CN103142742A - 一种杨树花口服液的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种杨树花口服液的制备方法,属于兽药技术领域。其包括下述步骤:(1)将杨树花放入提取罐中,加入杨树花质量4-6倍的水,搅拌并升温至45-50℃;(2)在提取罐中加入杨树花质量3-7%的纤维素酶,调节pH值至5.0-5.5,45-50℃下酶解90-120min;(3)将酶解液过滤,收集滤液,即得杨树花口服液。本发明利用纤维素酶解技术提取杨树花,开发了一种提取杨树花的新工艺,大大缩短了提取时间、降低了热能耗、减小了工艺用水量,达到了节能减排、提高工作效率和提取率的目的,具有良好的社会和经济效益。
Description
技术领域
本发明涉及兽药技术领域,尤其是一种杨树花口服液的制备方法。
背景技术
杨树花系杨柳科植物加拿大杨柳populus canadensis Mench.花序,富含黄酮、生物碱、有机酸、维生素、酚类等成分,具有健脾养胃、化湿止痢、涩肠止泻、清热解毒之功效。杨树花口服液被收载于2010版《中国兽药典》二部,临床多用于猪、羊、禽下痢。现代药理学研究表明杨树花具有抗菌、解热抗炎、止痢止泻等作用。传统杨树花口服液是通过浸泡、加热煮沸、煎煮、浓缩等方法制备而成,工艺时间长,热能消耗高、工艺用水消耗大、提取率低。每生产1吨口服液从浸泡、煎煮、浓缩、沉淀、过滤到分装前需要十几个多小时;煎煮、浓缩需要消耗热蒸汽3-5吨;药材煎煮2次,需要消耗纯化水8吨(按饮用水标准需要40吨),浓缩需要用水10吨;有效成分黄酮含量最高为0.132%。
中药的有效成分大多储存在于细胞壁纤维素构成的框架中,被纤维素包裹在内,提取其有效成分,必须先打破其细胞壁的纤维素框架使有效成分充分溶解出来。用于中药提取研究较多的是纤维素酶,纤维素则是由β-D-葡萄糖以1,4-β葡萄糖苷键连接,用纤维素酶酶解可以破坏β-D-葡萄糖键,使植物细胞壁破坏,有利于对有效成分的提取。近年来,国内采用纤维素酶提取中药有效成分的报道不断出现。吕卫明等介绍采用酶水解法从黄芩中提取分离黄芩素达75.67%,收率为2.46%。有人在纤维素酶的作用下,从葛根中提取总黄酮,收率提高了13%。在三七提取过程中,用纤维素酶酶解作用破坏细胞壁,三七总皂昔提取率提高23.5%。此外,上海中药一厂首先应用酶法成功地制备了生脉饮口服液。与传统提取方法比较纤维素酶解法具有提高收率、节约能源,减少溶剂使用量的等优势,但至今未见采用纤维素酶解提取杨树花的报道。
发明内容
本发明提供一种杨树花口服液的制备方法,利用纤维素酶解技术提取杨树花,开发了一种提取杨树花的新工艺,大大缩短了提取时间、降低了热能耗、减小了工艺用水量,达到了节能减排、提高工作效率和提取率的目的,具有良好的社会和经济效益。
一种杨树花口服液的制备方法,包括下述步骤:
(1)将杨树花放入提取罐中,加入杨树花质量4-6倍的水,搅拌并升温至45-50℃;
(2)在提取罐中加入杨树花质量3-7%的纤维素酶,调节pH值至5.0-5.5, 45-50℃下酶解90-120min;
(3)将酶解液过滤,收集滤液,即得杨树花口服液。
步骤(2)中用10-50%的乳酸溶液或10-50%的氢氧化钠溶液调节pH值。
步骤(2)中纤维素酶的质量为杨树花质量的4%。
步骤(2)中酶解时间为120min。
其用法用量为:马、牛50~100ml;羊、猪10~20ml;兔、禽1~2ml。
酶添加量、酶解温度、酶解时间、溶剂pH值等单因素对黄酮提取率影响试验:
1、纤维素酶活性检测
纤维素酶是一种重要的生物复合酶,主要由外切β-葡聚糖酶、内切β-葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶等组成,还有很高活力的木聚糖酶。
纤维素和半纤维素构成了植物细胞壁构架,杨树花有效成分存在于有纤维素和半纤维素构成的框架内。纤维素酶具有专一性,纤维素酶分解纤维素,木聚糖酶分解半纤维素,葡聚糖酶将纤维素和半纤维素分解产物继续分解成葡萄糖。杨树花在纤维素酶和木聚糖酶作用下细胞壁充分分解释放出杨树花有效成分。
采用分光光度法测定纤维素酶和木聚糖酶活力。
检测纤维素酶中纤维素酶≥30000U/g ,木聚糖酶≥100000U/g ,β-葡聚糖酶≥120000U/g。
