CN103079587A - 呈现核激素受体活性的胰高血糖素超家族肽 - Google Patents

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Abstract

本文提供能对核激素受体起作用的与NHR配体缀合的胰高血糖素超家族肽。本文还提供含有本发明缀合物的药用组合物和药剂盒。本文进一步提供治疗疾病，例如，代谢障碍，诸如糖尿病和肥胖症的方法，其包括给予本发明的缀合物。

Description

呈现核激素受体活性的胰高血糖素超家族肽
引用电子递交材料的结合
与本文同时提交且确认如下的计算机可读的氨基酸序列表通过引用以其全部结合到本文中：一个2011年4月29日创建的名为“44822B_SeqListing”的889,723字节ASCII(文本)文件。
相关申请的交叉引用
本申请要求2010年5月13日递交的美国临时专利申请号61/334,435和2011年1月12日递交的61/432,077的优先权。各临时申请的公开特通过全文引用明确结合于本文。
发明背景
本公开的领域
本发明提供缀合至能对核激素受体起作用的核激素受体配体的胰高血糖素超家族肽。
相关技术的简述
核激素受体蛋白形成一类配体激活的蛋白，当其结合至DNA的特定序列时，充当细胞核内转录的启闭开关。这些开关控制皮肤、骨骼和大脑中行为中枢的发育和分化以及生殖组织的持续调节。
核激素受体配体诸如类固醇、甾醇、类维生素A、甲状腺激素和维生素D起激活核激素受体的作用。激素和受体的相互作用引发受体的构象变化，这导致基因表达的上调。配体和核激素受体的相互作用激活的细胞信号转导的水平由配体和可用于结合的可获得受体的数量和配体和受体间的结合亲合力决定。结合至核激素受体的许多配体和相应的类似物被用作药物治疗，例如，帕金森病(NURR1)、睡眠障碍(RZRβ)、关节炎和小脑共济失调(RORα)、中枢神经***障碍(NOR-1、Rev-ErbAβ、T 1x、NGFI-Bβ、HZF-2α、COUP-TFα、COUP-TFβ、COUR-TFγ、NUR77)、高胆固醇血症(LXRα，COR)、肥胖症(Rev-ErbAα)、糖尿病(HNF4α)、免疫障碍(TOR)、代谢障碍(MB67α、SHP、FXR、SF-1、LXRβ)和***症和避孕(GCNF、TR2-11α，β、TR4、ERα，βERRα，β)。
前胰高血糖素原(Pre-proglucagon)为158个氨基酸前体多肽，其在不同组织中经加工形成多种衍生自不同胰高血糖素原的肽，包括胰高血糖素、胰高血糖素样肽-1(GLP-1)、胰高血糖素样肽-2(GLP-2)和泌酸调节肽(OXM)，这些肽参与各种生理功能，包括葡萄糖稳态、胰岛素分泌、胃排空和肠道生长以及调节食物摄取。胰高血糖素为一种对应于前胰高血糖素原的氨基酸33-61的29个氨基酸的肽，而GLP-1作为对应于前胰高血糖素原的氨基酸72-108的37个氨基酸的肽产生。GLP-1(7-36)酰胺或GLP-1(7-37)酸为GLP-1的生物学上有效形式，它们证实对GLP-1受体的基本上等效的活性。
胰高血糖素用于严重低血糖症的急性治疗。已经报道泌酸调节肽具有抑制食欲和减轻体重的药理学功能。GLP-1和GLP-1受体激动剂用于治疗II型糖尿病。毒蜥外泌肽-4为希拉毒蜥(Gila monster)的唾液中存在的肽，其在结构上类似于GLP-1且像胰高血糖素和GLP-1一样可增加胰岛素释放。
抑胃多肽(GIP)也称作葡萄糖依赖性促胰岛素释放肽，并且为激素的促胰岛素肽家族的成员。GIP衍生自GIP基因编码的153个氨基酸的原蛋白并且作为生物活性的42个氨基酸肽循环。GIP基因在小肠以及唾液腺中表达并且为胃酸分泌的弱抑制剂。除了其在胃的抑制作用以外，在葡萄糖存在下，以生理学剂量给予时GIP增强胰岛素经胰腺胰岛β细胞释放。确信GIP可作为刺胰腺胰岛素释放的肠内因子起作用并且可在维持葡萄糖稳态中起生理作用。
骨钙蛋白为在骨骼和牙质中发现的非胶原蛋白。它由成骨细胞分泌并被认为在矿化和钙离子稳态中起作用。也已经报道骨钙蛋白也已经报道在体内作为激素起作用，引起胰腺中的β细胞释放更多的胰岛素，并在同时导引脂肪细胞释放激素脂连蛋白，后者增加对胰岛素的敏感性。
发明概述
本文提供缀合至核激素受体配体(“NHR配体”)的胰高血糖素超家族肽。这些具有多重活性的缀合物可用于治疗多种疾病。
本发明的胰高血糖素超家族肽缀合物可由下式表示：
Q-L-Y
其中Q是胰高血糖素超家族肽，Y是NHR配体和L是连接基团或键。
胰高血糖素超家族肽(Q)在一些实施方案中可为对胰高血糖素受体呈现激动剂活性、对GLP-1受体呈现激动剂活性、对GIP受体呈现激动剂活性、对胰高血糖素和GLP-1受体呈现协同激动剂活性、对胰高血糖素和GIP受体呈现协同激动剂活性、对GLP-1和GIP受体呈现协同激动剂活性或对胰高血糖素、GIP和GLP-1受体呈现三重激动剂活性的胰高血糖素相关肽。在一些实施方案中，胰高血糖素相关肽对胰高血糖素、GLP-1或GIP受体呈现拮抗剂活性。胰高血糖素相关肽对胰高血糖素受体、对GLP-1受体或对GIP受体的活性可与本文所阐述的任何讲授相一致。在一些特别的实施方案中，胰高血糖素相关肽对胰高血糖素受体呈现原生胰高血糖素的至少0.1％的活性，对GLP-1受体呈现原生GLP-1至少0.1％的活性，或对GIP受体呈现原生GIP至少0.1％的活性。
NHR配体(Y)完全或部分地为非肽的，并且具有与本文所阐述的任何讲授相一致的活性作用于核激素受体。在某些实施方案中，NHR配体的EC50或IC50为约1mM或更少，或100μM或更少，或10μM或更少，或1μM或更少。在某些实施方案中，NHR配体具有最多约5000道尔顿、或最多约2000道尔顿、或最多约1000道尔顿、或最多约500道尔顿的分子量。NHR配体可对本文描述的任何核激素受体起作用或具有本文描述的任何结构。
在一些实施方案中，胰高血糖素相关肽对胰高血糖素受体的EC50(或IC50)为GPCR配体对其G蛋白偶联受体的EC50或IC50的约100倍以内、或约75倍以内，或约50倍以内、或约40、30、25、20、15、10或5倍以内。在一些实施方案中，胰高血糖素相关肽对GLP-1受体的EC50(或IC50)为GPCR配体对其G蛋白偶联受体的EC50或IC50的约100倍以内、或约75倍以内，或约50倍以内、或约40、30、25、20、15、10或5倍以内。在一些实施方案中，胰高血糖素相关肽对GIP受体的EC50(或IC50)为GPCR配体对其G蛋白偶联受体的EC50或IC50的约100倍以内、或约75倍以内，或约50倍以内、或约40、30、25、20、15、10或5倍以内。
在本发明一些方面中，提供Q-L-Y的前药，其中前药包含经由酰胺键共价连接于Q的活性位点的二肽前药元件(A-B)。随后在生理条件下除去二肽并在缺乏酶活性下复原Q-L-Y缀合物的完全活性。
在本发明一些方面，也提供包含Q-L-Y缀合物和药学上可接受的载体的药用组合物。
在本发明其它方面中，提供给予治疗有效量的本文描述的Q-L-Y缀合物用于在患者治疗疾病或医学病症的方法。在一些实施方案中，疾病或医学病症选自代谢综合征、糖尿病、肥胖症、肝脂肪变性和神经退行性疾病。
图的简述
图1呈现各种胰高血糖素超家族肽或其相关片段的氨基酸序列的比对。呈现的氨基酸序列为GHRH(SEQ ID NO：1619)、PHI(SEQID NO：1622)、VIP(SEQ ID NO：1620)、PACAP-27(SEQ ID NO：1621)、毒蜥外泌肽-4(SEQ ID NO：1618)、GLP-1(SEQ ID NO：1603)、胰高血糖素(SEQ ID NO：1601)、泌酸调节肽(SEQ ID NO：1606)、GIP(SEQ IDNO：1607)、GLP-2(SEQ ID NO：1608)和促胰液素(SEQ ID NO：1624)。比对显示胰高血糖素的氨基酸位置如何对应于其它胰高血糖素超家族肽的氨基酸位置。
图2表明给予指定的GLP-1缀合物对db/db小鼠的体重和血糖水平的变化的影响。图2a表明，给予高剂量GLP-1(Aib2A22CexK40)/***(17-酯)缀合物的小鼠比单独给予GLP-1的小鼠经历略微更大的体重减轻，但类似于媒介组。图2b和2c显示给予高剂量的GLP-1(Aib2A22CexK40)/***(17-酯)缀合物的小鼠在0-14天之间经历最大的血糖水平下降，表明改善血糖的能力增强而与体重变化无关。
图3表明给予指定的GLP-1缀合物对膳食诱导的肥胖小鼠的血糖、体重、脂肪量和肌肉(lean muscle)量的影响。图3a表示第21天的ipGTT测试的结果。图3b-d表明给予指定的GLP-1缀合物对膳食诱导的肥胖小鼠的体重变化(图3b)、脂肪量变化(图3c)和肌肉量变化(图3d)的影响。给予高剂量GLP-1(Aib2A22CexK40)/***(17-酯)缀合物的小鼠的体重和脂肪量经历最大下降和最少量的肌肉量变化。图3e表明给予指定的GLP-1缀合物对膳食诱导的肥胖小鼠的血糖变化的影响。给予高剂量GLP-1(Aib2A22CexK40)/***(17-酯)缀合物的小鼠在0-14天之间经历最大的血糖水平下降。这些结果表明，向基于A22的弱GLP-1激动剂加入***增加剂量依赖性功效。
图4表明给予指定的GLP-1缀合物对血糖水平、体重变化、脂肪量变化和血糖变化的影响。图4a表明在腹膜内葡萄糖耐量试验中，给予指定的GLP-1缀合物在14天每日给药后对膳食诱导的肥胖小鼠的的血糖水平的影响。图4b-c表明给予指定的GLP-1缀合物对膳食诱导的肥胖小鼠的体重变化和脂肪量变化的影响。给予高剂量GLP-1/***缀合物的小鼠经历最大的总体重下降(图4b)。相对于用媒介处理的动物，用高剂量***醚缀合物处理使脂肪量下降(图4c)。图4d表明给予指定的GLP-1缀合物对膳食诱导的肥胖小鼠的血糖的影响。在高剂量下，给予任一GLP-1(Aib2E16CexK40)/***缀合物的小鼠比单独给予GLP-1(Aib2E16CexK40)的小鼠在0-21天之间的血糖水平变化更大。
图5表明给予指定的GLP-1缀合物对膳食诱导的肥胖小鼠的体重变化和血糖变化的影响。给予高剂量GLP-1***缀合物的小鼠体重下降最大(图5a)。给予或高或低剂量的GLP-1(Aib2E16K40Cex)以及给予高剂量GLP-1(Aib2E16K40Cex)/***(3-醚)的小鼠经历最大的血糖变化(图5b)。
图6表明给予指定的GLP-1缀合物对膳食诱导的肥胖小鼠的体重变化、脂肪量变化和血糖变化的影响。给予任一***缀合物的小鼠经历最大的总体重下降(图6a)。脂肪量(图6b)分析随总体重体减轻相对恒定。给予GLP-1(Aib2E16K40Cex)/***(3-醚)或GLP-1(Aib2E16K40Cex)/***(17-酯)缀合物的小鼠在0-7天间经历最大的血糖水平变化(图6c)。
