CN103140485B - 二酰胺化合物的结晶草酸盐 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及联苯-2-基胺基甲酸1-(2-{[4-(4-{[(R)-2-羟基-2-(8-羟基-2-氧代-1，2-二氢喹啉-5-基)乙氨基]甲基}苯基胺甲酰基)丁基]甲基胺甲酰基}乙基)哌啶-4-基酯的结晶草酸盐。本发明还涉及含有所述结晶草酸盐的组合物；使用所述结晶草酸盐例如治疗肺病症的方法；和用于制备所述结晶草酸盐的工艺。

Description

二酰胺化合物的结晶草酸盐
技术领域
本发明涉及新颖二酰胺化合物的结晶草酸盐。本发明还涉及含有所述结晶盐的医药组合物；适用于制备所述结晶盐的工艺和中间体；和使用所述结晶盐例如治疗肺病症的方法。
背景技术
2010年10月28日公开的WO 2010/123766A1揭示预期可用作治疗例如慢性阻塞性肺病(COPD)和哮喘的肺病症的治疗剂的二酰胺化合物。在本申请案中揭示的一种化合物为联苯-2-基胺基甲酸1-(2-{[4-(4-{[(R)-2-羟基-2-(8-羟基-2-氧代-1，2-二氢喹啉-5-基)乙氨基]甲基}苯基胺甲酰基)丁基]甲基胺甲酰基}乙基)哌啶-4-基酯，其化学结构由式I表示：
通常使用吸入装置(例如干粉吸入器(DPI)、定量吸入器(MDI)或喷雾吸入器)直接将用于治疗肺病症的治疗剂投与到呼吸道中。当调配用于这类装置的治疗剂时，宜具有稳定结晶形式的治疗剂，其可微粉化或以其它方式调配并且存储而不显著分解或损失结晶度。具体来说，结晶形式不应为过度吸湿的或易潮解的。另外，结晶形式应具有相对较高的熔点(也就是约高于130℃)以使加工和存储期间的热降解降到最低。
然而，形成有机化合物的结晶形式非常不可预料。不存在预测有机化合物的形式是否将结晶的可靠方法。此外，不存在预测结晶形式是否将具有用于例如医药吸入装置所需的物理性质的方法。
目前，尚未揭示联苯-2-基胺基甲酸1-(2-{[4-(4-{[(R)-2-羟基-2-(8-羟基-2-氧代-1，2-二氢喹啉-5-基)乙氨基]甲基}苯基胺甲酰基)丁基]甲基胺甲酰基}乙基)哌啶-4-基酯的结晶形式。因此，需要此化合物的稳定结晶形式。具体来说，需要稳定、不潮解的结晶形式，其具有可接受程度的吸湿性和相对较高的熔点。
发明内容
本发明涉及呈结晶固态形式的联苯-2-基胺基甲酸1-(2-{[4-(4-{[(R)-2-羟基-2-(8-羟基-2-氧代-1，2-二氢喹啉-5-基)乙氨基]甲基}苯基胺甲酰基)丁基]甲基胺甲酰基}乙基)哌啶-4-基酯的草酸加成盐。所述结晶草酸盐包括结晶草酸盐异丙醇溶剂合物盐和结晶草酸盐水合物盐。
已发现当暴露于大气湿度时，本发明的某些结晶草酸盐为不潮解的并且具有可接受的吸湿性。此外，本发明的结晶草酸盐具有至少为约160℃的相对较高的熔点。
因此，在一个方面中，本发明提供联苯-2-基胺基甲酸1-(2-{[4-(4-{[(R)-2-羟基-2-(8-羟基-2-氧代-1，2-二氢喹啉-5-基)乙氨基]甲基}苯基胺甲酰基)丁基]甲基胺甲酰基}乙基)哌啶-4-基酯的结晶草酸盐。
在一个实施例中，本发明的结晶草酸盐为异丙醇溶剂合物，其特征在于11.66±0.20、15.75±0.20、19.55±0.20、23.00±0.20和23.45±0.20的2θ值处包含衍射峰的粉末x射线衍射图案。此结晶形式或多晶型物已命名为形式1。
在另一实施例中，本发明的结晶草酸盐为水合物，其特征在于15.32±0.20、16.90±0.20、19.25±0.20和23.73±0.20的2θ值处包含衍射峰的粉末x射线衍射图案。此结晶形式或多晶型物已命名为形式2。
在一个实施例中，本发明的结晶草酸盐为通过暴露联苯-2-基胺基甲酸1-(2-{[4-(4-{[(R)-2-羟基-2-(8-羟基-2-氧代-1，2-二氢喹啉-5-基)乙氨基]甲基}苯基胺甲酰基)丁基]甲基胺甲酰基}乙基)哌啶-4-基酯的结晶草酸盐于约80％到约100％相对湿度约1到约5天的时间而制备的水合物。
在另一方面中，本发明提供包含本发明的结晶草酸盐的组合物。
在一个实施例中，组合物为包含(a)本发明的结晶草酸盐和(b)医药学上可接受的载剂的医药组合物。
在另一实施例中，组合物为包含(a)本发明的结晶草酸盐；(b)类固醇消炎剂或其医药学上可接受的盐或溶剂合物；和(c)医药学上可接受的载剂的医药组合物。
在另一方面中，本发明提供本发明的结晶草酸盐用于治疗。
在一个实施例中，本发明的结晶草酸盐用于治疗肺病症。在特定实施例中，肺病症为慢性阻塞性肺病。在另一特定实施例中，肺病症为哮喘。
在一个实施例中，本发明提供治疗肺病症的方法，所述方法包含向患者投与本发明的结晶草酸盐。
在另一实施例中，本发明提供治疗肺病症的方法，所述方法包含向患者投与(a)本发明的结晶草酸盐；和(b)类固醇消炎剂或其医药学上可接受的盐或溶剂合物。
在另一实施例中，本发明提供在哺乳动物中产生支气管扩张的方法，所述方法包含通过吸入向哺乳动物投与本发明的结晶草酸盐。
在另一实施例中，本发明提供本发明的结晶草酸盐用于制造药剂。
本发明的其它方面和实施例在本文中揭示。
附图说明
本发明的各种方面参考附图来说明。
图1展示联苯-2-基胺基甲酸1-(2-{[4-(4-{[(R)-2-羟基-2-(8-羟基-2-氧代-1，2-二氢喹啉-5-基)乙氨基]甲基}苯基胺甲酰基)丁基]甲基胺甲酰基}乙基)哌啶-4-基酯的结晶草酸盐异丙醇溶剂合物盐(形式1)的粉末x射线衍射(PXRD)图案。
图2展示联苯-2-基胺基甲酸1-(2-{[4-(4-{[(R)-2-羟基-2-(8-羟基-2-氧代-1，2-二氢喹啉-5-基)乙氨基]甲基}苯基胺甲酰基)丁基]甲基胺甲酰基}乙基)哌啶-4-基酯的结晶草酸盐异丙醇溶剂合物盐(形式1)的差示扫描热量测定(DSC)迹线。
图3展示联苯-2-基胺基甲酸1-(2-{[4-(4-{[(R)-2-羟基-2-(8-羟基-2-氧代-1，2-二氢喹啉-5-基)乙氨基]甲基}苯基胺甲酰基)丁基]甲基胺甲酰基}乙基)哌啶-4-基酯的结晶草酸盐异丙醇溶剂合物盐(形式1)的热解重量分析(TGA)迹线。
图4展示联苯-2-基胺基甲酸1-(2-{[4-(4-{[(R)-2-羟基-2-(8-羟基-2-氧代-1，2-二氢喹啉-5-基)乙氨基]甲基}苯基胺甲酰基)丁基]甲基胺甲酰基}乙基)哌啶-4-基酯的结晶草酸盐水合物盐(形式2)的粉末x射线衍射(PXRD)图案。
图5展示联苯-2-基胺基甲酸1-(2-{[4-(4-{[(R)-2-羟基-2-(8-羟基-2-氧代-1，2-二氢喹啉-5-基)乙氨基]甲基}苯基胺甲酰基)丁基]甲基胺甲酰基}乙基)哌啶-4-基酯的结晶草酸盐水合物盐(形式2)的差示扫描热量测定(DSC)迹线。
图6展示联苯-2-基胺基甲酸1-(2-{[4-(4-{[(R)-2-羟基-2-(8-羟基-2-氧代-1，2-二氢喹啉-5-基)乙氨基]甲基}苯基胺甲酰基)丁基]甲基胺甲酰基}乙基)哌啶-4-基酯的结晶草酸盐水合物盐(形式2)的热解重量分析(TGA)迹线。
图7展示联苯-2-基胺基甲酸1-(2-{[4-(4-{[(R)-2-羟基-2-(8-羟基-2-氧代-1，2-二氢喹啉-5-基)乙氨基]甲基}苯基胺甲酰基)丁基]甲基胺甲酰基}乙基)哌啶-4-基酯的结晶草酸盐水合物盐(形式2)的动态吸湿(DMS)迹线。
具体实施方式
本发明涉及呈结晶固态形式的联苯-2-基胺基甲酸1-(2-{[4-(4-{[(R)-2-羟基-2-(8-羟基-2-氧代-1，2-二氢喹啉-5-基)乙氨基]甲基}苯基胺甲酰基)丁基]甲基胺甲酰基}乙基)哌啶-4-基酯的草酸加成盐，包括其异丙醇溶剂合物和水合物。除非另外指出，否则本发明的结晶草酸盐可呈现为一种或一种以上相异结晶固态形式并且本发明涵盖所有所述形式，包括各形式的混合物。
在一个实施例中，本发明提供本文中称为形式1的第一结晶草酸盐固态形式的式I化合物的草酸加成盐。形式1为异丙醇溶剂合物形式。
在另一实施例中，本发明提供本文中称为形式2的第二结晶草酸盐固态形式的式I化合物的草酸加成盐。形式2为水合物。
式I化合物含有一个具有(R)组态的手性中心。然而，所属领域的技术人员将了解除非另外指出，否则少量(S)立体异构体可存在于本发明的组合物中，其限制条件为组合物的效用整体看来不因存在所述异构体而消除。
式I化合物和其中间体已使用市售ISIS/Draw软件(加利福尼亚州圣克拉拉赛美科技公司(Symyx，Santa Clara，California))的AutoNom特征命名。
定义
当描述本发明的化合物、组合物、方法和工艺时，除非另外指出，否则以下术语具有以下涵义。
术语“熔点”意指通过差示扫描热量测定观察到最大吸热热流的温度。
术语“微粉化”或“呈微粉化形式”意指至少约90％颗粒的直径小于约10μm的颗粒。
术语“溶剂合物”意指一个或一个以上溶质分子(也就是式I化合物的草酸盐)和一个或一个以上溶剂分子的缔合物，例如复合物或聚集物。代表性溶剂包括，例如水和异丙醇。当溶剂为水时，形成的溶剂合物为水合物。
术语“治疗有效量”意指当投与需要治疗的患者时足以有效治疗的量。
术语“治疗(treating或treatment)”意指：
(a)预防疾病或医学病况发生，也就是预防性治疗患者或个体；
(b)改善疾病或医学病况，也就是消除患者的疾病或医学病况或导致其消退；
(c)抑制疾病或医学病况，也就是减缓或阻止患者的疾病或医学病况的发展；或
(d)减轻患者中的疾病或医学病况的症状。
术语“单位剂型”意指适用于对患者给药的物理离散单位，也就是各单位含有预定数量的推算单独或与一种或一种以上其它单位组合产生治疗效果的治疗剂。举例而言，所述单位剂型可为干粉吸入器胶囊、来自定量吸入器的定剂量、胶囊、片剂、药丸等。
本发明的代表性结晶草酸盐
