバント療法としての外科的療法及び放射線療法と組み合わせることができる。本発明による併用療法は、ｔａｓｅｌｉｓｉｂの投与と、一又は複数の他のがん治療方法若しくは様式とを含む。ｔａｓｅｌｉｓｉｂと（一又は複数の）化学療法剤の量と、それぞれの投与タイミングは、所望の併用治療効果を達成するために選択されるだろう。
薬学的組成物の投与
本発明の治療的組み合わせは、治療される状態に適した任意の経路により投与することができる。適切な経路には、経口、非経口（皮下、筋肉内、静脈内、動脈内、吸入、皮内、髄腔内、硬膜外、及び点滴技術を含む）、経皮、直腸内、鼻腔内、局所（頬側及び舌下を含む）、膣内、腹腔内、肺内及び鼻腔内が含まれる。局所投与は、経皮パッチ又はイオントホレシス装置といった経皮投与の使用も含むことができる。薬物の製剤は、Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed., （1995） Mack Publishing Co., Easton, PAにおいて議論されている。薬物の他の例は、Liberman, H. A. and Lachman, L., Eds., Pharmaceutical Dosage Forms, Marcel Decker, Vol 3, 2nd Ed., New York, NYに見ることができる。局所的な免疫抑制治療のために、化合物は、移植前に移植片を潅流適用するか、又は他の方法で阻害剤と接触させることを含む病巣内投与によって投与されうる。好ましい経路は、例えばレシピエントの状態によって変わりうることが理解されよう。化合物は、経口投与される場合、薬学的に許容される担体、流動促進剤、又は賦形剤とピル、カプセル、錠剤などとして製剤化されうる。化合物は、非経口投与される場合、薬学的に許容される非経口ビヒクル又は希釈剤と共に、後述のような注射可能な単位投与形態で製剤化されうる。
ヒト患者を治療するための用量は、約１ｍｇから約１０００ｍｇのｔａｓｅｌｉｓｉｂ、例えば約５ｍｇから約２０ｍｇの化合物とすることができる。用量は、特定の化合物の吸収、分布、代謝、及び***を含む薬物動態学的（ＰＫ）及び薬力学的（ＰＤ）特性に応じて、一日一回（ＱＤ）、一日二回（ＢＩＤ）、又はそれよりも頻繁に投与されうる。加えて、毒性係数が、投薬量及び投与用量投与レジメンに影響を及ぼしうる。経口投与されるとき、ピル、カプセル、又は錠剤は、一日二回、毎日、又はそれよりも少ない頻度で、例えば毎週又は二若しくは三週毎に、特定の期間にわたって摂取されうる。レジメンは、療法の複数周期にわたって繰り返されてよい。
製造品
本発明の別の実施態様において、上記の疾患及び障害の治療に有用なｔａｓｅｌｉｓｉｂを含有する製品又は「キット」が提供される。一実施態様では、キットはｔａｓｅｌｉｓｉｂを含む容器を備える。キットは、容器上に又は容器に付属するラベル又は添付文書をさらに含みうる。「添付文書」という用語は、このような治療製品の使用に関する、指示、使用法、用量、投与、禁忌及び／又は注意事項についての情報を含む、治療製品の商品包装に通例含まれる説明書を指すために使用される。適切な容器は、例えばボトル、バイアル、シリンジ、ブリスターパッグなどを含む。容器はガラス又はプラスチックなどの様々な材料から形成されうる。容器は、病態を治療するのに有効なｔａｓｅｌｉｓｉｂ又はその製剤を保持することができ、無菌アクセスポートを有しうる（例えば、容器は、皮下注射針によって穿孔可能なストッパーを有する静脈注射用溶液のバッグ又はバイアルとすることができる）。組成物中の少なくとも一の活性剤はｔａｓｅｌｉｓｉｂである。ラベル又は添付文書には、組成物が、がんなどの選択した病態の治療のために使用されることが示される。一実施態様において、ラベル又は添付文書に、式Ｉの化合物を含む組成物が、異常な細胞増殖から生じる障害を治療するために使用されうることが示される。ラベル又は添付文書には、この組成物が、他の障害を治療するために使用できることが示されてもよい。代替的に、又は追加的に、製造品は、薬学的に許容可能なバッファー、例えば注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝生理食塩水、リンガー溶液及びデキストロース溶液を含む第二の容器をさらに含んでもよい。製造品は、他のバッファー、希釈剤、フィルター、針、及びシリンジを含め、商業的及び使用者の観点から望ましいその他の材料をさらに含んでもよい。
キットは、ｔａｓｅｌｉｓｉｂと、存在する場合、第２の薬学的製剤の投与のための説明書をさらに含むことができる。例えば、キットがｔａｓｅｌｉｓｉｂ及び第２の薬学的製剤を含む第１の組成物を含む場合、キットは、第１及び第２の薬学的組成物を、それを必要とする患者に、同時投与、連続投与又は個別投与するための説明書をさらに含むことができる。
別の実施態様において、キットは、錠剤又はカプセル剤などのｔａｓｅｌｉｓｉｂの固体経口形態の送達に適している。このようなキットは、複数の単位投与量を含むことが好ましい。このようなキットは、意図された使用のための投薬量を記載したカードを含むことができる。このようなキットの例は「ブリスターパック」である。ブリスターパックは、包装産業において周知であり、薬学的単位投与形態を包装するために広く使用されている。必要であれば、記憶の助けとなるものを、例えば数字、文字、若しくは他のマーキングの形態で、又は投薬量を投与できる治療スケジュールの日にちを示すカレンダー挿入物と共に、提供することができる。
一実施態様によれば、キットは、（ａ）ｔａｓｅｌｉｓｉｂが中に含まれる第１の容器；及び任意選択的に（ｂ）第２の薬学的製剤が中に含まれる第２の容器を含み、この場合第２の薬学的製剤は、抗過剰増殖活性を有する第２の化合物を含む。代替的に、又は追加的に、キットは、薬学的に許容可能なバッファー、例えば注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝生理食塩水、リンガー溶液及びデキストロース溶液を含む第三の容器をさらに含んでもよい。製造品は、他のバッファー、希釈剤、フィルター、針、及びシリンジを含む、商業的及び使用者の観点から望ましいその他の材料をさらに含んでもよい。
キットは、ｔａｓｅｌｉｓｉｂと第２の治療剤、即ち化学療法剤を含む場合、例えば分けられた瓶又は分けられたホイル小包（ｐａｃｋｅｔ）など、別個の組成物を収容するための容器を含むことができるが、別個の組成物は、分けられていない単一の容器の中に収容されてもよい。一般的に、キットは、別個の成分を投与するための説明書を含む。キットの形態は、別個の成分を異なる投与形態（例えば経口と非経口）で投与することが好ましいとき、異なる投与間隔で投与するとき、又は処方医師が組み合せられる個々の成分の滴定を望むとき、特に有利である。
実施例１ ｐ１１０α（アルファ）ＰＩ３Ｋ結合アッセイ