图7表明给予指定的GLP-1缀合物对膳食诱导的肥胖小鼠的体重和血糖变化的影响。给予GLP-1(Aib2E16K40Cex)/***缀合物的小鼠在7天的时期经历总体重(图7a)和血糖水平(图7b)的最大下降。相对于GLP-1(Aib2E16CexK40)/***缀合物，含A22或含d-氨基酸的肽都不表现出大的降低。此外，GLP-1(Aib2E16CexK40)的***缀合物显然比相同肽的非***形式更加有效。
图8表明给予指定的GLP-1缀合物对体重、血糖和脂肪量的变化的影响。含有d-氨基酸的肽在所有功效测定方面明显次于含有l-氨基酸的肽。图8a表明给予指定的GLP-1缀合物对膳食诱导的肥胖小鼠的体重变化的影响。在这些剂量下含或不含***的肽在体重减轻方面没有多少明显的区别。虽然如此，在图8b中显示给予指定的GLP-1缀合物对膳食诱导的肥胖小鼠的血糖变化的影响。给予GLP-1(Aib2E16CexK40)/***(3-酯)缀合物的小鼠在0-7天之间经历最大的体内血糖水平变化，远大于用相同但不含***的肽处理的动物。这表明直接改善血糖而与体重差异无关。图8c表明给予指定的GLP-1缀合物对脂肪量变化的影响。
图9表明给予指定的GLP-1缀合物对膳食诱导的肥胖小鼠的体重变化、脂肪质量的量和血糖变化的影响。以相对于对照的含有l-氨基酸的升高的剂量给予含有d-氨基酸的GLP-1/***(3-酯)缀合物的小鼠经历体重的最大下降(图9a)而脂肪质量的量最少(图9b)。在0和7天之间含有d-氨基酸的GLP-1/***(3-酯)缀合物存在明显的剂量依赖的血糖降低作用且相对于单独给予GLP-1的小鼠，最高剂量下有所增加(图9c)。
图10表明给予指定的GLP-1缀合物对膳食诱导的肥胖小鼠的体重变化和血糖水平变化的影响。给予小鼠含有d-氨基酸的GLP-1/***缀合物，其中的***共价连接成任一种稳定的酰胺或体内不稳定的酯。用不稳定酯缀合物处理的动物经历总体重的最大下降(图10a)。图10b表明，给予含有d-氨基酸的GLP-1/***酯缀合物的小鼠在0和7天之间经历比给予相当的含有d-氨基酸但含有稳定***缀合物的肽的小鼠更大的血糖水平变化。
图11表明指定的缀合物对GLP-1受体和***受体的活性。活性的、亚稳态的GLP-1/***缀合物对GLP-1受体的活性相当(图11a)，而对***受体的活性可变(图11b)。
图12表明给予指定的GLP-1缀合物对膳食诱导的肥胖小鼠的体重、食物摄取量、血糖、肝脏重量和子宫重量的变化的影响。给予非活性的***不稳定的含d-氨基酸的GLP-1/***(3-酯)缀合物的小鼠经历最大的体重下降，高剂量下影响更显著(图12a)。图12b表明，给予非活性的***不稳定的含d-氨基酸的GLP-1/***(3-酯)缀合物的小鼠比给予单独的非活性的含d-氨基酸的GLP-1或***稳定的含d-氨基酸的GLP-1/***(3-醚)缀合物的小鼠食用显著更少的食物，高剂量下影响更显著。图12c表明，相对于媒介处理的动物，高剂量的***不稳定的、非活性的含d-氨基酸的GLP-1/***(3-酯)缀合物降低血糖水平。图12d表明，给予***不稳定的、非活性的含d-氨基酸的GLP-1/***(3-醚)缀合物的小鼠经历肝脏重量的微小的但比给予***稳定的、非活性的含d-氨基酸的GLP-1/***(3-醚)缀合物的小鼠的更大的下降。图12e表明，与给予单独的非活性GLP-1或非活性的、***稳定的含d-氨基酸的GLP-1/***(3-醚)缀合物的小鼠相比，给予非活性的、***不稳定的含d-氨基酸的GLP-1/***(3-酯)缀合物的小鼠的子宫重量有显著更大的增加。
图13表明给予指定的GLP-1缀合物对切除卵巢的小鼠的体重、脂肪量、食物摄取量、血糖水平和子宫重量的变化的影响。图13a表明，与给予单独的活性的、GLP-1激动剂、非活性的、***不稳定的含d-氨基酸的GLP-1/雌酮(3-酯)缀合物或非活性的、***稳定的含d-氨基酸的GLP-1/***(3-醚)缀合物的小鼠的相比，给予活性的、***稳定的GLP-1激动剂/***(3-醚)缀合物的小鼠经历更大的体重下降。图13b表明，给予GLP-1激动剂、非活性的、***不稳定的含d-氨基酸的GLP-1/雌酮(3-酯)缀合物，以及活性的、***稳定的GLP-1激动剂/***(3-醚)缀合物的小鼠表现出脂肪量下降。图13c表明，与给予单独的活性的、GLP-1激动剂、非活性的、***不稳定的含d-氨基酸的GLP-1/雌酮(3-酯)缀合物，或非活性的、***稳定的含d-氨基酸的GLP-1/***(3-醚)缀合物的小鼠相比，给予活性的、***稳定的GLP-1激动剂/***(3-醚)缀合物的小鼠食用更少的食物。图13d表明，给予非活性的、***不稳定的含d-氨基酸的GLP-1/雌酮(3-酯)缀合物，或非活性的、***稳定的含d-氨基酸的GLP-1/***(3-醚)缀合物，或活性的、***稳定的GLP-1激动剂/***(3-醚)缀合物的小鼠比给予媒介的小鼠经历更大的血糖水平的降低，并且表明给予非活性的、***稳定的含d-氨基酸的GLP-1/***(3-醚)缀合物的小鼠并不表现出血糖水平的下降。图13e表明，与给予单独的GLP-1、非活性的、***稳定的含d-氨基酸的GLP-1/***(3-醚)缀合物，或活性的、***稳定的GLP-1/***(3-醚)缀合物的小鼠相比，给予非活性的、***不稳定的含d-氨基酸的GLP-1/雌酮(3-酯)缀合物的小鼠经历子宫重量的显著更大的增加。
图14表明给予指定的GLP-1缀合物对切除卵巢的小鼠的体重、脂肪量、血糖和子宫重量的变化的影响。与给予单独的活性的、GLP-1激动剂，或活性的、***不稳定的GLP-1激动剂/雌酮(3-酯)缀合物的小鼠相比，给予亚稳态的GLP-1激动剂/***缀合物的小鼠经历更大的体重和脂肪量的下降(图14a和14b)。分别给予亚稳态的酶不稳定和酸不稳定的缀合物、GLP-1激动剂/***(17-组织蛋白酶)和GLP-1激动剂/***(17-腙)的小鼠最初具有最大的体重下降，而亚稳态的硫醇易还原缀合物、GLP-1激动剂/***(17-氨基甲酸酯二硫化物)表现出体重的全面最大下降。图14c表示，分别给予亚稳态的硫醇还原不稳定和酸不稳定的缀合物、GLP-1激动剂/***(17-氨基甲酸酯二硫化物)和GLP-1激动剂/***(17-腙)的小鼠比给予***不稳定的GLP-1激动剂/雌酮(3-酯)缀合物的小鼠经历更多的血糖水平下降。图14d表示，与给予三种亚稳态的GLP-1/***缀合物中的任何一种的小鼠相比，给予***不稳定的GLP-1/雌酮(3-酯)缀合物的小鼠经历显著更大的子宫重量的增加。
图15表明给予指定的GLP-1缀合物对体重和累积食物摄取量的变化的影响。与给予单独的活性的、GLP-1激动剂或活性的、***不稳定的GLP-1激动剂/***(3-酯)缀合物的小鼠相比，给予活性的、***稳定的GLP-1激动剂/***(3-醚)缀合物的小鼠经历显著更大的体重降低(图15a)。图15b表明，与给予单独的活性的、GLP-1激动剂或活性的、***不稳定的GLP-1激动剂/***(3-酯)缀合物的小鼠相比，给予活性的、***稳定的GLP-1激动剂/***(3-醚)缀合物的小鼠食用明显更少的食物。
图16a-e描述表明37℃下人血浆中的指定的GLP-1/***缀合物的稳定性的HPLC谱。***稳定的GLP-1/***(3-醚)缀合物经72小时显示无***释放，而***不稳定GLP-1/***(3-酯)缀合物在3小时后表现出大量的***释放和6小时内的完全的***释放。
图17a-c表明给予指定的缀合物对膳食诱导的肥胖症小鼠的体重百分比、累积食物摄取量和血糖水平的变化的影响。
图18a-c表明给予指定的缀合物对膳食诱导的肥胖症野生型小鼠、***受体β基因敲除(ERβKO)小鼠和***受体α基因敲除(ERαKO)小鼠的体重百分比、累积食物摄取量和血糖水平的变化的影响。
图19表明指定的GLP-1缀合物随时间对血糖水平的影响。给予GLP-1激动剂的小鼠经48小时表现出血糖的最少的有效下降(除媒介外)，而给予***稳定的GLP-1激动剂/***(3-醚)缀合物的小鼠的血糖经48小时表现出最有效的下降。
发明详述
定义
在描述和要求的本发明中，以下术语将按照以下阐述的定义来使用。
如本文所用的术语″约″意指大于或小于所述数值或数值的范围达10％，但是不打算只将任何数值或数值的范围指定在这个更宽的定义。前面有术语″约″的每一个数值或数值的范围也打算包括所述绝对值或数值范围的实施方案。
本文使用的术语“药学上可接受的载体”包括任何标准药用载体，例如磷酸盐缓冲盐水溶液、水、乳液例如油/水或水/油乳液、以及各种类型的润湿剂。该术语也包括美国联邦政府监管机构批准或美国药典中列出用于动物，包括人的任何试剂。
本文使用的术语“药学上可接受的盐”指的是保留母体化合物的生物活性的化合物的盐，并且这种盐不是生物学上或者不合需要的。本文公开的许多化合物能够通过其上存在氨基和/或羧基或类似基团形成酸和/或碱盐。
药学上可接受的碱加成盐可自无机和有机碱制备。衍生自无机碱的盐包括(仅通过举例)钠、钾、锂、铵、钙和镁盐。衍生自有机碱的盐包括，但不限于伯、仲和叔胺的盐。药学上可接受的酸加成盐可自无机和有机酸制备。衍生自无机酸的盐包括盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等。衍生自有机酸的盐包括乙酸、丙酸、乙醇酸、丙酮酸、草酸、苹果酸、丙二酸、琥珀酸、马来酸、富马酸、酒石酸、柠檬酸、苯甲酸、肉桂酸、扁桃酸、甲磺酸、乙磺酸、对-甲苯磺酸、水杨酸等。
本文使用的术语“治疗”包括预防特定的障碍或病症、或者减轻与具体障碍或病症相关的症状和/或防止或消除所述症状。例如，本文使用的术语“治疗糖尿病”通常指的是以正常水平方向改变血液葡萄糖水平，并且可包括依给定的情况而定增加或减少血液葡萄糖水平。
本文使用的″有效″量或″治疗有效量″的胰高血糖素肽指的是非毒性但是足够量的提供期望的作用的肽。例如一种期望的效果应为预防或治疗低血糖症，如例如通过增加血液葡萄糖水平测量的那样。本公开的胰高血糖素肽的备选期望的效果应包括治疗高血糖症，例如如通过血液葡萄糖水平变化为更加接近于正常所测量的那样，或者诱导体重减轻/防止体重增加，例如如通过体重减少或者防止或减少体重增加，或者使身体脂肪分布正常化测量的那样。其为“有效的”量将依个体的年龄和一般状况、给药方式等而在不同受试者与受试者之间变化。因此，不总是能够指定精确的″有效量″。然而，合适的″有效″量在任何个体情况下可由本领域的普通技术人员使用常规试验来确定。
术语″肠胃外″意指不通过消化道，而是通过一些其它途径，例如皮下、肌内、脊柱内或静脉内。
如本文所用的术语″患者″在无进一步指定下意欲涵盖任何温血脊椎驯化动物(包括例如，但不限于家畜、马、猫、犬和其它宠物)、哺乳动物和人。
如本文所用的术语“分离”意指已经从其自然环境中移出。在某些实施方案中，通过重组方法制备类似物，而自宿主细胞分离类似物。
本文使用的术语″纯化的″涉及以基本上不含通常与原生或自然环境中的分子或化合物有关的污染物的形式分离分子或化合物，并且意指由于与初始组成的其它组分分离而已经增加纯度。术语″纯化的多肽″本文用于描述已经与包括，但不限于核酸分子、脂质和碳水化合物的其它化合物分离的多肽。