已发现联苯-2-基胺基甲酸1-(2-{[4-(4-{[(R)-2-羟基-2-(8-羟基-2-氧代-1，2-二氢喹啉-5-基)乙氨基]甲基}苯基胺甲酰基)丁基]甲基胺甲酰基}乙基)哌啶-4-基酯的结晶草酸盐以至少两个不同结晶形式存在。出于本发明的目的，这些形式在本书中确定为形式1和形式2。
形式1为异丙醇溶剂合物，其特征在于在约11.66±0.20、15.75±0.20、19.55±0.20、23.00±0.20和23.45±0.20的2θ值处具有显著衍射峰的粉末x射线衍射(PXRD)图案。形式1的差示扫描热量测定(DSC)迹线在约162℃到约164℃下(例如在约163.3℃下)在吸热热流中展现峰。形式1包含每摩尔当量的式I化合物草酸盐约1到约2摩尔当量的异丙醇，包括约1.25到约1.75摩尔当量，例如1.5摩尔当量。
形式2为水合物，其特征在于在约15.32±0.20、16.90±0.20、19.25±0.20和23.73±0.20的2θ值处具有显著衍射峰的粉末x射线衍射(PXRD)图案。形式2的差示扫描热量测定(DSC)迹线在约162℃到约164℃下(例如在约162.6℃下)在吸热热流中展现峰。形式2包含每摩尔当量的式I化合物草酸盐约1到约3摩尔当量的水，包括约1.5到约2摩尔当量。
本发明的结晶草酸盐通常含有每摩尔当量的式I化合物约0.90到约1.10摩尔当量的草酸；包括每摩尔当量的式I化合物约0.95到约1.05摩尔当量的草酸。在特定实施例中，本发明的草酸盐含有每摩尔当量的式I化合物约1摩尔当量的草酸。使用常规方法(例如13C NMR、元素分析、离子分析或HPLC)测定摩尔比。
本发明的结晶草酸盐通常使用草酸或草酸二水合物和联苯-2-基胺基甲酸1-(2-{[4-(4-{[(R)-2-羟基-2-(8-羟基-2-氧代-1，2-二氢喹啉-5-基)乙氨基]甲基}苯基胺甲酰基)丁基]甲基胺甲酰基}乙基)哌啶-4-基酯制备。草酸和草酸二水合物可例如从密苏里州圣路易斯西格玛-奥德里奇公司(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)购得。用于本发明的联苯-2-基胺基甲酸1-(2-{[4-(4-{[(R)-2-羟基-2-(8-羟基-2-氧代-1，2-二氢喹啉-5-基)乙氨基]甲基}苯基胺甲酰基)丁基]甲基胺甲酰基}乙基)哌啶-4-基酯可容易地使用以下实例中所述的程序或通过使用本申请案的现有技术部分中所述的共同让渡的美国申请案中所述的程序从市售起始物质和试剂制备。
用于制备本发明的结晶草酸盐的方法或工艺在实例中提供。通常，联苯-2-基胺基甲酸1-(2-{[4-(4-{[(R)-2-羟基-2-(8-羟基-2-氧代-1，2-二氢喹啉-5-基)乙氨基]甲基}苯基胺甲酰基)丁基]甲基胺甲酰基}乙基)哌啶-4-基酯与约0.90到约1.1摩尔当量(例如1.0摩尔当量)的草酸或草酸二水合物于稀释剂中接触。一般地，此反应在介于约0℃到约60℃(包括约20℃到约35℃，例如约25℃到约30℃)的范围内的温度下进行。用于此反应的适合惰性稀释剂包括(但不限于)任选含水的甲醇、异丙醇等。任选地，反应混合物可使用常规设备超声波处理以促进结晶。
制备本发明的结晶草酸盐的工艺可任选包括使用晶种以主要制备特定结晶形式。举例而言，通过使用形式2的晶种，结晶草酸盐水合物盐可制备为具有基本上与晶种(也就是形式2)相同的形式。当最初形成本发明的结晶草酸盐时可使用所述晶种，或其可用于再结晶结晶或部分结晶形式。
通常，通过不搅拌并且不应用冷却的情况下减缓结晶来制备晶种。经由例证说明，为获得晶种，式I化合物通常在足以提供溶解的温度下溶解于稀释剂中。举例而言，式I化合物溶解于热10％(v/v)水于甲醇中并且随后使其冷却到周围温度。使此溶液缓慢蒸发以提供本发明的结晶草酸盐。所得晶体通过过滤或其它常规方法分离。或者，晶种可从先前结晶物质制备中获得。
已发现当结晶物质在高湿度下在环境温度下存储时，形式2的结晶度改良。举例而言，当形式2的样品在84％相对湿度下在环境温度下存储时，如通过样品的PXRD图测量的结晶度在约5天的时期内改良。
组合物、组合和调配物
本发明的结晶草酸盐可与其它物质(例如治疗剂、载剂、赋形剂、稀释剂、溶剂等)组合以形成组合物。
在一个实施例中，本发明的结晶草酸盐以载剂或赋形剂调配以形成医药组合物或调配物。所述医药组合物通常将含有治疗有效量的本发明的结晶草酸盐。然而在某些情况下，医药组合物可含有多于治疗有效量，例如浓缩总成分；或少于治疗有效量，例如意欲多元投与的单位剂型。
医药组合物通常将含有约0.01到约95重量％的本发明的结晶草酸盐，包括例如约0.05到约30重量％或约0.1到约10重量％。
所述医药组合物可使用常规载剂或赋形剂制备。特定载剂或赋形剂、或载剂或赋形剂的组合的选择，将取决于各种因素，例如投与模式、或正治疗的疾病或医学病况。制备医药组合物的许多适合载剂和赋形剂可从市售商品取得。举例而言，物质可购自西格玛公司(Sigma)(密苏里州圣路易斯)。制备适用于特定投与模式的医药组合物的程序和物质在医药技术中有所描述，包括例如：医药科学与实践(Remington：The Science andPractice of Pharmacy)，第20版，利平科特威廉姆斯与怀特公司(Lippincott Williams&White)，巴尔的摩(Baltimore)，马里兰(Maryland)(2000)；和H.C.安塞尔(H.C.Ansel)等人，医药剂型与药物递送***(Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems)，第7版，利平科特威廉姆斯与怀特公司，巴尔的摩，马里兰(1999)。
医药学上可接受的载剂的代表性实例包括(但不限于)：(1)糖，例如乳糖、葡萄糖和蔗糖；(2)淀粉，例如玉米淀粉和马铃薯淀粉；(3)纤维素和其衍生物，例如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和乙酸纤维素；(4)粉末黄蓍胶；(5)麦芽；(6)明胶；(7)滑石；(8)固化油和蜡，例如可可脂和栓剂蜡；(9)液体油(在室温下)，例如花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和大豆油；(10)二醇，例如丙二醇；(11)多元醇，例如甘油、山梨糖醇、甘露糖醇和聚乙二醇；(12)酯，例如油酸乙酯和月桂酸乙酯；(13)琼脂；(14)缓冲剂，例如氢氧化镁和氢氧化铝；(15)褐藻酸；(16)无热原质水；(17)等渗盐水；(18)林格氏溶液(Ringer′s solution)；(19)乙醇；(20)磷酸盐缓冲溶液；(21)压缩推进气体，例如氯氟碳化物和氢氟碳化物；和(22)用于医药组合物的其它无毒相容物质。
医药组合物通常通过完全地并且均匀地混合或掺合本发明的结晶草酸盐与医药学上可接受的载剂和任何其它任选的成份来制备。如果必需或需要，那么随后可将所得经均匀掺合的混合物使用常规程序及设备成形或装载到片剂、胶囊、药丸、罐、药筒、分配器等中。
在一个实施例中，医药组合物适合用于吸入投与。用于吸入投与的医药组合物通常呈气溶胶或粉末的形式。所述组合物一般使用吸入器传送装置(例如定量吸入器(MDI)、干粉吸入器(DPI)、喷雾吸入器或类似传送装置)投与。
在特定实施例中，医药组合物通过使用干粉吸入器吸入来投与。所述干粉吸入器通常以在吸气期间分散于患者气流中的自由流动粉末形式投与医药组合物。为获得自由流动粉末组合物，治疗剂通常以适合赋形剂(例如乳糖、淀粉、甘露糖醇、右旋糖、聚乳酸(PLA)、聚丙交酯-共-乙交酯(PLGA)或其组合)调配。通常，治疗剂经微粉化并且与适合载剂组合以形成适用于吸入的组合物。因此，在一个实施例中，本发明的结晶草酸盐呈微粉化形式。
用于干粉吸入器的代表性医药组合物包含乳糖及呈微粉化形式的本发明的结晶草酸盐。所述干粉组合物可例如通过合并干燥磨成粉的乳糖与治疗剂并且随后干掺和组份来制造。组合物接着通常装载到干粉分配器中或装载到与干粉传送装置一起使用的吸入药筒或胶囊中。
适用于通过吸入投与治疗剂的干粉吸入器传送装置在此项技术中有所描述并且所述装置的实例可从市售商品取得。举例而言，代表性干粉吸入器传送装置或产品包括Aeolizer(诺华公司(Novartis))、Airmax(安维世公司(IVAX))、ClickHaler(诺特瓦生物公司(Innovata Biomed))、Diskhaler(葛兰素史克股份有限公司(GlaxoSmithKline))、Diskus/Accuhaler(葛兰素史克股份有限公司)、Easyhaler(奥里昂制药公司(OrionPharma))、Eclipse(安内特公司(Aventis))、FlowCaps(好利安制药公司(Hovione))、Handihaler(德国勃林格殷格翰制药公司(Boehringer Ingelheim))、Pulvinal(凯西制药公司(Chiesi))、Rotahaler(葛兰素史克股份有限公司)、SkyeHaler/Certihaler(斯基制药公司(SkyePharma))、Twisthaler(先灵葆雅公司(Schering-Plough))、Turbuhaler(阿斯特拉捷利康公司(AstraZeneca))、Ultrahaler(安内特公司)等。
在另一特定实施例中，医药组合物通过使用定量吸入器吸入来投与。所述定量吸入器通常使用压缩推进气体排出实测数量的治疗剂。因此，使用定量吸入器投与的医药组合物通常包含治疗剂于液化推进剂中的溶液或悬浮液。可使用任何适合液化推进剂，包括氢氟烷烃(HFA)，例如1，1，1，2-四氟乙烷(HFA 134a)及1，1，1，2，3，3，3-七氟-正丙烷(HFA227)；及氯氟碳化物，例如CCl3F。在特定实施例中，推进剂为氢氟烷烃。在某些实施例中，氢氟烷烃调配物含有共溶剂(例如乙醇或戊烷)和/或表面活性剂(例如脱水山梨糖醇三油酸酯、油酸、卵磷脂和甘油)。