結合アッセイ：最初の偏光実験は、Ａｎａｌｙｓｔ ＨＴ ９６−３８４（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ Ｃｏｒｐ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）において実施された。蛍光偏光親和性測定のための試料を、偏光バッファー（１０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７．５）、５０ｍＭのＮａＣｌ、４ｍＭのＭｇＣｌ２、０．０５％のＣｈａｐｓ、及び１ｍＭのＤＴＴ）中最終濃度２０ｕｇ／ｍＬから開始して１０ｍＭのＰＩＰ２（Ｅｃｈｅｌｏｎ−Ｉｎｃ．，Ｓａｌｔ Ｌａｋｅ Ｃｉｔｙ，ＵＴ）最終濃度まで１：３に段階希釈したｐ１１０アルファＰＩ３Ｋ（Ｕｐｓｔａｔｅ Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ，Ｃｈａｒｌｏｔｔｅｓｖｉｌｌｅ，ＶＡ）の付加により調製した。室温で３０分のインキュベーション時間の後、ＧＲＰ−１及びＰＩＰ３−ＴＡＭＲＡプローブ（Ｅｃｈｅｌｏｎ−Ｉｎｃ．，Ｓａｌｔ Ｌａｋｅ Ｃｉｔｙ，ＵＴ）の付加により反応を止めた。最終濃度はそれぞれ１００ｎＭ及び５ｎＭであった。３８４ウェルのブラックローボリュームＰｒｏｘｉｐｌａｔｅｓ（登録商標）（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、Ｗｅｌｌｅｓｌｅｙ、ＭＡ．）においてローダミンフルオロフォア用の標準のカットフィルター（λｅｘ＝５３０ｎｍ；λｅｍ＝５９０ｎｍ）により読み取りを行った。蛍光偏光の値をタンパク質濃度の関数としてグラフ化した。ＥＣ５０値は、ＫａｌｅｉｄａＧｒａｐｈ（登録商標）ソフトウェア（Ｓｙｎｅｒｇｙ ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｒｅａｄｉｎｇ，ＰＡ）を用いて４パラメーター方程式にデータを当てはめることにより得られた。この実験は、続いて行われる阻害剤を用いた競合実験に用いられる適切なタンパク質濃度も確立する。
阻害剤のＩＣ５０値は、ＰＩＰ２（１０ｍＭの最終濃度）と組み合わせた０．０４ｍｇ／ｍＬのｐ１１０アルファ ＰＩ３Ｋ（最終濃度）を、偏光バッファー中最終濃度２５ｍＭのＡＴＰ（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．，Ｄａｎｖｅｒｓ，ＭＡ）中で１：３に段階希釈したアンタゴニストを含むウェルに対して付加することにより決定された。室温で３０分のインキュベーション時間の後、ＧＲＰ−１及びＰＩＰ３−ＴＡＭＲＡプローブ（Ｅｃｈｅｌｏｎ−Ｉｎｃ．，Ｓａｌｔ Ｌａｋｅ Ｃｉｔｙ，ＵＴ）の付加により反応を止めた。最終濃度はそれぞれ１００ｎＭ及び５ｎＭであった。３８４ウェルのブラックローボリュームＰｒｏｘｉｐｌａｔｅｓ（登録商標）（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ，Ｗｅｌｌｅｓｌｅｙ，ＭＡ）においてローダミンフルオロフォア用の標準のカットフィルター（λｅｘ＝５３０ｎｍ；λｅｍ＝５９０ｎｍ）により読み取りを行った。蛍光偏光の値をアンタゴニスト濃度の関数としてグラフ化し、Ａｓｓａｙ Ｅｘｐｌｏｒｅｒソフトウェア（ＭＤＬ，Ｓａｎ Ｒａｍｏｎ、ＣＡ）においてデータを４パラメーター方程式に当てはめることによりＩＣ５０値を得た。
代替的に、ＰＩ３Ｋの阻害を、精製した組み換え酵素及びＡＴＰを濃度１μＭ（マイクロモル）で用いる放射測定アッセイにおいて決定した。化合物は１００％のＤＭＳＯ中において段階希釈した。キナーゼ反応を室温で１時間インキュベートし、ＰＢＳの付加により反応を終了させた。その後、ＩＣ５０値を、シグモイド用量反応曲線フィッティング（可変スロープ）を用いて決定した。
実施例２ ｉｎ ｖｉｔｒｏでの細胞増殖アッセイ
細胞の培養：細胞株を、１０％のウシ胎子血清、１００ Ｕ／ｍＬのペニシリン、及び１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシンを含むＲＰＭＩ培地において、標準の組織培養条件下で増殖させた。ＨＣＣ−１９５４及びＨＤＱ−Ｐ１は、乳がん細胞株（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ；Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）である。ＨＣＣ−１９５４及びＨＤＱ−Ｐ１細胞を、６ウェルの組織培養プレートの各ウェルに、８００，００細胞／ウェルで配置し、３７℃で一晩インキュベートした。細胞を、各化合物に示された濃度で２４時間インキュベートした。インキュベーションに続いて、細胞を、冷たいリン酸緩衝生理食塩水 （ＰＢＳ）で一度洗浄し、プロテアーゼ阻害剤（Ｆ．Ｈｏｆｆｍａｎ−ＬａＲｏｃｈｅ；Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、１ｍＭのフェニルメチルスルホニルフルオリド、及びホスファターゼ阻害剤カクテル１及び２（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ；Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を補充したＢｉｏｓｏｕｒｃｅTM Ｃｅｌｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）中に溶解した。タンパク質濃度を、Ｐｉｅｒｃｅ ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を用いて決定した。
ＰＩ３Ｋ結合化合物の有効性を、以下のプロトコールを用いる細胞増殖アッセイ（Mendoza et al （2002）Cancer Res. 62 （5485-5488）により測定した。
ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙは、代謝的に活性な細胞の存在を示す、存在するＡＴＰの定量化に基づいて培養物中における生細胞の数を決定する均一な方法である。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）Ａｓｓａｙは、マルチウェルプレートフォーマットに使用するために設計されており、自動ハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）、細胞増殖及び細胞傷害性アッセイのために理想的である。均一なアッセイの手順には、単一試薬（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）Ｒｅａｇｅｎｔ）を、血清を補充した培地において培養された細胞に直接付加することが含まれる。細胞洗浄、培地の除去又は複数のピペッティングの工程は不要である。試薬及びプロトコールを含め、Ｔｈｅ Ｃｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙは市販されている（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．，Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ、Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ ＴＢ２８８）。
このアッセイは、細胞に入り込んで細胞増殖を阻害する化合物の能力を評価する。アッセイの原理は、Ｃｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）試薬の付加により細胞が溶解し、ルシフェラーゼ反応により発光性シグナルが生成される均一アッセイにおいて、存在するＡＴＰを定量化することによる、存在する生細胞の数の決定に基づいている。発光性シグナルは、存在するＡＴＰの量に比例している。
手順：１日目−細胞プレートの播種（Ｆａｌｃｏｎ ＃３５３９６２：３８４ウェル、ブラック、透明底、マイクロクリア、蓋付きＴＣプレート）、細胞回収、３日間のアッセイのために１ウェル５４μｌ当たり１０００個の細胞を３８４ウェルのセルプレートに播種。細胞培地：ＲＰＭＩ又はＤＭＥＭ高グルコース、１０％のウシ胎児血清、２ｍＭのＬ−グルタミン、Ｐ／Ｓ。３７℃、５％のＣＯ２でＯ／Ｎ（一晩）インキュベート。