本文使用的术语“肽”包括2个或更多个氨基酸且通常少于50个氨基酸的序列，其中氨基酸为天然存在的或者为编码或非天然存在的或者为非编码的氨基酸。非天然存在的氨基酸指的是不是体内天然存在的，然而可向本文描述的肽结构中增加的氨基酸。本文使用的“非编码的”指的是不为以下20种氨基酸中任何一种的L-异构体的氨基酸：Ala、Cys、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp、Tyr。
如本文所用的，“部分非肽”指其中一部分分子是具有生物学活性且不包括氨基酸序列的化合物或取代基的分子。
如本文所用的，“非肽的”指具有生物学活性和不包括氨基酸序列的分子。
如本文所用的术语″多肽″和″蛋白″是可交换使用的术语，指氨基酸聚合物，而不考虑聚合物的长度。通常，多肽和蛋白的聚合物长度大于″肽″的。在某些情况下，蛋白包括不止一个共价或非共价相互连结的多肽链。
贯穿本申请，用数字对具体氨基酸位置的所有加注(例如位置28)指的是原生胰高血糖素中的位置的氨基酸(SEQ ID NO：1601)或其任何类似物中的相应氨基酸位置。例如，本文提及的“位置28”应意指其中SEQ ID NO：1601的第一个氨基酸已经缺失的胰高血糖素的类似物的相应位置27。类似地，本文提及的“位置28”应意指其中已经在SEQ ID NO：1601的N-末端之前增加一个氨基酸的胰高血糖素的类似物的相应位置29。
本文使用的“氨基酸修饰”指的是(i)用不同的氨基酸(天然存在的或者编码或非编码的或者非天然存在的氨基酸)取代或替代参考肽的氨基酸(例如SEQ ID NOs：1601、1603、1607)，(ii)向参考肽(例如SEQ ID NOs：1601、1603、1607)增加氨基酸(天然存在的或者编码或非编码的或者非天然存在的氨基酸)，或者(iii)自参考肽(例如SEQID NOs：1601、1603、1607)缺失一个或多个氨基。
在一些实施方案中，氨基酸取代或替代为保守的氨基酸取代，例如在位置1、2、5、7、8、10、11、12、13、14、16、17、18、19、20、21、24、27、28或29中一个或多个位置的氨基酸的保守取代。本文使用的术语″保守性氨基酸取代″为一个氨基酸用具有类似性质例如大小、电荷、疏水性、亲水性和/或芳香性的另一个氨基酸替代，并且包括在以下五组的一组内的交换：
I.小的脂肪族、非极性或略带极性的残基：
Ala、Ser、Thr、Pro、Gly；
II.极性的、荷负电残基及其酰胺和酯：
Asp、Asn、Glu、Gln、半胱氨酸和同型半胱氨酸；
III.极性的、荷正电残基：
His、Arg、Lys；鸟氨酸(Orn)
IV.大的、脂肪族、非极性残基：
Met、Leu、Ile、Val、Cys、正亮氨酸(Nle)、同型半胱氨酸；
V.大的、芳族残基：
Phe、Tyr、Trp、乙酰苯丙氨酸
在一些实施方案中，氨基酸取代不是保守的氨基酸取代，例如为非保守的氨基酸取代。
本文使用的术语″氨基酸″包括含有氨基和羧基官能团两者的任何分子，其中氨基和羧基连接于相同的碳(α碳)。该α碳任选地可具有一个或两个其它的有机取代基。对于本公开的目的，指明氨基酸而不指定其立体化学打算包括氨基酸的L或D形式，或者外消旋混合物。然而，在其中氨基酸用其3个字母代码指明并且包括上标数字的情况中(即Lys-1)，这种指明打算指定氨基酸的原生L形式，而D形式通过包含3个字母代码前的小写字母d和上标数字来指定(即dLys-1)。
本文使用的术语“羟基酸”指的是已被修饰，以用羟基替代α碳氨基的氨基酸。
本文使用的术语″带电氨基酸″指的是包含在生理pH下的水溶液中具有负电荷(即去质子化)或正电荷(即质子化)的侧链的氨基酸。例如荷负电的氨基酸包括天冬氨酸、谷氨酸、半胱氨酸、同型半胱氨酸和高谷氨酸，而荷正电的氨基酸包括精氨酸、赖氨酸和组氨酸。荷电氨基酸包括20种编码氨基酸以及非典型或非天然存在的或非编码氨基酸中的荷电氨基酸。
如本文所用的术语″酸性氨基酸″指包括第二个酸性部分(除氨基酸的α羧酸外)，包括例如，侧链羧酸或磺酸基团的氨基酸。
本文使用的“酰基化”氨基酸为包含酰基的氨基酸，其为非天然-天然存在的氨基酸，与其生成途径无关。生产酰化氨基酸和酰化肽的示例性方法为本领域已知的，并且包括在包含于肽中或肽合成之前酰化氨基酸，随后化学酰化肽。在一些实施方案中，酰基造成肽具有以下作用的一种或多种：(i)延长循环中的半衰期，(ii)延迟作用的起效，(iii)延长作用的持续时间，(iv)改善对蛋白酶例如DPP-IV的抗性，和(v)增加对胰高血糖素超家族肽受体的功效。
本文使用的“烷基化”氨基酸为包含烷基的氨基酸，其为非天然-天然存在的氨基酸，与其生成途径无关。产生烷基化氨基酸和烷基化肽的示例性方法为本领域已知的，并且包括在包含于肽中或肽合成之前烷基化氨基酸，随后化学烷基化肽。不受任何具体的理论所束缚，认为肽的烷基化将与肽的酰化获得类似(如果不相同的话)效果，例如循环中的半衰期延长、延迟作用的起效、作用的持续时间延长、对蛋白酶例如DPP-IV的抗性改善和对胰高血糖素超家族肽受体的功效增加。
本文所用的术语″C1-Cn烷基″，其中n可为1-18，表示具有1-指定数量的碳原子的支链或直链烷基。例如，C1-C6烷基表示具有1-6个碳原子的支链或直链烷基。代表性的C1-C18烷基包括，但不限于，甲基、乙基、正丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、己基等。烷基任选可被例如，羟基(OH)、卤代、芳基、羧基、硫代、C3-C8环烷基和氨基取代。
本文所用的术语″C0-Cn烷基″，其中n可为1-18，表示具有最多18个碳原子的支链或直链烷基。例如，术语“(C0-C6烷基)OH”表示连至具有最多6个碳原子的烷基取代基的羟基母体部分(例如-OH、-CH2OH、-C2H4OH、-C3H6OH、-C4H8OH、-C5H10OH、-C6H12OH)。
本文所用的术语″C2-Cn链烯基″，其中n可为2-18，表示具有2-指定碳原子数和至少一个双键的不饱和支链或直链基团。这类基团的实例包括，但不限于，1-丙烯基、2-丙烯基(-CH2-CH＝CH2)、1，3-丁二烯基(-CH＝CHCH＝CH2)、1-丁烯基(-CH＝CHCH2CH3)、己烯基、戊烯基等。链烯基任选可被例如羟基(OH)、卤代、芳基、羧基、硫代、C3-C8环烷基和氨基取代。
术语″C2-Cn炔基″，其中n可为2-18，指具有2-n个碳原子和至少一个三键的不饱和支链或直链基团。这类基团的实例包括，但不限于，1-丙炔基、2-丙炔基、1-丁炔基、2-丁炔基、1-戊炔基等。炔基任选可被例如，羟基(OH)、卤代、芳基、羧基、硫代基、C3-C8环烷基和氨基取代。
本文所用的术语″芳基″指单环或多环(例如，双环、三环或四环)芳族基团。芳基环的大小通过指出存在的碳的数量表示。例如，术语″(C1-C3烷基)(C6-C10芳基)″指经1-3元烷基链连着母体部分的6-10元芳基。除非另有说明，芳基可未被取代或被独立地选自例如，卤代、烷基、链烯基、OCF3、NO2、CN、NC、OH、烷氧基、氨基、CO2H、C3-C8环烷基、C(O)O烷基、芳基和杂芳基的一个或多个，并且特别是1-5个基团取代。示例性芳基包括，但不限于，苯基、萘基、四氢萘基、氯苯基、茚满基、茚基、甲基苯基、甲氧基苯基、三氟甲基苯基、硝基苯基、2，4-甲氧基氯苯基等。
如本文所用的术语″杂芳基″指含有一个或多个芳环且在芳环上含有至少一个氮、氧或硫原子的单环或多环***。指明存在的碳的数量表明杂芳环的大小和取代基或连接基团的存在。例如，术语″(C1-C6烷基)(C5-C6杂芳基)″指经1-6元烷基链连着母体部分的5或6元杂芳基。除非另有说明，杂芳基可未被取代或被独立地选自例如，卤代、烷基、链烯基、OCF3、NO2、CN、NC、OH、烷氧基、氨基、CO2H、C3-C8环烷基、C(O)O烷基、芳基和杂芳基的一个或多个，并且特别是1-5个基团取代。杂芳基的实例包括，但不限于噻吩基、呋喃基、吡啶基、噁唑基、喹啉基、噻吩基、异喹啉基、吲哚基、三嗪基、***基、异噻唑基、异噁唑基、咪唑基、苯并噻唑基、吡嗪基、嘧啶基、噻唑基和噻二唑基。
如本文使用的术语“杂烷基”指的是在结构骨架中含有指明数目的碳原子和至少一个杂原子的直链或支链烃。用于本文目的的合适杂原子包括，但不限于N、S和O。杂烷基任选地可例如被羟基(OH)、卤代、芳基、羧基和氨基取代。
本文使用的术语“卤素”或“卤代”指的是由氟、氯、溴和碘组成的基团中的一个或多个成员。
本文使用的术语“胰高血糖素相关肽”指的是对胰高血糖素、GLP-1、GLP-2和GIP受体中的任何一个或多个具有生物活性(作为激动剂或拮抗剂)，并且包含与原生胰高血糖素、原生泌酸调节肽、原生毒蜥外泌肽-4、原生GLP-1、原生GLP-2或原生GIP中的至少一个共有至少40％序列同一性(例如45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％)的氨基酸序列的那些肽。除非另外指明，对胰高血糖素相关肽中氨基酸位置的任何加注(例如NHR配体、缀合部分、亲水性聚合物、酰化或烷基化的连接)指的是相对于原生胰高血糖素氨基酸序列(SEQ ID NO：1601)的对应位置。
本文使用的术语分子对于第一种受体相对于第二种受体的“选择性”指的是以下比率：分子对第二种受体的EC50除以分子对第一种受体的EC50。例如，对第一种受体具有1nM的EC50的和对第二种受体具有100nM的EC50的分子对于第一种受体相对于第二种受体具有100倍的选择性。
本文使用的术语“同一性”涉及两种或更多种序列之间的相似性。同一性通过相同的残基数除以残基总数并把结果乘以100以获得百分数来测量。因此，两份完全相同的序列具有100％的同一性，而相对于彼此具有氨基酸缺失、增加或取代的两个序列具有较低程度的同一性。本领域的技术人员应认识到，几种计算机程序，例如采用算法例如BLAST (Basic Local Alignment Search Tool，Altschul等(1993)J.Mol.Biol.215：403-410)的那些计算机程序可用于测定序列同一性。
本文使用的术语“胰高血糖素超家族肽”指的是在其N-末端和C-末端区域结构相关的一组肽(参见例如Sherwood et al.，EndocrineReviews 21：619-670(2000))。该组的成员包括所有的胰高血糖素相关肽，以及生长激素释放激素(GHRH；SEQ ID NO：1619)、血管活性肠肽(VIP；SEQ ID NO：1620)、垂体腺苷酸环化酶激活多肽27(PACAP-27；SEQ ID NO：1621)、组氨酸异亮胺酸肽(PHI；SEQ IDNO：1642)、组胺酸蛋氨酸肽(PHM；SEQ ID NO：1622)、促胰液素(SEQ ID NO：1623)和相对于原生肽具有最多1、2、3、4、5、6、7、8、9或10种氨基酸修饰的类似物、衍生物或缀合物。这种肽优选地保留与胰高血糖素受体超家族的受体相互作用的能力(激动剂或拮抗剂)。除非另外指明，对胰高血糖素超家族肽的氨基酸位置的任何加注(例如NHR配体、缀合部分、亲水性聚合物、酰化或烷基化的连接)指的是相对于原生胰高血糖素氨基酸序列的相应位置(SEQ ID NO：1601)，对于代表性胰高血糖素超家族肽的比对参见图1。