用于定量吸入器的代表医药组合物包含约0.01重量％到约5重量％的本发明的结晶草酸盐；约0重量％到约20重量％的乙醇；和约0重量％到约5重量％的表面活性剂；其余部分为HFA推进剂。所述组合物一般系通过添加经冷冻或加压的氢氟烷烃到含有活性剂、乙醇(如果存在)和表面活性剂(如果存在)的合适容器中来制备。为制备悬浮液，将治疗剂微粉化并且随后与推进剂组合。组合物接着装载到气溶胶罐中，其通常形成定量吸入器装置的一部分。
适用于通过吸入投与治疗剂的定量吸入器装置在此项技术中有所描述并且所述装置的实例可从市售商品取得。举例而言，代表性定量吸入器装置或产品包括AeroBid吸入器***(森林制药公司(Forest Pharmaceuticals))、Atrovent吸入气溶胶(德国勃林格殷格翰制药公司)、Flovent(葛兰素史克股份有限公司)、Maxair吸入器(3M公司)、Proventil吸入器(先灵公司(Schering))、Serevent吸入气溶胶(葛兰素史克股份有限公司)等。
在另一特定实施例中，医药组合物通过使用喷雾吸入器吸入投与。所述喷雾器装置通常产生高速空气流，其引起医药组合物呈薄雾形式喷雾送到患者的呼吸道中。因此，当调配用于喷雾吸入器时，治疗剂可溶解于适合载剂中形成溶液。或者，治疗剂可经微粉化并且与适合载剂组合，以形成微粉化颗粒的悬浮液。
用于喷雾吸入器的代表性医药组合物包含等渗水性悬浮液，其包含约0.05μg/mL到约10mg/mL的呈微粉化形式的本发明的结晶草酸盐。在一个实施例中，溶液pH值为约4到约6。
适用于通过吸入投与治疗剂的喷雾器装置已说明于相关技术中，并且所述装置的实例可从市售商品取得。举例而言，代表性喷雾器装置或产品包括Respimat Softmist吸入器(德国勃林格殷格翰制药公司)、AERx肺传送***(阿拉迪姆公司(Aradigm Corp.))、PARI LC Plus重复使用式喷雾器(德国百瑞公司(Pari GmbH))等。
如果需要，本发明的结晶草酸盐可与一种或一种以上其它治疗剂组合投与。在本发明的此方面中，本发明的结晶草酸盐与其它治疗剂物理性混合，以形成含有两种药剂的组合物；或各药剂同时或相继分开向患者投与。
举例而言，本发明的结晶草酸盐可使用常规程序和设备与第二治疗剂组合，形成包含本发明的结晶草酸盐和第二治疗剂的组合物。另外，治疗剂可与医药学上可接受的载剂组合，以形成包含本发明的结晶草酸盐、第二治疗剂和医药学上可接受的载剂的医药组合物。在此实施例中，通常混合或掺合组合物的组份，以产生物理混合物。物理混合物接着使用任何本文中所描述的途径向患者投与。
或者，治疗剂在投与患者之前可保持分离并且独立。在此实施例中，治疗剂在投与之前不物理混合在一起但作为独立药剂或组合物同时或相继投与。举例而言，本发明的结晶草酸盐可与另一治疗剂同时或相继通过使用吸入传送装置(其使用用于各治疗剂的独立区室(例如泡罩包装))吸入来投与。或者，组合可使用独立传送装置投与，也就是用于各治疗剂的一种传送装置。另外，治疗剂可通过不同投与途径传送，也就是一种通过吸入传送并且另一通过口服传送。
任何与本发明的结晶草酸盐相容的治疗剂可与所述盐组合使用。在特定实施例中，第二治疗剂为通过吸入有效地投与的治疗剂。经由例证说明，可使用的治疗剂的代表性类型包括(但不限于)：消炎剂，例如类固醇消炎剂(包括皮质类固醇和糖皮质激素)、非类固醇消炎剂(NSAID)和PDE4抑制剂；支气管扩张剂，例如PDE3抑制剂、腺苷2b调节剂和β2肾上腺素能受体激动剂；抗感染剂，例如革兰氏阳性(Gram-positive)抗生素、革兰氏阴性(Gram-negative)抗生素和抗病毒剂；抗组织胺剂；蛋白酶抑制剂；传入阻断剂，例如D2激动剂和神经激肽调节剂；和蕈毒碱受体拮抗剂(抗胆碱能剂)。所述治疗剂的许多实例在此项技术中已知。这些其它治疗剂的适合剂量也在此项技术中已知并且通常介于约0.05微克/日到约500毫克/日的范围内。在一个实施例中，第二治疗剂适用于治疗肺病症。
在特定实施例中，本发明的结晶草酸盐与类固醇消炎剂组合投与。代表性类固醇消炎剂包括(但不限于)：二丙酸倍氯米松(beclomethasone dipropionat)；布***(budesonide)；丙酸布替可特(butixocort propionate)；20R-16α，17α-[亚丁基双(氧基)]-6α，9α-二氟-11β-羟基-17β-(甲硫基)雄甾-4-烯-3-酮(RPR-106541)；环索奈德；***(dexamethasone)；6α，9α-二氟-17α-[(2-呋喃基羰基)氧基]-11β-羟基-16α-甲基-3-氧代雄甾-1，4-二烯-17β-硫代甲酸S-氟甲基酯；6α，9α-二氟-11β-羟基-16α-甲基-17α-[(4-甲基-1，3-噻唑-5-羰基)氧基]-3-氧代雄甾-1，4-二烯-17β-硫代甲酸S-氟甲基酯；6α，9α-二氟-11β-羟基-16α-甲基-3-氧代-17α-丙酰基氧基雄甾-1，4-二烯-17β-硫代甲酸(S)-(2-氧代四氢呋喃-3S-基)酯；氟尼缩松(flunisolide)；糠酸氟替卡松(fluticasone furoate)；丙酸氟替卡松(fluticasone propionate)；甲基去氢皮质醇(methyl prednisolone)；糠酸莫美他松(mometasone furoate)；去氢皮质醇；强的松(prednisone)；罗氟奈德(rofleponide)；ST-126；曲安奈德(triamcinolone acetonide)等和其医药学上可接受的盐和溶剂合物。所述类固醇消炎剂可从市售商品取得或可使用常规程序和试剂制备。举例而言，类固醇消炎剂的制备和用途在2003年3月25日颁布的美国专利第6,537,983号、2004年6月15日颁布的美国专利第6,750,210B2号、2004年7月6日颁布的美国专利第6,759,398B2号、2005年2月22日颁布的美国专利第6,858,596B2号、2006年9月5日颁布的U.S.7,101,866B2和其中引用的参考文献中有所描述。
当使用类固醇消炎剂时，其通常以当与本发明的结晶草酸盐共投与时产生治疗上有益效应的量投与。通常，类固醇消炎剂投与量足以提供每剂量约0.05μg到约500μg的药剂。
代表性医药组合物包括(但不限于)以下实例：
A.干粉组合物
将本发明的微粉化结晶草酸盐(100mg)与干燥磨成粉的乳糖(25g)掺合。接着将此经掺合的混合物以足以提供每剂量约10μg到约500μg的本发明的结晶草酸盐的量装载到可剥离泡罩包装的个别泡罩中。泡罩的内容物使用干粉吸入器投与。
B.干粉组合物
将本发明的微粉化结晶草酸盐(1g)与干燥磨成粉的乳糖(200g)掺合以形成结晶草酸盐与乳糖的重量比为1∶200的总成分。将经掺合的组合物塞入能够传送每剂量约10μg到约500μg的本发明的结晶草酸盐的干粉吸入装置中。
C.干粉组合物
将本发明的微粉化结晶草酸盐(100mg)和微粉化类固醇消炎剂(500mg)与干燥磨成粉的乳糖(30g)掺合。接着将此经掺合的混合物以足以提供每剂量约10μg到约500μg的本发明的结晶草酸盐的量装载到可剥离泡罩包装的个别泡罩中。泡罩的内容物使用干粉吸入器投与。
D.定量吸入器组合物
将本发明的微粉化结晶草酸盐(10g)分散于通过溶解卵磷脂(0.2g)于脱矿物质水(200mL)中制备的溶液中。将所得悬浮液喷雾干燥并且接着微粉化以形成微粉化组合物，其包含平均直径小于约1.5μm的粒子。接着将微粉化组合物装载到含有加压1，1，1，2-四氟乙烷的定量吸入器药筒中，当通过定量吸入器投与时，其量足以提供每剂量约10μg到约500μg的本发明的结晶草酸盐。
效用
联苯-2-基胺基甲酸1-(2-{[4-(4-{[(R)-2-羟基-2-(8-羟基-2-氧代-1，2-二氢喹啉-5-基)乙氨基]甲基}苯基胺甲酰基)丁基]甲基胺甲酰基}乙基)哌啶-4-基酯同时拥有β2肾上腺素能受体激动剂和蕈毒碱受体拮抗剂活性，并且因此预期此化合物的草酸盐适用作治疗通过β2肾上腺素能受体或蕈毒碱受体所介导的医学病况(也就是通过以β2肾上腺素能受体激动剂或蕈毒碱受体拮抗剂治疗而改善的医学病况)的治疗剂。
所述医学病况在此项技术中已知，如通过例如以下教示例示：艾格伦(Eglen)等人，蕈毒碱受体亚型：药理学和治疗潜能(Muscarinic Receptor Subtypes：Pharmacology andTherapuetic Potential)，DN&P 10(8)，462-469(1997)；艾米利安(Emilien)等人，β-肾上腺素能受体激动剂和拮抗剂的当今治疗用途和潜能(Current Therapeutic Uses and Potentialof beta-Adrenoceptor Agonists and Antagonists)，欧洲临床药学期刊(European J.ClinicalPharm.)，53(6)，389-404(1998)；和其中引用的参考文献。举例而言，所述医学病况包括例如：与可逆性气管阻塞相关的肺病症或疾病，例如慢性阻塞性肺病、哮喘、支气管炎、肺气肿、肺纤维化，等等病症。慢性阻塞性肺病或COPD在此项技术中已知包括各种呼吸病况(其包括慢性阻塞性支气管炎和肺气肿)，如通过巴恩斯(Barnes)，慢性阻塞性肺病(Chronic Obstructive Pulmonary Disease)，新英格兰医学期刊(N.Engl.J.Med.)，2000：343：269-78的教示和其中引用的参考文献例示。其它病况包括早产、抑郁症、充血性心脏衰竭、皮肤病(例如发炎性、过敏性、牛皮癣性和增生性皮肤病)、其中需要降低胃液酸性的病况(例如消化性溃疡和胃溃疡)和肌肉萎缩病。
