CN109321544A - 一种提高烟叶提取物中腐胺n-甲基转移酶的提取方法 - Google Patents
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Abstract
本申请属于烟草代谢物技术领域,具体涉及一种提高烟叶提取物中腐胺N‑甲基转移酶(PMT)酶活提取方法专利申请事宜。该方法针对新鲜烟叶中腐胺N‑甲基转移酶的提取,具体包括:制备提取液(采用裂解液RIPA、缓冲液NEB或PBS)、烟叶预处理、溶液法提取等步骤。初步测定结果表明,经过相关提取工艺参数优化后,提取液中腐胺N‑甲基转移酶(PMT)酶活得到了较好提高,可达9.6×10‑3U/μg全蛋白,较好达到了减少杂质蛋白干扰、提升PMT酶含量的目的。同时由于相关提取方法简单快速、耗时较短(仅1.5 h左右),因此使得本申请具有较好的科研价值,可为PMT活性分析及其它相关蛋白分析和研究奠定技术基础。
Description
技术领域
本申请属于烟草代谢物技术领域,具体涉及一种提高烟叶提取物中腐胺N-甲基转移酶(PMT)酶活提取方法专利申请事宜。
背景技术
烟草作为一种较为特殊的经济作物,其产量与品质直接关系到我国国民经济的健康发展。为了研究烟草基因功能,创制新的育种材料,对烟草代谢物进行深入研究和分析显然具有十分重要的意义。
烟草中的香气物质是烟草内形成的一类次生代谢产物,目前按照致香功能团可分为酸类、醇类、酮类、醛类、酯类、酚类等,其中对烟草香气贡献最大的3 类物质分别为多酚类化合物、萜类化合物以及生物碱。普通烟草栽培品种中主要有烟碱、降烟碱、新烟草碱和假木贼碱4 种生物碱,其中烟碱的含量最高,这些生物碱分别由不同代谢途径生成,腐胺N-甲基转移酶(PMT)被认为是烟碱合成的限速酶,催化二胺腐胺甲基化生成N-甲基腐胺。由于此生物酶的重要作用,对于该酶的深入研究,对于烟草生理生化的深入研究、以及烟草新材料鉴定、新品种培育都具有十分重要的意义。
现有技术中,植物蛋白(包括生物酶)的提取方法主要有两种:溶液法和沉淀法。其中沉淀法因其提取过程中采用了变性剂,会导致部分蛋白酶结构改变并失去活性,因此沉淀法并不适合烟草叶片全蛋白的提取。而在应用溶液法进行提取时,由于不同蛋白(生物酶)特性不同,因此具体提取所选择的提取液及提取工艺也往往缺乏可借鉴性,往往均需重新设计。而现有技术中尚未见到较好的提取腐胺N-甲基转移酶(PMT)提取方法报道。
发明内容
本申请目的在于提供一种提高烟叶提取物中腐胺N-甲基转移酶(PMT)酶活提取方法,从而为烟草生长代谢研究奠定一定方法学基础。
本申请所采取的技术方案详述如下。
一种提高烟叶提取物中腐胺N-甲基转移酶(PMT)酶活的提取方法,该方法针对新鲜烟叶中腐胺N-甲基转移酶(PMT)的提取,具体包括如下步骤::
(1)制备提取液,具体可采用裂解液RIPA 、NEB或PBS;配方组成为:
裂解液RIPA :Tris-Cl(pH 8.0)、50 mM,EDTA、1mM,SDS、0.1%,NaCl、150 mM,NP-40、1%,PMSF、1 mM;
缓冲液NEB: Hepes(pH 7.5)、20mM,KCl、40 mM,EDTA、1 mM,PMSF、1 mM;
pH 8.0的PBS:NaCl、137 mM,KCl、2.7 mM,Na2HPO4 9.5 mM,NaH2PO4、0.5 mM,PMSF、1mM;
pH7.2的PBS:NaCl、137 mM,KCl、2.7 mM,Na2HPO4 7.2 mM,NaH2PO4、2.8 mM,PMSF、1 mM;
pH 6.0的PBS:NaCl、137 mM,KCl、2.7 mM,Na2HPO4 1.2 mM,NaH2PO4、8.8 mM,PMSF、1mM;
(2)烟叶预处理
将栽培烟草K326(或者NC82)8-12叶期的新鲜烟叶,液氮速冻后,研磨成粉。
(3)溶液法提取
在步骤(2)研磨成粉烟叶样品中加入步骤(1)中制备的提取液(裂解液),震荡混匀后,冰上静置不少于1h;
具体用量方面,研磨成粉烟叶样品100mg,提取液(裂解液)用量为500μl-1mL;