术语“胰高血糖素激动剂肽”指的是结合于并激活胰高血糖素受体的下游信号传导的化合物。然而，该术语不应视为将化合物限于仅对胰高血糖素受体具有活性。当然啦，本公开的胰高血糖素激动剂肽可如本文进一步讨论的那样，对其它受体呈现另外的活性。胰高血糖素激动剂肽例如可对GLP-1受体和/或GIP受体呈现活性(例如激动剂活性)。而且，术语“胰高血糖素激动剂肽”不应视为将化合物仅限于肽。相反地，除肽以外的化合物也被包括在该术语内。因此，胰高血糖素激动剂肽在一些方面为以缀合物形式(杂二聚体、多聚体、融合肽)存在的肽、化学衍化的肽、肽的药用盐、肽模拟物等。
术语“GLP-1激动剂肽”指的是结合于并激活GLP-1受体的下游信号传导的化合物。然而，该术语不应视为将化合物限于仅对GLP-1受体具有活性。相反，本公开的GLP-1激动剂肽可如本文进一步讨论的那样，对其它受体呈现另外的活性。GLP-1激动剂肽例如可对胰高血糖素受体和/或GIP受体呈现活性(例如激动剂活性)。而且，术语“GLP-1激动剂肽”不应视为将化合物仅限于肽。相反，除肽以外的化合物也被该术语涵盖。因此，GLP-1激动剂肽在一些方面为以缀合物形式(杂二聚体、多聚体、融合肽)存在的肽、化学衍化的肽、肽的药用盐、肽模拟物等。
术语“GIP激动剂肽”指的是结合于并激活GIP受体的下游信号传导的化合物。然而，该术语不应视为将化合物限于仅对GIP受体具有活性。相反，本公开的GIP激动剂肽可如本文进一步讨论的那样，对其它受体表现出另外的活性。GIP激动剂肽例如可对GLP-1受体表现出活性(例如激动剂活性)。同样，术语“GIP激动剂肽”不应视为将化合物仅限于肽。相反，该术语涵盖除肽以外的化合物。因此，GIP激动剂肽在一些方面为以缀合物形式(杂二聚体、多聚体、融合肽)存在的肽、化学衍化的肽、肽的药用盐、肽模拟物等。
术语″胰高血糖素拮抗剂肽″指抵消胰高血糖素活性或阻止胰高血糖素功能的化合物。例如，胰高血糖素拮抗剂对胰高血糖素受体呈现由胰高血糖素获得的最大应答的至少60％抑制作用(例如至少70％、80％、90％或者更大的抑制作用)。在一个特别的实施方案中，约1μM浓度的胰高血糖素拮抗剂呈现经胰高血糖素对胰高血糖素受体实现的少于约20％(例如少于约10％或5％)的最大激动剂活性。该术语不应视为将化合物限于仅对胰高血糖素受体具有活性。相反，本公开的胰高血糖素拮抗剂肽可对胰高血糖素受体(例如部分激动)或其它受体呈现另外的活性。胰高血糖素拮抗剂肽例如可对GLP-1受体表现出活性(例如激动剂活性)。同样，术语“胰高血糖素拮抗剂肽”不应视为将化合物仅限于肽。相反，这些术语涵盖除肽之外的化合物。因此，在一些方面，胰高血糖素激动剂肽为以缀合物形式存在的肽、化学衍化的肽、肽的药用盐、肽模拟物等。
术语“GLP-1拮抗剂肽”指的是抵消GLP-1活性或阻止GLP-1功能的化合物。例如，GLP-1拮抗剂对GLP-1受体呈现由GLP-1获得的最大应答的至少60％抑制作用(例如至少70％、80％、90％或者更多的抑制作用)。在一个特别的实施方案中，约1μM浓度的GLP-1拮抗剂呈现通过GLP-1对GLP-1受体实现的少于约20％(例如少于约10％或5％)的最大激动剂活性。术语不应被解释为限定化合物仅对GLP-1受体具有活性。相反，本公开的GLP-1拮抗剂肽可对GLP-1受体(例如部分激动)或其它受体呈现另外的活性。GLP-1拮抗剂肽例如可对胰高血糖素受体表现出活性(例如激动剂活性)。同样，术语“GLP-1拮抗剂肽”不应被解释为将化合物仅限于肽。相反，这些术语涵盖除肽之外的化合物。因此，在一些方面，GLP-1激动剂肽为以缀合物形式存在的肽、化学衍化的肽、肽的药用盐、肽模拟物等。
术语″GIP拮抗剂肽″指抵消GIP活性或阻止GIP-1的功能的化合物。例如，GIP拮抗剂呈现通过GIP对GIP受体实现的至少60％抑制(例如，至少70％、80％、90％或更多抑制)的最大应答。在一个特别的实施方案中，约1μM浓度的GIP拮抗剂呈现经GIP对GIP受体实现的少于约20％(例如少于约10％或5％)的最大激动剂活性。该术语不应被解释为限定化合物仅对GIP受体具有活性。相反，本公开的GIP拮抗剂肽可对GIP受体(例如，部分激动作用)或其它受体表现出另外的活性。GIP拮抗剂肽，例如，可对胰高血糖素受体表现出活性(例如，激动剂活性)。同样，术语“GIP拮抗剂肽”不应被解释为限定化合物仅为肽。相反，这些术语涵盖除肽之外的化合物。因此，在一些方面，GIP激动剂肽为以结合形式存在的肽、化学衍化的肽、肽的药用盐、肽模拟物等。
本文所用的术语“胰高血糖素类似物”和“胰高血糖素肽”可相互交换使用，指对胰高血糖素相关肽受体具有所指活性的胰高血糖素的类似物。
本文所用的术语“原生胰高血糖素”指由SEQ ID NO：1601序列组成的肽。
本文所用的术语“原生GLP-1”是指明GLP-1(7-36)酰胺(SEQID NO：1603)、GLP-1(7-37)酸(SEQ ID NO：1604)或这两种化合物的混合物的通用术语。
本文所用的术语“原生GIP”指由SEQ ID NO：1607组成的肽。
本文所用的分子的“胰高血糖素功效”或“与原生胰高血糖素相比较的功效”指分子对胰高血糖素受体的EC50除以原生胰高血糖素对胰高血糖素受体的EC50的比率。
本文使用的分子的“GLP-1功效”或“与GLP-1相比较的功效”指的是分子对GLP-1受体的EC50除以原生GLP-1对GLP-1受体的EC50的比率。
本文使用的分子的“GIP功效”或“与原生GIP相比较的功效”指的是分子对GIP受体的EC50除以原生GIP对GIP受体的EC50的比率。
本文使用的“NHR配体”指对核激素受体(NHR)具有生物学活性(或者激动剂或者拮抗剂)的疏水或亲脂部分。NHR配体为完全或部分非肽的。在某些实施方案中，NHR配体是结合至NHR并活化其的激动剂。在其它实施方案中，NHR配体是拮抗剂。在某些实施方案中，NHR配体是通过完全或部分阻断原生配体结合至活化位点起作用的拮抗剂。在其它实施方案中，NHR配体是通过结合至活化位点或变构位点和阻止NHR的活化或使其失活起作用的拮抗剂。
如本文所用的“核激素受体”(NHRs)指有时与其它共活化剂和共抑制剂协作(concert)在细胞核中调节基因表达的配体活化的蛋白。
如本文所用的“类固醇及其衍生物”指或者天然存在或者合成的具有式A结构的化合物：
Figure BPA00001673726800211
其中R1和R2，当存在时，独立地为在式A化合物结合至核激素受体时允许或促进激动剂或拮抗剂活性的部分；R3和R4独立地为当式A化合物结合至核激素受体时允许或促进激动剂或拮抗剂活性的部分；和各虚线表示任选的双键。式A可进一步包括位置1、2、3、4、5、6、7、8、9、11、12、14、15、16和17中的一个或多个位置上的一个或多个取代基。期望的任选的取代基包括，但不限于，OH、NH2、酮和C1-C18烷基。类固醇及其衍生物的特别的非限制性实例包括胆固醇、胆酸***、睾酮和氢化可的松。
如本文所用的，“胆汁酸及其衍生物”指或者天然存在或者合成的式M化合物：
Figure BPA00001673726800212
其中各R15、R16和R17独立地为当式M化合物结合至核激素受体时允许或促进激动剂或拮抗剂活性的部分。在某些实施方案中，各R15和R16独立地为氢、(C0-C8烷基)卤代、C1-C18烷基、C2-C18链烯基、C2-C18炔基、杂烷基或(C0-C8烷基)OH；和R17为OH、(C0-C8烷基)NH(C1-C4烷基)SO3H或(C0-C8烷基)NH(C1-C4烷基)COOH。式M可进一步包括在位置1、2、3、4、5、6、7、8、9、11、12、14、15、16和17中的一个或多个位置的一个或多个取代基。胆汁酸的非限制性实例包括胆酸、去氧胆酸、石胆酸、鹅去氧胆酸、牛磺胆酸和甘氨胆酸。
如本文所用的“胆固醇及其衍生物”指如下所示的包含类似于胆固醇的结构的或者天然存在的或者合成的化合物：
Figure BPA00001673726800221
胆固醇的衍生物可包括氧甾醇类(oxysterols)，诸如羟基胆固醇、24(S)-羟基胆固醇、27-羟基胆固醇和胆甾烯酸(cholestenoic acid)。
如本文所用的“***及其衍生物”指或者天然存在的或者合成的式B化合物：
Figure BPA00001673726800222
其中R1、R5和R6为当式B化合物结合至***受体时允许或促进激动剂或拮抗剂活性的部分。在某些实施方案中，式B的结构被在四环的一个或多个位置，例如，位置1、2、4、6、7、8、9、11、12、14、15、16和17的一个或多个取代基取代。在某些情况下，取代基包括6位的酮。
Figure BPA00001673726800231
***的衍生物的特定的非限制性实例包括β-***17-乙酸酯、β-***17-环戊丙酸酯(cypionate)、β-***17-庚酸酯、β-***17-戊酸酯、β-***3，17-二乙酸酯、β-***3，17-二丙酸酯、β-***3-苯甲酸酯、β-***3-苯甲酸酯17-正丁酸酯、β-***3-缩水甘油醚、β-***3-甲醚、β-***6-酮、β-***3-缩水甘油基、β-***6-酮6-(O-羧甲基肟)、16-表雌三醇、17-表雌三醇、2-甲氧基***、4-甲氧基***、***17-苯基丙酸酯和17β-***2-甲醚、17α-乙炔基***、甲地孕酮乙酸酯和雌三醇。
如本文所用的“睾酮及其衍生物”指或者天然存在的或者合成的式F化合物：
Figure BPA00001673726800232
其中R1，当存在时，R2、R3和R6各独立地为在式F化合物结合至核激素受体时允许或促进激动剂或拮抗剂活性的部分；和各虚线表示任选的双键，前提是在位置5上存在不超过一个任选的碳-碳双键。在某些实施方案中，式F结构被四环的一个或多个位置，例如，位置1、2、3、4、5、6、7、8、9、11、12、14、15、16和17上的一个或多个取代基取代。睾酮衍生物的特定的非限制性实例包括脱氢表雄酮、雄烯二酮、5-***、雄酮和二氢睾酮。
如本文所用的“脂肪酸及其衍生物”指包含长的非支链C1-C28烷基或C2-C28链烯基部分的羧酸并可任选地包括一个或多个卤代取代基和/或任选地包括不同于卤代的一个或多个取代基。在某些实施方案中，长的非支链烷基或链烯基部分可被全部卤代取代(例如用卤原子替代所有的氢)。短链脂肪酸包含1-5个碳原子。中链脂肪酸包含6-12个碳。长链脂肪酸包含13-22个碳原子。极长链的脂肪酸包含23-28个碳原子。脂肪酸的特定非限制性实例包括甲酸、乙酸、正己酸、庚酸、辛酸、壬酸、癸酸、十一烷酸、月桂酸、十三烷酸、肉豆蔻酸、十五烷酸、棕榈酸、十七烷酸、硬脂酸、十九烷酸、花生酸、二十一烷酸、二十二烷酸、二十三烷酸、二十碳三烯酸、肉豆蔻脑酸、棕榈油酸、十六碳烯酸、油酸、亚油酸、α-亚麻酸、反油酸、岩芹酸、花生四烯酸、二羟基二十碳四烯酸(DiHETE)、十八炔酸、二十碳三炔酸、二十碳二烯酸、二十碳三烯酸、二十碳五烯酸、芥酸、二高亚麻酸(dihomolinolenic acid)、二十二碳三烯酸、二十二碳五烯酸、二十二碳六烯酸和和肾上腺酸。