在一个方面中，本发明提供本发明的结晶草酸盐用于治疗。举例而言，本发明的结晶草酸盐可用于治疗肺病症，例如慢性阻塞性肺病或哮喘。
当用以治疗肺病症时，本发明的结晶草酸盐投与需要治疗的患者。在一个实施例中，结晶草酸盐通过吸入投与。本发明的结晶草酸盐可依每日多次剂量(例如每日两次或每日三次)、依每日一次剂量(例如每日一次)、依每周单次剂量或视需要投与。一般，用于治疗肺病症的剂量将介于约10微克/日到约1,000微克/日的范围内。
当通过吸入投与哺乳动物时，本发明的结晶草酸盐通常引起支气管扩张，并且因此本发明的结晶草酸盐适用作在哺乳动物(例如人类、犬、天竺鼠、大鼠，等等动物)中引起支气管扩张的药剂。在此实施例中，本发明的结晶草酸盐通常通过让哺乳动物吸入可以引起支气管扩张的量来投药。一般，引起支气管扩张的剂量将介于约0.25μg/kg到约20μg/kg的范围内。
当用作治疗剂时，本发明的结晶草酸盐任选与一种或一种以上其它治疗性组合投与。具体来说，通过与类固醇消炎剂一起投与本发明的结晶草酸盐，三重肺治疗法(也就是β2肾上腺素能受体激动剂活性、蕈毒碱受体拮抗剂活性和消炎活性)可仅使用两种治疗剂实现。因为含有两种治疗剂的医药组合物(和组合)与含有三种治疗剂的组合物相比通常较易于调配和/或投与，所以所述两组份组合物提供优于含有三种治疗剂的组合物的显著优势。因此，在特定实施例中，本发明的医药组合物、组合和方法进一步包含类固醇消炎剂或其医药学上可接受的盐或溶剂合物。
本发明结晶草酸盐的性质和效用可使用所属领域的技术人员已知的各种活体外和活体内分析得以证明。举例而言，代表性分析在以下实例中加以描述。
实例
提供以下实例以说明本发明的各种代表性实施例和方面并且除非特别指示，否则不意欲以任何方式限制本发明的范畴。
以下实例中所用的所有试剂、起始物质和溶剂购自商业供应商(例如密苏里州圣路易斯西格玛-奥德里奇化学品公司(Sigma-Aldrich Chemical Company，St.Louis，MO))并且除非另外指示，否则无需进一步纯化即可使用。以下缩写用于稀释剂：DCM＝二氯甲烷；DMF＝N，N-二甲基甲酰胺；DMSO＝二甲亚砜；EtOAc＝乙酸乙酯；MeOH＝甲醇；和THF＝四氢呋喃。
除非另外指示，否则1H NMR光谱在400MHz瓦里安(Varian)AS400光谱仪上记录。化学位移以ppm为单位相对于作为内标的四甲硅烷(TMS)报告为δ值。耦合常数(J值)以赫兹(Hz)为单位提供并且多重性使用以下缩写报告：s＝单峰，d＝双峰，t＝三重峰，q＝四重峰，m＝多重峰，br＝宽峰，nd＝未测定。
液相色谱质谱分析(LC-MS)条件
使用Agilent 1100液相色谱***-G1312A二元泵(Agilent Technologies)、ZORBAX快速解析3.5μm Rx，Bonus-RP管柱(3.5μm粒径；2.1mm×50mm)(安捷伦技术公司(Agilent Technologies))和API 150EX单四极LC/MS质谱仪(铂金埃尔默Sciex仪器公司(Perkin-Elmer Sciex Instruments))获得LC-MS数据。所用溶剂***为：
溶剂A：   98％水和2％乙腈(v/v)+1mL/L TFA
溶剂B：   90％乙腈和10％水(v/v)+1mL/L TFA
流动速率：500μL/min
梯度：(方法10到90)：10％B到90％B历时3分钟
      (方法2到90)：2％B到90％B历时3分钟
      (方法10到70)：10％B到70％B历时3分钟。
HPLC条件
使用HP 1100系列HPLC***(安捷伦技术公司)和ZORBAX快速解析3.5μm Rx，Bonus-RP管柱(3.5μm粒径；2.1mm×50mm)(安捷伦技术公司)或Ascentis Express C18HPLC管柱(2.7μm粒径，3.0mm×3cm)进行HPLC。所用溶剂***为：
溶剂A：98％水和2％乙腈(v/v)+1mL/L TFA
溶剂B：90％乙腈和10％水(v/v)+1mL/L TFA
流动速率：500μL/min
梯度：(方法10到50)：10％B到50％B历时6分钟
      (方法10到70)：10％B到70％B历时6分钟
      (方法2到90)：2％B到90％B历时6分钟。
实例1
制备3-[4-(联苯-2-基胺甲酰基氧基)哌啶-1-基]丙酸
在50℃下加热联苯-2-基胺基甲酸哌啶-4-基酯(50.0g，168.7mmol)(参见例如2006年2月16日公开的美国专利公开案第2006/0035931 A1号)和丙烯酸(15.1mL，219.3mmol)于DCM(500mL)中的搅拌溶液过夜。在减压下浓缩反应混合物并且溶解残余物于MeOH(600mL)中。在75℃下加热所得溶液2h并且随后使其在室温下静置约48h。所得固体通过过滤收集、以MeOH洗涤并且干燥得到标题化合物(61.5g，99％产率)。
实例2
制备5-甲氨基戊酸甲酯盐酸盐
在100℃下加热1-甲基-2-哌啶酮(4.40mL，40.0mmol)于含水氢氧化钠(4M，11.0mL，44.0mmol)中的搅拌溶液15h。将反应混合物冷却到室温并且随后以浓盐酸酸化到pH值为2。随后在减压下浓缩混合物得到呈带粉红色的白色固体状的粗产物5-甲氨基戊酸。向粗产物5-甲氨基戊酸中添加MeOH(40.0mL，987mmol)和浓盐酸(0.33mL，4.0mmol)。在60℃下加热所得混浊溶液39h，此时LC-MS展示剩余起始物质。另外添加浓盐酸(0.33mL，4.0mmol)并且在60℃下加热所得混合物33h并且随后在65℃下再加热24h。LC-MS展示剩余起始物质。在减压下浓缩反应混合物并且添加氯化氢于MeOH(1.25M)中的溶液到残余物。在60℃下加热所得混合物72h，此时通过LC-MS观察不到剩余起始物质。在减压下部分浓缩反应混合物并且通过过滤、以MeOH洗涤来去除形成的固体物质。随后在减压下浓缩滤液以提供呈淡黄色固体状的5-甲氨基戊酸甲酯盐酸盐(7.57g，100％产率)。
LC-MS(方法2到90)：Rt 1.10min；m/z 146.4[M+H]+。1H NMR(CD3OD)δ4.86(s)，3.66(s)，3.30(t)，3.00(t)，2.69(s)，2.41(t)，1.71(m)。
实例3
制备5-({3-[-(联苯-2-基胺甲酰基氧基)哌啶-1-基]丙酰基}甲氨基)戊酸甲酯
在室温下搅拌5-甲氨基戊酸甲酯盐酸盐(7.27g，40.0mmol)、3-[4-(联苯-2-基胺甲酰基氧基)哌啶-1-基]丙酸(13.3g，36.0mmol)和1-羟基-7-氮杂苯并***(5.14g，37.8mmol)于DCM(160mL)和二甲基吡啶(12.5mL，108mmol)中的混合物3h。添加N-(3-二甲氨基丙基)-N′-乙基碳化二亚胺盐酸盐(10.4g，54.0mmol)并且在室温下搅拌所得混合物2h。添加碳酸氢钠饱和水溶液(约100mL)并且分离各层。以DCM(50mL)萃取水层并且合并有机层、经硫酸钠干燥、过滤并且在减压下浓缩。通过硅胶急骤色谱法(30％到100％EtOAc于己烷中；随后2％到10％MeOH于DCM中)纯化残余物得到呈淡黄色稠油/白色固体状的标题化合物(12.38g，69％产率)。
LC-MS(方法2到90)：Rt 2.43min；m/z 496.6[M+H]+。1H NMR(CDCl3)δ8.10(d，1H)，7.40(m，6H)，7.20(m，2H)，6.58(s，1H)，4.74(m，1H)，3.66(d，3H)，3.37(t，1H)，3.29(m，1H)，2.97(s，2H)，2.91(s，1H)，2.70(m，4H)，2.49(m，2H)，2.34(m，4H)，1.92(m，2H)，1.60(m，5H)。
实例4
制备5-({3-[-(联苯-2-基胺甲酰基氧基)哌啶-1-基]丙酰基}甲氨基)戊酸
向5-({3-[4-(联苯-2-基胺甲酰基氧基)哌啶-1-基]丙酰基}-甲氨基)戊酸甲酯(10.21g，20.60mmol)、第三丁醇(20mL)和水(20mL)的混合物中添加1∶1 LiOH∶水的混合物(1.97g，41.2mmol)。在室温下搅拌所得混合物4h并且随后使用盐酸水溶液(1N)调整混合物的pH值到约pH 2。以DCM(约80mL，2次)萃取水层并且合并有机层、经硫酸钠干燥、过滤并且在减压下浓缩得到呈灰白色多泡沫固体状的标题化合物(12.23g，定量)(含有残余第三丁醇)。
LC-MS(方法2到90)：Rt 2.32min；m/z 482.4[M+H]+。
实例5
制备2-(4-硝基苯基)-1，3-二氧杂环戊烷
在120℃下在配备有迪恩-斯达克分水器(Dean-Stark trap)的烧瓶中加热对硝基苯甲醛(101.5g，672mmol)、乙二醇(112mL)和对甲苯磺酸(12.8g，67.2mmol)于甲苯(800mL)中的搅拌溶液4h。冷却到室温之后，在减压下浓缩反应混合物。向残余物中添加饱和碳酸氢钠水溶液(800mL)并且在室温下搅拌此混合物15min。通过过滤分离所得固体并且在真空下干燥得到呈黄色固体状的标题化合物(121.8g，92％产率)。
1H NMR(DMSO-d6)：δ＝8.12(d，2H)，7.59(d，2H)，5.78(s，1H)，3.8-4.0(m，4H)。
实例6
制备4-(1，3-二氧杂环戊烷-2-基)苯胺
