CN103145817A - 黄花苜蓿叶绿体冷响应蛋白MfcpCOR14及其编码基因和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种黄花苜蓿叶绿体冷响应蛋白MfcpCOR14及其编码基因及应用，属于植物基因工程领域。本发明通过获得MfcpCOR14基因，并将获得的MfcpCOR14基因构建植物表达载体，用构建的表达载体转化植物组织，然后培育成转基因植株。MfcpCOR14基因受低温的诱导；本发明提供了利用MfcpCOR14基因培育耐寒、耐强光植物的方法，将该基因在植物过量表达后，转基因植株的生长优于野生型植株，同时转基因植株明显提高了抗寒性和抗强光能力。

Description

黄花苜蓿叶绿体冷响应蛋白MfcpCOR14及其编码基因和应用

技术领域

本发明属于植物基因工程领域，涉及一种黄花苜蓿叶绿体冷响应蛋白MfcpCOR14及其编码基因和应用。

背景技术

植物生长和作物产量会受各种不利的环境条件严重影响，热带植物特别容易受到低温的伤害。培育耐逆的植物品种是种植业的主要目标之一。然而，植物耐逆性是一个数量性状，涉及至少几百个基因的作用，因此从耐逆性强的植物中分离耐性基因是十分必要的。

黄花苜蓿（Medicago sativa subsp.falcata)是一种非常耐寒的豆科牧草种质，在寒冷的西伯利亚也有分布，从中克隆抗寒基因，能为转基因育种提供更为优良的目的基因，而且对于农林植物抗逆分子育种尤为重要和迫切。黄花苜蓿在冷驯化中mRNA和蛋白发生变化（Chinnusamy et al.2007），除了对少数几个冷驯化特异基因进行克隆和表达分析外（Mohapatra et al.1989,Wolfraim et al.1993），利用黄花苜蓿分离抗寒基因的研究很少。

发明内容

为克服现有技术的缺点和不足，本发明的首要目的是提供一种黄花苜蓿叶绿体冷响应蛋白MfcpCOR14。

本发明的另一目的在于提供编码所述的黄花苜蓿叶绿体冷响应蛋白MfcpCOR14的基因。

本发明的再一目的在于提供所述的黄花苜蓿叶绿体冷响应蛋白MfcpCOR14的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：一种黄花苜蓿叶绿体冷响应蛋白MfcpCOR14，其氨基酸序列如下所示：

MATMLTSNTLFQTSNSFPNVPSLTLPKPSRVFLASNWRNASEGTKNTSLSWAYTSSSTKTRRYADGTAGKAGETVNAGIDDIKQFGQDADEKTKDAASSIADKAKENTDKTVEAVGSAGDKAKDYAFDANDKAKEAIGSATDKAKEGFEAATKNTQEAAGSATEALKNAGDQAKEAVEGALDAAKDAVAGKE；

编码所述的黄花苜蓿叶绿体冷响应蛋白MfcpCOR14的核苷酸序列如下所示：

ATGGCAACAATGTTGACAAGTAACACACTCTTCCAAACCTCAAACTCATTCCCTAATGTCCCTTCACTCACCCTTCCTAAACCCTCCAGGGTCTTCTTAGCTTCCAACTGGAGAAATGCATCAGAAGGAACAAAAAACACTTCACTCAGTTGGGCTTACACTTCTTCTTCTACAAAGACAAGAAGATATGCAGATGGAACAGCCGGCAAAGCCGGAGAAACGGTGAACGCAGGCATAGATGACATCAAACAATTCGGACAAGATGCAGATGAAAAGACAAAGGACGCTGCGAGTTCAATTGCGGATAAAGCAAAAGAAAACACAGACAAGACTGTAGAGGCAGTAGGAAGTGCTGGAGACAAGGCAAAAGATTATGCTTTTGATGCAAATGACAAAGCCAAGGAAGCAATAGGTTCTGCTACTGATAAGGCAAAAGAAGGATTTGAGGCAGCAACGAAGAACACACAGGAGGCTGCTGGGTCAGCGACAGAGGCTCTGAAGAATGCAGGAGATCAGGCAAAGGAGGCGGTGGAAGGAGCGTTGGACGCGGCCAAGGATGCCGTGGCTGGGAAGGAGTAA；

上述黄花苜蓿叶绿体冷响应蛋白MfcpCOR14在促进植物生长及提高植物抗寒性和抗强光能力中的应用：该应用包括用本发明的MfcpCOR14基因构建植物表达载体；用构建的表达载体转化植物组织；将转化的植物组织培育成转基因植株。

所述的用本发明的MfcpCOR14基因构建植物表达载体，可用现有的植物表达载体构建含有所述基因的重组表达载体；

所述植物表达载体包括但不限于双元农杆菌载体以及用于单子叶基因枪转化的载体；所述的双元农杆菌载体包括pBI121，pCAMBIA系列载体；所述植物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它效应mRNA加工或基因表达的DNA片段；

使用所述基因构建重组植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可使用任何一种强启动子或诱导型启动子；这些启动子包括但不限于花椰菜花叶病毒（CaMV）35S启动子和泛素（Ubiqutin）启动子，它可单独使用或与其他的植物启动子结合使用；此外使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，这些增强子区域包括但不限于ATG起始密码子和邻接区域。起始密码子必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的翻译。翻译控制信号和起始密码子可以使多种不同的来源，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或来自结构基因。

为了便于对转基因植株进行鉴定及筛选，可对所使用的植物表达载体进行加工，包括加入或替换植物可选择性标记。可使用的选择性标记包括编码抗除草剂的酶的基因或具有抗性的抗生素标记物；所述的除草剂包括草丁膦、草甘膦等，所述的抗生素包括卡那霉素、潮霉素、庆大霉素等。从转基因植物的安全性考虑，可以不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。

含有MfcpCOR14基因的表达盒、转基因细胞系及重组菌均属于本发明的保护范围。

本发明的表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接的DNA转化，显微注射、电穿孔等各种常规或特异的遗传转化方法导入植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。被转化的植物宿主可以是双子叶植物或单子叶植物。

