CN102417911B - 过表达甘蓝型油菜BnLAS基因提高植物抗旱性 - Google Patents

Abstract

本发明属于植物基因工程领域，具体涉及一种具有抗旱性能的甘蓝型油菜BnLAS基因的克隆及利用该基因在拟南芥中过表达，获得抗旱高的拟南芥转化植株。方法是，利用如SEQ ID NO：2和3所示的引物扩增甘蓝型油菜基因组DNA片段，确定该扩增的DNA片段序列与拟南芥中LAS基因为同源性序列，命名为BnLAS，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示。通过提取甘蓝型油菜不同组织部位的RNA，采用RT-PCR进行表达量的检测，发现该基因在甘蓝型油菜中存在时刻表达差异。利用BnLAS基因与CaMV35S启动子构建了过表达载体，通过农杆菌介导的遗传转化方法将该过表达载体转化野生型拟南芥，RT-PCR技术鉴定BnLAS基因阳性转化植株中BnLAS基因存在过量表达，结合田间形态鉴定获得了耐旱的拟南芥转化植株。

Description

过表达甘蓝型油菜BnLAS基因提高植物抗旱性

技术领域

本发明属于植物分子育种技术领域，具体涉及甘蓝型油菜BnLAS基因的克隆及利用该基因在植物中过表达，引起过表达植物抗旱性提高，从而培育抗旱性显著增加的植物。

背景技术

干旱对植物生长发育的危害主要表现在四个方面：1)植物体内水分的缺失降低植物代谢活动从而抑制植物的生长发育；2)干旱条件下由于气孔关闭的影响，植物光合作用效率下降甚至发生光抑制作用；3)干旱条件下植物呼吸作用增强，从而加快植物体内物质的分解；4)干旱胁迫下植物体内自由基的产生和清除体系平衡被打破，从而加剧过氧化作用对植物造成氧化伤害。据统计，世界陆地面积的三分之一为干旱或半干旱地区，我国有二分之一的陆地面积为干旱半干旱地区。在人口不断增加、耕地面积日趋减少以及淡水资源严重匮缺的条件下，有效减少淡水资源消耗和提高农业生产效率的矛盾，是国内外迫切需要解决的重大课题之一。

在干旱条件下，植物可以通过自身形态结构改变维持植物的正常生长发育，如株型变小，根系发达，气孔下陷，气孔关闭，蒸腾面积减少等。另外，植物也可以通过细胞内渗透势的变化增强对外界干旱胁迫忍耐的能力，如产生脯氨酸和甜菜碱、渗调素等具有提高植物渗透调节能力的物质。在适应干旱胁迫过程中，植物体内分子水平上干旱应答体系是多基因控制的。这些基因主要表现在两个方面：一类是在干旱胁迫下诱导表达量变化的基因，如渗透调节基因(P5CS)、Lea蛋白、水通道蛋白(PM28A)、抗氧化损伤***等；另一类是在调节抗旱功能基因表达的转录因子如DREB。当前植物抗旱性的分子生物学机理研究不断深入，转基因技术的日益成熟，为植物抗旱性育种创造了一条新的途径。

GRAS蛋白家族是一类广泛存在于高等植物中特有的转录因子，该家族基因主要特点是在蛋白水平上具有一个不保守的N端，VHIID模体及两侧的亮氨酸重复序列，PFYRE和SAW模体(Pysh LD，Wysocka-Diller J，Camilleri C，Bouchez D，Benfey PN(1999)The GRAS gene family in Arabidopsis：sequencecharacterization and basic expression analysis of the SCARECROW-LIKE genes.Plant J 18：111-119；Bolle C(2004)The role of GRAS proteins in plant signal transduction and development.Planta，218：683-692)目前在拟南芥基因组已发现有33个GRAS成员(TAIR，http://www.arabidopsis.org；Lee et al.2008)。

GRAS家族虽然在拟南芥中目前已发现了33个成员，但只有三分之一的成员功能通过突变体的研究获知其功能。在这些成员研究中发现GRAS蛋白在不同的细胞水平上涉及到根的发育，分生组织维持和GA信号转导等重要功能。LAS基因是GRAS转录因子家族成员，该基因只具有一个外显子结构。该基因在拟南芥、甘蓝型油菜等芸薹植物中高度保守，属内不同物种的LAS基因ORF区域具有75-90％的同源性。

发明内容

本发明的目的是过量表达甘蓝型油菜中的BnLAS基因提高植物抗旱性，从而培育具有良好抗旱性，并能稳定遗传的植物。

本发明通过以下技术方案实现：

本发明首先克隆了甘蓝型油菜中的LAS同源基因，申请人将其命名为BnLAS基因，通过在CaMV35S启动子控制下在拟南芥中过量表达BnLAS基因，导致植物抗旱性增强。

申请人通过分离和克隆方法获得一种的来源于甘蓝型油菜具有抗旱性的BnLAS基因，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示。