在干氮气下向二氧化铂(227mg，1.00mmol)和碳酸氢钠(420mg，5.00mmol)的混合物中添加2-(4-硝基苯基)-1，3-二氧杂环戊烷(976mg，5.00mmol)于EtOH(30.0mL)中的溶液。以氢气鼓泡反应混合物15min并且随后在氢气氛(气球)下搅拌2h。反应混合物随后经硅藻土垫以MeOH洗涤来过滤。在减压下浓缩滤液得到标题化合物(0.80g，96％产率)。
实例7
制备联苯-2-基胺基甲酸1-(2-{[4-(4-(1，3-二氧杂环戊烷-2-基)苯基胺甲酰基)丁基]甲基胺甲酰基}乙基)哌啶-4-基酯
向5-({3-[4-(联苯-2-基胺甲酰基氧基)哌啶-1-基]丙酰基}甲氨基)戊酸(2.33g，4.84mmol)、4-(1，3-二氧杂环戊烷-2-基)苯胺(800mg，5mmol)和N，N-二异丙基乙胺(1.26mL，7.26mmol)于DCM(48.4mL)中的搅拌溶液中添加1-羟基-7-氮杂苯并***(692mg，5.08mmol)和N-(3-二甲氨基丙基)-N′-乙基碳化二亚胺盐酸盐(1.39g，7.26mmol)。在室温下搅拌所得混合物过夜。反应混合物随后以碳酸氢钠饱和水溶液洗涤、经硫酸钠干燥、过滤并且在减压下浓缩得到呈黄色固体状的标题化合物(3.04g，100％产率)。
LC-MS(方法10到70)：Rt 2.67min；m/z 629.6[M+H]+。
实例8
制备联苯-2-基胺基甲酸1-(2-{[4-(4-甲酰基苯基胺甲酰基)丁基]甲基胺甲酰基}乙基)哌啶-4-基酯
在50℃下加热联苯-2-基胺基甲酸1-(2-{[4-(4-(1，3-二氧杂环戊烷-2-基)苯基胺甲酰基)丁基]甲基胺甲酰基}乙基)哌啶-4-基酯(3.04g，4.84mmol)于含水盐酸(1M，10mL)和乙腈(10mL)中的搅拌混合物2h。在减压下浓缩反应混合物并且添加碳酸氢钠饱和水溶液和DCM到残余物。分离各层并且经硫酸钠干燥有机层、过滤并且在减压下浓缩得到标题化合物(2.83g，100％产率)。
LC-MS(方法10到70)：Rt 2.67min；m/z 585.4[M+H]+。
实例9
制备联苯-2-基胺基甲酸1-(2-{[4-(4-{[(R)-2-(第三丁基二甲基硅烷氧基)-2-(8-羟基-2-氧代-1，2-二氢喹啉-5-基)乙氨基]甲基}苯基胺甲酰基)丁基]甲基胺甲酰基}乙基)哌啶-4-基酯
向联苯-2-基胺基甲酸1-(2-{[4-(4-甲酰基苯基胺甲酰基)丁基]甲基胺甲酰基}乙基)哌啶-4-基酯(2.83g，4.84mmol)和5-[(R)-2-氨基-1-(第三丁基二甲基硅烷氧基)乙基]-8-羟基-1H-喹啉-2-酮乙酸盐(1.91g，4.84mmol)于MeOH∶DCM 1∶1的混合物(40.0mL，312mmol)中的搅拌溶液中添加三乙酰氧基硼氢化钠(3.08g，14.5mmol)。在室温下搅拌反应混合物2h并且随后分离各层。以碳酸氢钠饱和水溶液洗涤有机层、经硫酸钠干燥、过滤并且在减压下浓缩得到黄色固体。通过硅胶急骤色谱法(0到30％MeOH于DCM+0.5％NH4OH中)纯化固体得到呈黄色固体状的标题化合物(3.60g，82％产率)。
LC-MS(方法10到70)：Rt 2.72min；m/z 903.8[M+H]+。
实例10
制备联苯-2-基胺基甲酸1-(2-{[4-(4-{[(R)-2-羟基-2-(8-羟基-2-氧代-1，2-二氢喹啉-5-基)乙氨基]甲基}苯基胺甲酰基)丁基]甲基胺甲酰基}乙基)哌啶-4-基酯二(三氟乙酸)盐
向联苯-2-基胺基甲酸1-(2-{[4-(4-{[(R)-2-(第三丁基二甲基硅烷氧基)-2-(8-羟基-2-氧代-1，2-二氢喹啉-5-基)乙氨基]甲基}苯基胺甲酰基)丁基]甲基胺甲酰基}乙基)哌啶-4-基酯(3.60g，3.98mmol)于DCM∶DMF 9∶1的混合物(32.9mL)中的搅拌溶液中添加三氢氟化三乙胺(195mL，12.0mmol)。在室温下搅拌所得混合物过夜并且随后在减压下浓缩。通过HPLC(方法10到70)纯化残余物得到呈白色固体状的标题化合物(1.90g，46％产率)。
LC-MS(方法10到70)：Rt 2.12min；m/z 789.6[M+H]+。
实例11
制备联苯-2-基胺基甲酸1-(2-{[4-(4-{[(R)-2-羟基-2-(8-羟基-2-氧代-1，2-二氢喹啉-5-基)乙氨基]甲基}苯基胺甲酰基)丁基]甲基胺甲酰基}乙基)哌啶-4-基酯二氢氟酸盐
向联苯-2-基胺基甲酸1-(2-{[4-(4-{[(R)-2-(第三丁基二甲基硅烷氧基)-2-(8-羟基-2-氧代-1，2-二氢喹啉-5-基)乙氨基]甲基}苯基胺甲酰基)丁基]甲基胺甲酰基}乙基)哌啶-4-基酯(3.87g，4.28mmol)于DCM(20mL)和DMF(2.5mL)的混合物中的搅拌溶液中添加三氢氟化三乙胺(2.1mL，13mmol)。在室温下搅拌所得混合物过夜。添加DCM(68mL)到反应混合物，并且随后在搅拌下逐滴添加EtOAc(68mL)。形成的浅色沉淀产生浆液。经中等孔隙率烧结玻璃过滤器过滤浆液混合物并且滤饼以EtOAc(10mL，2次)冲洗并且随后在氮气压力上压缩干燥得到标题化合物(3.73g，99％产率)。
实例12
制备联苯-2-基胺基甲酸1-(2-{[4-(4-{[(R)-2-羟基-2-(8-羟基-2-氧代-1，2-二氢喹啉-5-基)乙氨基]甲基}苯基胺甲酰基)丁基]甲基胺甲酰基}乙基)哌啶-4-基酯
将联苯-2-基胺基甲酸1-(2-{[4-(4-{[(R)-2-羟基-2-(8-羟基-2-氧代-1，2-二氢喹啉-5-基)乙氨基]甲基}苯基胺甲酰基)-丁基]甲基胺甲酰基}乙基)哌啶-4-基酯二氢氟酸盐(15.2g，16.7mmol)于含有10％0.5M氢氧化铵于MeOH中的DCM溶液(150mL总溶液)中的溶液装载到粗糙烧结玻璃漏斗中的硅胶(80g)上，所述漏斗已预先以含有10％0.5M氢氧化铵于MeOH中的DCM溶液(200mL)润湿。硅胶依次以含有20％0.5M氢氧化铵于MeOH中的DCM溶液(1000mL，1次)和含有25％0.5M氢氧化铵于MeOH中的DCM溶液(1000mL，1次)冲洗。在减压下浓缩滤液得到黄色玻璃状固体(13.6g)。此物质溶解于DCM(600mL)中并且经烧结玻璃过滤器过滤所得溶液并且以DCM(150mL，3次)洗涤过滤器。在减压下浓缩滤液并且使用油浴将残余物升温到50℃并且保持在高真空下过夜以提供标题化合物(12.7g)(含有约6重量％的DCM)。
实例13
制备结晶联苯-2-基胺基甲酸1-(2-{[4-(4-{[(R)-2-羟基-2-(8-羟基-2-氧代-1，2-二氢喹啉-5-基)乙氨基]甲基}苯基胺甲酰基)丁基]甲基胺甲酰基}乙基)哌啶-4-基酯草酸盐水合物盐(形式2)
向联苯-2-基胺基甲酸1-(2-{[4-(4-{[(R)-2-羟基-2-(8-羟基-2-氧代-1，2-二氢喹啉-5-基)乙氨基]甲基}苯基胺甲酰基)丁基]甲基胺甲酰基}乙基)哌啶-4-基酯(0.50g，0.63mmol)于THF(5mL，60mmol)中的搅拌溶液中逐滴添加草酸二水合物(80mg，0.63mmol)于MeOH(2mL，50mmol)中的溶液。立即形成灰白色沉淀，并且固体在5min的时期内聚结形成粘性球。随后在60℃下加热反应混合物2h，此时混合物已形成灰白色极细粒的浓浆。缓慢冷却此混合物到室温并且随后搅拌约72h。试图过滤混合物但大部分沉淀物穿过过滤器。随后在减压下浓缩滤液形成残余物。
移出约四分的一的残余物并且将其溶解于10％(v/v)水于MeOH中的热溶液中。冷却此溶液到室温但没有沉淀物形成。随后使溶液静置并且在4天的时期内在室温下缓慢蒸发，其产生展示一些双折射率的颗粒。在5天的时期内继续搅拌同时不定期超声波处理以形成展示更好双折射率的白色浆液物质。通过过滤收集此物质并且在高真空下在室温下干燥2h得到标题化合物。PXRD图展示此物质为结晶或半晶质。
实例14
制备结晶联苯-2-基胺基甲酸1-(2-{[4-(4-{[(R)-2-羟基-2-(8-羟基-2-氧代-1，2-二氢喹啉-5-基)乙氨基]甲基}苯基胺甲酰基)丁基]甲基胺甲酰基}乙基)哌啶-4-基酯草酸盐水合物盐(形式2)
向联苯-2-基胺基甲酸1-(2-{[4-(4-{[(R)-2-羟基-2-(8-羟基-2-氧代-1，2-二氢喹啉-5-基)乙氨基]甲基}苯基胺甲酰基)丁基]甲基胺甲酰基}乙基)哌啶-4-基酯(0.65g，0.824mmol)于MeOH(12.4mL)中的搅拌溶液中逐滴添加草酸二水合物(104mg，0.824mmol)于水(0.6mL)中的溶液。立即形成微粘性沉淀物并且添加来自实例13的晶种。在室温下搅拌所得浆液约72小时并且随后超声波处理5min。随后在30℃下搅拌浆液过夜。随后将浆液冷却到0℃，搅拌30分钟并且过滤以收集沉淀物。将滤饼风干1h并且随后在高真空下在室温下干燥2h得到标题化合物(705mg，96％产率，大于99％纯度)。
实例15
暴露形式2到高相对湿度
将联苯-2-基胺基甲酸1-(2-{[4-(4-{[(R)-2-羟基-2-(8-羟基-2-氧代-1，2-二氢喹啉-5-基)乙氨基]甲基}苯基胺甲酰基)丁基]甲基胺甲酰基}乙基)哌啶-4-基酯草酸盐水合物(约100mg；来自实例14)铺于放在培养皿中的滤纸上。培养皿放在饱和氯化钾水溶液(100mL)上方的多孔板上的干燥器中并且干燥器密封。腔室内的相对湿度如通过湿度计测量保持在约84％RH。三天之后，从干燥器中去除固体。此物质的PXRD、DSC、TGA和DMS图分别展示于图4、5、6和7中。
实例16
制备结晶联苯-2-基胺基甲酸1-(2-{[4-(4-{[(R)-2-羟基-2-(8-羟基-2-氧代-1，2-二氢喹啉-5-基)乙氨基]甲基}苯基胺甲酰基)丁基]甲基胺甲酰基}乙基)哌啶-4-基酯草酸盐水合物盐(形式2)