所述的MfcpCOR14基因片段的获得和植物表达载体的制备方法，包括以下步骤：

（1）引物设计

①MfcpCOR14扩增上游引物RT81：CACAAACTCGAAAAACTTAAGAACCA；

②MfcpCOR14扩增下游引物RT82：CTTACTCCTTCCCAGCCACG；

③引入BamHⅠ酶切位点的上游引物pMD1：GATCGGATCCGAGGATCTACTAGTCATATGG；

④突变原有BamHⅠ酶切位点，引入XbaⅠ酶切位点的下游引物pMD2：GTGATCTAGAGCTCGGTACCCGGAAATCCGA；

（2）MfcpCOR14基因片段的获得：

以黄花苜蓿（Medicago falcata）的cDNA为模板，使用引物①和引物②扩增MfcpCOR14基因片段，并连接进入pMD20-T载体中，构建获得pMD-MfcpCOR14载体；

（3）植物表达载体pBI-MfcpCOR14的构建

以pMD20-MfcpCOR14载体为模板，使用引物③和引物④使MfcpCOR14基因片段引入XbaⅠ和BamHⅠ两个酶切位点，进而构建获得植物表达载体pBI-MfcpCOR14；

所述的转基因植物为转基因烟草；

所述的转基因烟草的获得，包括以下的步骤：

（1）用电转的方法将pBI-MfcpCOR14导入根瘤农杆菌EHA105中，获得含表达载体pBI-MfcpCOR14农杆菌阳性菌落；

（2）将活化的含有表达载体pBI-MfcpCOR14的农杆菌EHA105浸染烟草无菌苗叶盘，经共培养和抗生素筛选，获得转基因烟草。

发明人从黄花苜蓿中克隆了一个新基因的cDNA序列，在NCBI数据库查不到与它同源性高的蛋白序列；该基因表达受低温诱导，而且它翻译的蛋白预测定位于叶绿体基质，成熟蛋白分子大小为14kDa，故将其命名为叶绿体冷响应蛋白14（chloroplastic cold responsive14kDa protein），基因名MfcpCOR14。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

发明人已从黄花苜蓿中克隆了叶绿体冷响应蛋白MfcpCOR14的cDNA序列MfcpCOR14。MfcpCOR14基因的表达受低温诱导，构建了适合于双子叶植物的表达载体，转化双子叶模式植物烟草，转基因植株的生长优于野生型植株，同时转基因植株明显提高了抗寒性和抗强光能力。

附图说明

图1是植物表达载体pBI-MfcpCOR14的示意图。

图2是本发明所述MfcpCOR14基因开放阅读框序列的PCR扩增琼脂糖凝胶电泳图，其中，M是标准DNA分子；1是MfcpCOR14基因的扩增片段。

图3是MfcpCOR14基因的植物表达载体的PCR鉴定琼脂糖凝胶电泳图，其中，M是标准DNA分子；1-8是阳性重组子；9是pMD-MfcpCOR14载体，为阳性对照；10是阴性对照。

图4是低温诱导MfcpCOR14基因表达的特征柱状图；柱上方的字母a、b和c表示不同处理之间的差异显著（P≤0.05），即数据柱上方字母相同时表示没有显著差异，数据柱上方字母不同时表示存在显著差异。

图5是导入MfcpCOR14基因的转基因烟草PCR鉴定结果琼脂糖凝胶电泳图，其中，M是标准DNA分子；W表示野生型烟草；6-3、11-2、13-2表示不同的转MfcpCOR14基因烟草。

图6是导入MfcpCOR14基因的转基因烟草的Southern杂交和Northern杂交鉴定，其中，W表示野生型；6-3、11-2、13-2表示不同的转MfcpCOR14基因烟草；图(a)是Southern杂交，图(b)是Northern杂交。

图7是导入MfcpCOR14基因的转基因烟草的Western杂交鉴定，其中，W表示野生型；6-3、11-2、13-2表示不同的转MfcpCOR14基因烟草。

图8是导入MfcpCOR14基因的转基因烟草生长测定，其中，W表示野生型烟草；6-3、11-2、13-2表示不同的转MfcpCOR14基因烟草；图（a）是4、5、6周龄苗地上部鲜重，图（b）是4、5、6周龄苗根部鲜重，图（c）是4、5、6周龄苗整株鲜重，图（d）是10、14周龄苗地上部鲜重，图（e）是10、14周龄苗根部鲜重，图（f）是10、14周龄苗整株鲜重，图（g）4、5、6、10、14周龄苗生长状况；柱上方的字母a、b、c、d和e表示不同处理之间的差异显著（P≤0.05），即数据柱上方字母相同时表示没有显著差异，数据柱上方字母不同时表示存在显著差异。

图9是导入MfcpCOR14基因的转基因烟草抗寒性和抗强光分析，其中，W表示野生型烟草；6-3、11-2、13-2表示不同的转MfcpCOR14基因烟草；图（a）是冷处理（3℃）的净光合速率，图（b）是冻处理（-4℃3小时）的相对电导率及各株系照片，图（c）是冻处理（系列零下低温）的相对电导率，图（d）是强光（1200μmol·m^-2s^-1）处理的相对电导率，图（e）是强光（1200μmol·m^-2s^-1）处理的最大光化学效率Fv/Fm；柱上方的字母a、b、c、d、e、f、g和h表示不同处理之间的差异显著（P≤0.05），即数据柱上方字母相同时表示没有显著差异，数据柱上方字母不同时表示存在显著差异。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