其中克隆所述BnLAS基因的特异引物为YM113和YM114，其核苷酸序列如下所示(见序列表SEQ IDNO：2，3)：

YM113：5′-CAGTGTCGACAACAATGCTTACTTCCTTCAAA-3′；

YM114：5′-CAGTGAGCTCTCATTTCCACGACGAAAC-3′。

申请人建立了一种利用BnLAS基因提高植物拟南芥抗旱性的方法，其包括如下步骤：

1)设计权利要求1所述的引物，从甘蓝型油菜基因组中克隆具有有抗旱性的BnLAS基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；

2)构建BnLAS基因过量表达载体，并将该载体转化到农杆菌中；

3)通过农杆菌介导的方法转化拟南芥，筛选得到BnLAS基因过表达转化植株；

4)采用分子检测方法对步骤3)的过表达转化植株进行抗旱性鉴定；

5)进一步在田间鉴定过表达转化植株的叶片表面蜡质层、叶绿素含量及叶片结构。

4、权利要求1所述的基因在提高植物抗旱性中的应用。

5、权利要求2所述的引物在提高植物抗旱性中的应用。

6、权利要求1所述的基因在芸薹属GRAS基因家族成员提高植物抗旱性中的应用。

更详细的技术方案如下所述：

1、BnLAS基因的克隆：

根据拟南芥中LAS序列(http://www.arabidopsis.org/servlets/TairObject？type＝gene&id＝431571)设计引物在甘蓝型油菜华双5号(该品种为中国公开推广的甘蓝型油菜品种)中进行PCR，扩增结果进行测序后，利用已知序列设计TAIL-PCR(Liu YG，Misukawa N，Oosumi T and Whittier R F.Efficient isolation andmapping of Arabidopsis thaliana T-DNA insertjunctions by thermal asymmetric interlaced PCR.1995.The PlantJournal 8：457-463.)引物对该已知序列的未知侧翼序列进行分离。将以上获得序列拼接后通过生物信息学确认后为一个完整的开放性阅读框。进行BLAST(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)分析后确定该序列与拟南芥中LAS基因为同源性序列，根据其来源分别将甘蓝型油菜的LAS基因同源性基因命名为BnLAS基因。

2、BnLAS基因在甘蓝型油菜中表达验证：

为了进一步验证BnLAS基因，通过提取甘蓝型油菜品种华双5号不同组织部位的RNA通过RT-PCR进行表达量的检测。

3、过表达载体的构建：

将BnLAS基因两端外加酶切接头连接至PGEM-T载体(购自Promega公司)中，通过双酶切，连接pBI121载体(购自Clontech公司)，通过CaCl₂的化学方法转化至大肠杆菌中。提取大肠杆菌中阳性克隆质粒，将其通过化学冷激方法(参照J.萨姆布鲁克，EF弗里奇，T曼尼阿蒂斯著，黄培堂，王嘉玺等译，分子克隆实验指南(第三版)，科学出版社，2002版)转化至农杆菌GV3101菌系中。

4、35S::BnLAS植物表达载体的转化：

将构建好的过表达载体的农杆菌菌液采用真空侵染的方式转化正在花期的拟南芥植物花序。待果实成熟后在1/2MS培养基中进行抗性分离，有抗性植株转移到无菌的常规报道的水稻营养土中(含有水稻生长的基本营养土，如加有常规的氮肥、磷肥和钾肥以及菜园的土，对其他营养无特殊要求)。通过PCR技术和RT-PCR技术鉴定该基因在获得阳性转化植株存在和过量表达。

5、过表达植株抗旱性的鉴定：

将上述步骤4获得阳性植株通过离体叶片失水率的测定和在温室土培生长条件下抗旱鉴定，确定该植株具有较野生型拟南芥植株明显的抗旱表型。

6、抗旱性拟南芥转化植株的原因分析

通过导入甘蓝型油菜BnLAS外源基因获得具有良好的抗旱性的拟南芥转化植株，为进一步分析本发明所获得的过表达植株产生抗旱性的原因，申请人进行了过表达BnLAS基因植株叶片颜色观察、叶绿素含量测定、叶片表面的蜡质含量及叶片结构观测。

更详尽的方案如《具体实施方式》所述。

本发明的积极效果

本发明通过导入甘蓝型油菜BnLAS外源基因，导致拟南芥在缺水处理下生存率提高。其抗旱机理是转化植株气孔开度的减小、叶片表面蜡质层增加，从而导致植株叶片表面水分散失减缓，最终达到抗旱的效果；本发明为提高植物抗旱性提供了一种新的思路及可行方法，在作物的抗旱性育种方面有广泛的应用前景。

附图说明

序列表SEQ ID NO：1是本发明克隆的BnLAS基因，序列全长为1326bp。

序列表SEQ ID NO：2和3是本发明克隆BnLAS基因的一对引物，分别命名为引物YM113和引物YM114。

图1：是本发明的技术流程图。

图2：是BnLAS基因在甘蓝型油菜中不同组织表达分析图。

图3：是本发明的其中一个实施例的植物真核表达载体pBnLAS构建。A为pBI121载体示意图；B为pBnLAS载体示意图。

图4：是转基因植株BnLAS过量表达检测结果，泳道1为野生型拟南芥植株，2-5为不同转基因株系，6为阴性对照。图中：BnLAS扩增引物对为HY225/HY226(引物序列见表3)；BnActin2为内参，扩增引物对为Actin2F/Actin2R(引物序列见表3)。