２日目−細胞への薬物付加、化合物稀釈、ＤＭＳＯプレート（９ポイントについて１：２の段階）。９６ウェルプレートの第２のカラム内で２０μｌの化合物を１０ｍＭで付加。全部で９のポイントについて、ＮｕｎｃのＰｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｍｅｄｉａ Ｐｌａｔｅｓ ９６ウェル円錐底ポリプロピレンプレート（ｃａｔ．＃ ２４９９４６）を用いて、プレート全体に１：２の段階を実施する（１０μｌ＋２０μｌの１００％ ＤＭＳＯ）（１：５０稀釈）。１４７μｌの培地をすべてのウェルに加える。３μｌのＤＭＳＯ＋化合物を、Ｒａｐｉｄｐｌａｔｅ（登録商標）（Ｃａｌｉｐｅ，ａ Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｃｏ．）を用いてＤＭＳＯプレートの各ウェルからＭｅｄｉａ Ｐｌａｔｅ上のそれぞれに対応するウェルに移す。２つの薬物の組み合わせの試験のために、一方の薬物である１．５μｌのＤＭＳＯ＋化合物を、Ｒａｐｉｄｐｌａｔｅを用いてＤＭＳＯプレートの各ウェルからＭｅｄｉａ Ｐｌａｔｅ上のそれぞれに対応するウェルに移す。次いで、他方の薬物１．５μｌを培地プレートに移す。
細胞への薬物付加、細胞プレート（１：１０の希釈）：６μｌの培地＋化合物を細胞に直接付加する（細胞には既に５４μｌの培地）。頻繁に開閉されないインキュベーター内で３日間３７℃、５％のＣＯ２でインキュベートする。
５日目−プレートの増殖、室温でのＣｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ Ｇｌｏバッファー解凍：細胞プレートを３７℃から除去し、約３０分間室温に均衡させる。Ｃｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）バッファーをＣｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）基質に付加する（ボトルからボトルへ）。３０μｌのＣｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ ｃａｔ．＃ Ｇ７５７２）を各ウェルの細胞に付加する。プレートシェーカーに約３０分間置く。Ａｎａｌｙｓｔ ＨＴ Ｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒで発光を読み取る（１ウェル当たり１／２秒）。
細胞生存率アッセイ及び組み合わせアッセイ：３８４ウェルプレートにおいて細胞を１０００〜２０００細胞／ウェルで１６時間播種した。二日目に、９つの連続した１：２の化合物稀釈物を、９６ウェルプレートにおいてＤＭＳＯ中で作製した。Ｒａｐｉｄｐｌａｔｅ（登録商標）ロボット（Ｚｙｍａｒｋ Ｃｏｒｐ．，Ｈｏｐｋｉｎｔｏｎ，ＭＡ）を用いて化合物をさらに増殖培地中に希釈した。稀釈した化合物を、次いで３８４ウェル細胞プレートの４つ一組のウェルに加え、３７℃及び５％のＣＯ２でインキュベートした。４日後、生細胞の相対数を、製造者の指示に従ってＣｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて発光により測定し、Ｗａｌｌａｃ Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ Ｒｅａｄｅｒ（登録商標）（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ）で読み取った。ＥＣ５０値を、Ｐｒｉｓｍ（登録商標）４．０ ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ）を用いて計算した。組み合わせアッセイにおける薬物の投与は、４Ｘ ＥＣ５０濃度から開始された。薬物のＥＣ５０が＞２．５μＭである場合、用いた最大濃度は１０μＭであった。ＰＩ３Ｋ結合化合物及び化学療法剤は、すべてのアッセイにおいて、同時に又は４時間の間隔を空けて（順に）付加された。
追加的且つ例示的なｉｎ ｖｉｔｒｏでの細胞増殖アッセイは、以下の工程を含む：
１．培地中に約１０４個の細胞を含む細胞培養物１００μｌのアリコート（細胞株及び腫瘍種類については表３を参照）を、３８４ウェルの不透明な壁を有するプレートの各ウェルに配した。
２．培地のみで細胞を含まないコントロールウェルを準備した。
３．化合物を実験ウェルに加え、３〜５日間インキュベートした。
４．プレートを、約３０分間室温に平衡化した。
５．各ウェル中に存在する細胞培養培地の体積に等しい体積のＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）試薬を加えた。
６．内容物をオービタルシェーカーで２分間混合し、細胞溶解を誘導した。
７．プレートを室温で１０分間インキュベートし、発光シグナルを安定化させた。
８．発光を記録し、ＲＬＵ＝相対発光単位としてグラフに報告した。
９．ＣｈｏｕとＴａｌａｌａｙの組み合わせ方法及びＣａｌｃｕＳｙｎ（登録商標）ソフトウェアを用いるＤｏｓｅ−Ｅｆｆｅｃｔ Ａｎａｌｙｓｉｓ（Ｂｉｏｓｏｆｔ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＵＫ）を使用して分析し、組み合わせ指標を得る。
代替的に、細胞を最適な密度で９６ウェルプレートに播種し、４日間試験化合物の存在下でインキュベートした。その後Ａｌａｍａｒ ＢｌｕｅＴＭをアッセイ培地に加え、細胞を６時間インキュベートした後に５４４ｎｍ励起、５９０ｎｍ放出において読み取った。ＥＣ５０値を、シグモイド用量応答曲線フィッティングを用いて計算した。
代替的に、増殖／生存率を、Ｃｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｉｎｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を用いて薬物処理の４８時間後に分析した。すべての生存率アッセイにおいてＤＭＳＯ処理をコントロールとして用いた。ＩＣ５０値を、ＸＬフィッティングソフトウェア（ＩＤＢＳ，Ａｌａｍｅｄａ，ＣＡ）を用いて計算した。
細胞株は、ＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）又はＤＳＭＺ（Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ ＧｍｂＨ，Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ，ＤＥ）から得た。細胞を、１０％のウシ胎児血清、１００単位／ｍｌのペニシリン、２ｍＭのＬ−グルタミン、及び１００ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシン（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）を補充したＲＰＭＩ １６４０培地で、５％のＣＯ２下において３７℃で培養した。
実施例３ ＳＷ４８同質遺伝子的細胞株生存率アッセイ
細胞の培養：細胞株は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ，ＶＡ）又はＤｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ ＧｍｂＨ（ＤＭＳＺ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から得た。細胞株を、１０％のウシ胎児血清、１００単位／ｍｌのペニシリン、及び１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを補充したＤＭＥＭ又はＲＰＭＩ中で、５％のＣＯ２下において３７℃で培養した。ＭＣＦ７−ｎｅｏ／ＨＥＲ２は、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ社で開発された、ｉｎ ｖｉｖｏで選択される腫瘍細胞株であり、親ＭＣＦ７ヒト乳がん細胞株に由来する。同質遺伝子的細胞株（ＳＷ４８親、ＳＷ４８Ｅ５４５Ｋ、及びＳＷ４８Ｈ１０４７Ｒ）を、Ｈｏｒｉｚｏｎ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｌｔｄ．（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）からライセンシングし、１０％のウシ胎児血清、１００単位／ｍｌのペニシリン、及び１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを補充したＭｃＣｏｙ'ｓ ５Ａにおいて、５％のＣＯ２下において３７℃で培養した。