黄花苜蓿或黄花苜蓿种子：品种为呼伦贝尔，中国农科院北京畜牧兽医研究所牧草种质资源库。

大肠杆菌（Escherichia coli）DH10B：购自上海超研生物科技有限公司。

pBI121表达载体:购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司。

根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）EHA105：购自北京天恩泽基因科技有限公司。

烟草或烟草（Nicotiana tabacum L.）种子：品种为中烟90，广东省农科院作物研究所。

实施例1MfcpCOR14的克隆

一、黄花苜蓿cDNA模板制备

将黄花苜蓿（Medicago falcata）种子用60℃热水浸泡5分钟，于28℃黑暗条件下催芽，当种子露白时，点播于盛有泥土的塑料盆（直径15cm）中，于温室内培养，自然光照，温度25-28℃。将苗龄8-10周的黄花苜蓿植株放入温度为5℃的人工气候箱（光照强度为200μmol·m^-2s^-1）内，光/暗周期为12小时光照，进行5℃低温处理，连续处理2天。取黄化苜蓿的成熟叶片，用TRE-Trizol方法提取总RNA，用M-MLV逆转录酶试剂盒（Promega公司）反转录获得反转录第一链cDNA作为模板，-20℃保存备用。

二、设计扩增MfcpCOR14基因引物

根据本实验室构建的黄花苜蓿冷诱导基因cDNA缩减文库中发现的MfcpCOR14基因cDNA片段的序列（ES323281），在NCBI上进行BLASTX比对，并下载相应核苷酸序列一致性最高的序列，蒺藜苜蓿MTR2g014050。根据MfcpCOR14基因cDNA片段的序列相应于蒺藜苜蓿MTR2g014050开放阅读框两端的区域设计引物：

MfcpCOR14扩增上游引物RT81：CACAAACTCGAAAAACTTAAGAACCA；

MfcpCOR14扩增下游引物RT82：CTTACTCCTTCCCAGCCACG；

三、扩增获得MfcpCOR14基因并构建载体

用上述步骤一制备的模板和步骤二设计的引物进行PCR扩增。

PCR反应体系（25μL）：Ex Taq DNA聚合酶（TaKaRa公司，5U·μL^-1）0.1μL，10×Ex Taq DNA聚合酶缓冲液2.5μL，dNTPs（10mmol·L^-1）0.25μL，上游引物RT81（10μmol·L^-1）0.8μL，下游引物RT82（10μmol·L^-1）0.8μL，反转录第一链cDNA1μL，ddH₂O补足至25μL。

PCR反应程序：94℃3分钟；94℃20秒，57℃30秒，68℃40秒，35个循环；68℃10分钟。扩增产物以1％的琼脂糖凝胶电泳检测（如图2）。

获得与预期片段长度（605bp）一致的PCR片段（图2）。将获得的PCR产物用DNA凝胶回收试剂盒（东盛公司）回收后，用T4DNA连接酶（TaKaRa公司）将PCR回收片段与线性pMD20-T载体（TaKaRa公司）进行连接，反应体系如下：1μL10×T4连接酶缓冲液，PCR回收片段150ng，1μL T4DNA连接酶，1.5μL线性pMD20-T载体（10mmol·L^-1），加无菌水至总体积为10μL，16℃连接过夜。

大肠杆菌感受态细胞的制备：用接种环取保存于-70℃超低温冰箱的大肠杆菌DH10B菌液，在SOB固体培养基上划板，于37℃培养箱内培养过夜；挑取大肠杆菌DH10B单菌落接种于1mL的SOB液体培养基中，在37℃恒温摇床上以200rpm振荡培养6小时，接种于200mL SOB液体培养基中，于37℃恒温摇床上以200rpm振荡培养至OD₅₅₀＝0.8。以2500rpm离心10分钟收集菌体，加入预冷的10％甘油洗涤，离心收集细菌。重复用10％甘油洗涤，离心收集细菌。最后将细菌分装，于-70℃保存备用。

连接产物电击转化大肠杆菌：取20μL大肠杆菌感受态细胞至电击杯（孔径2mm），加入1μL连接产物，用电击仪（MicroPulser，Bio-RAD公司）电击转化。电击参数为：电阻200Ω，1800V，25μF。电击后的菌体转入1mL SOC液体中，于37℃恒温摇床上以200rpm振荡培养1小时。取100μL菌液涂布于含24mg·L^-1IPTG和40mg·L^-1X-gal的LB固体（含100mg·L^-1氨苄青霉素）培养基上，于37℃培养箱内倒置培养过夜。

重组质粒pMD-MfcpCOR14的筛选、纯化及测序：呈蓝斑的菌落不含***片段，仅挑取呈白斑的菌落，做菌落PCR检测。挑取PCR阳性菌落，接种于1mL含100mg·L^-1氨苄青霉素的LB液体培养基中，于37℃恒温摇床上以200rpm振荡培养5小时，以RT81/RT82为引物做菌液PCR检测。吸取5μL阳性菌液，接种于3mL含100mg·L^-1氨苄青霉素的LB液体培养基中，于37℃恒温摇床上以200rpm振荡培养过夜。用碱裂解法抽提质粒，4℃保存备用。纯化的重组质粒命名为pMD-MfcpCOR14，送交上海生工生物工程技术服务有限公司进行测序，测序结果反向互补链如下：

CACAAACTCGAAAAACTTAAGAACCATGGCAACAATGTTGACAAGTA ACACACTCTTCCAAACCTCAAACTCATTCCCTAATGTCCCTTCACTCACCC TTCCTAAACCCTCCAGGGTCTTCTTAGCTTCCAACTGGAGAAATGCATCAG AAGGAACAAAAAACACTTCACTCAGTTGGGCTTACACTTCTTCTTCTACAA AGACAAGAAGATATGCAGATGGAACAGCCGGCAAAGCCGGAGAAACGGT GAACGCAGGCATAGATGACATCAAACAATTCGGACAAGATGCAGATGAAA AGACAAAGGACGCTGCGAGTTCAATTGCGGATAAAGCAAAAGAAAACAC AGACAAGACTGTAGAGGCAGTAGGAAGTGCTGGAGACAAGGCAAAAGAT TATGCTTTTGATGCAAATGACAAAGCCAAGGAAGCAATAGGTTCTGCTACT GATAAGGCAAAAGAAGGATTTGAGGCAGCAACGAAGAACACACAGGAGG CTGCTGGGTCAGCGACAGAGGCTCTGAAGAATGCAGGAGATCAGGCAAA GGAGGCGGTGGAAGGAGCGTTGGACGCGGCCAAGGATGCCGTGGCTGGG AAGGAGTAAG