图5：是过表达拟南芥植株与野生型拟南芥叶绿素含量比较

图中，A、B分别代表野生型拟南芥WT(A)和过表达拟南芥植株OL18(B)在1/2MS培养基上生长16天的幼苗。C为野生型拟南芥WT和过表达拟南芥植株OL14、OL18、OL10、OL50叶绿素含量比较，星号(**)表示过表达拟南芥植株叶绿素含量同野生型拟南芥WT比较差异显著(t测验，在P＝0.01水平，n＝5)。

图6：转基因植株(OL14和OL18)和野生型植株离体叶片失水失水速率比较。A为3小时和6小时叶片离体失水图片，左至右依次为野生型植株对照、过表达植株家系OL14、过表达植株家系OL18。B为叶片离体失水速率曲线图，*(OL14)或#(OL18)和**或##分别表示转基因植株同野生型在P＜0.05和P＜0.01水平下t测验的差异显著。

图7是过表达拟南芥植株与野生型拟南芥植株抗旱性比较。图中：(A)野在植株生长30天时，保持每盆生物量相等后，灌满水再进行抗旱处理，下图为抗旱后15天图片。实验进行三次重复。WT：野生型拟南芥，OL18：转基因植株，las：突变体植株。(B)旱胁迫恢复后的转基因植株和野生型植株。植株生长30天后灌满水进行旱胁迫处理。植株复水5天后进行计数，实验重复3次，每个重复15-20个植株。(C)野生型，过表达植株(OL14，OL18)和las突变体复水后存活率。误差线为标准偏差。*和**分别表示转基因同野生型植株t测验在P＜0.05和P＜0.01水平下差异显著。

图8：是SEM和光学显微镜下野生型拟南芥和过表达家系OL18的背轴面气孔形态及分布。同野生型植株(A)比较，过表达家系OL18(B)的表皮细胞变小及关闭气孔数目增加。(C)相同条件下野生型植株和过表达植株OL18新鲜叶片和固定叶片单位面积总气孔数和开放气孔数目计算。误差线为标准误差，**表示转基因同野生型植株通过t测验P＜0.01水平下的差异显著。(D)过表达植株OL18和野生型植株固定叶片和新鲜叶片气孔开度。误差线为标准误差，**表示过表达植株同野生型植株通过t测验差异显著(P＜0.01)。

图9：过表达BnLAS基因拟南芥植株叶片表面蜡质层增加和通过叶绿素浸出表明叶片表皮渗透性改变。同野生型拟南芥叶片表面(A)相比，过表达植株OL18(B)表皮蜡质含量上升。(C)野生型植株和过表达植株OL14，OL18莲座叶叶绿素浸出分析。数据来源于三个重复试验。误差线表示标准误差。*(OL14)或#(OL18)和**或##分别表示过表达植株同野生型t测验在P＜0.05和P＜0.01水平下差异显著。

具体实施方式

实施例1甘蓝型油菜BnLAS基因分离

BnLAS基因的克隆：在本实施例中，根据拟南芥LAS基因ORF两端的核苷酸序列设计引物YM113，和引物YM114(该引物序列见说明书表1和序列表SEQ ID NO：2和3)在甘蓝型油菜华双5号中进行PCR扩增，反应体系100μl，反应体系如下：1×PCR缓冲液(含MgCl₂，购自MBI Fermentas，Lithuania公司)，200μM dNTPs，1U Pfu聚合酶，0.25μM引物(引物为上海生工生物工程有限公司合成，其余三者购自MBIFermentas，Lithuania公司)，加双蒸水至100μl。PCR扩增仪为PTC-100(购自Bio-Rad公司)。反应条件如下：94℃3min；94℃30s，56℃45s，72℃1min20s，29个循环；72℃4min。将反应产物进行浓缩，操作如下：加1/9体积3M醋酸钠后加2倍体积无水乙醇后置-20℃放置30min，离心机(购自eppendorf公司)高速离心10min倒去上清，吹干10min加50μl双蒸水。进行末端加A，反应体系如下：1×PCR缓冲液，1.5mMMgCl₂，200μM dATP，加PCR产物至50μl。反应条件如下：94℃3min，72℃30min。电泳完毕后采用UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒(上海生工生物工程有限公司)进行切胶回收。回收程序按照试剂盒说明：用刀片切出目标片段放入1.5ml的离心管，加入结合缓冲液，置于55℃水浴中加热10min，每2min混匀一次；胶完全融化后转移至套在收集管内的UNIQ-10柱中，室温放置2min；8,000rpm，离心1min；倒掉收集管中的废液，加入500μl冲洗液，8,000rpm室温离心1min，将该步骤重复一次；倒掉收集管中的废液，将UNIQ-10柱放入同一个收集管中，12,000rpm离心15sec；将UNIQ-10柱放入一根新的1.5ml的离心管中，在柱子膜中央加30μl的双蒸水，室温放置5min；12,000rpm离心1min，离心管中的液体即为回收的DNA片段。回收的目标片段连接在pGEM