静置完成后,5000~15000rpm离心不少于20min(离心速度具体例如为5000 rpm、9000rpm或13000rpm等),保留上清液,即为含有较高腐胺N-甲基转移酶(PMT)酶活的提取液;
进一步地,利用BCA法可对上清液中蛋白浓度进行检测,可利用ELISA法对上清液中PMT的活性进行检测。
现有技术中,针对所提取全蛋白中腐胺N-甲基转移酶(PMT)酶活进行分析测定时,由于所提取蛋白杂质较多,因而对于准确酶活测定造成了较大影响。本申请中,针对全蛋白提取方式做了部分优化,以期提高PMT酶活。
初步测定结果表明,经过相关提取工艺参数优化后,提取液中腐胺N-甲基转移酶(PMT)酶活得到了较好提高,可达9.6×10-3U/μg全蛋白,较好达到了减少杂质蛋白干扰、提升PMT酶含量的目的。同时由于相关提取方法简单快速、耗时较短(仅1.5 h左右),因此使得本申请具有较好的科研价值,可为PMT活性分析及其它相关蛋白分析和研究奠定技术基础。
附图说明
图1 不同提取液不同离心速率获得的PMT活性;
图2不同提取液比例获得的PMT活性;
图3不同品种获得的PMT活性;
各图中:K326、NEB、RIPA分别表示对应的裂解液,P6、P7、P8分别表示pH=6.0、7.2、8.0的PBS,数字5、13分别表示离心速度为5000、13000,1:5、1:10分别表示提取液比例。
具体实施方式
下面结合实施例对本申请做进一步的解释说明,在介绍具体实施例前,就下述实施例中涉及部分实验材料、实验方法等背景情况简要介绍说明如下。
实验材料:
栽培烟草K326和NC82 ,实验室培育至8-12叶期,采取新鲜烟叶。
实验方法:
1、BCA法检测蛋白浓度时,具体参考如下操作步骤:
(1)取上清液,稀释10倍;根据样品数量,按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B(50:1)配制BCA工作液,充分混匀;
(2)设置空白孔、标准品孔和样品孔,每个样品三次重复,每空加入20μl蛋白提取液,200μL BCA工作液;
(3)把酶标板放在振荡器上振荡30sec,37℃放置30分钟,然后在562nm下酶标仪检测,以蛋白含量(μg)为横坐标,吸光值为纵坐标,绘出标准曲线;
根据所测样品的吸光值,依据标准曲线获得相应的蛋白含量(μg),除以样品稀释液总体积(20μL),乘以样品稀释倍数即为样品实际浓度(单 位:μg/μL);
2、ELISA法检测酶活性时,参考如下步骤:
(1)室温平衡20min酶活性检测试剂;
(2)设置标准品孔和样本孔,标准品孔各加不同浓度的标准品50μL;样本孔中加入待测样本50μL,空白孔不加;
除空白孔外,标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的检测抗体100μL,用封板膜封住反应孔,37℃水浴锅或恒温箱温育60min;
(3)弃去液体,吸水纸上拍干,每孔加满洗涤液(350μL),静置1min,甩去洗涤液,吸水纸上拍干,如此重复洗板5次(也可用洗板机洗板);
每孔加入试剂盒中底物A、B各50μL,37℃避光孵育15min;
每孔加入终止液50μL,15min内,在450nm波长处测定各孔的OD值;
以所测标准品的OD值为横坐标,标准品的浓度值为纵坐标,绘制标准曲线,并得到直线回归方程,将样品的OD值代入方程,计算出样品的浓度。
实施例
本申请所提供的提高烟叶提取物中腐胺N-甲基转移酶(PMT)酶活的提取方法,针对新鲜烟叶中腐胺N-甲基转移酶(PMT)的提取,具体步骤简要介绍如下。
(1)制备提取液,具体可采用裂解液RIPA、NEB或PBS;配方组成为:
裂解液RIPA :Tris-Cl(pH 8.0)、50 mM,EDTA、1mM,SDS、0.1%,NaCl、150 mM,NP-40、1%,PMSF、1 mM;
缓冲液NEB: Hepes(pH 7.5)、20mM,KCl、40 mM,EDTA、1 mM,PMSF、1 mM;
pH 8.0的PBS:NaCl、137 mM,KCl、2.7 mM,Na2HPO4 9.5 mM,NaH2PO4、0.5 mM,PMSF、1mM;