向联苯-2-基胺基甲酸1-(2-{[4-(4-{[(R)-2-羟基-2-(8-羟基-2-氧代-1，2-二氢喹啉-5-基)乙氨基]甲基}苯基胺甲酰基)丁基]甲基胺甲酰基}乙基)哌啶-4-基酯(1.0g，1.27mmol)于MeOH(19mL)中的搅拌溶液中逐滴添加草酸二水合物(160mg，1.269mmol)于水(1.0mL)中的溶液。立即形成粘性带黄色的沉淀物。在40℃下加热反应混合物过夜并且随后超声波处理5min。随后在40℃下加热反应混合物18h，冷却到0℃，通过过滤收集沉淀物。干燥沉淀物得到标题化合物(1.05g，93％产率，大于99％纯度)。
实例17
暴露形式2到高相对湿度
在干燥器底部制备过饱和氯化钾水溶液(在广泛漩涡之后保持固体KCl)。将联苯-2-基胺基甲酸1-(2-{[4-(4-{[(R)-2-羟基-2-(8-羟基-2-氧代-1，2-二氢喹啉-5-基)乙氨基]甲基}苯基胺甲酰基)丁基]甲基胺甲酰基}乙基)哌啶-4-基酯草酸盐水合物(500mg，0.569mmol；来自实例16)铺于称量纸中并且将称量纸放在干燥器中的KCl溶液顶上的多孔塑料板上并且封闭干燥器。由于KCl溶液的平衡蒸气压，干燥器内的相对湿度维持于84％RH。在3、5和10天之后得到部分草酸盐的PXRD图。PXRD图展示草酸盐的结晶度改良了高达5天。结晶度的变化在5到10天为可忽略的。
实例18
制备结晶联苯-2-基胺基甲酸1-(2-{[4-(4-{[(R)-2-羟基-2-(8-羟基-2-氧代-1，2-二氢喹啉-5-基)乙氨基]甲基}苯基胺甲酰基)丁基]甲基胺甲酰基}乙基)哌啶-4-基酯草酸盐水合物盐(形式2)
向联苯-2-基胺基甲酸1-(2-{[4-(4-{[(R)-2-羟基-2-(8-羟基-2-氧代-1，2-二氢喹啉-5-基)乙氨基]甲基}苯基胺甲酰基)丁基]甲基胺甲酰基}乙基)哌啶-4-基酯(11.0g，13.9mmol)于MeOH(400mL)中的搅拌溶液中逐滴添加草酸二水合物(1.758g，13.9mmol)于水(22mL)中的溶液。立即形成粘性沉淀物。在室温下搅拌反应混合物过夜并且随后超声波处理5min。随后在室温下搅拌反应混合物48h并且随后在40℃下加热8h。使反应混合物缓慢冷却到周围温度并且随后在30℃下加热约72h。通过过滤收集沉淀物、以MeOH(50mL，1次)洗涤并且在高真空下干燥过夜得到标题化合物(11.6g，94％产率，大于99％纯度)。
实例19
制备结晶联苯-2-基胺基甲酸1-(2-{[4-(4-{[(R)-2-羟基-2-(8-羟基-2-氧代-1，2-二氢喹啉-5-基)乙氨基]甲基}苯基胺甲酰基)丁基]甲基胺甲酰基}乙基)哌啶-4-基酯草酸盐异丙醇溶剂合物盐(形式1)
将结晶联苯-2-基胺基甲酸1-(2-{[4-(4-{[(R)-2-羟基-2-(8-羟基-2-氧代-1，2-二氢喹啉-5-基)乙氨基]甲基}苯基胺甲酰基)丁基]甲基胺甲酰基}乙基)哌啶-4-基酯草酸盐水合物(约40mg)悬浮于5％(v/v)水于异丙醇(4mL)中的溶液中并且在室温下以200rpm搅拌所得浆液。三天之后，通过抽吸过滤来过滤浆液并且在空气中干燥固体得到标题化合物(36mg)。
此物质的PXRD、DSC和TGA光谱分别展示于图1、2和3中。
实例20
粉末X射线衍射
使用Rigaku MiniFlex X射线衍射仪执行粉末X射线衍射分析。X射线源为Cu-Kα辐射输出电压为20kV并且电流为15mA。以Bragg-Brentano几何学运行仪器，设定入射、发散和散射狭缝以使样品的强度达到最大。为了测量，将少量粉末(5到25mg)平缓地压到单晶硅样品夹上形成平滑表面并且使其经受X射线曝光。以2θ-2θ模式从2°到40°扫描样品，2θ步长为0.03°并且扫描速度为每分钟2.0°。数据采集由日本理学电机(Rigaku)标准测定软件(版本1.2.0.0)控制并且通过Jade软件(版本7.5.1)分析。
形式1和形式2的代表性原始未加工的PXRD图分别展示于图1和图4中。观察到的形式1和形式2的PXRD 2θ峰位和d间距分别展示于表1和2中(仅列出具有约20％或更大的相对峰高(H％)的峰)。
表1-形式1的PXRD数据
1距基线的峰高。
2与最高峰相比的峰高％。
表2-形式2的PXRD数据
1距基线的峰高。
2与最高峰相比的峰高％。
实例21
差示扫描热量测定
使用具有热分析控制器的TA仪器Q-100型模组执行差示扫描热量测定(DSC)。收集数据并且使用TA仪器热溶液软件进行分析。将约2mg的样品精确称入有盖铝盘中。使用10℃/min的线性加热斜坡从周围温度到约300℃评估样品。在使用期间以干氮气净化DSC室。形式1和形式2的代表性DSC迹线分别展示于图2和图5中。
DSC迹线证明形式1和形式2具有极好热稳定性同时熔点在约162℃到164℃的范围内。
实例22
热解重量分析
使用配备有高解析能力的TA仪器Q-500型模组执行热解重量分析(TGA)。收集数据并且使用TA仪器热溶液软件进行分析。将重量为约10mg的样品置于铂盘上并且以高解析-加热速率从周围温度到300℃扫描。在使用期间以氮气流净化天平和炉腔。形式1和形式2的代表性TGA迹线分别展示于图3和图6中。
实例23
动态吸湿评估
使用SGA-100***的VTI大气微量天平(佛罗里达州海尔勒阿VTI公司(VTI Corp.，Hialeah，FL)33016)执行形式2的样品的动态吸湿(DMS)评估(也称为吸湿-脱湿型态)。使用约10mg的样品量并且在开始分析时将湿度设定为周围值。典型的DMS分析在5％相对湿度(RH)/步骤的扫描速率下由三种扫描组成：周围湿度到5％RH、5％RH到90％RH、90％RH到5％RH。每两分钟测量质量并且当5个连续点的样品质量稳定在在0.01％的内时将RH变为下一值(+/-5％RH)。形式2的代表性DMS迹线展示于图7中。
图7的DMS迹线显示形式2在5％RH到90％RH的湿度范围内具有约为1.6重量％的可忽略的重量增加。可逆吸湿/脱湿型态显示形式2拥有可接受的吸湿性并且不易潮解。盐的PXRD型态在DMS实验前后类似，其表明在吸湿和脱湿过程期间物理形式未发生变化。
生物分析和制备
实例A
从表达人类M1、M2、M3和M4蕈毒碱受体的细胞培养细胞和制备膜
分别稳定表达克隆人类hM1、hM2、hM3和hM4蕈毒碱受体亚型的CHO细胞系在补充有10％FBS和250μg/mL遗传霉素(Geneticin)的Hams F-12培养基中生长到近乎汇合。细胞在5％CO2，37℃培育箱中生长并且以2mM EDTA于dPBS中提升。通过在650×g下离心5分钟收集细胞，并且在-80℃下冷冻存储细胞团粒或立即制备膜以供使用。
为了制备膜，将细胞团粒再次悬浮于溶解缓冲液中并且以保利通(Polytron)PT-2100组织破碎机(凯恩迈特格(Kinematica)AG；20秒钟×2脉冲)匀化。在4℃下在40,000×g下离心粗产物膜15分钟。随后以再次悬浮缓冲液再次悬浮膜团粒并且再次以保利通组织破碎机匀化。
通过劳瑞(Lowry)等人，1951，生物化学期刊(Journal of Biochemistry)，193，265中所描述的方法测定膜悬浮液的蛋白质浓度。所有膜在-80℃下以等分试样冷冻存储或立即使用。
等分试样的所制备的hM5受体膜是购自铂金埃尔默公司(PerkinElmer，Inc.)(马萨诸塞州韦尔斯利(Wellesley，MA))并且在-80℃下存储直到使用。
实例B
蕈毒碱受体的放射性配体结合分析
在96孔微量滴定板中以100μL的总分析体积执行克隆蕈毒碱受体的放射性配体结合分析。将稳定表达hM1、hM2、hM3、hM4或hM5蕈毒碱受体亚型的CHO细胞膜在分析缓冲液中稀释到以下特定目标蛋白质浓度(微克/孔)：对于hM1为10μg、对于hM2为10μg到15μg、对于hM3为10μg到20μg、对于hM4为10μg到20μg并且对于hM5为10μg到12μg以得到类似信号(cpm)。在添加到分析板之前，膜使用Polytron组织破碎机短暂匀化(10秒)。
在0.001nM到20nM范围的浓度下使用L-[N-甲基-3H]莨菪碱氯甲烷([3H]-NMS)(TRK666，84.0Ci/mmol，英格兰白金汉郡安法玛西亚生物制药公司(Amersham PharmaciaBiotech，Buckinghamshire，England))执行用于测定放射性配体的KD值的饱和结合研究。
以1nM的[3H]-NMS和11种不同测试化合物浓度执行用于测定测试化合物的Ki值的置换分析。测试化合物最初在稀释缓冲液中溶解到浓度为400μM并且随后以稀释缓冲液连续稀释5倍到最终浓度范围介于10pM到100μM。添加顺序和添加到分析板的体积如下：25μL放射性配体、25μL稀释测试化合物和50μL膜。在37℃下培育分析板6小时。结合反应通过经于1％BSA中预处理的GF/B玻璃纤维滤板(铂金埃尔默公司)快速过滤来终止。将滤板以洗涤缓冲液(10mM HEPES)冲洗3次以去除未结合的放射性。随后将板风干并且添加50μL微森特(Microscint)-20液体闪烁流体(铂金埃尔默公司)到各孔。随后在铂金埃尔默拓普康(Topcount)液体闪烁计数器(铂金埃尔默公司)中对板进行计数。
以格拉夫派得普锐斯(GraphPad Prism)软件包(加利福利亚州圣地亚哥格拉夫派得(GraphPad)软件公司(GraphPad Software，Inc.，San Diego，CA))使用单位点竞争模型通过非线性回归分析来分析结合数据。使用程-普鲁萨福(Cheng-Prusoff)方程式(程(Cheng Y)；普鲁萨福(Prusoff W.H.)(1973)生化药理学期刊，22(23)：3099-108)从观察到的IC50值和放射性配体的KD值计算测试化合物的Ki值。将Ki值转化为pKi值以测定几何平均值和95％置信区间。随后将这些概括统计量转换回Ki值以供数据报告。