测序结果与cDNA缩减文库中MfcpCOR14基因cDNA片段的序列（ES323281）进行比对，证明所扩增出的PCR产物为MfcpCOR14基因，并且测序结果显示MfcpCOR14基因反向连接到pMD20-T上。用Omiga2.0软件分析所扩增的PCR产物序列，获得了MfcpCOR14基因的开放阅读框架（ORF）序列，如上述测序序列中下划线标注部分。编码所述的黄花苜蓿叶绿体冷响应蛋白MfcpCOR14的基因由605个碱基组成，其中MfcpCOR14的蛋白质编码区（Sequence coding for amino acids in protein，CDs）由26位～604位的579个碱基组成，编码192个氨基酸。用ChloroP分析软件预测MfcpCOR14所编码的蛋白具有55个氨基酸的叶绿体信号肽，对应上述测序结果反向互补链的26位～190位碱基，叶绿体信号肽加工后预测的成熟蛋白分子大小为14kDa。

实施例2MfcpCOR14基因的植物表达载体（pBI-MfcpCOR14）构建

由于MfcpCOR14基因反向连接在pMD20-T载体上的，根据pMD20-T载体***位点两翼序列，设计带有BamHⅠ和XbaⅠ酶切位点的扩增引物：

引入BamHⅠ酶切位点的上游引物pMD1：GATCGGATCCGAGGATCTACTAGTCATATGG；

突变原有BamHⅠ酶切位点，引入XbaⅠ酶切位点的下游引物pMD2：GTGATCTAGAGCTCGGTACCCGGAAATCCGA；

以实施例1中构建的克隆载体pMD-MfcpCOR14为模板，以pMD1和pMD2为上下游引物，进行MfcpCOR14基因PCR扩增，纯化回收扩增获得的MfcpCOR14基因片段。

将上述回收获得的MfcpCOR14基因片段和pBI121表达载体分别用限制性内切酶XbaⅠ（TaKaRa公司）和BamHⅠ（TaKaRa公司）双酶切，分别回收MfcpCOR14基因目的片段和酶切后pBI121载体大片段，用T4DNA连接酶（TaKaRa公司）连接后，将MfcpCOR14基因***到表达质粒pBI121CaMV35S启动子下游多克隆位点的XbaⅠ和BamHⅠ之间，构建获得重组表达载体，命名为pBI-MfcpCOR14。分别以RT81/RT82和pBI121载体CaMV35S序列上游引物ZG13（CTCGGATTCCATTGCCCAGCT）/RT82为引物进行菌液PCR检测，证明获得了重组子（图3）。进一步对***片段测序，结果表明，***片段的序列与MfcpCOR14编码区的序列完全一致，并且***片段两端的酶切位点也完全正确，从而证明构建成了pBI-MfcpCOR14表达载体，pBI-MfcpCOR14表达载体的示意图如图1。

实施例3MfcpCOR14受低温诱导的表达情况

一、获得低温条件下的黄花苜蓿模板

将苗龄8-10周的黄花苜蓿植株放入温度为5℃的人工气候箱（200μmol·m^-2s^-1）内，光照和黑暗时间均设为12小时光照。连续处理4天，进行5℃低温处理。分别取低温处理0h、12h、24h、48h、96h的成熟叶片，加入液氮磨碎样品，用TRE-Trizol试剂提取叶片的总RNA，用PrimeScript^TMRT reagent Kit（TaKaRa公司）反转录获得反转录第一链cDNA为cDNA模板，-20℃保存备用。

二、设计特异检测引物

根据MfcpCOR14基因cDNA序列和截型苜蓿Actin（MTR3g095530）的序列，用Beacon Designer7.0软件设计出检测用定量引物：

MfcpCOR14基因的上游定量引物ZG1861：ACGCAGGCATAGATGACAT；

MfcpCOR14基因的下游定量引物ZG1862：CAGAACCTATTGCTTCCTTGG；

Actin基因的上游定量引物ZG1613：ATTCACGAGACCACCTAC；

Actin基因的下游定量引物ZG1614：GAGCCACAACCTTAATCTTC。

三、定量PCR检测表达差异

将实施例3中步骤一制备的模板cDNA稀释到15ng·μL^-1用于定量PCR的模板。反应体系为10μL：SYBR Premix Ex Taq（2×）5μL，上游和下游引物（10μmol·L^-1）各0.5μL，cDNA模板1μL，无菌水3μL。使用仪器为Bio-Rad公司生产的Mini Option Real-Time PCR System，PCR反应条件设置为：95℃10秒；94℃5秒，57℃25秒，40个循环。以不加cDNA模板作为阴性对照，每个样品设置3个重复，以Actin作为内参基因。反应结束后，进行溶解曲线分析，PCR扩增效率在95%以上。利用Bio-Rad CFX Manager(version1.6)软件自动计算基因的相对表达量。

实时定量PCR的结果显示，MfcpCOR14表达在低温处理12小时明显受到诱导，在低温处理48小时和96小时，表达量一直维持在最高水平（图4）。结果表明，低温诱导MfcpCOR14基因的表达。

实施例4转基因烟草的产生及分子检测

一、转基因烟草的产生

农杆菌感受态细胞的制备：用接种环取保存于-70℃超低温冰箱的根瘤农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）EHA105菌液在YEB平板上划线，28℃培养48小时，挑取单菌落，接种于50mL液体SOB中，28℃培养过夜，吸取0.5mL菌液，接种于500mL液体SOB中，28℃培养8小时，至OD₆₀₀为0.6，冰浴冷却10分钟，倒入经灭菌的200mL离心管中，平衡后4℃，4000rpm，离心10分钟，收集菌体，倒去SOB，倒置于纸巾上，控干水分，加入50mL10%甘油，于冰上摇动，悬浮菌体，4℃，4000rpm，离心15分钟，收集菌体，弃10%甘油，重复洗涤一次，加入2mL10%甘油，悬浮菌体，分装，20μL/管，加液氮速冻后于-70℃冰箱保存。