如本文所用的“皮质醇及其衍生物”指或者天然存在的或者合成的式C化合物：
Figure BPA00001673726800241
其中R2、R3、R6、R7、R8、R9和R10各独立地为当式C化合物结合至核激素受体时允许或促进激动剂或拮抗剂活性的部分；和各虚线表示任选的双键。在某些实施方案中，式C结构被四环的一个或多个位置例如，位置1、2、4、5、6、7、8、11、12、14和15上的一个或多个取代基取代。皮质醇及其衍生物的衍生物的特定的非限制性实例包括皮质醇、可的松乙酸酯、倍氯米松、***、***龙、甲泼尼龙、倍他米松、曲安西龙和***。
如本文所用的“连接基团”是使分开的两个实体相互连接的分子或分子基团。连接基团可为两个实体提供最佳间隔或者可进一步提供允许两个实体相互分离的不稳定连接。不稳定连接包括可水解基团、可光裂解基团、酸不稳定部分、碱不稳定部分和可酶裂解基团。
如本文所用的术语“前药”定义为呈现其完全的药理学作用前经历化学修饰的任何化合物。
如本文所用的″二肽″是α-氨基酸或α-羟基酸经肽键连接至另一个氨基酸的结果。
如本文所用的术语″化学裂解″在不存在任何进一步指定下涵盖引起共价化学键的破坏的非酶促反应。
实施方案
本公开提供与NHR配体缀合的胰高血糖素超家族肽。在某些方面，NHR配体能对涉及代谢或糖稳态的核激素受体起作用，且缀合物相较于单独的肽或单独的NHR配体提供对代谢或糖稳态更优的生物学作用。不受本发明理论的束缚，NHR配体可用来使胰高血糖素超家族肽靶向特定类型的细胞或组织；或者作为选择，胰高血糖素超家族肽可用来使NHR配体靶向细胞或例如通过使肽结合至使缀合物内在化的受体促进其转运进细胞。
本发明的胰高血糖素超家族肽缀合物可由下式表示：
Q-L-Y
其中Q是胰高血糖素超家族肽，Y是NHR配体和L是连接基团或键。
在某些实施方案中，胰高血糖素超家族肽(Q)可为胰高血糖素相关肽，其对胰高血糖素受体表现出激动剂活性、对GLP-1受体表现出激动剂活性、对GIP受体表现出激动剂活性，对胰高血糖素和GLP-1受体表现出协同激动剂活性，对胰高血糖素和GIP受体表现出协同激动剂活性，对GLP-1和GIP受体表现出协同激动剂活性或对胰高血糖素、GIP和GLP-1受体表现出三重激动剂活性。在某些实施方案中，胰高血糖素相关肽对胰高血糖素、GLP-1或GIP受体呈现拮抗剂活性。
在某些实施方案中，胰高血糖素超家族肽(Q)可为胰高血糖素相关肽、生长激素释放激素(GHRH；SEQ ID NO：1619)、血管活性肠肽(VIP；SEQ ID NO：1620)、垂体腺苷酸环化酶活化多肽27(PACAP-27；SEQ ID NO：1621)、肽组氨酸蛋氨酸(PHM；SEQ ID NO：1622)或促胰液素(SEQ ID NO：1623)和/或其类似物、衍生物和缀合物。胰高血糖素超家族肽可具有共同的结构特征，包括但不限于在N-末端氨基酸内的同源性和/或在C-末端部分内的α-螺旋状结构。认为，C-末端通常在受体结合方面起作用和N-末端通常在受体信号传道方面起作用。N-末端部分和C-末端部分中的几个氨基酸在胰高血糖素超家族成员，例如，His1、Gly4、Phe6、Phe22、Val23、Trp25和Leu26中是高度保守的，在氨基酸侧链中的这些位置上的氨基酸表现出同一性、保守性取代或相似性。在一些实施方案中，胰高血糖素相关肽Q为胰高血糖素(SEQ ID NO：1601)、泌酸调节肽(SEQ ID NO：1606)、毒蜥外泌肽-4(SEQ ID NO：1618)、胰高血糖素样肽-1(GLP-1)(氨基酸7-37作为SEQ ID NOs：1603和1604提供)、胰高血糖素样肽-2(GLP-2)(SEQ ID NO：1608)、GIP(SEQ ID NO：1607)或者上述的类似物、衍生物和缀合物。在一些实施方案中，Q作为胰高血糖素相关肽，在原生肽的长度(或在对应于胰高血糖素的位置，参见例如图1)，包含与原生胰高血糖素、原生泌酸调节肽、原生毒蜥外泌肽-4、原生(7-37)GLP-1、原生GLP-2或原生GIP的相应序列相同至少约40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的氨基酸序列。在其它的实施方案中，胰高血糖素超家族肽(Q)包含具有最多1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸修饰的原生胰高血糖素、原生毒蜥外泌肽-4、原生(7-37)GLP-1、原生GLP-2、原生GHRH、原生VIP、原生PACAP-27、原生PHM、原生泌酸调节肽、原生促胰液素或原生GIP的氨基酸序列。在另外的其它实施方案中，Q包含为两种或更多种原生胰高血糖素相关肽序列的嵌合体的氨基酸序列。在一些实施方案中，Q包含与原生胰高血糖素(SEQ ID NO：1601)相同至少约50％的氨基酸序列，其保留对应于氨基酸12-29的氨基酸的α-螺旋构象。
在相关方面，本发明提供下式表示的肽缀合物
Q-L-Y
其中Q是骨钙蛋白、降钙素、糊精或其类似物、衍生物或缀合物，而非胰高血糖素超家族肽；Y是NHR配体；L是连接基团或键。在某些实施方案中，Q包括骨钙蛋白(SEQ ID NO：1644)或在原生肽长度方面至少约40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％等同于原生骨钙蛋白的氨基酸序列。Q可包括相对于原生骨钙蛋白具有最多1、2、3、4、5、6、7、8、9或10处氨基酸修饰的骨钙蛋白的类似物，或相对于原生截短骨钙蛋白(truncatedosteocalcin)具有最多1、2、3、4、5、6、7、8、9或10处氨基酸(例如，氨基酸70-84)修饰的骨钙蛋白的截短类似物。在某些实施方案中，Q包括降钙素(SEQ ID NO：1645)，或者在原生肽长度方面至少约40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％等同于原生降钙素的氨基酸序列。Q可包含相对于原生降钙素具有最多1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸修饰的降钙素类似物。在一些实施方案中，Q包含糊精(SEQ ID NO：1646)、或者在原生肽的长度上，与原生糊精有至少约40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％相同的氨基酸序列。Q可包含相对于原生糊精具有最多1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸修饰的糊精类似物。
NHR配体(Y)
在涉及Q-L-Y缀合物的公开中，Y是对任何核激素受体，包括表1中提出的任一种“核激素受体超家族”(NHR超家族)或其类别或亚组起作用的配体。该NHR超家族由细胞内所发现的调节基因转录的结构相关蛋白组成。这些蛋白包括类固醇受体和甲状腺激素受体、维生素受体及尚未发现配体的其它“孤儿”蛋白。核激素受体通常包括至少一个C4-型锌指DNA-结合域(DBD)和/或配体结合域(LBD)。DBD有结合靶基因附近的DNA的功能，且LBD结合其同源激素(cognatehormone)并对其响应。“典型核激素受体”拥有DBD和LBD(例如***受体α)二者，而其它核激素受体只有DBD(例如Knirps、ORD)或只有LBD(例如短杂二聚体伴侣(Short Heterodimer Partner)(SHP))。
核激素受体可分为四种机械类型：I型、II型、III型和IV型。结合至I型受体的配体(NR3组)导致热休克蛋白(HSP)从受体解离、受体同源二聚化、从细胞质易位进入细胞核，并结合至DNA的反向重复序列激素应答单元(HRE’s)。然后核受体/DNA复合物募集其它蛋白，其将来自HRE的下游DNA转录为信使RNA。II型受体(NR1组)保留在核中且作为通常与类维生素A(Retinoid)X受体(RXR)的杂二聚体结合至DNA。II型核激素受体常与辅阻遏物蛋白复合。结合至II型受体的配体使辅阻遏物解离并募集辅激活蛋白。其它蛋白被募集至核受体/DNA复合物，其将DNA转录为信使RNA。III型核激素受体(NR2组)是孤儿受体，其作为同型二聚体(homodimers)结合至DNA的同向重复序列HRE’s。IV型核激素受体或者作为单体或者作为二聚体结合至DNA。IV型受体是独特的，因为受体的单一DNA结合域结合至单一半位点HRE。NHR配体可为作用于任何一个或多个的I型、II型、III型或IV型核激素受体的配体(例如作为激动剂或拮抗剂)。
表1.核激素受体超家族
Figure BPA00001673726800281
Figure BPA00001673726800301
表数据取自Laudet和Gronemeyer“核受体实录(Facts Book)”AcademicPress。类别ID指各成员的分类码，登录号(accession)指NCBI GenBank核苷酸登录码。
NHR配体(Y)的活性
在某些实施方案中，Y对核激素受体活化表现出约10mM或更少，或1mM(1000μM)或更少(例如，约750μM或更少，约500μM或更少，约250μM或更少，约100μM或更少，约75μM或更少，约50μM或更少，约25μM或更少，约10μM或更少，约7.5μM或更少，约6μM或更少，约5μM或更少，约4μM或更少，约3μM或更少，约2μM或更少或约1μM或更少)的EC50(或在拮抗剂的情况下为IC50)。在某些实施方案中，Y对核激素受体表现出约1000nM或更少(例如，约750nM或更少，约500nM或更少，约250nM或更少，约100nM或更少，约75nM或更少，约50nM或更少，约25nM或更少，约10nM或更少，约7.5nM或更少，约6nM或更少，约5nM或更少，约4nM或更少，约3nM或更少，约2nM或更少或约1nM或更少)的EC50或IC50。在某些实施方案中，Y对核激素受体具有在皮摩尔范围内的EC50或IC50。因此，在某些实施方案中，Y对核激素受体表现出约1000pM或更少(例如，约750pM或更少，约500pM或更少，约250pM或更少，约100pM或更少，约75pM或更少，约50pM或更少，约25pM或更少，约10pM或更少，约7.5pM或更少，约6pM或更少，约5pM或更少，约4pM或更少，约3pM或更少，约2pM或更少或约1pM或更少)的EC50或IC50。