細胞生存率アッセイ：３８４ウェルプレートに、１ウェル当たり５４μｌの容積において１０００から２０００細胞／ウェルで播種した後、５％のＣＯ２下において一晩（〜１６時間）３７℃でインキュベートした。化合物をＤＭＳＯ中において希釈し、所望のストック濃度を生成し、次いで１ウェル当たり６μＬの容積に加えた。すべての処理は４つ一組で試験された。４日間のインキュベーション後、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を用いて生細胞の相対数を予測し、全発光をＷａｌｌａｃ Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ Ｒｅａｄｅｒ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）で測定した。細胞生存率の５０％阻害をもたらした薬物の濃度（ＩＣ５０）又は５０％最大有効濃度（ＥＣ５０）を、Ｐｒｉｓｍソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を用いて決定した。ＩＣ５０を達成できなかった細胞株については、試験した最大濃度（１０μＭ）を記録する。
実施例４ ｉｎ ｖｉｖｏでのマウス腫瘍異種移植片有効性
マウス：雌の重症複合免疫不全マウス（Ｆｏｘ Ｃｈａｓｅ ＳＣＩＤ（登録商標），Ｃ．Ｂ−１７／ＩｃｒＨｓｄ，Ｈａｒｌａｎ）又はヌードマウス（Ｔａｃｏｎｉｃ Ｆａｒｍｓ，Ｈａｒｌａｎ）は、週齢８から９であり、試験０日目の体重範囲は１５．１から２１．４グラムであった。動物に水（逆浸透、１ｐｐｍ Ｃｌ）及び１８．０％の粗タンパク質、５．０％の粗脂肪、及び５．０％の粗繊維からなるＮＩＨ ３１ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ ａｎｄ Ｉｒｒａｄｉａｔｅｄ Ｌａｂ Ｄｉｅｔ（登録商標）を自由に摂らせた。マウスを、１２時間の照明サイクル及び２１〜２２℃（華氏７０〜７２度）及び湿度４０〜６０％で静止マイクロアイソレーター内の照射ＡＬＰＨＡ−Ｄｒｉ（登録商標）ｂｅｄ−ｏ'ｃｏｂｓ（登録商標）Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｂｅｄｄｉｎｇに収容した。ＰＲＣは、具体的には、耐性、飼育、外科手技、給餌及び流体の管理、並びに動物医薬ケアに関して、Ｇｕｉｄｅ ｆｏｒ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌｓの推奨に準拠する。ＰＲＣの動物のケア及び使用プログラムは、Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ａｎｄ Ａｃｃｒｅｄｉｔａｔｉｏｎ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（ＡＡＡＬＡＣ）によって認証されており、これは実験動物のケア及び使用の許容基準への準拠を保証する。
腫瘍移植：異種移植をがん細胞で開始した。細胞を、１０％のウシ胎児血清、２ｍＭのグルタミン、１００単位／ｍＬのペニシリン、１００μｇ／ｍＬの硫酸ストレプトマイシン及び２５μｇ／ｍＬのゲンタマイシンを補充したＲＰＭＩ １６４０培地で培養した。細胞を、指数増殖期の間に回収し、細胞株の倍加時間に応じて５×１０６又は１０×１０６細胞／ｍＬの濃度でリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に再懸濁した。腫瘍細胞を右側腹部に皮下移植し、平均サイズが１００から１５０ｍｍ３の標的範囲に近づく際の腫瘍増殖を監視した。試験の０日目として設計された、腫瘍移植の２１日後、マウスを四群に分けた。各群は、それぞれが７５〜１７２ｍｍ３の範囲の腫瘍体積及び１２０〜１２１ｍｍ３の群の平均腫瘍体積を有する１０匹のマウスからなっていた（付録Ａ参照）。体積は、式：
腫瘍体積（ｍｍ３）＝（ｗ２×ｌ）／２［ｗ＝腫瘍の幅、ｌ＝腫瘍の長さ（ｍｍ）］を用いて計算した。腫瘍重量は、１ｍｇが腫瘍体積１ｍｍ３と等しいと仮定して予測されうる。
治療剤：ＰＩ３Ｋ結合化合物を、７３％の活性剤を含む塩形態の乾燥粉末として供給し、室温で光から保護した状態で貯蔵した。薬物用量を、０．５％のメチルセルロース中において毎週調製した：脱イオン水（「ビヒクル」）中０．２％のＴｗｅｅｎ ８０を４℃で貯蔵した。７３％の活性剤を含む塩形態が、Ｇ−０３３８２９用量の製剤に含まれた。ＰＩ３Ｋ結合化合物の用量は、各投薬日に、ストックのアリコートを滅菌生理食塩水（０．９％のＮａＣｌ）で希釈することにより調製された。すべての用量は、体重２０グラムにつき０．２ｍＬ（１０ｍＬ／ｋｇ）の容量で前述のｍｇ／ｋｇ用量を送達するために製剤化された。
処置：すべての用量は、個々の動物の体重に比例し、各図に示される経路により提供された。
エンドポイント：腫瘍体積を、Ｕｌｔｒａ Ｃａｌ ＩＶノギス（Ｍｏｄｅｌ ５４ １０ １１１；Ｆｒｅｄ Ｖ． Ｆｏｗｌｅｒ Ｃｏｍｐａｎｙ）を用いて、腫瘍体積（ｍｍ３）＝（長さｘ幅２）×０．５により２次元（長さ及び幅）において測定し、Ｅｘｃｅｌ ｖｅｒｓｉｏｎ １１．２（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を用いて分析した。線形混合効果（ＬＭＥ）モデル化手法を用いて、同じ動物から経時的に得た腫瘍体積の繰り返し測定を分析した（Pinheiro J, et al. nlme: linear and nonnonlinear mixed effects models. R package version 3.1 92. 2009; Tan N, et al. Navitoclax enhances the efficacy of taxanes in non-small cell lung cancer models. Clin. Cancer Res. 2011;17（6）:1394-1404）。この手法は、繰り返し測定と、試験終了前の動物の非処理関連死に起因するわずかな脱落の両方に対処する。キュービック回帰スプライン（ｃｕｂｉｃ ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ ｓｐｌｉｎｅ）を用いて、非線形プロファイルを、各用量レベルにおけるｌｏｇ２腫瘍体積の経時変化に適合させた。次いでこれら非線形プロファイルを、混合モデル内の用量に関連させた。ビヒクルコントロールのパーセント（％ ＴＧＩ）としての腫瘍増殖阻害を、以下の式を用いて、各用量群について、ビヒクルに対する１日当たりの近似曲線下面積（ＡＵＣ）のパーセンテージとして計算した：％ ＴＧＩ＝１００×（１−ＡＵＣ用量／ＡＵＣビヒクル）。この式を用いて、１００％のＴＧＩ値は腫瘍静止を示し、＞１％且つ＜１００％のＴＧＩ値は腫瘍増殖の減速を、＞１００％のＴＧＩ値は腫瘍縮小を、それぞれ示す。動物の部分寛解（ＰＲ）は、開始腫瘍体積の＞５０％且つ＜１００％の腫瘍縮小と定義された。完全寛解（ＣＲ）は、試験中の任意の日における１００％の腫瘍縮小（即ち、測定可能な腫瘍がないこと）と定義された。