pH7.2的PBS:NaCl、137 mM,KCl、2.7 mM,Na2HPO4 7.2 mM,NaH2PO4、2.8 mM,PMSF、1 mM;
pH 6.0的PBS:NaCl、137 mM,KCl、2.7 mM,Na2HPO4 1.2 mM,NaH2PO4、8.8 mM,PMSF、1mM;
(2)烟叶预处理
栽培烟草K326和NC82 ,实验室培育至8-12叶期,采集新鲜烟叶。液氮速冻后,研磨成粉。
(3)溶液法提取
在步骤(2)研磨成粉烟叶样品中加入步骤(1)中制备的提取液(裂解液),震荡混匀后,冰上静置不少于1h;
具体用量方面,研磨成粉烟叶样品100mg,提取液(裂解液)用量为500μl-1mL(具体为500μl或者1mL);
静置完成后,5000~15000rpm离心不少于20min(离心速度具体例如为5000 rpm、9000rpm或13000rpm等),保留上清液,即为含有较高腐胺N-甲基转移酶(PMT)酶活的提取液;
进一步地,利用BCA法对上清液中蛋白浓度进行检测,利用ELISA法对上清液中PMT的活性进行检测。
对不同提取液、不同pH 的PBS、不同离心速度、不同提取液比例处理后上清液中PMT活性进行检测,结果分别如图1、图2、图3所示。分析可以看出:采用PBS(pH 8.0)处理时,高速离心参数(13000 rpm)下获得酶活效果显然较高,也即高速离心情况下可以较好去除杂质蛋白对于酶活测定影响;在不同pH 的PBS处理时,pH 8.0的PBS提取时PMT活性更高;在不同提取液比例处理时,1:10比例时,PMT活性更高。而对于不同的栽培品种NC82,同样处理方法得到的PMT的活性也较高。
总体而言,就PMT酶活测定或提取而言,采用PBS (pH 8.0)、提取液比例1:10、离心速率13000rpm,处理结果最优,主要原因在于,裂解处理后,高速离心情况下可以较好去除杂质蛋白对于酶活测定影响,而合适pH值也使PMT的活性更好。
Claims (4)
1.一种提高烟叶提取物中腐胺N-甲基转移酶酶活的提取方法,其特征在于,该方法针对新鲜烟叶中腐胺N-甲基转移酶的提取,具体包括如下步骤:
(1)制备提取液,具体采用裂解液RIPA 、NEB或PBS;配方组成为:
裂解液RIPA:pH 8.0的Tris-Cl、50 mM,EDTA、1mM,SDS、0.1%,NaCl、150 mM,NP-40、1%,PMSF、1 mM;
缓冲液NEB: pH 7.5的Hepes、20mM,KCl、40 mM,EDTA、1 mM,PMSF、1 mM;
(2)烟叶预处理
将烟草8-12叶期的新鲜烟叶,研磨成粉备用;
(3)溶液法提取
在步骤(2)研磨成粉烟叶样品中加入步骤(1)中制备的提取液,震荡混匀后,冰上静置不少于1h;具体用量方面,研磨成粉烟叶样品100mg,提取液用量为500μl-1mL;
静置完成后,5000~15000rpm离心不少于20min,保留上清液,即为含有较高腐胺N-甲基转移酶酶活的提取液。
2.如权利要求1所述提高烟叶提取物中腐胺N-甲基转移酶酶活的提取方法,其特征在于,所述栽培烟草为K326或者NC82品种。
3.如权利要求2所述提高烟叶提取物中腐胺N-甲基转移酶酶活的提取方法,其特征在于,步骤(1)中PBS的pH=8.0、7.2或者6.0,具体组成为:
pH=8.0的PBS:NaCl、137 mM,KCl、2.7 mM,Na2HPO4 9.5 mM,NaH2PO4、0.5 mM,PMSF、1 mM;
pH=7.2的PBS:NaCl、137 mM,KCl、2.7 mM,Na2HPO4 7.2 mM,NaH2PO4、2.8 mM,PMSF、1 mM;
pH=6.0的PBS:NaCl、137 mM,KCl、2.7 mM,Na2HPO4 1.2 mM,NaH2PO4、8.8 mM,PMSF、1 mM。
4.如权利要求3所述提高烟叶提取物中腐胺N-甲基转移酶酶活的提取方法,其特征在于,步骤(1)中提取时,采用ph=8.0的PBS;步骤(3)中,提取液用量为1mL,13000 rpm离心20min。
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