在某些实施方案中，Y对核激素受体表现出约0.001pM或更多，约0.01pM或更多或约0.1pM或更多的EC50或IC50。可通过本领域已知的任何试验测定核激素受体活化(核激素受体活性)。例如，可通过在激素响应启动子的控制下，在也具有报道基因(例如，编码β-半乳糖苷酶的lacZ)的酵母细胞中表达该受体，测定对核激素受体的活性。因此，在对受体起作用的配体的存在下，表达报道基因并可测定报道基因产物的活性(例如，通过分解发色底物，诸如最初为黄色的氯酚红-β-D-吡喃半乳糖苷(CPRG)，变成可经吸光率测定的红色产物，测定β-半乳糖苷酶活性)。参见，例如，Jungbauer和Beck，J.Chromatog.B，77：167-178(2002)；Routledge和Sumpter，J.Biol.Chem，272：3280-3288(1997)；Liu等，J.Biol.Chem.，274：26654-26660(1999)。例如，可采用本领域已知的任何结合试验，诸如，荧光偏振或放射性试验，确定NHR配体与核激素受体的结合。参见，例如，Ranamoorthy等，138(4)：1520-1527(1997)。
在某些实施方案中，相对于原生核激素(核激素功效)，Y对核激素受体表现出约0.001％或更多，约0.01％或更多，约0.1％或更多，约0.5％或更多，约1％或更多，约5％或更多，约10％或更多，约20％或更多，约30％或更多，约40％或更多，约50％或更多，约60％或更多，约75％或更多，约100％或更多，约125％或更多，约150％或更多，约175％或更多，约200％或更多，约250％或更多，约300％或更多，约350％或更多，约400％或更多，约450％或更多或约500％或更多的活性。在某些实施方案中，相对于原生核激素，Y对核激素受体表现出约5000％或更少或约10,000％或更少的活性。相对于受体的原生配体，将Y对受体的活性计算为Y的EC50s相对原生配体的反比。在某些实施方案中，Y是受体的原生配体。
NHR配体(Y)的结构
本发明的NHR配体(Y)为部分或完全非肽的且为疏水或亲脂性的。在某些实施方案中，NHR配体的分子量为约5000道尔顿或更少，或约4000道尔顿或更少，或约3000道尔顿或更少，或约2000道尔顿或更少，或约1750道尔顿或更少，或约1500道尔顿或更少，或约1250道尔顿或更少，或约1000道尔顿或更少，或约750道尔顿或更少，或约500道尔顿或更少，或约250道尔顿或更少。Y结构与本文公开的任何讲述内容一致。
在本文描述的实施方案中，Y在能够与Q或L反应的Y的任何位置缀合于L(例如当L为连接基团时)或Q(例如当L为键时)。本领域的技术人员可鉴于一般知识和本文提供的公开易于确定缀合的位置和方式。
在本文描述的任何实施方案中，其中Y包含具有连接于1个5元环的3个6元环的四环骨架或其变体(例如作用于维生素D受体的Y)，骨架的碳原子用如以下显示的位置编号来指定：
Figure BPA00001673726800331
例如，在6-位具有酮的修饰指的是以下结构：
Figure BPA00001673726800332
对I型核激素受体起作用的NHR配体
在本发明的某些实施方案中，NHR配体(Y)对I型核激素受体起作用。在某些实施方案中，Y可在配体结合至I型核激素受体时具有允许或促进激动剂活性的任何结构，而在其它实施方案中，Y是I型核激素受体的拮抗剂。
在示例性实施方案中，Y包括如式A中所示的结构：
Figure BPA00001673726800333
其中R1和R2，当存在时，独立地为当式A化合物结合至I型核激素受体时允许或促进激动剂或拮抗剂活性的部分；R3和R4独立地为在式A化合物结合至I型核激素受体时允许或促进激动剂或拮抗剂活性的部分；和各虚线表示任选的双键。式A可在位置1、2、3、4、5、6、7、8、9、11、12、14、15、16、17、18和19中的一个或多个位置上进一步包括一个或多个取代基。预期的任选的取代基包括，但不限于，OH、NH2、酮和C1-C18烷基。
在某些实施方案中，Y包括式A结构，其中
R1存在并且为氢、C1-C18烷基、C2-C18链烯基、C2-C18炔基、杂烷基、(C0-C8烷基)芳基、(C0-C8烷基)杂芳基、(C0-C8烷基)C(O)C1-C18烷基、(C0-C8烷基)C(O)C2-C 18链烯基、(C0-C8烷基)C(O)C2-C 18炔基、(C0-C8烷基)C(O)H、(C0-C8烷基)C(O)芳基、(C0-C8烷基)C(O)杂芳基、(C0-C8烷基)C(O)OC1-C18烷基、(C0-C8烷基)C(O)OC2-C18链烯基、(C0-C8烷基)C(O)OC2-C 18炔基、(C0-C8烷基)C(O)OH、(C0-C8烷基)C(O)O芳基、(C0-C8烷基)C(O)杂芳基、(C0-C8烷基)C(O)NR24C 1-C 18烷基、(C0-C8烷基)C(O)NR24C2-C18链烯基、(C0-C8烷基)C(O)NR24C2-C 18炔基、(C0-C8烷基)C(O)NR24H2、(C0-C8烷基)C(O)NR24芳基、(C0-C8烷基)C(O)NR24杂芳基或SO3H；
R2存在并且为氢、(C0-C8烷基)卤代、C1-C18烷基、C2-C18链烯基、C2-C18炔基、杂烷基、(C0-C8烷基)芳基、(C0-C8烷基)杂芳基、(C0-C8烷基)OC1-C18烷基、(C0-C8烷基)OC2-C18链烯基、(C0-C8烷基)OC2-C18炔基、(C0-C8烷基)OH、(C0-C8烷基)SH、(C0-C8烷基)NR24C1-C18烷基、(C0-C8烷基)NR24C2-C18链烯基、(C0-C8烷基)NR24C2-C18炔基、(C0-C8烷基)NR24H2、(C0-C8烷基)C(O)C1-C18烷基、(C0-C8烷基)C(O)C2-C18链烯基、(C0-C8烷基)C(O)C2-C18炔基、(C0-C8烷基)C(O)H、(C0-C8烷基)C(O)芳基、(C0-C8烷基)C(O)杂芳基、(C0-C8烷基)C(O)OC1-C18烷基、(C0-C8烷基)C(O)OC2-C18链烯基、(C0-C8烷基)C(O)OC2-C18炔基、(C0-C8烷基)C(O)OH、(C0-C8烷基)C(O)O芳基、(C0-C8烷基)C(O)O杂芳基、(C0-C8烷基)OC(O)C1-C18烷基、(C0-C8烷基)OC(O)C2-C18链烯基、(C0-C8烷基)OC(O)C2-C18炔基、(C0-C8烷基)C(O)NR24C1-C18烷基、(C0-C8烷基)C(O)NR24C2-C18链烯基、(C0-C8烷基)C(O)NR24C2-C18炔基、(C0-C8烷基)C(O)NR24H2、(C0-C8烷基)C(O)NR24芳基、(C0-C8烷基)C(O)NR24杂芳基、(C0-C8烷基)NR24C(O)C1-C18烷基、(C0-C8烷基)NR24C(O)C2-C8链烯基、或(C0-C8烷基)NR24C(O)C2-C18炔基、(C0-C8烷基)NR24C(O)OH、(C0-C8烷基)OC(O)OC1-C18烷基、(C0-C8烷基)OC(O)OC2-C18链烯基、(C0-C8烷基)OC(O)OC2-C18炔基、(C0-C8烷基)OC(O)OH、(C0-C8烷基)OC(O)NR24C1-C18烷基、(C0-C8烷基)OC(O)NR24C2-C18链烯基、(C0-C8烷基)OC(O)NR24C2-C18炔基、(C0-C8烷基)OC(O)NR24H2、(C0-C8烷基)NR24(O)OC1-C18烷基、(C0-C8烷基)NR24(O)OC2-C18链烯基、(C0-C8烷基)NR24(O)OC2-C18炔基或(C0-C8烷基)NR24(O)OH；
R3为氢、(C0-C8烷基)卤代、C1-C18烷基、C2-C18链烯基、C2-C18炔基、杂烷基、(C0-C8烷基)芳基、(C0-C8烷基)杂芳基、(C0-C8烷基)OC1-C18烷基、(C0-C8烷基)OC2-C18链烯基、(C0-C8烷基)OC2-C18炔基、(C0-C8烷基)OH、(C0-C8烷基)SH、(C0-C8烷基)NR24C1-C18烷基、(C0-C8烷基)NR24C2-C18链烯基、(C0-C8烷基)NR24C2-C18炔基、(C0-C8烷基)NR24H2、(C0-C8烷基)C(O)C1-C18烷基、(C0-C8烷基)C(O)C2-C18链烯基、(C0-C8烷基)C(O)C2-C18炔基、(C0-C8烷基)C(O)H、(C0-C8烷基)C(O)芳基、(C0-C8烷基)C(O)杂芳基、(C0-C8烷基)C(O)OC1-C18烷基、(C0-C8烷基)C(O)OC2-C18链烯基、(C0-C8烷基)C(O)OC2-C18炔基、(C0-C8烷基)C(O)OH、(C0-C8烷基)C(O)O芳基、(C0-C8烷基)C(O)O杂芳基、(C0-C8烷基)OC(O)C1-C18烷基、(C0-C8烷基)OC(O)C2-C18链烯基、(C0-C8烷基)OC(O)C2-C18炔基、(C0-C8烷基)C(O)NR24C1-C18烷基、(C0-C8烷基)C(O)NR24C2-C18链烯基、(C0-C8烷基)C(O)NR24C2-C18炔基、(C0-C8烷基)C(O)NR24H2、(C0-C8烷基)C(O)NR24芳基、(C0-C8烷基)C(O)NR2杂芳基、(C0-C8烷基)NR24C(O)C1-C18烷基、(C0-C8烷基)NR24C(O)C2-C18链烯基、或(C0-C8烷基)NR24C(O)C2-C18炔基、(C0-C8烷基)NR24C(O)OH、(C0-C8烷基)OC(O)OC1-C18烷基、(C0-C8烷基)OC(O)OC2-C18链烯基、(C0-C8烷基)OC(O)OC2-C18炔基、(C0-C8烷基)OC(O)OH、(C0-C8烷基)OC(O)NR24C1-C18烷基、(C0-C8烷基)OC(O)NR24C2-C18链烯基、(C0-C8烷基)OC(O)NR24C2-C18炔基、(C0-C8烷基)OC(O)NR24H2、(C0-C8烷基)NR24(O)OC1-C18烷基、(C0-C8烷基)NR24(O)OC2-C18链烯基、(C0-C8烷基)NR24(O)OC2-C18炔基或(C0-C8烷基)NR24(O)OH；