毒性：動物の体重は、試験のはじめの五日間は毎日測定し、その後は週に二回測定した。動物の体重は、Ａｄｖｅｎｔｕｒｅｒ Ｐｒｏ（登録商標）ＡＶ８１２ハカリ（Ｏｈａｕｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を用いて測定した。パーセント重量変化を：体重の変化（％）＝［（重量当日−重量０日目）／重量０日目］´１００に従って計算した。マウスを、あらゆる有害な治療関連副作用の徴候について頻繁に観察し、毒性の臨床徴候が観察されたとき記録した。許容可能な毒性は、試験中における２０％未満の群平均体重（ＢＷ）の減少、及び１０匹の処理済み動物に複数の治療関連（ＴＲ）死がないことと定義される。それよりも大きな毒性をもたらすいずれの投与レジメンも、最大耐量（ＭＴＤ）を上回るものと考慮される。死亡は、臨床徴候及び／又は屍検により証明される処理の副作用に帰することができる場合にＴＲとして分類されるか、又は、投与期間中若しくは最終投与から１０日以内の既知の理由に起因する場合もＴＲとして分類されうる。死亡は、治療の副作用に関連していたという証拠が存在しない場合、ＮＴＲとして分類される。
実施例５ ｐ１１０ａタンパク質のウェスタンブロット分析
タンパク質アッセイ：タンパク質濃度を、Ｐｉｅｒｃｅ ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を用いて決定した。免疫ブロットの場合、等しいタンパク質の量を、ＮｕＰａｇｅ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ ４−１２％勾配ゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を用いた電気泳動により分離した；タンパク質を、ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ社のＩＢｌｏｔシステム及びプロトコールを用いてニトロセルロース膜上に移した。ホスホ−Ａｋｔ（Ｓｅｒ４７３）及びｐ１１０アルファに対する抗体はＣｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ（Ｄａｎｖｅｒｓ，ＭＡ）から取得した。ＧＡＰＤＨ及びベータ−アクチンに対する抗体はＳｉｇｍａから取得した。
ウェスタンブロットの場合、等量のタンパク質を、ＮｕＰａｇｅ Ｔｒｉｓ−アセテート ３−１８％ 勾配ゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いた電気泳動により分離した。タンパク質を、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）のｉＢｌｏｔシステム及びプロトコールを用いてニトロセルロース細孔膜上に移した。ｐＡｋｔ（Ｓｅｒ４７３）、及びｐ１１０アルファ、及びｐ８５抗体は、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｄａｎｖｅｒｓ，ＭＡ）から取得した。ベータアクチン抗体はＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から取得した。特異的な抗原−抗体相互作用を、強化した化学発光 ウェスタンブロット法検出試薬（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ）を用いて、ホースラディッシュペルオキシダーゼにコンジュゲートした二次抗体ＩｇＧにより検出した。
ポリクローナルウサギ抗ＰＩ３Ｋ ｐ１１０アルファ抗体を用いるウェスタンブロット分析を、製造者のプロトコールに従って実施した（ＰＩ３ Ｋｉｎａｓｅ ｐ１１０α Ａｎｔｉｂｏｄｙ＃４２５５、ＰＩ３ Ｋｉｎａｓｅ ｐ１１０α（Ｃ７３Ｆ８）Ｒａｂｂｉｔ ｍＡｂ＃４２４９、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）。モノクローナル及びポリクローナルＰＩ３Ｋ ｐ１１０アルファ抗体は市販されている（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）。Popkie et al （2010）J Biol Chem.; 285（53）:41337-47; Yoshioka et al （2012） Nat Med. Oct;18（10）:1560-9; Biswas et al （2013） J Biol Chem. Jan 25;288（4）:2325-39; Ramadani et al （2010） Sci Signal. Aug 10;3（134）参照。
ウェスタンブロット法プロトコール（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）：
ウェスタンブロットの場合、４℃の５％ ｗ／ｖのＢＳＡ、１Ｘ ＴＢＳ、０．１％のＴｗｅｅｎ（登録商標）２０中で稀釈した一次抗体と共に、穏やかに振とうしながら膜を一晩インキュベートする。
稀釈：
ウェスタンブロット法、１：１０００，
免疫沈降法、１：５０
免疫組織化学、１：４００
１０ｍＭのナトリウムＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１００μｇ／ｍｌのＢＳＡ、５０％のグリセロール及び０．０２％未満のアジ化ナトリウムにおいて供給。−２０℃で貯蔵。抗体は等分しない。
Ａ．溶液及び試薬
注意：逆浸透脱イオン化（ＲＯＤＩ）水又は等級の水を用いて溶液を調製する。
１． ２０Ｘのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）：（＃９８０８）１Ｌの１Ｘ ＰＢＳの調製：５０ｍｌの２０Ｘ ＰＢＳを９５０ｍｌのｄＨ２Ｏに付加、混合。
２．１０ＸのＴｒｉｓ緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）：（＃１２４９８）１Ｌの１Ｘ ＴＢＳの調製：１００ｍｌの１０Ｘを９００ｍｌのｄＨ２Ｏに付加、混合。
３．１Ｘ ＳＤＳの試料バッファー：Ｂｌｕｅ Ｌｏａｄｉｎｇ Ｐａｃｋ（＃７７２２）又はＲｅｄ Ｌｏａｄｉｎｇ Ｐａｃｋ（＃７７２３）１／１０容積の３０Ｘ ＤＴＴを１容積の３Ｘ ＳＤＳローディングバッファーに加えることにより新鮮な３Ｘ 還元ローディングバッファーを調製。ｄＨ２Ｏで１Ｘに希釈。
４．１０Ｘ Ｔｒｉｓ−Ｇｌｙｃｉｎｅ ＳＤＳランニングバッファー：（＃４０５０）１Ｌの１Ｘランニングバッファーの調製：１００ｍｌの１０Ｘランニングバッファーを９００ｍｌのｄＨ２Ｏに付加、混合。
５．１０Ｘ Ｔｒｉｓ−Ｇｌｙｃｉｎｅ転写バッファー：（＃１２５３９）１Ｌの１Ｘ転写バッファー：１００ｍｌの１０Ｘ転写バッファーを２００ｍｌのメタノール＋７００ｍｌのｄＨ２Ｏに付加、混合。
６．Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０（ＴＢＳＴ）を含む１０ＸのＴｒｉｓ緩衝生理食塩水：（＃９９９７）１Ｌの１Ｘ ＴＢＳＴの調製：１００ｍｌの１０Ｘ ＴＢＳＴを９００ｍｌのｄＨ２Ｏに付加、混合。
７．脱脂粉乳：（９９９９）。
８．ブロッキングバッファー：５％ ｗ／ｖの脱脂粉乳を含む１Ｘ ＴＢＳＴ；１５０ｍｌにつき、７．５ｇの脱脂粉乳を１５０ｍｌの１Ｘ ＴＢＳＴに付加、よく混合。
９．洗浄バッファー：（＃９９９７）１Ｘ ＴＢＳＴ。
１０．ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）：（９９９８）。