质粒电击转化农杆菌：将1μL pBI-MfcpCOR14质粒（20ng·μL^-1）加至20μL解冻的农杆菌感受态细胞中，轻弹管壁混匀，冰浴90秒后，转移至电击杯（孔径2mm）中，置于电击仪（MicroPulser，Bio-RAD公司）的电极间，选定程序Agr，进行电击。电击结束后，迅速将1mL YEB液体培养基倒入电击杯，再用移液枪转移至摇菌管中，28℃轻柔振荡培养2小时。吸取0.3mL菌液，涂布在YEB平板（含35mg·L^-1的氯霉素和50mg·L^-1的卡那霉素）上。28℃培养箱内倒置培养36小时。

阳性菌落的鉴定：挑取平板上的单菌落，分别以RT81/RT82和pBI121载体CaMV35S序列上游引物ZG13（CTCGGATTCCATTGCCCAGCT）/RT82为引物进行菌液PCR检测。进一步吸取PCR阳性菌液至3mL YEB液体培养基（含35mg·L^-1的氯霉素和50mg·L^-1的卡那霉素）中，28℃振荡培养36小时。取2mL菌液用碱裂解法抽提质粒，用限制性内切酶XbaⅠ（TaKaRa公司）和BamHⅠ（TaKaRa公司）进行酶切检测，确定阳性克隆中含有植物表达载体pBI-MfcpCOR14。取0.8mL农杆菌液，加0.2mL80%甘油，混匀后保存于-70℃超低温冰箱备用。

农杆菌的活化与悬浮：取含有表达载体pBI-MfcpCOR14的农杆菌EHA105贮存液，在YEB平板（含35mg·L^-1的氯霉素和50mg·L^-1的卡那霉素）上划线，28℃培养。挑分离良好的单菌落，接种于2mL液体YEB（含35mg·L^-1的氯霉素和50mg·L^-1的卡那霉素）中，28℃振荡暗培养24小时。吸取菌液50μL，涂布于YEB平板（含35mg·L^-1的氯霉素和50mg·L^-1的卡那霉素）上，28℃倒置暗培养36小时。将新长出的农杆菌刮下来，用MS液体培养基悬浮稀释，使OD₆₀₀为0.8，制成农杆菌菌液。

转基因烟草的产生：烟草（Nicotiana tabacum L.）种子经70％的酒精和2%次氯酸钠消毒后，接种于MS培养基上，28℃光照培养约1个月。待展开5-7片真叶时，即可用于农杆菌转化。取烟草无菌苗的叶片，用剪刀剪成1cm²大小的叶盘，并用尖嘴镊子在表面戳小孔，制造伤口，转入上述制备的农杆菌菌液中浸泡，其间不时摇匀。浸泡15分钟后，用无菌吸水纸吸去叶盘表面多余菌液，稍吹干，置于垫了滤纸的共培养基（MS基本培养基添加0.1mg·L^-1萘乙酸和1mg·L^-1苄基腺嘌呤，pH5.8）上，28℃黑暗共培养2天。将经过共培养的材料转移至选择培养基（MS基本培养基添加0.1mg·L^-1萘乙酸，1mg·L^-1苄基腺嘌呤，250mg·L^-1头孢霉素和100mg·L^-1卡那霉素，pH5.8），28℃光照培养。20天继代一次。将成功分化的苗转至生根培养基（MS基本培养基添加250mg·L^-1头孢霉素和100mg·L^-1卡那霉素，pH5.8）上生根，待长出5-7片真叶时，开瓶炼苗，移栽到土中。

转基因烟草的生长：将移栽的转基因烟草幼苗培养在温室内，初期给予一定的遮阴，存活后的幼苗逐渐转移到自然光照下生长。在生长过程中，定期浇水、施肥。采用自交收种，即在花瓣张开前，对花序套袋；在果实形成后，再除去套袋。果实成熟后收种，即获得转基因烟草种子。

二、转基因烟草的PCR检测

微量法快速提取DNA：用1.5mL离心管盖取转基因烟草及其野生型植株的叶圆片，加入400μL预热到80℃的提取液（200mmol·L^-1Tris-HCl pH8.0，250mmol·L^-1NaCl，25mmol·L^-1EDTA，质量分数为0.5％的SDS），用小研锤在1.5mL离心管中充分研磨，70℃干热浴10分钟后，移到冰浴放置2分钟。13000rpm离心1分钟，取300μL上清液至新的离心管中，加等量异丙醇，混匀，室温静置5分钟。13000rpm离心2分钟，弃净上清液，将DNA沉淀风干后溶于50μL TE溶液（1mol·L^-1NaCl，10mmol·L^-1Tris-HCl pH8.0，1mmol·L^-1EDTA），保存于-20℃，备用。

PCR检测：根据pBI121载体上CaMV35S启动子序列设计上游引物：pBI121载体CaMV35S序列上游引物ZG13：CTCGGATTCCATTGCCCAGCT；

与MfcpCOR14扩增下游引物RT82配对。以上述微量法快速提取的DNA为模板，进行PCR扩增。反应体系（20μL）为：Taq DNA聚合酶0.1μL，10×buffer2μL，dNTPs（10mmol·L^-1）0.25μL，上游引物ZG13和下游引物RT82（10μmol·L^-1）各0.5μL，DNA1μL，ddH₂O补足至20μL。PCR反应程序：94℃3分钟；94℃20秒，55℃30秒，72℃40秒，35个循环；72℃5分钟。以1％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。

