CN109321550A - 一种提高烟叶提取物中淀粉酶酶活的提取方法 - Google Patents
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Abstract
本申请属于烟草代谢物技术领域，具体涉及一种提高烟叶提取物中淀粉酶（AMS）酶活提取方法专利申请事宜。该方法针对新鲜烟叶中淀粉酶的提取，具体包括：制备提取液（采用裂解液RIPA、缓冲液NEB或PBS）、烟叶预处理、溶液法提取等步骤。初步测定结果表明，经过相关提取工艺参数优化后，提取液中淀粉酶（AMS）酶活得到了较好提高，可达9.7×10‑4U/μg全蛋白，较好达到了减少杂质蛋白干扰、提升AMS酶含量的目的。同时由于相关提取方法简单快速、耗时较短（仅1.5 h左右），因此使得本申请具有较好的科研价值，可为AMS活性分析及其它相关蛋白分析和研究奠定技术基础。
Description
技术领域
本申请属于烟草代谢物技术领域，具体涉及一种提高烟叶提取物中淀粉酶（AMS）酶活的提取方法专利申请事宜。
背景技术
烟草作为一种较为特殊的经济作物，其产量与品质直接关系到我国国民经济的健康发展。为了研究烟草基因功能，创制新的育种材料，对烟草代谢物进行深入研究和分析显然具有十分重要的意义。
淀粉是烟叶在生长发育过程中积累的主要糖水化合物，在鲜烟叶中含量高达30-40%。烤烟烟叶是我国卷烟产品的一种主要生产原料，由新鲜烟叶烤制加工而成。在烘烤加工过程中，烟叶中大部分淀粉会发生降解，由淀粉酶水解成糖类。而如果烤后烟叶中淀粉降解不充分，就会产生一系列杂气物质，影响烟叶的品质和吃味。另一方面，淀粉降解产物糖含量的高低直接影响烟叶的感官特性，同时还原糖又可以通过美拉德反应产生一系列烟叶香味成分。因此淀粉含量是烟叶质量评价的常规指标之一。由于淀粉含量指标的重要性，以及淀粉酶作为淀粉降解的主要生物酶，对烟叶中淀粉酶（AMS）深入研究和分析，对于植物生理生长研究以及植物新品种、新材料筛选和鉴定都具有重要意义。
现有技术中，植物蛋白（包括生物酶）的提取方法主要有两种：溶液法和沉淀法。其中沉淀法因其提取过程中采用了变性剂，会导致部分蛋白酶结构改变并失去活性，因此沉淀法并不适合烟草叶片全蛋白的提取。而在应用溶液法进行提取时，由于不同蛋白（生物酶）特性不同，因此具体提取所选择的提取液及提取工艺也往往缺乏可借鉴性，往往均需重新设计。而现有技术中尚未见到较好的提取3-羟基-3-甲基-戊二酰辅酶A还原酶（HMGR）提取方法报道。
发明内容
本申请目的在于提供一种提高烟叶提取物中淀粉酶（AMS）酶活提取方法，从而为烟草生长代谢研究奠定一定方法学基础。
本申请所采取的技术方案详述如下。
一种提高烟叶提取物中淀粉酶（AMS）酶活的提取方法，该方法针对新鲜烟叶中淀粉酶（AMS）的提取，具体包括如下步骤：：
（1）制备提取液，具体可采用裂解液RIPA、NEB或PBS；配方组成为：
裂解液RIPA ：Tris-Cl（pH 8.0）、50 mM，EDTA、1mM，SDS、0.1%，NaCl、150 mM，NP-40、1%，PMSF、1 mM；
缓冲液NEB： Hepes（pH 7.5）、20mM，KCl、40 mM，EDTA、1 mM，PMSF、1 mM；
pH 8.0的PBS：NaCl、137 mM，KCl、2.7 mM，Na2HPO4 9.5 mM，NaH2PO4、0.5 mM，PMSF、1mM；
pH7.2的PBS：NaCl、137 mM，KCl、2.7 mM，Na2HPO4 7.2 mM，NaH2PO4、2.8 mM，PMSF、1 mM；
pH 6.0的PBS：NaCl、137 mM，KCl、2.7 mM，Na2HPO4 1.2 mM，NaH2PO4、8.8 mM，PMSF、1mM；
（2）烟叶预处理
将栽培烟草K326（或者NC82）8-12叶期的新鲜烟叶，液氮速冻后，研磨成粉。
（3）溶液法提取
在步骤（2）研磨成粉烟叶样品中加入步骤（1）中制备的提取液（裂解液），震荡混匀后，冰上静置不少于1h；
具体用量方面，研磨成粉烟叶样品100mg，提取液（裂解液）用量为500μl-1mL；