-T载体(购自Promega公司)。操作程序按试剂盒提供的方法：在0.5ml的离心管中建立如下连接反应体系：2×快速连接缓冲液(购自MBI Fermentas，Lithuania公司)，2.5μl；pGEM

-T载体(50ng/μl)，0.5μl；T4 DNA连接酶(3U/μl)0.5μl；PCR回收产物1.5μl(T4 DNA连接酶和2×快速连接缓冲液均购自MBI Fermentas，Lithuania公司)。加入完成以上成分后轻弹动混匀离心后，置于4℃过夜连接。然后将连接产物转化至大肠杆菌：转化方法采用CaCl₂法(参照J.萨姆布鲁克，FF弗里奇，T曼尼阿蒂斯著，黄培堂，王嘉玺等译，分子克隆实验指南(第三版)，科学出版社，2002版)，步骤如下：-70℃冰箱中取出制备好的DH5αCaCl₂感受态细胞放在冰上5min待它解冻；取2μl连接反应液和50μl感受态细胞分别加入1.5ml无菌离心管，用手指轻弹混匀，放在冰上30min；在42℃水浴中热激90s，取出冰上放置2-3min；加400μl的LB液体培养基在37℃振荡培养1h(30-50rpm/min)；吸取振荡培养后的转化液200μl涂在无菌的含氨苄霉素抗性的LB固体培养基上，在37℃放置16-24hrs；挑选阳性克隆至10μl 0.02N NaOH放置10min后进行PCR检测，将检测为阳性的克隆挑置5ml含100mg/L氨苄霉素抗性的LB液体培养基在37℃摇床进行振荡(150rpm)培养12-18hrs培养；将菌液同50％无菌甘油体积比为1∶1混合保存到1.5ml无菌离心管中，分别进行测序。通过测序结果表明该基因长度为1326bp(参见序列表SEQ ID NO：1)具备一个完整的ORF阅读框，含有441个氨基酸序列。该基因同拟南芥的LAS(At1g55580)基因比对表明同源性为96.6％，故将该基因片段命名为BnLAS基因。

表1本发明中用于克隆甘蓝型油菜BnLAS基因所用引物序列表

为了验证获得的BnLAS基因两端序列氨基酸水平没有发生改变及该片段为完整基因片段。进行TAIL-PCP技术(Liu YG，Mitsukawa N，Oosumi T，Whittier RF.Efficient isolation and mapping ofArabidopsis thaliana T-DNA insert junctions by thermal asymmetric interlaced PCR.1995.Plant J8：457-463)对BnLAS两端的序列进行侧翼分离。在BnLAS基因的5‘端设计引物(MGp01，MGp02，MGp03，引物序列见表1)和3’端设计引物(MGp04，MGp05，MGp06，引物序列见表1)。TAIL-PCR步骤如下第一次反应体系如下：1×PCR缓冲液(购自MBI Fermentas，Lithuania公司)，1.5mM MgCl₂，200μM dNTPs，0.2μM引物sp1(MGp01或MGp04，引物序列见表1)，2μM兼并性引物(A，A2，A3，引物序列见表1)，0.75U聚合酶，20ng DNA。于PCR扩增仪(购自Bio-Rad公司)中进行反应，反应条件如表2中第一次反应。反应结束后取2μl反应产物稀释50倍，取1μl作为第二次的PCR模板。第二次反应体系如下：1×PCR缓冲液(购自MBI Fermentas，Lithuania公司)，1.5mM MgCl₂，200μM dNTPs，0.2μM引物MGp02或MGp05(引物序列见表1)，1.5-2μM兼并性引物(A，A2，A3，引物序列见表1)，0.75U聚合酶，1μl第一轮PCR稀释产物。反应程序如表2中第二次反应。取第二轮扩增产物2μl加98μl双蒸水稀释，-20℃保存或用于下一轮反应。第三次反应体系同第二次反应体系，引物分别为MGp03或MGp06(引物序列见表1)。程序同表2第三次反应。将BnLAS基因5’端兼并性引物A1第三轮扩增产物和A2的第二轮扩增产物，及BnLAS基因3’端A3第三轮扩增产物进行测序(测序由北京华大中生科技有限公司完成)。确认YM113，YM114扩增序列即为该基因序列的完整ORF序列，且两端氨基酸序列并没发生任何变异。将该序列进一步通过BLAST分析，得知该候选基因在DNA水平上同LAS基因的同源性达到90.0％，蛋白质水平上同LAS基因的同源性一致性达到87.8％和相似性达到96.8％。即该基因为LAS的同源性基因，申请人将其命名为BnLAS。