2、 标准溶液配制和标准曲线绘制
2.1芦丁对照品溶液的制备:
资料显示黄酮检测以芦丁为标准对照品。
准确称取芦丁对照品10mg,置于50ml容量瓶中,加30%的乙醇30ml,超声震荡使之溶解,冷却至室温,并稀释至刻度,摇匀得浓度为200μg/ml的芦丁对照品溶液,冷藏,备用。
2.2吸收波长的选择:
对照品测定波长的确定:取对照品溶液1ml,按标准曲线项下的方法进行,在400~700nm波长范围内扫描,结果在500nm波长处为最大吸收。样品测定波长的确定:取样品的乙醇提取液1ml,按标准曲线项下的方法进行,在400~700nm波长范围内扫描,结果在500nm波长处为最大吸收。
2.3标准曲线绘制:
精密称取芦丁对照品溶液0,1.0,2.0,3.0,4.0,5.0ml分别至25ml容量瓶中,分别加入5%亚硝酸钠溶液0.3ml,摇匀,放置6min,加入10%硝酸铝溶液0.3ml,放置6min,加入1mol氢氧化钠溶液4ml,分别用30%的乙醇定容,摇匀,放置15min,置比色皿中,在500nm波长处测定吸光度。以吸光度A为纵坐标,浓度C为横坐标,绘制标准曲线(见图1)。经回归统计,得标准曲线方程:A=0.0486+0.0002 R2=0.9996。浓度在0-400μg/ml范围内R的平方达到0.9996,线性关系良好。
3、单因素影响试验
3.1纤维素酶添加量对杨树花口服液中黄酮提取率的影响(A因素)
取杨树花7份,每份100g,纤维素酶添加量分别为2g、3g、4g、5g、6g、7 g、8 g,酶解温度控制在45℃、酶解pH值控制在5.0条件下,酶解时间控制在90 min,收集酶解液,依照检测杨树花口服液中总黄酮含量的测定方法检测总黄酮含量,纤维素酶添加量对杨树花口服液中黄酮提取率的影响见图2。
由图2可知,酶添加量单因素影响试验结果显示,取100g杨树花制备杨树花口服液,随着酶添加量增加,口服液中黄酮提取率升高,当酶添加到3g时样品中黄酮提取率,比添加2g的提取率大幅度升高,添加到4-8g时黄酮提取率一直提高,添加到7g以上时黄酮提取率提高的幅度变小,综合生产成本与杨树花中黄酮提取率等多方面因素,取100g杨树花制备口服液,添加3-7g纤维素酶比较适宜,优选为4g。
3.2酶解温度对杨树花口服液中黄酮提取率的影响(B因素)
取杨树花5份,每份100g,纤维素酶添加量为4g,酶解温度分别为35℃、40℃、45℃、50℃、55℃,酶解pH值控制在5.0等条件下,酶解时间控制在90 min,收集酶解液,依照检测杨树花口服液中总黄酮含量的测定方法检测总黄酮含量,酶解温度对杨树花口服液中黄酮提取率的影响见图3。
由图3可知,在相同酶添加量、酶解时间和酶解pH条件下,酶解温度单因素影响试验结果显示,酶解温度从35℃到45℃,随温度升高杨树花口服液中黄酮提取率由0.102%升高到0.154%,酶解温度升高50℃时提取率0.144%,当酶解温度达到55℃时提取率下降到0.016%,由此看来,酶解温度在纤维素酶法提取中影响较大,适宜提取的温度在45℃到50℃之间。
酶解时间对杨树花口服液中黄酮提取率的影响(C因素)
取杨树花500g,分成5份,每份100g,纤维素酶添加量为4g,酶解温度45℃,酶解时间分别为30min、60 min、90 min、120 min、150 min,酶解pH值控制在5.0,酶解时间到,收集酶解液,依照检测杨树花口服液中总黄酮含量的测定方法检测总黄酮含量,酶解时间对杨树花口服液中黄酮提取率的影响见图4。
由图4可知,在相同酶添加量、酶解温度和酶解pH条件下,酶解时间单因素影响试验结果显示:从酶解30min时间开始取样,随酶解时间延长提取率不断提高,当酶解时间达到120min之后提取率基本不变,酶解150min和120min的提取率基本一致。因此,从单因素试验来看,酶解时间在90-120min比较适宜,优选为120min。
3.4酶解pH值对杨树花口服液中黄酮提取率的影响(D因素)
取杨树花500g,分成5份,每份100g,纤维素酶添加量为4g,酶解温度45℃酶解时间90 min,pH值分别为4.0、4.5、5.0、5.5、6.0,收集酶解液,依照检测杨树花口服液中总黄酮含量的测定方法检测总黄酮含量,酶解pH值对杨树花口服液中黄酮提取率的影响见图5。