三、转基因烟草的Southern杂交和Northern杂交

基因组DNA的提取：采用CTAB法提取DNA，具体方法如下：取1g烟草（野生型烟草和转基因烟草）叶片，用液氮快速研磨成粉末，加入4mL预热到70℃的1.5×CTAB提取液（质量分数为1.5%的CTAB，75mmol·L^-1Tris-HClpH8.0，1mol·L^-1NaCl，15mmol·L^-1EDTA），研磨成浆后转移至50mL离心管，再用3mL1.5×CTAB提取液洗净研钵，转至50mL离心管，混匀。65℃水浴1小时，间断混匀。水浴结束后，加入5mL氯仿，旋紧管盖，上下颠倒混匀10分钟，5000rpm离心15分钟。小心吸取上清至新的50mL离心管，并记录体积，加入1/10体积的质量分数为10％的CTAB溶液，摇匀。加入4/5体积的氯仿，上下颠倒混匀10分钟。5000rpm离心15分钟。小心吸取上清至50mL离心管，并记录体积，加入等量的沉淀液（质量分数为1％CTAB，50mmol·L^-1Tris-HClpH8.0，10mmol·L^-1EDTA），轻柔上下颠倒混匀，室温放置15分钟，沉淀DNA。5000rpm离心10分钟，小心倒掉上清，用移液枪吸尽上清。向沉淀加入2mL高盐TE（1mol·L^-1NaCl，10mmol·L^-1Tris-HCl pH8.0，1mmol·L^-1EDTA）和5μL10mg·mL^-1的RNAase（用10mmol·L^-1Tris-HCl pH7.5和15mmol·L^-1NaCl溶液配制，经过100℃水浴15分钟灭活DNA酶），在55℃摇床中轻摇至沉淀完全溶解（30-40分钟）。加入2倍体积的无水乙醇，轻柔地上下颠倒混匀。用枪头钩出絮状DNA，在70％乙醇中漂洗，然后移至1.5mL离心管。短暂离心，吸尽上清，适当风干沉淀，用0.1-0.2mL TE（10mmol·L^-1Tris-HCl pH8.0，1mmol·L^-1EDTA）溶解沉淀。取2μL稀释10倍的DNA溶液，用0.8％琼脂糖凝胶电泳，检测DNA的质量，测OD_260nm和OD_280nm，确定DNA的纯度和浓度。

总RNA的提取：取0.1g烟草（野生型烟草和转基因烟草）叶片，用液氮快速研磨成粉末，用TRE-Trizol试剂提取叶片的总RNA，并确定总RNA的浓度与纯度。

基因组DNA的酶切和转膜：取15μg基因组DNA，加入用无菌的去离子水至总体积33μL，2μL EcoRI（或者XbaI），4μL10×酶切缓冲液，37℃酶切过夜。加入点样缓冲液，点样到0.8％琼脂糖凝胶，以4V·cm^-1电泳5小时，直至指示染料溴酚兰泳至凝胶长度2/3距离处。用毛细管法将DNA转移至HybondXL尼龙膜（Amersham）上。具体方法如下：将胶平放在用NaOH浸透的滤纸上，滤纸两端浸入转移池的0.4mol·L^-1NaOH溶液中。盖上尼龙膜后用保鲜膜封起尼龙膜的四周，以防转移***短路。盖上滤纸，并赶气泡，铺上约7cm厚的吸水纸，并压上200g的重物，持续转膜16小时。转移结束后，用2×SSC（300mmol·L^-1氯化钠，30mmol·L^-1柠檬酸钠，pH7.0）简单漂洗后，再用煮沸的0.5×SSC（含质量分数0.5％SDS）溶液浸泡几分钟。自然风干5分钟，用保鲜膜包好，做好标记，保存于4℃备用。

总RNA的变性电泳和转膜：用常规的甲醛变性电泳法将不同大小的RNA分子分离开，用毛细管法转到Hybond N⁺尼龙膜（Amersham）上。具体如下：称取1.2g琼脂糖，加热溶于85mL DEPC处理过的水中，冷却后加入10mL10×MOPS溶液，5mL37%甲醛，4μL GoldView充分混匀后，制备成1.2%的甲醛变性凝胶。取30μg RNA样品，依次加入2μL10×MOPS溶液，2.5μL37%甲醛，7.5μL甲酰胺，加DEPC处理水，使得总体积至50μL，混匀后于65℃保温10分钟，使RNA变性。然后置于冰上冷却5分钟，加入电泳载样缓冲液。将各个变性的RNA样品上样至变性凝胶上，以4V·cm^-1电泳3h，直至指示染料溴酚兰泳至凝胶长度2/3距离处。电泳结束后，用无菌去离子水洗凝胶两次，每次10分钟，再用10×SSC溶液洗10分钟。将凝胶平放在转移桥的滤纸上，赶走气泡。将一张大小与凝胶相近的Hybond N⁺（Amersham）尼龙膜铺在胶上，赶气泡。在尼龙膜上铺2张与尼龙膜大小一样并用10×SSC充分润湿的滤纸，用保鲜膜封起尼龙膜的四周，以防转移***短路。在滤纸上铺上约7cm厚的吸水纸，并压上200g的重物，持续转膜16小时。完成RNA转移后，将尼龙膜放置2×SSC湿润的滤纸上，置于紫外交联仪内将有RNA的面朝上进行紫外交联，采用的紫外光总能量为800kJ。再将尼龙膜放在DEPC处理水中漂洗，自然风干5分钟，用保鲜膜包好，做好标记，保存于4℃备用。

探针标记：以实施例1步骤中克隆获得的MfcpCOR14片段（即以引物对RT81和RT82和模板黄花苜蓿cDNA获得的PCR产物）50ng（25μL反应体系）作为探针标记的模板，采用Random Primer DNA Labeling Kit Ver.2.0（TaKaRa）参照说明书的方法来标记探针。每25μL反应体系含5μL[α-³²P]dCTP同位素（北京福瑞公司）进行标记，反应结束后，加入等体积的0.8mol·L^-1NaOH溶液，使探针分子变性，用于杂交分析。