表2本发明采用的TAIL-PCR反应程序

实施例2BnLAS基因组织特异性表达分析

甘蓝型油菜总RNA提取采用Trizol试剂提取(试剂购自Invitrogen公司)，提取程序按照该试剂的说明书进行，具体步骤如下：甘蓝型油菜根，茎，叶，花，花蕾和茎顶端组织剪取后迅速固定在液氮中；取出100mg材料在预冷研钵中用液氮快速磨碎；磨碎后材料迅速加如到含1ml Trizol的1.5ml离心管中剧烈震荡均匀，室温放置5min；加入0.2ml氯仿，振荡15s；2,000×g离心10min；取500-600μl上清液到新的无RNA酶1.5ml离心管中；加等量体积无RNA酶的异丙醇，上下颠倒数次，冰上静置10-30min；12,000×g离心10min；倒掉上清，此时RNA可见；加1ml 75％无RNA酶乙醇，冲洗后倒掉，吹干；加30-50μl0.05％DEPC处理双蒸水溶解。RNA检测后进行RT-PCR反应，该反应借助一个商业试剂盒完成(该试剂盒购自Fermentas公司，MBI)，操作程序按照试剂盒的说明书进行。具体步骤如下：将以下成分加入到0.5ml无RNA酶离心管中，10ng-5μg总RNA，1μl(dT)₁₈引物(0.5μg/μl)，DEPC处理双蒸水定容至12μg；将以上成分混匀后短暂离心；放在PTC-100PCR扩增仪(购自Bio-Rad公司)70℃反应5min，取出冰上冷却，离心；在离心管中继续加入以下成分：4μl 5×缓冲液，1μl RNA酶抑制剂(20U/μl)，2μl 10mM dNTP，混匀后离心；接种在37℃5min；加入1μl RevertAid^TM H Minus M-MuLV反转录酶(200U/μl)；将混合物接种至42℃反应60min；70℃反应10min终止反应；-20℃保存或用与PCR检测。使用HY225，HY226引物(引物序列见表3)进行，PCR反应条件如下：94℃3min；94℃30s，56℃45s，72℃30s，31个循环；72℃4min。检测结果表明，BnLAS基因在甘蓝型油菜的根部表达最强，其次花蕾和茎顶端，茎有微弱表达，叶片没有表达。

表3本发明中甘蓝型油菜基因表达和转基因植株检测引物序列表

引物名称        引物序列(5′-3′)

HY225           GAAGATGCCACCGAGAA

HY226           AGTGTTTTCAGACAAGCC

Actin2F         AGCGCTGAGGCTGATGATATTCAAC

Actin2R         TCTAGAAACATTTTCTGTGAACGATTC

NPT3            GAGGCTATTCGGCTATGACTG

NPT4            ATCGGGAGCGGCGATACCGTA

YM14            AAGACCGGCAACAGGATTCA

实施例3植物表达载体的构建及拟南芥遗传转化

1.植物表达载体的构建

将实施例1中将包含BnLAS基因的pGEM

-T载体质粒pV5载体和pBI121载体(购自Clontech公司)分别进行SacⅠ和SalⅠ双酶切(载体详情见图3所示)，酶切反应体系如下：1×Tango缓冲液，1U SacⅠ内切酶，1U SalⅠ内切酶(均购自MBI Fermentas，Lithuania公司)，约2μg DNA，加双蒸水定容至50μl。混匀离心后37℃恒温4h，切胶回收。将回收的BnLAS基因片段连接至pBI21载体反应体系如下：10×T4DNAl连接缓冲液1μl，酶切pBI121载体DNA 5μl，BnLAS基因片段3μl，T4 DNA连接酶(5U/μl)1μl，总体积为10μl(10×T4 DNA连接酶缓冲液和T4 DNA连接酶均购自MBI Fermentas，Lithuania公司)。混合均匀后4℃连接过夜后连接产物转化大肠杆菌菌株DH5α。在含有50μg/ml卡那霉素的LB固体平板中筛选阳性克隆，抽提质粒进行酶切及PCR鉴定(见实施例1)，测序确定没有读码框突变，获得含有***目的片段的重组克隆，将该载体命名为pBnLAS。应用冻融法(参照J.萨姆布鲁克，EF弗里奇，T曼尼阿蒂斯著，黄培堂，王嘉玺等译，分子克隆实验指南(第三版)，科学出版社，2002版)将所述的载体pBnLAS导入到农杆菌GV3101中。转化至GV3101具体步骤如下：取冰上融化的GV3101感受态细胞50μl和构建好的载体质粒分别加入1.5ml无菌离心管中，移液器轻轻吸打混匀；冰上放置30min；液氮中速冻成固体取出37℃水浴放置4min；加1ml液体LB混匀后28℃130-150rpm摇动2hrs；离心菌液沉淀至管底，倒掉上清底部约留50-100μl，混合菌液；铺LB(含庆大霉素25μg/ml和卡那霉素50μg/ml)吹干后28℃防2-3天；挑取菌斑进行PCR检测，阳性克隆进行摇菌分装-70℃保存或直接用于植物转化。