在此分析中，较低Ki值意指测试化合物对受体具有较高结合亲和力。在此分析中联苯-2基胺基甲酸1-(2-{[4-(4-{[(R)-2-羟基-2-(8-羟基-2-氧代-1，2-二氢喹啉-5-基)乙氨基]甲基}苯基胺甲酰基)丁基]甲基胺甲酰基}乙基)哌啶-4-基酯二(三氟乙酸)盐在hM3下具有0.1nM(数据舍入到最接近的0.1nM)的Ki值。
实例C
从表达人类β1、β2或β3肾上腺素能受体的细胞培养细胞和制备膜
稳定表达克隆人类β1和β2肾上腺素能受体的人类胚肾(HEK-293)细胞系或稳定表达克隆人类β3肾上腺素能受体的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系在500μg/mL遗传霉素存在下在含有10％FBS的DMEM或Hams F-12培养基中生长到近乎汇合。以2mM EDTA于PBS中提升细胞单层。通过在1,000rpm下离心使细胞成团，并且细胞团粒在-80℃下冷冻存储或立即制备膜以供使用。
为了制备表达β1和β2受体的膜，将细胞团粒再次悬浮于溶解缓冲液(10mMHEPES/HCl，10mM EDTA，在4℃下pH 7.4)中并且在冰上使用紧密装配的杜恩斯(Dounce)玻璃匀化器(30冲程)匀化。
为制备更多表达蛋白酶敏感性β3受体的膜，将细胞团粒在每50mL缓冲液(印第安纳州印第安纳波利斯罗氏分子生物化学公司(Roche Molecular Biochemicals，Indianapolis，IN))补充有一个片剂的“具有2mM EDTA的完全蛋白酶抑制剂混合物片剂”的溶解缓冲液(10mM Tris/HCl，pH 7.4)中匀化。将匀浆在20,000×g下离心，并且所得团粒通过如本文中所描述的再次悬浮和离心以溶解缓冲液洗涤一次。随后将最终团粒再次悬浮于冰冷结合分析缓冲液(75mM Tris/HCl pH 7.4，12.5mM MgCl2，1mM EDTA)中。
通过劳瑞等人，1951，生物化学期刊(Journal of Biological Chemistry)，193，265；和布拉德福(Bradford)，分析有机化学期刊(Analytical Biochemistry)，1976，72，248-54中所描述的方法测定膜悬浮液的蛋白质浓度。所有膜在-80℃下以等分试样冷冻存储或立即使用。
实例D
测定肾上腺素能受体激动剂效能的分析
根据制造商说明书，使用具有[125I]-cAMP(NEN SMP004，马萨诸塞州波士顿铂金埃尔默生命科学有限公司(PerkinElmer Life Sciences Inc.，Boston，MA))的闪烁板腺苷酰环化酶活化分析***以放射免疫分析格式执行cAMP分析。对于此分析，稳定表达克隆人类β1或β2受体的HEK-293细胞系在补充有10％FBS和遗传霉素(500μg/mL)的DMEM中生长到近乎汇合；或稳定表达克隆人类β3肾上腺素能受体的CHO-K1细胞系在补充有10％FBS和遗传霉素(250μg/mL)的Hams F-12培养基中生长到近乎汇合。细胞以PBS冲洗并且在含有2mM EDTA的dPBS(达尔伯克氏磷酸盐缓冲盐水(Dulbecco′s PhosphateBuffered Saline)，无CaCl2和MgCl2)或胰蛋白酶-EDTA溶液(0.05％胰蛋白酶/0.53mMEDTA)中脱离。在库尔特(Coulter)细胞计数器中计数细胞之后，通过在1,000rpm下离心使细胞成团并且再次悬浮于预升温到室温的含有IBMX(铂金埃尔默试剂盒(PerkinElmerKit))的刺激缓冲液中到浓度为1.6×106到2.8×106个细胞/毫升。在此分析中每孔使用约40,000到80,000个细胞。将测试化合物(10mM于DMSO)稀释到含有0.1％BSA的PBS于Beckman Biomek-2000中并且在11种不同的介于100μM到1pM范围内的浓度下测试。在37℃下培育反应10min并且通过添加含有[125I]-cAMP(NEN SMP004，马萨诸塞州波士顿铂金埃尔默生命科学有限公司)的100μL冷检测缓冲液终止。如制造商使用者手册中所述，基于所观察到的样品和cAMP标准的计数计算所产生的cAMP的量(pmol/孔)。
以GraphPad棱镜软件包(GraphPad Software，Inc.，San Diego，CA)以S形方程式通过非线性回归分析来分析数据。使用程-普鲁萨福方程式(程和普鲁萨福，生化药理学期刊，1973，22，23，3099-108)计算EC50值。
在此分析中，较低EC50值意指测试化合物对测试的受体具有较高功能活性。在此分析中联苯-2-基胺基甲酸1-(2-{[4-(4-{[(R)-2-羟基-2-(8-羟基-2-氧代-1，2-二氢喹啉-5-基)乙氨基]甲基}苯基胺甲酰基)丁基]甲基胺甲酰基}乙基)哌啶-4-基酯二(三氟乙酸)盐在hβ2下具有1nM(数据舍入到最接近的1nM)的EC50值。
实例E
Einthoven分析
此分析测量测试化合物在大鼠中提供保护支气管免于乙酰甲胆碱(methacholine；MCh)诱发的支气管收缩的能力。
重量在200g与350g之间的雄性斯普拉格-道利(Sprague-Dawley)大鼠(印第安纳州印第安纳波利斯哈兰(Harlan，Indianapolis，IN))用于所有研究。
测试化合物或媒剂(无菌去离子水)使用5mL给药溶液在馅饼状吸入腔室(R+SMolds，加利福尼亚州圣卡洛斯(San Carlos，CA))中通过吸入(IH)历时10min时期给药。将大鼠暴露于气溶胶，所述气溶胶在22psi的压力下从Bioblend(5％CO2/95％大气)所驱动的LC星形喷雾器组22F51型(弗吉尼亚州中洛锡安郡PARI呼吸设备有限公司(PARIRespiratory Equipment，Inc.Midlothian，VA))产生。除非另外指示，否则大鼠用100μg测试化合物给药。
在预定时点，腹膜内(IP)注射120mg/kg仲丁硫巴比妥(inactin)(仲丁硫巴比妥钠(thiobutabarbital))使大鼠麻醉。如果动物对物理刺激起反应(例如脚趾夹紧)，那么投与补充剂量(40mg/kg，IP)。削刮手术部位并且产生1到2cm颈腹面的中线切口。分离颈静脉并且以填充盐水的聚乙烯导管(PE-50)插套管以使MCh静脉内输液。自由切开气管并且以14号针(#NE-014，佛罗里达州迈阿密湖小部件公司(Small Parts，Miami Lakes，FL))插套管。放置气管套管之后，使用设定在1mL/100g体重(但不超过2.5mL体积)的心搏出量和每分钟90冲程的速率的呼吸器(683型，马萨诸塞州哈弗仪器有限公司(HarvardApparatus，Inc.，MA))使各大鼠通气。沿着呼吸器呼气管放置T形连接器以允许使用与Biopac(TSD 137C)前置放大器连接的Biopac传感器来测量通风压力(VP)的变化。使用加热垫使体温维持于37℃。
使用Acknowledge数据收集软件(加利福利亚州圣巴巴拉(Santa Barbara，CA))记录VP的变化。收集基线值至少2.5min。随后以非累积静脉内(IV)40和80μg/kg MCh输液攻击大鼠。以2mL/kg/min的速率从注射泵(sp210iw，美国佛罗里达州萨拉索塔世界精密仪器有限公司(World Precision Instruments，Inc.，Sarasota，FL))静脉内输注MCh 2.5分钟，MCh两种剂量之间的时间间隔为2分钟。处理动物中通风压力(cm H2O)的变化表示为相对于对照动物的MCh反应的抑制％。
在此分析中可使用其它支气管收缩剂(例如组织胺和乙酰胆碱)代替MCh。另外，可使用天竺鼠代替大鼠。
在此分析中，MCh反应的较高抑制％表明测试化合物提供较大支气管保护作用。在24h时大于或等于30％的抑制指示较长的作用持续时间。在此分析中联苯-2-基胺基甲酸1-(2-{[4-(4-{[(R)-2-羟基-2-(8-羟基-2-氧代-1，2-二氢喹啉-5-基)乙氨基]甲基}苯基胺甲酰基)丁基]甲基胺甲酰基}乙基)哌啶-4-基酯二(三氟乙酸)盐在24h时提供至少约40抑制％。

Claims (13)

1.一种联苯-2-基胺基甲酸1-(2-{[4-(4-{[(R)-2-羟基-2-(8-羟基-2-氧代-1，2-二氢喹啉-5-基)乙氨基]甲基}苯基胺甲酰基)丁基]甲基胺甲酰基}乙基)哌啶-4-基酯的结晶草酸盐；其中所述结晶草酸盐选自：
(a)异丙醇溶剂合物，其特征在于11.66±0.20、15.75±0.20、19.55±0.20、23.00±0.20及23.45±0.20的2θ值处包含衍射峰的粉末x射线衍射图案且特征进一步在于峰位置实质上与图1中所示图案的峰位置一致的粉末x射线衍射图案；及
(b)水合物，其特征在于15.32±0.20、16.90±0.20、19.25±0.20及23.73±0.20的2θ值处包含衍射峰的粉末x射线衍射图案且特征进一步在于峰位置实质上与图4中所示图案的峰位置一致的粉末x射线衍射图案。
2.根据权利要求1所述的结晶草酸盐，其中所述结晶草酸盐为异丙醇溶剂合物，其特征在于11.66±0.20、15.75±0.20、19.55±0.20、23.00±0.20及23.45±0.20的2θ值处包含衍射峰的粉末x射线衍射图案且其特征进一步在于峰位置实质上与图1中所示图案的峰位置一致的粉末x射线衍射图案。
3.根据权利要求2所述的结晶草酸盐，其中所述结晶草酸盐特征在于在162℃到164℃的范围内的熔点。
4.根据权利要求2所述的结晶草酸盐，其中所述结晶草酸盐特征在于实质上与图案2中所示者一致的差示扫描热量测定迹线。