１１．一次抗体稀釈バッファー：５％のＢＳＡを含む１Ｘ ＴＢＳＴ；２０ｍｌにつき、１．０ｇのＢＳＡを２０ｍｌの１Ｘ ＴＢＳＴに付加、よく混合。
１２．ビオチン化タンパク質ラダー検出パック：（＃７７２７）。
１３．事前染色タンパク質マーカー、広範囲（事前混合フォーマット）：（＃７７２０）。
１４．ブロッティング用膜及び紙：（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ＃１２３６９）このプロトコールはニトロセルロース膜のために最適化された。孔サイズ０．２μｍが一般に推奨される。
１５．ＨＲＰにコンジュゲートした二次抗体：抗ウサギＩｇＧ、ＨＲＰ結合抗体（＃７０７４）。
１６．検出試薬：ＳｉｇｎａｌＦｉｒｅＴＭ ＥＣＬ試薬（＃６８８３）。
Ｂ．タンパク質ブロッティング
試料調製のための一般的プロトコール
１．制御因子を含む新鮮な培地を所望の時間にわたって加えることにより細胞を処理する。
２．培養物から培地を吸引；細胞を１Ｘ ＰＢＳで洗浄；吸引する。
３．１Ｘ ＳＤＳ試料バッファーを加えることにより（６ウェルプレートの１ウェルにつき１００μｌ又は直径１０ｃｍのプレートにつき５００μｌ）細胞を溶解させる。直ちにプレートから細胞をこすり取り、抽出物をエッペンチューブに移す。氷上に維持する。
４．１０〜１５秒間超音波処理して細胞溶解を完了させ、ＤＮＡをせん断する（試料粘度を低下させるため）。
５．２０μｌの試料９５〜１００℃に５分間加熱；氷上で冷却する。
６．５分間微量遠心分離する。
７．２０μｌをＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにローディングする（１０ｃｍ×１０ｃｍ）。
注意：事前染色した分子量マーカーをローディング（＃７７２０、１０μｌ／レーン）し、電気泳動転写及びビオチン化タンパク質ラダー（＃７７２７、１０μｌ／レーン）を確認して分子量を決定することが推奨される。
８．ニトロセルロース膜への電気泳動転写（＃１２３６９）．
Ｃ．膜のブロッキング及び抗体のインキュベーション
注意：容積は１０ｃｍ×１０ｃｍ（１００ｃｍ２）の膜のものである；異なる大きさの膜については、容積を適宜調節されたい。
Ｉ．膜のブロッキング
１．（任意）転写後、ニトロセルロース膜を、２５ｍｌのＴＢＳで５分間室温で洗浄する。
２．膜を２５ｍｌのブロッキングバッファー中において１時間室温でインキュベートする。
３．１５ｍｌのＴＢＳＴを用いて三回、それぞれ５分間洗浄する。
ＩＩ．一次抗体のインキュベーション
１．膜及び一次抗体を、１０ｍｌの一次抗体稀釈バッファー中において（製品データシートにおいて推奨される適切な希釈及び希釈剤で）、穏やかに振とうさせながら一晩４℃でインキュベートする。
２．１５ｍｌのＴＢＳＴを用いて三回、それぞれ５分間洗浄する。
３．１０ｍｌのブロッキングバッファー中において、穏やかに振とうさせながら、１時間室温で抗ウサギＩｇＧ、ＨＲＰ結合抗体（１：２０００の＃７０７４）及び抗ビオチン、ＨＲＰ結合抗体（１：１０００−１：３０００の＃７０７５）と共に膜をインキュベートし、ビオチン化タンパク質マーカーを検出する。
４．１５ｍｌのＴＢＳＴを用いて三回、それぞれ５分間洗浄する。
５．検出（セクションＤ）を進める。
Ｄ．タンパク質の検出
使用方法：
１．膜結合ＨＲＰ（抗体コンジュゲート）を、ＴＢＳＴにおいて三回、５分間洗浄する。
２．一部分２Ｘの試薬Ａ及び一部分２Ｘの試薬Ｂ（例えば１０ｍｌにつき、５ｍｌの試薬Ａと５ｍｌの試薬Ｂを加える）を希釈することにより１Ｘ ＳｉｇｎａｌＦｉｒｅＴＭ ＥＣＬ試薬（＃６８８３）を調製する。よく混合する。
３．膜と共に基質を１分間インキュベートし、余分な溶液を除去し（膜は濡れたまま）、プラスチックに包んでＸ−ｒａｙ線フィルムに曝露する。
＊肌に繰り返し曝露することは避ける。
ウェスタンブロット再検出プロトコール
既存の膜の再検出は、利用できる試料の量が限られているとき、複数のタンパク質を独立して免疫ブロットするために便利な手段である。最良の結果のためには、新鮮なブロットが常に推奨されることに注意されたい。再検出は、有効な方法でありうるが、ブロットの各再検出において、バックグランドシグナルが増加する可能性が存在する。加えて、新規抗体の結合に起因するシグナルが最初の免疫ブロッティング実験の残存シグナルではないように、再検出に先立って最初の抗体複合体の除去を確認することが推奨される。これは、ブロットをＥＣＬ試薬に再曝露し、次の一次抗体を加える前にシグナルが存在しないことを確認することにより行うことができる。
Ａ．溶液及び試薬
注意：逆浸透脱イオン化（ＲＯＤＩ）水又は同等に精製された水を用いて溶液を調製する。
１．洗浄バッファー：Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０（ＴＢＳＴ−１０Ｘ）（＃９９９７）を含むＴｒｉｓ緩衝生理食塩水
２．ストリップバッファー：１００ｍｌを調製するために、０．７６ｇのＴｒｉｓベース、２ｇのＳＤＳ及び７００μｌのβ−メルカプトエタノールを混合する。脱イオン化Ｈ２Ｏを用いて１００ｍｌにする。ＨＣｌを用いてｐＨを６．８に調整する。
Ｂ．プロトコール
１．フィルム曝露の後、膜を４回、それぞれ５分間ＴＢＳＴ中で洗浄する。膜を乾燥させない場合に最良の結果が得られる。
２．ストリップバッファー中において（軽く振とうさせながら）膜を３０分間５０℃でインキュベートする。
３．膜を６回、それぞれ５分間ＴＢＳＴ中で洗浄する。
４．（任意）元のシグナルが除去されたことを確認するために、膜を２回、それぞれ５分間１０ｍｌのＴＢＳＴを用いて洗浄する。膜をＬｕｍｉＧＬＯ（登録商標）と共に、穏やかに振とうさせながら１分間室温でインキュベートする。膜から余分な現像液を排出させる。乾燥させない。プラスチックラップに包み、Ｘ線フィルムに曝露する。
５．再度膜を４回、それぞれ５分間ＴＢＳＴ中において洗浄する。
６．ここで膜は再使用の準備が整う。ウエスタン免疫ブロット法プロトコールの「膜のブロッティング及び抗体のインキュベーション」工程において検出を開始する。
実施例６ 突然変異ｐ１１０アルファの免疫組織化学（ＩＨＣ）検出
患者の腫瘍生検試料中における突然変異ｐ１１０アルファのレベルを決定するために、様々な診断アッセイが利用可能である。一実施態様では、突然変異ｐ１１０アルファのレベルは、免疫組織化学（ＩＨＣ）により分析できる。腫瘍生検由来のパラフィン包埋組織切片をＩＨＣアッセイに供し、以下の染色強度基準に合わせる：
スコア０−染色は観察されない、又は腫瘍細胞の１０％未満に膜染色が観察される。
スコア１＋−わずかな／ほとんど知覚できない膜染色が１０％を上回る腫瘍細胞に観察される。細胞の膜の一部のみが染色される。
スコア２＋−弱〜中程度の完全な膜染色が１０％を上回る腫瘍細胞に観察される。
スコア３＋−中〜強の完全な膜染色が１０％を上回る腫瘍細胞に観察される。
腫瘍試料はそれぞれのスコアに従って特徴付けされる。
いくつかの実施態様では、突然変異ｐ１１０アルファバイオマーカーは、抗突然変異ｐ１１０アルファ抗体を用いて検出される。いくつかの実施態様では、突然変異ｐ１１０アルファバイオマーカーは、ＩＨＣにより弱い染色強度として検出される。いくつかの実施態様では、突然変異ｐ１１０アルファバイオマーカーは、ＩＨＣにより中程度の染色強度として検出される。いくつかの実施態様では、突然変異ｐ１１０アルファバイオマーカーは、ＩＨＣにより強い染色強度として検出される。
Ｖｅｎｔａｎａ Ｂｅｎｃｈｍａｒｋ ＸＴ（登録商標）又はＢｅｎｃｈｍａｒｋ Ｕｌｔｒａ（登録商標）システムを使用してＩＨＣ染色が実施されうる。
実施例７ ｐ１１０アルファ細胞株の質量分析