R4为氢、(C0-C8烷基)卤代、C1-C18烷基、C2-C18链烯基、C2-C18炔基、杂烷基、(C0-C8烷基)芳基、(C0-C8烷基)杂芳基、(C0-C8烷基)OC1-C18烷基、(C0-C8烷基)OC2-C18链烯基、(C0-C8烷基)OC2-C18炔基、(C0-C8烷基)OH、(C0-C8烷基)SH、(C0-C8烷基)NR24C1-C18烷基、(C0-C8烷基)NR24C2-C18链烯基、(C0-C8烷基)NR24C2-C18炔基、(C0-C8烷基)NR24H2、(C0-C8烷基)C(O)C1-C18烷基、(C0-C8烷基)C(O)C2-C18链烯基、(C0-C8烷基)C(O)C2-C18炔基、(C0-C8烷基)C(O)H、(C0-C8烷基)C(O)芳基、(C0-C8烷基)C(O)杂芳基、(C0-C8烷基)C(O)OC1-C18烷基、(C0-C8烷基)C(O)OC2-C18链烯基、(C0-C8烷基)C(O)OC2-C18炔基、(C0-C8烷基)C(O)OH、(C0-C8烷基)C(O)O芳基、(C0-C8烷基)C(O)O杂芳基、(C0-C8烷基)OC(O)C1-C18烷基、(C0-C8烷基)OC(O)C2-C18链烯基、(C0-C8烷基)OC(O)C2-C18炔基、(C0-C8烷基)C(O)NR24C1-C18烷基、(C0-C8烷基)C(O)NR24C2-C18链烯基、(C0-C8烷基)C(O)NR24C2-C18炔基、(C0-C8烷基)C(O)NR24H2、(C0-C8烷基)C(O)NR24芳基、(C0-C8烷基)C(O)NR24杂芳基、(C0-C8烷基)NR24C(O)C1-C18烷基、(C0-C8烷基)NR24C(O)C2-C8链烯基、或(C0-C8烷基)NR24C(O)C2-C18炔基、(C0-C8烷基)NR24C(O)OH、(C0-C8烷基)OC(O)OC1-C18烷基、(C0-C8烷基)OC(O)OC2-C18链烯基、(C0-C8烷基)OC(O)OC2-C18炔基、(C0-C8烷基)OC(O)OH、(C0-C8烷基)OC(O)NR24C1-C18烷基、(C0-C8烷基)OC(O)NR24C2-C18链烯基、(C0-C8烷基)OC(O)NR24C2-C18炔基、(C0-C8烷基)OC(O)NR24H2、(C0-C8烷基)NR24(O)OC1-C18烷基、(C0-C8烷基)NR24(O)OC2-C18链烯基、(C0-C8烷基)NR24(O)OC2-C18炔基或(C0-C8烷基)NR24(O)OH；和
R24为氢或C1-C18烷基。
在某些实施方案中，Y包括式A结构，其中
R1存在并且为氢、C1-C7烷基、(C0-C3烷基)C(O)C1-C7烷基、(C0-C3烷基)C(O)芳基或SO3H；
R2存在并且为氢、卤代、OH或C1-C7烷基；
R3为氢、卤代、OH或C1-C7烷基；
R4为氢、(C0-C8烷基)卤代、C1-C18烷基、C2-C18链烯基、C2-C18炔基、杂烷基、(C0-C8烷基)芳基、(C0-C8烷基)杂芳基、(C0-C8烷基)OC1-C8烷基、(C0-C8烷基)OC2-C8链烯基、(C0-C8烷基)OC2-C8炔基、(C0-C8烷基)OH、(C0-C8烷基)SH、(C0-C8烷基)NR24C1-C8烷基、(C0-C8烷基)NR24C2-C8链烯基、(C0-C8烷基)NR24C2-C8炔基、(C0-C8烷基)NR24H2、(C0-C8烷基)C(O)C1-C8烷基、(C0-C8烷基)C(O)C2-C8链烯基、(C0-C8烷基)C(O)C2-C8炔基、(C0-C8烷基)C(O)H、(C0-C8烷基)C(O)芳基、(C0-C8烷基)C(O)杂芳基、(C0-C8烷基)C(O)OC1-C8烷基、(C0-C8烷基)C(O)OC2-C8链烯基、(C0-C8烷基)C(O)OC2-C8炔基、(C0-C8烷基)C(O)OH、(C0-C8烷基)C(O)O芳基、(C0-C8烷基)C(O)O杂芳基、(C0-C8烷基)OC(O)C1-C8烷基、(C0-C8烷基)OC(O)C2-C8链烯基、(C0-C8烷基)OC(O)C2-C18炔基、(C0-C8烷基)C(O)NR24C1-C8烷基、(C0-C8烷基)C(O)NR24C2-C8链烯基、(C0-C8烷基)C(O)NR24C2-C8炔基、(C0-C8烷基)C(O)NR24H2、(C0-C8烷基)C(O)NR24芳基、(C0-C8烷基)C(O)NR24杂芳基、(C0-C8烷基)NR24C(O)C1-C8烷基、(C0-C8烷基)NR24C(O)C2-C8链烯基、或(C0-C8烷基)NR24C(O)C2-C8炔基、(C0-C8烷基)NR24C(O)OH、(C0-C8烷基)OC(O)OC1-C8烷基、(C0-C8烷基)OC(O)OC2-C8链烯基、(C0-C8烷基)OC(O)OC2-C8炔基、(C0-C8烷基)OC(O)OH、(C0-C8烷基)OC(O)NR24C1-C8烷基、(C0-C8烷基)OC(O)NR24C2-C8链烯基、(C0-C8烷基)OC(O)NR24C2-C8炔基、(C0-C8烷基)OC(O)NR24H2、(C0-C8烷基)NR24(O)OC1-C8烷基、(C0-C8烷基)NR24(O)OC2-C8链烯基、(C0-C8烷基)NR24(O)OC2-C8炔基或(C0-C8烷基)NR24(O)OH；和
R24为氢或C1-C7烷基。
在一些实施方案中，R1为氢、丙酸酯、乙酸酯、苯甲酸酯或硫酸酯；R2为氢或甲基；R3为氢或甲基；和R4为乙酸酯、环戊丙酸酯、半琥珀酸酯、庚酸酯或丙酸酯。
在其中Y包含式A结构的实施方案中，Y在能够与Q或L反应的式A的任何位置缀合于L(例如当L为连接基团时)或Q(例如当L为键时)。本领域的技术人员可鉴于一般知识和本文提供的公开易于确定式A上的缀合位置和式A与Q或L缀合的方式。在一些实施方案中，式A在式A的位置1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20中的任何位置缀合于L或Q。在一些实施方案中，式A在式A的位置1、3、6、7、12、10、13、16、17或19缀合于L或Q。
在某些实施方案中，Y作用于***受体(例如ERα、ERβ)。在某些实施方案中，Y在***受体上允许或促进激动剂活性，而在其它实施方案中，Y为ER的拮抗剂。在示例性实施方案中，Y可具有式B结构：
Figure BPA00001673726800381
其中R1、R5和R6是在式B化合物结合至***受体时允许或促进激动剂或拮抗剂活性的部分。在某些实施方案中，式B在位置1、2、4、6、7、8、9、11、12、14、15和16中的一个或多个位置进一步包括一个或多个取代基(例如6位的酮)。
在某些实施方案中，当Y包括式B结构时，其中
R1为氢、C1-C18烷基、C2-C18链烯基、C2-C18炔基、杂烷基、(C0-C8烷基)芳基、(C0-C8烷基)杂芳基、(C0-C8烷基)C(O)C1-C18烷基、(C0-C8烷基)C(O)C2-C18链烯基、(C0-C8烷基)C(O)C2-C18炔基、(C0-C8烷基)C(O)H、(C0-C8烷基)C(O)芳基、(C0-C8烷基)C(O)杂芳基、(C0-C8烷基)C(O)OC1-C18烷基、(C0-C8烷基)C(O)OC2-C18链烯基、(C0-C8烷基)C(O)OC2-C18炔基、(C0-C8烷基)C(O)OH、(C0-C8烷基)C(O)O芳基、(C0-C8烷基)C(O)O杂芳基、(C0-C8烷基)C(O)NR24C1-C18烷基、(C0-C8烷基)C(O)NR24C2-C18链烯基、(C0-C8烷基)C(O)NR24C2-C18炔基、(C0-C8烷基)C(O)NR24H2、(C0-C8烷基)C(O)NR24芳基、(C0-C8烷基)C(O)NR24杂芳基或SO3；
R5为氢、(C0-C8烷基)卤代、C1-C18烷基、C2-C18链烯基、C2-C18炔基、杂烷基、(C0-C8烷基)芳基、(C0-C8烷基)杂芳基、(C0-C8烷基)OC1-C18烷基、(C0-C8烷基)OC2-C18链烯基、(C0-C8烷基)OC2-C18炔基、(C0-C8烷基)OH、(C0-C8烷基)SH、(C0-C8烷基)NR24C1-C18烷基、(C0-C8烷基)NR24C2-C18链烯基、(C0-C8烷基)NR24C2-C18炔基、(C0-C8烷基)NR24H2、(C0-C8烷基)C(O)C1-C18烷基、(C0-C8烷基)C(O)C2-C18链烯基、(C0-C8烷基)C(O)C2-C18炔基、(C0-C8烷基)C(O)H、(C0-C8烷基)C(O)芳基、(C0-C8烷基)C(O)杂芳基、(C0-C8烷基)C(O)OC1-C18烷基、(C0-C8烷基)C(O)OC2-C18链烯基、(C0-C8烷基)C(O)OC2-C18炔基、(C0-C8烷基)C(O)OH、(C0-C8烷基)C(O)O芳基、(C0-C8烷基)C(O)O杂芳基、(C0-C8烷基)OC(O)C1-C18烷基、(C0-C8烷基)OC(O)C2-C18链烯基、(C0-C8烷基)OC(O)C2-C18炔基、(C0-C8烷基)C(O)NR24C1-C18烷基、(C0-C8烷基)C(O)NR24C2-C18链烯基、(C0-C8烷基)C(O)NR24C2-C18炔基、(C0-C8烷基)C(O)NR24H2、(C0-C8烷基)C(O)NR24芳基、(C0-C8烷基)C(O)NR24杂芳基、(C0-C8烷基)NR24C(O)C1-C18烷基、(C0-C8烷基)NR24C(O)C2-C8链烯基、或(C0-C8烷基)NR24C(O)C2-C18炔基、(C0-C8烷基)NR24C(O)OH、(C0-C8烷基)OC(O)OC1-C18烷基、(C0-C8烷基)OC(O)OC2-C18链烯基、(C0-C8烷基)OC(O)OC2-C18炔基、(C0-C8烷基)OC(O)OH、(C0-C8烷基)OC(O)NR24C1-C18烷基、(C0-C8烷基)OC(O)NR24C2-C18链烯基、(C0-C8烷基)OC(O)NR24C2-C18炔基、(C0-C8烷基)OC(O)NR24H2、(C0-C8烷基)NR24(O)OC1-C18烷基、(C0-C8烷基)NR24(O)OC2-C18链烯基、(C0-C8烷基)NR24(O)OC2-C18炔基或(C0-C8烷基)NR24(O)OH；(C0-C8烷基)C(O)C1-C18烷基、(C0-C8烷基)C(O)C2-C18链烯基、(C0-C8烷基)C(O)C2-C18炔基、(C0-C8烷基)C(O)OC1-C18烷基、(C0-C8烷基)C(O)OC2-C18链烯基、(C0-C8烷基)C(O)OC2-C18炔基、(C0-C8烷基)C(O)OH、(C0-C8烷基)OC(O)C1-C18烷基、(C0-C8烷基)OC(O)C2-C18链烯基、(C0-C8烷基)OC(O)C2-C18炔基、(C0-C8烷基)C(O)NR24C1-C18烷基、(C0-C8烷基)C(O)NR24C2-C18链烯基、(C0-C8烷基)C(O)NR24C2-C18炔基、(C0-C8烷基)C(O)NR24H2、(C0-C8烷基)NR24C(O)C1-C18烷基、(C0-C8烷基)NR24C(O)C2-C8链烯基或(C0-C8烷基)NR24C(O)C2-C18炔基或(C0-C8烷基)NR24C(O)OH；
R6为氢、C1-C18烷基、C2-C18链烯基、C2-C18炔基、杂烷基、(C0-C8烷基)芳基、(C0-C8烷基)杂芳基、(C0-C8烷基)C(O)C1-C18烷基、(C0-C8烷基)C(O)C2-C18链烯基、(C0-C8烷基)C(O)C2-C18炔基、(C0-C8烷基)C(O)H、(C0-C8烷基)C(O)芳基、(C0-C8烷基)C(O)杂芳基、(C0-C8烷基)C(O)OC1-C18烷基、(C0-C8烷基)C(O)OC2-C18链烯基、(C0-C8烷基)C(O)OC2-C18炔基、(C0-C8烷基)C(O)OH、(C0-C8烷基)C(O)O芳基、(C0-C8烷基)C(O)O杂芳基、(C0-C8烷基)C(O)NR24C1-C18烷基、(C0-C8烷基)C(O)NR24C2-C18链烯基、(C0-C8烷基)C(O)NR24C2-C18炔基、(C0-C8烷基)C(O)NR24H2、(C0-C8烷基)C(O)NR24芳基、(C0-C8烷基)C(O)NR24杂芳基或SO3H；和