静置完成后，5000~15000rpm离心不少于20min（离心速度具体例如为5000 rpm、9000rpm或13000rpm等），保留上清液，即为含有较高淀粉酶（AMS）酶活的提取液；
进一步地，利用BCA法可对上清液中蛋白浓度进行检测，可利用ELISA法对上清液中AMS的活性进行检测。
现有技术中，针对所提取全蛋白中淀粉酶（AMS）酶活进行分析测定时，由于所提取蛋白杂质较多，因而对于准确酶活测定造成了较大影响。本申请中，针对全蛋白提取方式做了部分优化，以期提高AMS酶活。
初步测定结果表明，经过相关提取工艺参数优化后，提取液中淀粉酶（AMS）酶活得到了较好提高，可达9.7×10-4U/μg全蛋白，较好达到了减少杂质蛋白干扰、提升AMS酶含量的目的。同时由于相关提取方法简单快速、耗时较短（仅1.5 h左右），因此使得本申请具有较好的科研价值，可为AMS活性分析及其它相关蛋白分析和研究奠定技术基础。
附图说明
图1不同提取液获得的AMS活性；
图2不同pH 的PBS获得的AMS活性；
图3 不同提取液比例的AMS活性；
图4 不同烟草品种中PBS获得的AMS活性；
各图中：K326、NEB、RIPA分别表示对应的裂解液，P6、P7、P8分别表示pH=6.0、7.2、8.0的PBS；数字5、13分别表示离心速度为5000、13000；1：5、1：10分别表示提取液比例。
具体实施方式
下面结合实施例对本申请做进一步的解释说明，在介绍具体实施例前，就下述实施例中涉及部分实验材料、实验方法等背景情况简要介绍说明如下。
实验材料：
栽培烟草K326和NC82 ，实验室培育至8-12叶期，采取新鲜烟叶。
实验方法：
1、BCA法检测蛋白浓度时，具体参考如下操作步骤：
（1）取上清液，稀释10倍；根据样品数量，按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B（50:1）配制BCA工作液，充分混匀；
（2）设置空白孔、标准品孔和样品孔，每个样品三次重复，每空加入20μl蛋白提取液，200μL BCA工作液；
（3）把酶标板放在振荡器上振荡30sec，37℃放置30分钟，然后在562nm下酶标仪检测，以蛋白含量（μg）为横坐标，吸光值为纵坐标，绘出标准曲线；
根据所测样品的吸光值，依据标准曲线获得相应的蛋白含量（μg），除以样品稀释液总体积（20μL），乘以样品稀释倍数即为样品实际浓度（单 位：μg/μL）；
2、ELISA法检测酶活性时，参考如下步骤：
（1）室温平衡20min酶活性检测试剂；
（2）设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL；样本孔中加入待测样本50μL，空白孔不加；
除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的检测抗体100μL，用封板膜封住反应孔，37℃水浴锅或恒温箱温育60min；
（3）弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液（350μL），静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次（也可用洗板机洗板）；
每孔加入试剂盒中底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min；
每孔加入终止液50μL，15min内，在450nm波长处测定各孔的OD值；
以所测标准品的OD值为横坐标，标准品的浓度值为纵坐标，绘制标准曲线，并得到直线回归方程，将样品的OD值代入方程，计算出样品的浓度。
实施例
本申请所提供的提高烟叶中淀粉酶（AMS）酶活的提取方法，针对新鲜烟叶中淀粉酶（AMS）的提取，具体步骤简要介绍如下。
（1）制备提取液，具体可采用裂解液RIPA、NEB或PBS；配方组成为：
裂解液RIPA ：Tris-Cl（pH 8.0）、50 mM，EDTA、1mM，SDS、0.1%，NaCl、150 mM，NP-40、1%，PMSF、1 mM；
缓冲液NEB： Hepes（pH 7.5）、20mM，KCl、40 mM，EDTA、1 mM，PMSF、1 mM；
pH 8.0的PBS：NaCl、137 mM，KCl、2.7 mM，Na2HPO4 9.5 mM，NaH2PO4、0.5 mM，PMSF、1mM；