液体クロマトグラフィー−タンデム質量分析（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）分析を、それぞれＤＭＳＯ（ビヒクル）又はＧＤＣ−００３２（５００ｎＭ）で２４時間処理した三つの細胞株：ＨＣＣ１９５４、ＨＣＣ２０２及びＨＤＱＰ１から免疫沈降させたｐ１１０アルファ（ＰＩＫ３ＣＡ）タンパク質に対して実施した。各実験は、ｎ＝４の生物学的複写物について、一つの細胞株／処理当たり４〜６ｍｇのタンパク質溶解物（合計６の試料／実験）から開始して実施された。ＰＩＫ３ＣＡの予想される移動に対応して、一つの試料当たり一つのゲル領域を、隣接レーンの精製済みｐ１１０アルファタンパク質の移動に基づいて切除した。ゲル片を〜１ｍｍ３の片に切断し、以下のようにしてゲル内消化させた。ゲル片を、５０ｍＭの炭酸水素アンモニウム／５０％のアセトニトリルを用いて脱染し、１００％のアセトニトリルを用いて脱水した後、５０ｍＭのジチオスレイトール（３０分、５０℃）及び５０ｍＭのヨードアセトミド（２０分、室温）を用いてそれぞれ還元及びアルキル化した。ゲル片を再度脱水し、次いで氷上で２時間にわたり５０ｍＭの炭酸水素アンモニウム／５％のアセトニトリル消化バッファー中の２０ｎｇ／ｕｌのトリプシンで再度膨張させ、次いで３７℃のオーブンに移して一晩インキュベーションした。消化されたペプチドをエッペンチューブに移し、ゲル片を、一度は５０％のアセトニトリル／０．５％のトリフルオロ酢酸で、二回目は１００％のアセトニトリルで、計二回抽出した。抽出物を消化されたペプチドと混合し、高速真空（ｓｐｅｅｄ−ｖａｃ）乾燥させて完了した。試料を５％のギ酸／０．１％のヘプタフルオロ酪酸／０．０１％の過酸化水素中において３０分間再構成した後、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析した。
試料を、Ｗａｔｅｒｓ ｎａｎｏＡｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣに接続されたＴｈｅｒｍｏ ＬＴＱ Ｏｒｂｉｔｒａｐ Ｅｌｉｔｅ上において、重複注入を用いるＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより分析した（試料が一度注入された第１の複写物を除いて）。ペプチドを、１．７ｕｍのＢＥＨ−１３０樹脂をパッキングした０．１ｍｍ Ｘ １００ｍｍ Ｗａｔｅｒｓ Ｓｙｍｍｅｔｒｙ Ｃ１８カラムにローディングし、溶媒Ｂ（９８％のアセトニトリル、２％の水）を２０分かけて５％から２５％まで、次いで２分かけて２５％から５０％まで傾斜させた二段階式直線勾配により分離した。データは、６０，０００の分解能で収集されたＯｒｂｉｔｒａｐフルＭＳスキャンと、イオントラップにおけるＣＩＤ ＭＳ／ＭＳ断片化のために選択された上位１５の強力な前駆体とを用いたデータ依存モードで取得した。ＭＳ２スペクトルを、ヒトタンパク質の連結されたターゲット−デコイＵｎｉｐｒｏｔデータベースに対して、並びに野生型、Ｅ５４５Ｋ及びＨ１０４７Ｒ突然変異ＰＩＫ３ＣＡ配列を含む小規模データべースに対して、Ｍａｓｃｏｔを用いて検索し、突然変異ペプチドを同定した。Ｕｎｉｐｒｏｔ検索のスペクトルマッチは、手検測の前に線形判別分析を用いて、１０％の許容偽発見率でフィルタリングした。
ＰＩＫ３ＣＡ ペプチドの抽出されたイオンクロマトグラム及びピーク面積の統合は、社内ソフトウェア（ＭＳＰｌｏｒｅｒ）を用いて１０ｐｐｍの質量許容差で生成された。１４のペプチドの各々に関するピーク面積データは、六つの試料の中で最も豊富なピーク面積にブロック単位で正規化された。重複注入（技術的複写物）が利用可能である場合、二つの複写物について正規化されたデータを平均し、ペプチド−条件−実験毎に単一の正規化ピーク面積を生成し（即ち定量化フィーチャ）、タンパク質配列プロットを生成した。
統計的分析のために、元の、四つの生物学的複写物の非正規化ピーク面積を、線形混合効果モデル化（ｌｍｅ４パッケージ）を用いるＲで統合し、総ＰＩＫ３ＣＡ、野生型ＰＩＫ３ＣＡ、及び突然変異 ＰＩＫ３ＣＡの各々について、ＤＭＳＯ（ビヒクル）とＧＤＣ−００３２（５００ｎＭ）とによる処理の比較のための相対比及びｐ値を決定した。総ＰＩＫ３ＣＡは、以下のペプチドから生成されるデータに基づいて決定された：
Ｈ１０４７Ｒ突然変異（即ちＨＣＣ−１９５４）を有する（一又は複数の）細胞株について、野生型ＰＩＫ３ＣＡを、ＱＭＮＤＡＨＨＧＧＷＴＴＫ（１０４２〜１０５４；７４９．８２８２４ｍ／ｚ）ペプチド（配列番号７）に基づいて、突然変異ＰＩＫ３ＣＡを、１０４７位（図２４Ａ及び２４Ｂ）をカバーするＱＭＮＤＡＲ（１０４２〜１０４７；３７５．６６３６０ｍ／ｚ）（配列番号１８）及びＨＧＧＷＴＴＫ（１０４８〜１０５４；３９３．６９８３ｍ／ｚ）（配列番号８）ペプチドに基づいて、それぞれ決定した。Ｅ５４５Ｋ突然変異（即ちＨＣＣ−２０２）を有する（一又は複数の）細胞株について、野生型ＰＩＫ３ＣＡを、ＤＰＬＳＥＩＴＥＱＥＫ（５３８〜５４８；６４４．８１９１７ｍ／ｚ）（配列番号１９）ペプチドに基づいて、突然変異ＰＩＫ３ＣＡを、５４５位をカバーするＤＰＬＳＥＩＴＫ（５３８〜５４５；４５１．７４６２７ｍ／ｚ）（配列番号２０）ペプチドに基づいて、それぞれ決定した。これら二つの座位に由来するペプチドは、総ＰＩＫ３ＣＡを決定するときには考慮しなかった。適用可能であれば、ＰＩＫ３ＣＡペプチド内のシステイン残基を、それらのカルバミドメチル化形態（＋５７．０２１ Ｄａ）において分析し、メチオニン残基をそれらの単一酸化（メトスルホキシド）形態（＋１５．９９４９ Ｄａ）に基づいて定量化した。総ＰＩＫ３ＣＡ，野生型ＰＩＫ３ＣＡ、及び突然変異ＰＩＫ３ＣＡのＬｏｇ２比（ＧＤＣ−００３２／ＤＭＳＯ）及び対応するｐ値を使用して、質量保存の法則を適用することにより、各条件及び細胞株における野生型ＰＩＫ３ＣＡと突然変異ＰＩＫ３ＣＡの比存在度（及びそれに関連する９５％信頼区間）を決定した。明確には：
ＷＴ＿ＰＩ３ＫＣＡ＿ＤＭＳＯ＋ＭＵＴ＿ＰＩ３ＫＣＡ＿ＤＭＳＯ＝総＿ＰＩ３ＫＣＡ＿ＤＭＳＯ
ＷＴ＿ＰＩ３ＫＣＡ＿ＧＤＣ＋ＭＵＴ＿ＰＩ３ＫＣＡ＿ＧＤＣ＝総＿ＰＩ３ＫＣＡ＿ＧＤＣ
比率ＷＴ＿ＰＩ３ＫＣＡ＝ｐ＝ＷＴ＿ＰＩ３ＫＣＡｃ／総＿ＰＩ３ＫＣＡ
比率ＭＵＴ＿ＰＩ３ＫＣＡ＝１−ｐ＝ＭＵＴ＿ＰＩ３ＫＣＡ／総＿ＰＩ３ＫＣＡ
データは、線形効果モデルに基づいて総＿ＰＩ３ＫＣＡ＿ＤＭＳＯが１．０に正規化され、エラーバーが各測定値の９５％信頼区間を表す相対的強度値としてプロッティングされる。
前述の発明は理解を明確にするために図示及び実施例を用いてある程度詳細に説明されているが、記載及び実施例は、本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。本明細書に引用されるすべての特許及び科学文献の開示内容は、参照によりその全体が本明細書に包含される。

Claims (33)

  1. ｔａｓｅｌｉｓｉｂによる治療のための患者を選択する方法であって：
    （ａ）患者から得られた生物学的試料をｔａｓｅｌｉｓｉｂにより処理すること；及び
    （ｂ）ｐ１１０アルファタンパク質の枯渇を検出すること；
    を含み、生物学的試料におけるｐ１１０アルファタンパク質の枯渇が、ｔａｓｅｌｉｓｉｂによる治療に応答するであろう患者を同定する、方法。
  2. ｐ１１０アルファタンパク質の枯渇が、患者による当該化合物への治療的応答性を示す、請求項１に記載の方法。
  3. ｐ１１０アルファタンパク質の枯渇が、抗ｐ１１０アルファ抗体への結合により測定される、請求項１に記載の方法。
  4. 試料中のｐ１１０アルファタンパク質に対する抗ｐ１１０アルファ抗体の結合が、ウェスタンブロット分析、酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、免疫組織化学（ＩＨＣ）、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）、又は逆相タンパク質アレイにより決定される、請求項３に記載の方法。