2.拟南芥的遗传转化

将上述构建的pBnLAS载体转化至农杆菌GV3101后，采用的真空转化方法(Clough SJ and BentAF.Floral dip：a simplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana.1998.Plant J 16：735-743)转化到野生型拟南芥植株中，具体步骤如下：挑取平板上的单克隆菌斑到6mlLB(含庆大霉素25μg/ml和卡那霉素50μg/ml)，28℃，250rpm过夜；将摇混菌液1ml加入到250ml含25μg/ml庆大霉素和50μg/ml卡那霉素抗性的LB液体培养基中，振荡过夜OD600达到1.2-1.4之间；取出菌液至250ml离心瓶，调节平衡后Beckman大型离心机(购自Beckman公司)6000rpm离心10min；小心倒掉上清后，加入少量1/2MS液体培养基将菌液混合均匀，加1/2MS液体培养基至400ml，转化前加0.01％silwet-77(一种表面活性剂，购自美国GE公司)；将培养的含pBnLAS载体的菌液倒入盆中，将抽薹开花的拟南芥植株倒立盆中抽真空4min；将转化过的拟南芥植株暗培养24h后放入正常条件下生长，收取果实做下步分析。

3.转化植株抗性筛选

转化植株收取果实后晾干进行阳性苗筛选，步骤如下：将转化种子分到螺旋口1.5ml离心管中，加1ml95％乙醇灭菌1min；倒掉乙醇，加1ml 1/284消毒液，灭菌10min；6000rpm离心10s，移液器吸取上清，加无菌水洗3min，重复两次；加入1ml 0.01％琼脂糖悬浮种子；将种子平铺到1/2MS固体培养基(含卡那霉素50μg/ml，Timtin 100μg/ml，蔗糖0.75％)，超净工作台吹干，封口膜密封后于光照培养室中生长；待植株生长2-3周后，即可区分有抗性的苗子(有抗性苗子为绿色且能正常生长；无抗性苗子变成黄色不能正常生长)，将具有抗性植株转入到土中生长。

4、转化植株阳性分子生物学检测

获得的转化拟南芥植株进行PCR阳性鉴定，NPT3/NPT4(该引物序列见表3)检测载体抗性标记，YM113/YM14(引物序列见表1和3)检测***BnLAS基因片段完整性。具体程序如下：(1)拟南芥的转化植株的总DNA提取采用Edwards法提取(Edwards K，Johnstone C and Thompson C.A simple and rapidmethod for the preparation of plant genomic DNA for PCR analysis.1991.Nucleic Acids Research，19：1349-1350)，具体步骤如下：取幼嫩拟南芥转化植株的叶片(叶尖约4mm×4mm大小)，加400μl Edwards缓冲液磨碎样品，室温放置1小时；13,000rpm离心1min，取300μl上清至新的离心管中，加等体积异丙醇，冰上放10-20min；13,000rpm离心5min，倒上清，沥干；加50μl TE溶解，-20℃保存或直接用于PCR反应。(2)PCR反应体系：1×PCR缓冲液(购自MBI Fermentas，Lithuania公司)，1.5mM MgCl₂，200μM dNTPs，1U Taq聚合酶，0.25μM引物(引物为上海生工生物工程有限公司合成，其余三者购自MBI Fermentas，Lithuania公司)，加双蒸水至20μl。反应于PTC-100扩增仪(Bio-Rad)中进行，抗性标记检测PCR反应程序如下：94℃3min；94℃30s，58℃45s，72℃30s，30个循环；72℃4min。BnLAS基因片度完整性PCR反应程序如下：94℃3min；94℃30s，56℃45s，72℃1min20sec，30个循环；72℃4min。PCR扩增完成后扩增产物在水平电泳槽(北京六一仪器公司生产)上，使用1×TAE缓冲液，电压3V/cm，电泳30min左右，0.8％琼脂糖凝胶(含EB)电泳分离，利用GeneRuler^TM DNA Marker(MBI Fermentas，Lithuania公司)估算扩增产物大小。电泳完毕，于凝胶成像***(UVP)拍照保存，记录结果。

过表达植株外源基因表达检测：因为T0代植株大多表现型比较一致，表现为植株生长速度延缓、株型变小、叶色变深等。选择一些有代表性阳性植株进行RNA水平上的检测。T1代植株，取其叶片100mg，使用Trizol(Invitrogen，USA)进行RNA提取，试验方法参照试剂说明书。Actin2F/Actin2FR作为内标基因Action2引物(引物序列见表3)，HY225/HY226(引物序列见表3)作为外源基因BnLAS特异性引物进行表达检测(附图4)。结果显示转基因植株中，外源基因表达量显著上升。