5.根据权利要求1所述的结晶草酸盐，其中所述结晶草酸盐为水合物，其特征在于15.32±0.20、16.90±0.20、19.25±0.20及23.73±0.20的2θ值处包含衍射峰的粉末x射线衍射图案且其特征进一步在于峰位置实质上与图4中所示图案的峰位置一致的粉末x射线衍射图案。
6.根据权利要求5所述的结晶草酸盐，其中所述结晶草酸盐特征在于在162℃到164℃的范围内的熔点。
7.根据权利要求5所述的结晶草酸盐，其中所述结晶草酸盐特征在于实质上与图5中所示者一致的差示扫描热量测定迹线。
8.一种医药组合物，其包含：
(a)根据权利要求1到7中任一权利要求所述的结晶草酸盐；及
(b)医药学上可接受的载剂。
9.一种医药组合物，其包含：
(a)根据权利要求1到7中任一权利要求所述的结晶草酸盐；
(b)类固醇消炎剂或其医药学上可接受的盐或溶剂合物；及
(c)医药学上可接受的载剂。
10.一种根据权利要求1到7中任一权利要求所述的结晶草酸盐的用途，其用于制备用以治疗肺病症的药剂。
11.一种(a)根据权利要求1到7中任一权利要求所述的结晶草酸盐与(b)类固醇消炎剂或其医药学上可接受的盐或溶剂合物组合的用途，其用于制备用以治疗肺病症的药剂。
12.根据权利要求10或11所述的用途，其中所述肺病症为慢性阻塞性肺病或哮喘。
13.一种根据权利要求1到7中任一权利要求所述的结晶草酸盐的用途，其用于制备用以在哺乳动物中产生支气管扩张的通过吸入投与的药剂。
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Families Citing this family (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2386555A1 (en) 2010-05-13 2011-11-16 Almirall, S.A. New cyclohexylamine derivatives having beta2 adrenergic agonist and m3 muscarinic antagonist activities
ITRM20110083U1 (it) 2010-05-13 2011-11-14 De La Cruz Jose Antonio Freire Piastra per la costruzione di carrelli per aeroplani
EP2592078A1 (en) 2011-11-11 2013-05-15 Almirall, S.A. New cyclohexylamine derivatives having beta2 adrenergic agonist and M3 muscarinic antagonist activities
EA201500651A1 (ru) 2012-12-18 2015-11-30 Альмираль, С.А. НОВЫЕ ПРОИЗВОДНЫЕ ЦИКЛОГЕКСИЛ- И ХИНУКЛИДИНИЛКАРБАМАТА, ОБЛАДАЮЩИЕ АГОНИСТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТЬЮ ПО ОТНОШЕНИЮ К β2 АДРЕНЕРГИЧЕСКОМУ РЕЦЕПТОРУ И АНТАГОНИСТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТЬЮ ПО ОТНОШЕНИЮ К МУСКАРИНОВОМУ РЕЦЕПТОРУ М3
TWI643853B (zh) 2013-02-27 2018-12-11 阿爾米雷爾有限公司 同時具有β2腎上腺素受體促效劑和M3毒蕈鹼受體拮抗劑活性之2-氨基-1-羥乙基-8-羥基喹啉-2(1H)-酮衍生物之鹽類
TWI641373B (zh) 2013-07-25 2018-11-21 阿爾米雷爾有限公司 具有蕈毒鹼受體拮抗劑和β２腎上腺素受體促效劑二者之活性的２－胺基－１－羥乙基－８－羥基喹啉－２（１Ｈ）－酮衍生物之鹽
TW201517906A (zh) 2013-07-25 2015-05-16 Almirall Sa 含有ｍａｂａ化合物和皮質類固醇之組合
CN104030933A (zh) * 2014-05-16 2014-09-10 烟台恒迪克能源科技有限公司 一种β-异烷醇基氨基戊酸环己胺的合成方法
TW201617343A (zh) 2014-09-26 2016-05-16 阿爾米雷爾有限公司 具有β２腎上腺素促效劑及Ｍ３蕈毒拮抗劑活性之新穎雙環衍生物

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20040167167A1 (en) * 2003-02-14 2004-08-26 Mathai Mammen Biphenyl derivatives
WO2010123766A1 (en) * 2009-04-23 2010-10-28 Theravance, Inc. DIAMIDE COMPOUNDS HAVING MUSCARINIC RECEPTOR ANTAGONIST AND β2 ADRENERGIC RECEPTOR AGONIST ACTIVITY

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6759398B2 (en) 2000-08-05 2004-07-06 Smithkline Beecham Corporation Anti-inflammatory androstane derivative
US6750210B2 (en) 2000-08-05 2004-06-15 Smithkline Beecham Corporation Formulation containing novel anti-inflammatory androstane derivative
EA005992B1 (ru) 2000-08-05 2005-08-25 Глаксо Груп Лимитед S-ФТОРМЕТИЛОВЫЙ ЭФИР 6α,9α-ДИФТОР-17α-[(2-ФУРАНИЛКАРБОНИЛ)ОКСИ]-11β-ГИДРОКСИ-16α-МЕТИЛ-3-ОКСОАНДРОСТА-1,4-ДИЕН-17β-КАРБОТИОКИСЛОТЫ В КАЧЕСТВЕ ПРОТИВОВОСПАЛИТЕЛЬНОГО АГЕНТА
US6858596B2 (en) 2000-08-05 2005-02-22 Smithkline Beecham Corporation Formulation containing anti-inflammatory androstane derivative
UA77656C2 (en) 2001-04-07 2007-01-15 Glaxo Group Ltd S-fluoromethyl ester of 6-alpha, 9-alpha-difluoro-17-alpha-[(2-furanylcarbonyl)oxy]-11-beta-hydroxy-16- alpha-methyl-3-oxoandrosta-1,4-dien-17-beta-carbothioacid as anti-inflammatory agent
EP1615881A2 (en) * 2003-04-01 2006-01-18 Theravance, Inc. Diarylmethyl and related compounds having beta2 adrenergic receptor agonist and muscarinic receptor antagonist activity
US7320990B2 (en) 2004-02-13 2008-01-22 Theravance, Inc. Crystalline form of a biphenyl compound
JP2008510015A (ja) * 2004-08-16 2008-04-03 セラヴァンス， インコーポレーテッド β２アドレナリン作用性レセプターアゴニスト活性およびムスカリン性レセプターアンタゴニスト活性を有する化合物
TWI374883B (en) 2004-08-16 2012-10-21 Theravance Inc Crystalline form of a biphenyl compound
GB0602778D0 (en) 2006-02-10 2006-03-22 Glaxo Group Ltd Novel compound
TW200811104A (en) 2006-04-25 2008-03-01 Theravance Inc Crystalline forms of a dimethylphenyl compound

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20040167167A1 (en) * 2003-02-14 2004-08-26 Mathai Mammen Biphenyl derivatives
WO2010123766A1 (en) * 2009-04-23 2010-10-28 Theravance, Inc. DIAMIDE COMPOUNDS HAVING MUSCARINIC RECEPTOR ANTAGONIST AND β2 ADRENERGIC RECEPTOR AGONIST ACTIVITY

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