pH7.2的PBS：NaCl、137 mM，KCl、2.7 mM，Na2HPO4 7.2 mM，NaH2PO4、2.8 mM，PMSF、1 mM；
pH 6.0的PBS：NaCl、137 mM，KCl、2.7 mM，Na2HPO4 1.2 mM，NaH2PO4、8.8 mM，PMSF、1mM；
（2）烟叶预处理
栽培烟草K326和NC82 ，实验室培育至8-12叶期，采集新鲜烟叶。液氮速冻后，研磨成粉。
（3）溶液法提取
在步骤（2）研磨成粉烟叶样品中加入步骤（1）中制备的提取液（裂解液），震荡混匀后，冰上静置不少于1h；
具体用量方面，研磨成粉烟叶样品100mg，提取液（裂解液）用量为500μl-1mL（具体为500μl或者1mL）；
静置完成后，5000~15000rpm离心不少于20min（离心速度具体例如为5000 rpm、9000rpm或13000rpm等），保留上清液，即为含有较高淀粉酶（AMS）酶活的提取液；
进一步地，利用BCA法对上清液中蛋白浓度进行检测，利用ELISA法对上清液中AMS的活性进行检测。
对不同提取液、不同pH 的PBS、不同离心速度、不同提取液比例处理后上清液中AMS活性进行检测，结果分别如图1、图2、图3、图4所示。分析可以看出：采用PBS（pH 7.2）RIPA和NEB处理时，低速离心结果相对较好，分析认为，这主要是杂质蛋白之间的相互作用有一定抵消，减弱了对于AMS酶活测定的影响，并且PBS的提取效果更好；在不同pH 的PBS处理时，pH 8.0的PBS提取时AMS活性更高；在不同提取液比例处理时，1：10比例时，AMS活性更高。而对于不同的栽培品种NC82，同样处理方法得到的AMS的活性也较高。
总体而言，就AMS酶活测定或提取而言，采用PBS （pH 8.0）、提取液比例1:10、离心速率5000rpm，处理结果最优，主要原因在于，裂解处理后，杂质蛋白之间的相互作用有一定抵消，减弱了对于AMS酶活测定，而合适pH值也使AMS的活性更好。
Claims (4)
1.一种提高烟叶提取物中淀粉酶酶活的提取方法，其特征在于，该方法针对新鲜烟叶中淀粉酶的提取，具体包括如下步骤：
（1）制备提取液，具体采用裂解液RIPA、NEB或PBS；配方组成为：
裂解液RIPA ：pH 8.0的Tris-Cl、50 mM，EDTA、1mM，SDS、0.1%，NaCl、150 mM，NP-40、1%，PMSF、1 mM；
缓冲液NEB：pH 7.5 的Hepes、20mM，KCl、40 mM，EDTA、1 mM，PMSF、1 mM；
（2）烟叶预处理
将烟草8-12叶期的新鲜烟叶，研磨成粉备用；
（3）溶液法提取
在步骤（2）研磨成粉烟叶样品中加入步骤（1）中制备的提取液，震荡混匀后，冰上静置不少于1h；具体用量方面，研磨成粉烟叶样品100mg，提取液用量为500μl-1mL；
静置完成后，5000~15000rpm离心不少于20min，保留上清液，即为含有较高淀粉酶酶活的提取液。
2.如权利要求1所述提高烟叶提取物中淀粉酶酶活的提取方法，其特征在于，步骤（2）中，所述烟草为K326或者NC82品种。
3.如权利要求2所述提高烟叶提取物中淀粉酶酶活的提取方法，其特征在于，步骤（1）中PBS的pH=8.0、7.2或者6.0，具体组成为：
pH=8.0的PBS：NaCl、137 mM，KCl、2.7 mM，Na2HPO4 9.5 mM，NaH2PO4、0.5 mM，PMSF、1 mM；
pH=7.2的PBS：NaCl、137 mM，KCl、2.7 mM，Na2HPO4 7.2 mM，NaH2PO4、2.8 mM，PMSF、1 mM；
pH=6.0的PBS：NaCl、137 mM，KCl、2.7 mM，Na2HPO4 1.2 mM，NaH2PO4、8.8 mM，PMSF、1 mM。
4.如权利要求3所述提高烟叶提取物中淀粉酶酶活的提取方法，其特征在于，步骤（1）中提取时，采用ph=8.0的PBS；步骤（3）中，提取液用量为1mL，5000 rpm离心20min。
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