实施例4转基因拟南芥植株叶绿素含量分析

拟南芥过量表达BnLAS植株家系OL10，OL14，OL18和OL50及野生型植株(对照)叶绿素提取的方法参考Lichtenthaler(Lichtenthaler HK.Chlorophylls and carotenoids：pigments of photosyntheticbiomembranes.1987.Methods Enzymol 148：350-382)和Laby et al(Laby RJ，Kincaid MS，Kim D，Gibson SIThe Arabidopsis sugar-insensitive mutants sis4 and sis5 are defective in abscisic acid synthesis and response.2000.Plant J 23：587-596)。步骤如下：将拟南芥种子灭菌后点播至1/2MS固体培养基下，置于温室16小时光照条件下生长20天；将培养皿中野生型拟南芥植物，转基因植株(OL14，OL18，OL10，OL50四个转基因系)分别按照3个单株为一个组合在天平下进行称重，计数；每个组合分别做5个重复浸入到含4ml 95％乙醇的10ml离心管中；将植株在80℃烘箱暗光下处理2-3小时，到处含叶绿素的乙醇；再加4ml 95％乙醇，重新置于至80℃烘箱暗光下处理1小时，目测拟南芥叶片无绿色叶绿素。将两次的乙醇混合均匀，每个离心管取2ml 95％乙醇于分光光度计UV1601(Shimadzu Japan)测量OD664和OD649值进行叶绿素含量的计算。每克拟南芥植株的叶绿素含量的计算公式如下：叶绿素a/新鲜样品重量(mg/g)＝(13.36×OD664-5.19×OD649)×抽提液体积(ml)/植株重量(g)；叶绿素b/新鲜样品重量(mg/g)＝(27.43×OD649-8.12×OD664)×抽提液体积(ml)/植株重量(g)；总叶绿素/新鲜样品重量(mg/g)＝(5.24×OD664-22.24×OD649)×抽提液体积(ml)/植株重量(g)。叶绿素含量的测量结果表明转基因拟南芥四个株系(OL10，OL14，OL18，OL50)叶绿素总含量，叶绿素a，叶绿素b都显著高于野生型拟南芥叶片叶绿素含量(附图5C)。

实施例5过表达BnLAS拟南芥植株抗旱性评价

同时申请者对过表达家系(OL14，OL18)和野生型植株(对照)的抗旱胁迫能力进行了分析比较。拟南芥植株生长至6-8片真叶时，取OL14，OL18和野生型植株同种生长阶段的莲座叶置培养皿中，放温室中温度25℃，湿度44％条件下进行叶片离体失水鉴定。通过每隔一个小时称重一次，测量前7个小时的叶片失水情况，拟南芥叶片失水速率计算公式为：叶片失水速率(％)＝(起始叶片重量-失水后叶片重量)/起始叶片重量×100。该实验重复三次。在失水处理3个小时时，可以见到野生型拟南芥植株的叶片边缘开始出现萎蔫，在6个小时时可以看到野生型拟南芥叶片萎蔫程度显然较转基因植株的叶片明显(附图6A)。在叶片离体失水的数据中也可以看到，转基因植株的叶片失水速率显著慢于野生型植株叶片失水速率。

为了进一步证实过表达植株的抗旱能力提高。在拟南芥植株正常条件下生长30天时，通过保持过表达家系OL18和野生型植株相等的生物量的条件下，将拟南芥植株进行旱胁迫处理。当植株停止浇水15天后，可以看到，野生型拟南芥植株叶片发生严重萎蔫，而转基因植株相对叶片表现饱满。说明在BnLAS过表达拟拟南芥植株的抗旱能力优于野生型植株。

同时通过将过表达家系OL14，OL18和野生型拟南芥及拟南芥las突变体(SALK000896，Hiibara K，Karim MR，Takada S，Taoka K，Furutani M，Aida M，Tasaka M(2006)Arabidopsis CUP_SHAPEDCOTYLEDON3 regulates postembryonic shoot meristem and organ boundary formation.Plant Cell18：2946-1957)种在同一钵中，待植株生长一个月后停止浇水进行旱胁迫处理，待植株叶片萎焉后复水，复水5天后调查植株死亡率(附图7B)，该实验重复三次。抗旱胁迫30天后复水的拟南芥植转基因过表达家系OL14和OL18植株死亡率分别为71.9％和91.6％，而野生型植株的las突变体植株的存活率分别为21.9％和11％(附图7C)。转基因过表达家系OL14和OL18抗旱能力显著优于野生型植株和las突变体植株。

实施例6BnLAS过表达植株气孔和蜡质层分析

取BnLAS基因过表达家系OL18和野生型植株对照CK进行光镜和电镜条件下气孔观察。BnLAS基因过表达家系OL18和野生型植株在22℃温室，生长35天，剪取第一片完全叶片切成2×2mm的小块后立即固定在5％的戊二醛中同时抽真空过夜。样品送至华中农业大学电镜平台进行脱水干燥。将样品黏贴至铝块上，在EIKO IB-5ION coater(EIKO IB-5ION，日本)15min进行镀金。后直接置于JSM-3690/LV扫描电镜(SEM，JSM-6390，日本)下进行扫描成像，使用软件ImagJ进行气孔开度的测量计算。通过将固定的拟南芥植株叶片在SEM下进行扫描发现，过表达植株OL18的气孔数目显著增多而相对应的表皮细胞大小也变小(如附图8A，B)。通过对过表达植株OL18和对照野生型拟南芥气孔数目的定量分析发现过表达植株的气孔数目较野生型植株气孔数目增加了1.9倍，但是在其表皮上绝大多数的气孔明显变小且发育不正常，有很多气孔的孔没有或只有很小的孔。在测量气孔开度是发现过表达植株OL18的气孔开度0.85μm只有对照野生型植株18％大小。