杂交：将尼龙膜放入杂交管中，加入适量预杂交液（每1cm²膜面积加入0.1mL预杂交液），42℃预杂交4小时，把标记好的探针加入杂交管中，42℃杂交16小时。杂交完毕，倒出杂交液，用含质量分数0.5%SDS的2×SSPE（300mmol·L^-1NaCl，20mmol·L^-1Na₂HPO₄，2mmol·L^-1EDTA，pH7.4）在42℃和65℃各洗一次，每次15分钟，第三次用含质量分数0.2%SDS的0.2×SSPE在65℃洗15分钟。洗膜结束后，用计数器检测放射性强度，用保鲜膜包膜，压膜显影1天后，用FX自动成像***（BIO-RAD公司）扫描分析杂交结果。

采用PCR法检测（使用引物对ZG13和RT82）转基因烟草，阳性植株能扩增出900bp左右的特异带，而野生型对照植物不能扩出该特异带（图5），证明MfcpCOR14基因已导入到转基因烟草中。

Southern杂交结果显示（如图6a），在野生型烟草中没有MfcpCOR14基因的特异杂交信号，转基因烟草植株中有MfcpCOR14基因的特异杂交信号，表明MfcpCOR14基因已整合到转基因烟草的基因组中。

Northern杂交结果显示（如图6b），在野生型烟草中没有MfCPCOR14基因的特异杂交信号，转基因烟草中有MfCPCOR14基因的特异杂交信号，表明MfCPCOR14基因能在转基因烟草中表达。

四、转基因烟草的Western杂交

多克隆抗体的制备：以由MfcpCOR14蛋白57位～156位的100个氨基酸的肽段为抗原，将对应实施例1中测序结果反向互补链的194位～493位碱基重组肽段纯化并免疫兔子，经过4次免疫后取全血纯化，获得MfcpCOR14多克隆抗体（由艾比玛特生物医药（上海）有限公司制备）。

总蛋白的提取：取0.1g烟草（野生型烟草和转基因烟草）叶片，用液氮快速研磨成粉末，用0.1mL RIPA蛋白抽提液（150mmol·L^-1NaCl，50mmol·L^-1Tris，5mmol·L^-1EDTA，1%NP-40，质量分数为0.5%脱氧胆酸钠，质量分数为0.1%SDS，pH7.5）提取叶片的总蛋白，并用考马斯亮蓝法（质量分数为0.01%考马斯亮蓝G250，5%乙醇，10%磷酸）于595nm波长下测定蛋白含量。

总蛋白的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和电转移：用常规的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法将不同大小的蛋白分离开，用水浴式电转移到BioTrace^TMNT尼龙膜（Pall）上。具体如下：使用Mini-

system Casting stand凝胶模具配制15%丙烯酰胺分离胶和5%丙烯酰胺浓缩胶。取100μg蛋白样品，加入10μL样品缓冲液（0.5mmol·L^-1Tris-HCl pH6.8，25%甘油，质量分数为4%SDS，质量分数为0.01%溴酚蓝，5%巯基乙醇），加双蒸水使得总体积至20μL，混匀后于95℃保温5分钟，使蛋白变性。然后冷却至室温，12000rpm离心10分钟以去除可能干扰电泳的不溶物。将各个变性的蛋白样品上样至SDS-聚丙烯酰胺凝胶，先在70V恒压下电泳至溴酚蓝染料从浓缩胶进入分离胶，再以100V恒压继续电泳至溴酚蓝迁移至分离胶底部。取出凝胶于转移缓冲液（25mmol·L^-1Tris，192mmol·L^-1甘氨酸，20%甲醇）平衡20分钟，剪1张大小与凝胶相近的BioTrace^TMNT尼龙膜（Pall）在转移缓冲液浸泡15分钟。湿润海绵垫及大小与凝胶相近的滤纸后，在转移夹依次铺放海绵垫、滤纸、凝胶、尼龙膜、滤纸、海绵垫，关上转移夹，放入转移槽中在冷却条件下200mA恒流电转2小时。

免疫检测：电转移后取出尼龙膜，将尼龙膜置于封闭液（质量分数为5%脱脂奶粉，0.05%Tween20,20mmol·L^-1Tris，500mmol·L^-1NaCl，pH7.5）室温摇荡封闭1小时后，转至以TBST（0.05%Tween20,20mmol·L^-1Tris，500mmol·L^-1NaCl，pH7.5）1:500稀释的MfcpCOR14多克隆抗体中，室温振摇2小时。用TBST洗5次，每次振摇5分钟后，转至以TBST（0.05%Tween20,20mmol·L^-1Tris，500mmol·L^-1NaCl，pH7.5）1:10000稀释的辣根过氧化物酶共轭的羊抗兔IgG二抗（Kirkegaard and Perry Laboratories）中，室温振摇1.5小时。用TBST洗5次，每次振摇5分钟后，使用化学发光底物

West Pico ChemiluminescentSubstrate（Thermo）反应5分钟后压X-胶片曝光显影。

Western杂交结果见图7，结果显示转基因烟草6-3,11-2,13-2中MfcpCOR14蛋白表达，对应的野生型植株W没有MfcpCOR14表达。

实施例5转基因烟草的生长、抗寒性和抗强光鉴定

一、生长测定

将转基因烟草及其野生型种子播种在盛有泥土的塑料盆（直径15cm）中，于温室内覆膜培养，自然光照，温度25-30℃。1周后将烟草幼苗移栽到盛有泥土的育苗盆（每格边长6cm）中，每格1株，于温室内培养，自然光照，温度25-30℃。分别于4、5、6周苗龄时，小心地将植株取出，将泥土洗干净，擦干后分别称量每株地上部、地下部及整株重量。同时，播种1周后将烟草幼苗移栽到盛有泥土的塑料盆（直径15cm）中，每盆1株，于温室内培养，自然光照，温度25-30℃。分别于10、14周苗龄时，小心地将植株取出，将泥土洗干净，擦干后分别称量每株地上部、地下部及整株鲜重。