由图5可知,在相同酶添加量、酶解温度和酶解时间的条件下,酶解pH值单因素影响试验结果显示:酶解pH值在5.0、5.5时杨树花口服液中黄酮提取率明显高于酶解pH值为4.0、4.5、6.0时的提取率,其中酶解pH值为6.0时的提取率0.023%明显低于pH值为4.0的提取率0.082%。由此看来pH值为6.0对纤维素酶破坏严重,造成纤维素酶失活,影响了酶解效果。因此,在纤维素酶解法提取杨树花口服液工艺中设定酶解pH范围为5.0-5.5。
4、正交试验结果:
选用L9(34)正交设计表以黄酮提取率为考核指标,考察纤维素酶解法提取杨树花口服液中酶添加量因素A、酶解温度因素B、酶解时间因素C、酶解pH值因素D对杨树花口服液提取工艺的影响,正交试验结果见表1。
表1 L9(34)正交设计表
通过对L9(34)正交试验结果进行极差分析,在影响黄酮提取率的A因素酶添加量、B因素酶解温度、C因素酶解时间和D因素酶解pH值对黄酮提取率的影响顺序依次为A>B>C>D。在A因素中kA3和kA2几乎一致,kA3、kA2和KA1差异显明显;B因素中KB2 和KB3差异不大,两者与KB1差异明显;在C因素中kC3明显高于 kC1和kC2;kD3和kD2比较接近,明显高于KD1。
综合以上因素影响程度和因素控制能力,酶的添加量和酶解时间容易控制,不易受其他条件影响,酶解温度和酶解pH值在提取溶剂中分布有一定差异。因此,通过正交L9(34)筛选出纤维素酶解法提取杨树花工艺条件为添加酶3-7g,酶解时间90-120min,酶解温度控制在45-50℃之间,酶解pH值控制在5.0-5.5之间。
5、验证试验
根据L9(34)正交试验筛选出的添加酶3-7%,酶解时间90-120min,酶解温度控制在45-50℃之间,酶解pH值控制在5.0-5.5之间的工艺条件,在中试车间开展了连续三批的验证性试验,三批试验温度分别为46℃、48℃、48℃,pH分别为5.2、5.5、5.1,三批试验产品黄酮提取率分别为0.185%、0.189%、0.188%,加权平均验证试验提取率为0.187%。依照2010版《中国兽药典》二部杨树花口服液质量标准检验,各项检验结果符合规定。
6、临床疗效:
药敏试验结果显示本发明的纤维素酶解法提取杨树花口服液对肉鸡大肠杆菌有明显的抑菌效果,可用于肉鸡大肠杆菌病的治疗。
6.1杨树花口服液对肉鸡大肠杆菌的药敏试验。课题组采用位于三个地域的鸡场临床发病确诊的大肠杆菌病的病料编号为A、B、C,以本发明的杨树花口服液为试验药物药敏片编号为1,以氟苯尼考原粉、硫酸粘菌素原粉、硫酸新霉素原粉、阿莫西林原粉为对照药物(编号为2、3、4、5),开展了药物敏感试验。试验结果见表2:
表2 药物敏感试验结果(单位:mm)
由表2的试验结果显示:来自不同地域三组鸡群的菌株无论是否用药治疗过,对杨树花口服液均敏感。
6.2杨树花口服液防治肉鸡大肠杆菌病的临床疗效试验
项目组针对某肉鸡养殖场饲养的12600羽,15日龄,罗斯308肉鸡临床发生的大肠杆菌病进行了临床疗效对比试验。本试验用杨树花口服液和10%硫酸粘菌素可溶性粉和10%氧氟沙星可溶性粉为对照药物,考察纤维素酶解杨树花口服液临床疗效,试验结果见表3。
表3 杨树花口服液临床疗效
由表3的试验结果显示:A组、B组死淘率较C组、D组差异极显著,增重有显著差异,料肉比无显著差异;A组死淘数、死淘率、增重、料肉试验效果明显好于B组,单统计数据无显著差异。
7、经济效益分析
经实验分析,采用酶解工艺制备杨树花口服液,蒸汽用量下降86.4%,节约用水53.5%,节约了大量资源。
每生产杨树花口服液45吨,按每吨售价为17.5万元,新增产值787.5万元,扣除新增生产费和推广费97.058万元后,新增纯收益为690.442万元;其投入产出比为1:8.11,科技投资收益率为1:7.11推广投资收益率为1:40.28。即在本项目中,社会投资每增加10000元,可增加产出81100元,可回报纯收益71100元;推广单位投资每增加10000元,可使社会获得纯收益402800元。因此,实施本项目取得了极为显著的社会和经济效益。
采用上述技术方案所产生的有益效果在于:
1.本发明利用纤维素酶解技术提取杨树花,开发了一种提取杨树花的新工艺,缩短了工艺时间、降低了热能耗、减小了工艺用水量,达到了节能减排、提高工作效率和提取率的目的,具有良好的社会和经济效益。
2.将黄酮的提取率提高到0.18%以上,较之传统工艺提高了40%以上。
附图说明
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。
图1是芦丁对照品的标准曲线图;
图2是酶的添加量对黄酮提取率影响示意图;
图3是酶解温度对黄酮提取率影响示意图;
图4是酶解时间对黄酮提取率影响示意图;
图5是酶解pH值对黄酮提取率影响示意图。
具体实施方式
以下实施例中使用的纤维素酶由山东康源生物科技有限公司提供。
实施例1
(1)将100g杨树花放入提取罐中,加入杨树花质量400g水,搅拌并升温至45℃;
(2)在提取罐中5g纤维素酶,调节pH值至5.5, 45℃下酶解95min;
(3)将酶解液过滤,收集滤液,得杨树花口服液105mL。
依照检测杨树花口服液中总黄酮含量的测定方法检测本实施例中总黄酮含量,经计算总黄酮的提取率为:0.188%。依照2010版《中国兽药典》二部杨树花口服液质量标准检验,各项检验结果符合规定。
实施例2
(1)将100g杨树花放入提取罐中,加入杨树花质量500g水,搅拌并升温至45-50℃;
(2)在提取罐中加入3g纤维素酶,调节pH值至5.1, 46℃下酶解110min;
(3)将酶解液过滤,收集滤液,得杨树花口服液120mL。
依照检测杨树花口服液中总黄酮含量的测定方法检测本实施例中总黄酮含量,经计算总黄酮的提取率为:0.181%。依照2010版《中国兽药典》二部杨树花口服液质量标准检验,各项检验结果符合规定。
实施例3
(1)将100g杨树花放入提取罐中,加入杨树花质量600g水,搅拌并升温至45-50℃;
(2)在提取罐中加入7g纤维素酶,调节pH值至5.4, 48℃下酶解100min;
(3)将酶解液过滤,收集滤液,得杨树花口服液130mL。
依照检测杨树花口服液中总黄酮含量的测定方法检测本实施例中总黄酮含量,经计算总黄酮的提取率为:0.189%。依照2010版《中国兽药典》二部杨树花口服液质量标准检验,各项检验结果符合规定。
实施例4
(1)将100g杨树花放入提取罐中,加入杨树花质量450g水,搅拌并升温至45-50℃;
(2)在提取罐中加入4g纤维素酶,调节pH值至5.2, 50℃下酶解120min;
(3)将酶解液过滤,收集滤液,得杨树花口服液108mL。
依照检测杨树花口服液中总黄酮含量的测定方法检测本实施例中总黄酮含量,经计算总黄酮的提取率为:0.186%。依照2010版《中国兽药典》二部杨树花口服液质量标准检验,各项检验结果符合规定。
实施例5
(1)将100g杨树花放入提取罐中,加入杨树花质量500g水,搅拌并升温至45-50℃;
(2)在提取罐中加入6g纤维素酶,调节pH值至5.0, 46℃下酶解90min;
(3)将酶解液过滤,收集滤液,得杨树花口服液120mL。
依照检测杨树花口服液中总黄酮含量的测定方法检测本实施例中总黄酮含量,经计算总黄酮的提取率为:0.188%。依照2010版《中国兽药典》二部杨树花口服液质量标准检验,各项检验结果符合规定。
Claims (5)
1.一种杨树花口服液的制备方法,其特征在于包括下述步骤:
(1)将杨树花放入提取罐中,加入杨树花质量4-6倍的水,搅拌并升温至45-50℃;
(2)在提取罐中加入杨树花质量3-7%的纤维素酶,调节pH值至5.0-5.5, 45-50℃下酶解90-120min;
(3)将酶解液过滤,收集滤液,即得杨树花口服液。
2.根据权利要求1所述的杨树花口服液的制备方法,其特征在于所述步骤(1)中加入杨树花质量4倍的水。
3.根据权利要求1所述的杨树花口服液的制备方法,其特征在于所述步骤(2)中用10-50%的乳酸溶液或10-50%的氢氧化钠溶液调节pH值。
4.根据权利要求1所述的杨树花口服液的制备方法,其特征在于所述步骤(2)中纤维素酶的质量为杨树花质量的4%。
5.根据权利要求1所述的杨树花口服液的制备方法,其特征在于所述步骤(2)中酶解时间为120min。
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