为了避免电镜条件下对气孔开度会形成影响，光镜下新鲜叶片的气孔开度被实施。光镜下开度观察方法(参照Cominelli E，Galbiati M，Vavasseur A，Conti L，Sala T，Vuylsteke M，Leonhardt N，Dellaporta SL，andTonelli C.A guard-cell-specific MYB transcription factor regulates stomatal movements and plant droughttolerance.2005.Curr Biol 15：1196-1200)。生长30天拟南芥叶片，将其切成2cm左右正方形表皮条，浸入到30mM KCl and 10mM MES-KOH组成的缓冲液(pH 6.5)中，在光条件下光照4h后置于Nikon ECLIPSE 80i显微镜(Tokyo，Japan)下照相，使用软件ImagJ进行气孔开度的测量计算。同时通过表皮条在MES缓冲液条件下进行光照4小时后进行观察。发现BnLAS过表达植株气孔数目总数增加了1.7倍(附图8C)，而气孔开度为野生型植株的40％(附图8D)。而在两种条件下野生型植株和BnLAS过表达植株开放的气孔数目并无明显差异。气孔开度减少可以导致拟南芥植株抗旱能力提高已被证实(参照Cominelli E，Galbiati M，VavasseurA，Conti L，Sala T，Vuylsteke M，Leonhardt N，Dellaporta SL，and Tonelli C.A guard-cell-specific MYBtranscription factor regulates stomatal movements and plant drought tolerance.2005.Curr Biol 15：1196-1200)。

同时过表达家系OL18和野生型植株对照扫描电镜进行了叶片表皮蜡质层的观察，结果可以看出在过表达家系OL18叶片(附图9B)的表面上覆盖了一层蜡质，而野生型植株叶片标明蜡质层并不明显(附图9A)。植株叶片表皮蜡质层增厚导致角质层渗透能力的改变而导致抗旱以背证实(Zhang JY，Broeckling CD，Sumner LW，Wang ZY.Herterologous expression of two Medicago truncatula putative ERF transcription factorgenes，WXP1 and WXP2，in Arabidopsis led to increased leaf wax accumulation and improved drought tolerance，but differential response in freezing tolerance.2007.Plant Mol Biol 64：265-278)。叶绿素浸出实验(Lolle SJ，Berlyn GP，Engstrom EM，Krolikowski KA，Reiter W，Pruitt RE(1997)Developmental regulation of cellinteractions in the Arabidopsis fiddlehead-1 mutant：a role for the epidermal cell wall and cuticle.Dev Biol189：311-321)在过表达家系OL14、OL18和野生型植株对照中进行。具体步骤如下：将同实施例6相同生长条件拟南芥植株去根后，将莲座叶浸入到30ml 80％乙醇，置于暗处。每隔15min，30min，60min，90min，120min，180min取出3ml溶液进行波长649和664测定。计算总叶绿素含量公式如下：总叶绿素含量(mg/g新鲜组织)＝7.93(A664)+19.53(A647)。叶绿素浸出实验表明，在过表达家系OL14、OL18前三个小时叶绿素总量浸出速度较野生型植株缓慢。说明BnLAS过表达植株角质层渗透能力减弱。

上述实验结果证实了BnLAS基因过表达植株抗旱能力增强是通过过表达拟南芥植株的气孔开度减小和蜡质层增厚实现的。

Claims (4)

1.一种分离的来源于甘蓝型油菜具有抗旱性的BnLAS基因，其核苷酸序列如序列表SEQ IDNO：1所示。

2.克隆权利要求1所述基因的特异引物YM113、引物YM114，其核苷酸序列如下所示：

YM113：5′-CAGTGTCGACAACAATGCTTACTTCCTTCAAA-3′；

YM114：5′-CAGTGAGCTCTCATTTCCACGACGAAAC-3′。

3.一种利用BnLAS基因提高拟南芥植物抗旱性的方法，其包括如下步骤：

1)设计如权利要求2所述的引物，从甘蓝型油菜基因组中克隆具有有抗旱性的BnLAS基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；

2)构建BnLAS基因过量表达载体，并将该载体转化到农杆菌中；

3)通过农杆菌介导的方法转化拟南芥，筛选得到BnLAS基因过表达转化植株；

4)采用分子检测方法对步骤3)的过表达转化植株进行抗旱性鉴定；

5)进一步在田间鉴定过表达转化植株的叶片表面蜡质层、叶绿素含量及叶片结构。

4.权利要求1所述的基因在提高拟南芥植物抗旱性中的应用。

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