对正常环境下转基因烟草的生长状况进行观察，发现其长势明显优于野生型（图8g）。对4周、5周、6周、10周和14周龄烟草植株鲜重称量结果显示，4周苗龄期转基因烟草鲜重跟野生型没差异，而5周、6周、10周和14周苗龄期转基因烟草鲜重则显著高于野生型（图8a-f）。结果表明转基因烟草的生长优于野生型。

二、抗冷性测定

将转基因烟草及其野生型植株幼苗在温室内生长12周后，移到温度为3℃的人工气候箱（光强500μmol photon·m^-2s^-1）内，人工气候箱每天光照和黑暗时间各为12小时。连续低温处理4天，测定净光合速率，评价抗冷性。具体如下，使用Li-Cor6400P便携式光合作用***（美国Li-Cor公司生产）测定植株顶端以下第3片叶的光合速率，测定光强为700μmol·m^-2s^-1，适应30分钟后测定，每个株系植株重复3株，计算平均值。

在冷处理后，转基因烟草的净光合速率明显高于野生型烟草。3℃处理4天后野生型烟草叶片净光合速率降至处理前的28%，而转基因烟草叶片净光合速率分别降至处理前47.5%、45.9%和46.6%（图9a）。结果表明转基因烟草在低温下比野生型烟草具有较高的光合速率，提高了抗冷性。

三、抗冻性测定

将转基因烟草及其野生型种子经质量分数为2%的次氯酸钠溶液消毒20分钟，再用无菌水清洗4次，播种于MS培养基上，28℃光照培养，光照强度为200μmol·m^-2s^-1，光周期为12小时。待植株长出真叶后，转到新的MS培养基中，每皿12株，每编号3皿。将培养5周的幼苗放到人工气候箱（200μmol·m^-2s^-1）中适应低温，15℃培养12小时，8℃培养8小时，4℃培养4小时后，置于-4℃处理3小时。剪取植株地上部放进装有25mL去离子水的三角瓶中，设3个重复，于摇床轻摇2小时后用DDS-11A型电导仪测电导R1。沸水浴20分钟后冷却至室温，测电导R2。相对电导率的计算公式为(R1/R2)×100%。

取温室内生长12周的转基因烟草及其野生型植株顶端以下第3片叶直径为1cm的叶圆片3片放入试管，叶片不能重叠，置于冰水混合物中平衡1小时后往试管中加入一块小冰块，尽量让叶圆片贴住冰块，移至冷冻循环仪中处理。分别测定0℃、-2℃、-4℃、-6℃、-8℃、-10℃处理的相对电导率。具体处理如下：0℃平衡1小时，取出0℃样品；以每小时降2℃的速率降温，于相应温度处理1小时后取样。取样后待管内冰块溶解后移入三角瓶中，加入去离子水至25mL，于摇床轻摇2小时后用DDS-11A型电导仪测电导R1；沸水浴20分钟后冷却至室温，测电导R2。相对电导率的计算公式为(R1/R2)×100%。每次试验每个株系植株3株，试验重复3次。

冻处理后，烟草叶片膜***受到伤害，相对电导率明显升高。对5周龄幼苗进行-4℃处理3小时后，野生型相对电导率为27.8%，转基因烟草相对电导率分别为15.5%、17.1%、16%，明显低于野生型（图9b）。对叶圆片进行一系列零下低温处理，野生型相对电导率显著高于转基因烟草（图9c）。结果表明转基因烟草比野生型受冻害程度较轻，提高了抗冻性。

四、抗强光鉴定

取温室内生长12周的转基因烟草及野生型植株，成熟展开叶第3位叶，用打孔器取直径为1cm的叶圆片，叶面正面朝上置于盛有蒸馏水的培养皿中，用两支1000W的卤钨灯照光，光源与叶面之间隔一层流动水层以保持叶表温度于室温，叶表面光强为1200μmol·m^-2s^-1。分别于照光0、1.5、3小时取样，测定相对电导率及Fv/Fm。取样后，将5个叶圆片放进装有25mL去离子水的三角瓶中，设3个重复，于摇床轻摇2小时后用DDS-11A型电导仪测电导R1；沸水浴20分钟后冷却至室温，测电导R2；相对电导率的计算公式为(R1/R2)×100%。同时，取样后使用叶夹将叶圆片暗适应20分钟，5个重复，使用FMS-2便携调制式荧光仪（英国Hansatech公司）照射检测光（<0.05μmol·m^-2s^-1）测得初始荧光（initial fluorescence yield，Fo），然后照射饱和脉冲光（3000μmol·m^-2s^-1）测得最大荧光（maximal fluorescence yield，Fm），最大荧光与初始荧光的差值为可变荧光（variable fluorescence，Fv），从而计算出最大光化学效率(maximalphotochemical efficiency，Fv/Fm)，所有测定值由仪器计算。

强光处理后野生型烟草相对电导率急速增加，处理1.5小时升至16%，3小时则升至30.7%；而转基因烟草相对电导率的增加较和缓，处理3小时后分别为17.5%、15.2%和19.2%（图9d）。相应地，野生型烟草Fv/Fm强光处理后急速下降，而转基因烟草Fv/Fm的下降较和缓，强光处理后转基因烟草Fv/Fm显著高于野生型（图9e）。结果表明转基因烟草受强光伤害较野生型轻，抗强光能力提高。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (4)

1.一种黄花苜蓿叶绿体冷响应蛋白MfcpCOR14，其特征在于其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.编码权利要求1所述的黄花苜蓿叶绿体冷响应蛋白MfcpCOR14的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.权利要求1所述的黄花苜蓿叶绿体冷响应蛋白MfcpCOR14在促进植物生长及提高植物抗寒性和抗强光能力中的应用。

4.根据权利要求3所述的黄花苜蓿叶绿体冷响应蛋白MfcpCOR14的应用，其特征在于：该应用包括用本发明获得的MfcpCOR14基因构建植物表达载体；用构建的表达载体转化植物组织；将转化的植物组织培育成转基因植物。

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