  5. ｐ１１０アルファタンパク質の枯渇が質量分析法により検出される、請求項１に記載の方法。
  6. （ａ）患者から得られた生物学的試料を、Ｈ１０４７Ｒ、Ｃ４２０Ｒ、Ｈ１０４７Ｌ、Ｅ５４２Ｋ、Ｅ５４５Ｋ及びＱ５４６Ｒから選択される突然変異を含むＰＩＫ３ＣＡ突然変異状態について試験すること；
    （ｂ）ＰＩＫ３ＣＡ突然変異を有する患者由来の生物学的試料をｔａｓｅｌｉｓｉｂと接触させ、ｐ１１０アルファアイソフォームの枯渇を検出すること；及び
    （ｃ）ｔａｓｅｌｉｓｉｂを、ＰＩＫ３ＣＡ突然変異を有する患者に投与すること
    を含む、患者の治療方法。
  7. 生物学的試料が、患者へのｔａｓｅｌｉｓｉｂの投与に先立って取得される、請求項６に記載の方法。
  8. 生物学的試料が循環性腫瘍細胞である、請求項６に記載の方法。
  9. ＰＩＫ３ＣＡ突然変異を有する患者に対し、５−ＦＵ、ドセタキセル、エリブリン、ゲムシタビン、ＧＤＣ−０９７３、ＧＤＣ−０６２３、パクリタキセル、タモキシフェン、フルベストラント、デキサメタゾン、ペルツズマブ、トラスツズマブエムタンシン、トラスツズマブ及びレトロゾールから選択される化学療法剤を投与することをさらに含む、請求項６に記載の方法。
  10. 化学療法剤がフルベストラントである、請求項９に記載の方法。
  11. 患者がＨＥＲ２発現乳がんを有する、請求項６に記載の方法。
  12. 患者がエストロゲン受容体陽性（ＥＲ＋）乳がんを有する、請求項６に記載の方法。
  13. エストロゲン受容体陽性（ＥＲ＋）乳がんが転移性である、請求項１２に記載の方法。
  14. ｔａｓｅｌｉｓｉｂがアジュバント設定で患者に投与される、請求項６に記載の方法。
  15. 患者が以前にタモキシフェン、フルベストラント、又はレトロゾールで治療されたことがある、請求項１４に記載の方法。
  16. ｔａｓｅｌｉｓｉｂによる治療のための、ＰＩＫ３ＣＡ突然変異を有する患者を選択する方法であって：
    （ａ）患者から得られた生物学的試料中のＰＩＫ３ＣＡ突然変異を検出すること；及び
    （ｂ）ｔａｓｅｌｉｓｉｂの投与に先立って患者から得られた生物学的試料中のｐ１１０アルファのレベルと、ｔａｓｅｌｉｓｉｂの投与後に同患者から得られた生物学的試料中のｐ１１０アルファのレベルとを比較すること
    を含み、ｔａｓｅｌｉｓｉｂの投与後に患者から得られた生物学的試料中のｐ１１０アルファのレベルの枯渇が、ｔａｓｅｌｉｓｉｂによる治療に応答するであろう患者を同定する、方法。
  17. （ａ）ｔａｓｅｌｉｓｉｂの投与に先立ってがん患者から得られた生物学的試料中のｐ１１０アルファのレベルと、ｔａｓｅｌｉｓｉｂの投与後に同患者から得られた生物学的試料中のｐ１１０アルファのレベルとを比較すること、及び
    （ｂ）患者に投与されるｔａｓｅｌｉｓｉｂ療法の投薬量、投与頻度、又は過程を変更すること
    を含む、がんの治療方法。
  18. がん患者における治療有効性の監視方法であって：
    （ａ）患者にｔａｓｅｌｉｓｉｂを投与すること；
    （ｂ）ｔａｓｅｌｉｓｉｂの投与後に患者から得られた生物学的試料中のｐ１１０アルファを測定すること；及び
    （ｃ）患者に投与されるｔａｓｅｌｉｓｉｂ療法の投薬量、投与頻度、又は過程を変更すること
    を含む方法。
  19. がんを有すると診断された患者のための治療レジメンを選択する方法であって、患者のがん細胞を有効量のｔａｓｅｌｉｓｉｂと接触させること、及びｔａｓｅｌｉｓｉｂに応答したｐ１１０アルファのレベルを検出することを含み、ｐ１１０アルファの枯渇の検出は、がんがｔａｓｅｌｉｓｉｂによる治療に感受性であることを示し、治療レジメンは、がんがｔａｓｅｌｉｓｉｂによる治療に感受性であると決定された場合に患者にｔａｓｅｌｉｓｉｂを投与することを含む方法。
  20. がん細胞がＰＩＫ３ＣＡ突然変異がん細胞である、請求項１９に記載の方法。
  21. ａ）患者にｔａｓｅｌｉｓｉｂを投与すること；
    ｂ）患者から得られた生物学的試料中のｐ１１０アルファのレベル又はｐ１１０アルファのレベルと相関するバイオマーカーにおける変化を測定すること；及び
    ｃ）患者から得られた生物学的試料中にｐ１１０アルファの枯渇を示す患者に投与されるｔａｓｅｌｉｓｉｂ療法の投薬量、投与頻度、又は過程を選択すること
    を含む、がんの治療方法。
  22. ｐ１１０アルファのレベルの変化がｐ１１０アルファのレベルの枯渇である、請求項２１に記載の方法。
  23. がんの治療においてｔａｓｅｌｉｓｉｂに対する応答性を監視するためのバイオマーカーを同定する方法であって：
    （ａ）少なくとも一用量のｔａｓｅｌｉｓｉｂを投与された患者から得られた生物学的試料中のｐ１１０アルファのレベルと相関するバイオマーカーの発現、変調、又は活性を検出すること；及び
    （ｂ）バイオマーカーの発現、変調、又は活性を、ｔａｓｅｌｉｓｉｂの投与に先立って患者から得られた生物学的試料である基準試料中のバイオマーカーの状態と比較すること；
    を含み、基準試料と比較して、バイオマーカーの変化が少なくとも２分の１への低下又は少なくとも２倍への増加に相当する変調が、ｔａｓｅｌｉｓｉｂに対する応答性を監視するために有用なバイオマーカーとして同定される、方法。
  24. がんがＨＥＲ２発現乳がんである、請求項２３に記載の方法。
  25. 患者に治療的有効量のｔａｓｅｌｉｓｉｂを投与することを含む、患者のがんの治療方法であって、治療が、患者から得られた生物学的試料中のｐ１１０アルファのレベルと相関するバイオマーカーを検出することに基づいている、方法。
  26. 生物学的試料が腫瘍生検試料又は循環性腫瘍細胞である、請求項２５に記載の方法。
  27. 治療対象の患者がＰＩＫ３ＣＡ突然変異を有する、がんの治療に使用されるｔａｓｅｌｉｓｉｂであって、突然変異がＨ１０４７Ｒ、Ｃ４２０Ｒ、Ｈ１０４７Ｌ、Ｅ５４２Ｋ、Ｅ５４５Ｋ及びＱ５４６Ｒより選択される突然変異を含む、ｔａｓｅｌｉｓｉｂ。
  28. ｔａｓｅｌｉｓｉｂとＰＩＫ３ＣＡ突然変異状態を有する生物学的試料とを接触させた後にｐ１１０アルファアイソフォームの枯渇を伴うＰＩＫ３ＣＡ突然変異を治療対象の患者が有する、がんの治療に使用されるｔａｓｅｌｉｓｉｂであって、突然変異がＨ１０４７Ｒ、Ｃ４２０Ｒ、Ｈ１０４７Ｌ、Ｅ５４２Ｋ、Ｅ５４５Ｋ及びＱ５４６Ｒより選択される突然変異を含む、ｔａｓｅｌｉｓｉｂ。
  29. 治療対象がＰＩＫ３ＣＡ突然変異を有する、がんの治療のための医薬の製造におけるｔａｓｅｌｉｓｉｂの使用。
  30. ｔａｓｅｌｉｓｉｂとＰＩＫ３ＣＡ突然変異状態を有する生物学的試料とを接触させた後にｐ１１０アルファアイソフォームの枯渇を伴うＰＩＫ３ＣＡ突然変異を治療対象の患者が有する、がんの治療のための医薬の製造におけるｔａｓｅｌｉｓｉｂの使用であって、突然変異がＨ１０４７Ｒ、Ｃ４２０Ｒ、Ｈ１０４７Ｌ、Ｅ５４２Ｋ、Ｅ５４５Ｋ及びＱ５４６Ｒより選択される突然変異を含む、使用。
  31. ｔａｓｅｌｉｓｉｂとの接触後にｐ１１０アルファアイソフォームの枯渇を患者が有する、がんの治療に使用されるｔａｓｅｌｉｓｉｂ。
  32. ｔａｓｅｌｉｓｉｂに対する応答性を決定する方法であって：
    ａ）ｔａｓｅｌｉｓｉｂを投与する工程；及び
    ｂ）患者から得られた生物学的試料中のｐ１１０アルファ又はｐ１１０アルファのレベルと相関したバイオマーカーのレベルの変化を測定する工程
    を含む方法。
  33. 上に記載の発明。
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