R24为氢或C1-C18烷基。
在某些实施方案中，Y包括式B结构，其中
R1为氢、C1-C7烷基、(C0-C3烷基)C(O)C1-C7烷基、(C0-C3烷基)C(O)芳基或SO3H；
R5为氢、(C0-C8烷基)卤代、C1-C8烷基、C2-C8链烯基、C2-C18炔基、杂烷基、(C0-C8烷基)芳基、(C0-C8烷基)杂芳基、(C0-C8烷基)OC1-C8烷基、(C0-C8烷基)OC2-C8链烯基、(C0-C8烷基)OC2-C8炔基、(C0-C8烷基)OH、(C0-C8烷基)SH、(C0-C8烷基)NR24C1-C8烷基、(C0-C8烷基)NR24C2-C8链烯基、(C0-C8烷基)NR24C2-C8炔基、(C0-C8烷基)NR24H2、(C0-C8烷基)C(O)C1-C8烷基、(C0-C8烷基)C(O)C2-C8链烯基、(C0-C8烷基)C(O)C2-C8炔基、(C0-C8烷基)C(O)H、(C0-C8烷基)C(O)芳基、(C0-C8烷基)C(O)杂芳基、(C0-C8烷基)C(O)OC1-C8烷基、(C0-C8烷基)C(O)OC2-C8链烯基、(C0-C8烷基)C(O)OC2-C8炔基、(C0-C8烷基)C(O)OH、(C0-C8烷基)C(O)O芳基、(C0-C8烷基)C(O)O杂芳基、(C0-C8烷基)OC(O)C1-C8烷基、(C0-C8烷基)OC(O)C2-C8链烯基、(C0-C8烷基)OC(O)C2-C18炔基、(C0-C8烷基)C(O)NR24C1-C8烷基、(C0-C8烷基)C(O)NR24C2-C8链烯基、(C0-C8烷基)C(O)NR24C2-C8炔基、(C0-C8烷基)C(O)NR24H2、(C0-C8烷基)C(O)NR24芳基、(C0-C8烷基)C(O)NR24杂芳基、(C0-C8烷基)NR24C(O)C1-C8烷基、(C0-C8烷基)NR24C(O)C2-C8链烯基、或(C0-C8烷基)NR24C(O)C2-C8炔基、(C0-C8烷基)NR24C(O)OH、(C0-C8烷基)OC(O)OC1-C8烷基、(C0-C8烷基)OC(O)OC2-C8链烯基、(C0-C8烷基)OC(O)OC2-C8炔基、(C0-C8烷基)OC(O)OH、(C0-C8烷基)OC(O)NR24C1-C8烷基、(C0-C8烷基)OC(O)NR24C2-C18链烯基、(C0-C8烷基)OC(O)NR24C2-C8炔基、(C0-C8烷基)OC(O)NR24H2、(C0-C8烷基)NR24(O)OC1-C8烷基、(C0-C8烷基)NR24(O)OC2-C8链烯基、(C0-C8烷基)NR24(O)OC2-C8炔基或(C0-C8烷基)NR24(O)OH；
R6为氢、C1-C8烷基、C2-C8链烯基、C2-C8炔基、杂烷基、(C0-C8烷基)芳基、(C0-C8烷基)杂芳基、(C0-C8烷基)C(O)C1-C8烷基、(C0-C8烷基)C(O)C2-C8链烯基、(C0-C8烷基)C(O)C2-C8炔基、(C0-C8烷基)C(O)H、(C0-C8烷基)C(O)芳基、(C0-C8烷基)C(O)杂芳基、(C0-C8烷基)C(O)OC1-C8烷基、(C0-C8烷基)C(O)OC2-C8链烯基、(C0-C8烷基)C(O)OC2-C8炔基、(C0-C8烷基)C(O)OH、(C0-C8烷基)C(O)O芳基、(C0-C8烷基)C(O)O杂芳基、(C0-C8烷基)C(O)NR24C1-C8烷基、(C0-C8烷基)C(O)NR24C2-C8链烯基、(C0-C8烷基)C(O)NR24C2-C8炔基、(C0-C8烷基)C(O)NR24H2、(C0-C8烷基)C(O)NR24芳基或(C0-C8烷基)C(O)NR24杂芳基；和
R24为氢或C1-C7烷基。
例如，R1为氢、丙酸酯、乙酸酯、苯甲酸酯或硫酸酯；R5为氢、乙炔基、羟基；和R6为乙酸酯、环戊丙酸酯、半琥珀酸酯、庚酸酯，或丙酸酯。
化合物的非限制性实例包括17β-***、***的修饰形式例如β-***17-乙酸酯、β-***17-环戊丙酸酯、β-***17-庚酸酯、β-***17-戊酸酯、β-***3，17-二乙酸酯、β-***3，17-二丙酸酯、β-***3-苯甲酸酯、β-***3-苯甲酸酯17-正丁酸酯、β-***3-缩水甘油基醚、β-***3-甲基醚、β-***6-酮、β-***3-缩水甘油基、β-***6-酮6-(O-羧甲基肟)、16-表雌三醇、17-表雌三醇、2-甲氧基***、4-甲氧基***、***17-苯基丙酸酯和17β-***2-甲基醚、17α-乙炔基***、醋酸甲地孕酮、雌三醇及其衍生物。在一些实施方案中，17-碳具有酮取代基，并且R5和R6不存在(例如雌酮)。以下显示一些以上提及的式B化合物：
Figure BPA00001673726800421
在其中Y包括式B结构的实施方案中，Y在能与Q或L反应的式B的任何位置缀合于L(例如当L为连接基团时)或Q(例如当L为键时)。本领域的技术人员可鉴于一般知识和本文提供的公开易于确定式B上的缀合位置和式B与Q或L的缀合方式。在某些实施方案中，式B在式B的位置1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20中的任何位置缀合至L或Q。在某些实施方案中，式B在式B的位置3或17缀合至L或Q。
在其它实施方案中，Y作用于***受体但不被式B所涵盖。作用于***受体并不被式B所涵盖的配体的非限制性实例表示如下：
在某些实施方案中，Y作用于糖皮质激素受体(GR)。在某些实施方案中，Y包括允许或促进对GR的激动剂活性的结构，而在其它实施方案中，Y是GR的拮抗剂。在示例性实施方案中，Y包括式C结构：
Figure BPA00001673726800432
其中R2、R3、R6、R7、R8、R9和R10各独立地为在式C化合物结合至GR时允许或促进激动剂或拮抗剂活性的部分；和各虚线表示任选的双键。在某些实施方案中，式C进一步包括在位置1、2、4、5、6、7、8、9、11、12、14和15中的一个或多个位置上的一个或多个取代基(例如11-位上的羟基或酮)。
在某些实施方案中，Y包括式C结构，其中
R2为氢、(C0-C8烷基)卤代、C1-C18烷基、C2-C18链烯基、C2-C18炔基、杂烷基、(C0-C8烷基)芳基、(C0-C8烷基)杂芳基、(C0-C8烷基)OC1-C18烷基、(C0-C8烷基)OC2-C18链烯基、(C0-C8烷基)OC2-C18炔基、(C0-C8烷基)OH、(C0-C8烷基)SH、(C0-C8烷基)NR24C1-C18烷基、(C0-C8烷基)NR24C2-C18链烯基、(C0-C8烷基)NR24C2-C18炔基、(C0-C8烷基)NR24H2、(C0-C8烷基)C(O)C1-C18烷基、(C0-C8烷基)C(O)C2-C18链烯基、(C0-C8烷基)C(O)C2-C18炔基、(C0-C8烷基)C(O)H、(C0-C8烷基)C(O)芳基、(C0-C8烷基)C(O)杂芳基、(C0-C8烷基)C(O)OC1-C18烷基、(C0-C8烷基)C(O)OC2-C18链烯基、(C0-C8烷基)C(O)OC2-C18炔基、(C0-C8烷基)C(O)OH、(C0-C8烷基)C(O)O芳基、(C0-C8烷基)C(O)O杂芳基、(C0-C8烷基)OC(O)C1-C18烷基、(C0-C8烷基)OC(O)C2-C18链烯基、(C0-C8烷基)OC(O)C2-C18炔基、(C0-C8烷基)C(O)NR24C1-C18烷基、(C0-C8烷基)C(O)NR24C2-C18链烯基、(C0-C8烷基)C(O)NR24C2-C18炔基、(C0-C8烷基)C(O)NR24H2、(C0-C8烷基)C(O)NR24芳基、(C0-C8烷基)C(O)NR24杂芳基、(C0-C8烷基)NR24C(O)C1-C18烷基、(C0-C8烷基)NR24C(O)C2-C8链烯基或(C0-C8烷基)NR24C(O)C2-C18炔基、(C0-C8烷基)NR24C(O)OH、(C0-C8烷基)OC(O)OC1-C18烷基、(C0-C8烷基)OC(O)OC2-C18链烯基、(C0-C8烷基)OC(O)OC2-C18炔基、(C0-C8烷基)OC(O)OH、(C0-C8烷基)OC(O)NR24C1-C18烷基、(C0-C8烷基)OC(O)NR24C2-C18链烯基、(C0-C8烷基)OC(O)NR24C2-C18炔基、(C0-C8烷基)OC(O)NR24H2、(C0-C8烷基)NR24(O)OC1-C18烷基、(C0-C8烷基)NR24(O)OC2-C18链烯基、(C0-C8烷基)NR24(O)OC2-C18炔基或(C0-C8烷基)NR24(O)OH；
R3为氢、(C0-C8烷基)卤代、C1-C18烷基、C2-C18链烯基、C2-C18炔基、杂烷基、(C0-C8烷基)芳基、(C0-C8烷基)杂芳基、(C0-C8烷基)OC1-C18烷基、(C0-C8烷基)OC2-C18链烯基、(C0-C8烷基)OC2-C18炔基、(C0-C8烷基)OH、(C0-C8烷基)SH、(C0-C8烷基)NR24C1-C18烷基、(C0-C8烷基)NR24C2-C18链烯基、(C0-C8烷基)NR24C2-C18炔基、(C0-C8烷基)NR24H2、(C0-C8烷基)C(O)C1-C18烷基、(C0-C8烷基)C(O)C2-C18链烯基、(C0-C8烷基)C(O)C2-C18炔基、(C0-C8烷基)C(O)H、(C0-C8烷基)C(O)芳基、(C0-C8烷基)C(O)杂芳基、(C0-C8烷基)C(O)OC1-C18烷基、(C0-C8烷基)C(O)OC2-C18链烯基、(C0-C8烷基)C(O)OC2-C18炔基、(C0-C8烷基)C(O)OH、(C0-C8烷基)C(O)O芳基、(C0-C8烷基)C(O)O杂芳基、(C0-C8烷基)OC(O)C1-C18烷基、(C0-C8烷基)OC(O)C2-C18链烯基、(C0-C8烷基)OC(O)C2-C18炔基、(C0-C8烷基)C(O)NR24C1-C18烷基、(C0-C8烷基)C(O)NR24C2-C18链烯基、(C0-C8烷基)C(O)NR24C2-C18炔基、(C0-C8烷基)C(O)NR24H2、(C0-C8烷基)C(O)NR24芳基、(C0-C8烷基)C(O)NR24杂芳基、(C0-C8烷基)NR24C(O)C1-C18烷基、(C0-C8烷基)NR24C(O)C2-C 8链烯基或(C0-C8烷基)NR24C(O)C2-C18炔基、(C0-C8烷基)NR24C(O)OH、(C0-C8烷基)OC(O)OC1-C18烷基、(C0-C8烷基)OC(O)OC2-C18链烯基、(C0-C8烷基)OC(O)OC2-C18炔基、(C0-C8烷基)OC(O)OH、(C0-C8烷基)OC(O)NR24C1-C18烷基、(C0-C8烷基)OC(O)NR24C2-C18链烯基、(C0-C8烷基)OC(O)NR24C2-C18炔基、(C0-C8烷基)OC(O)NR24H2、(C0-C8烷基)NR24(O)OC1-C18烷基、(C0-C8烷基)NR24(O)OC2-C18链烯基、(C0-C8烷基)NR24(O)OC2-C18炔基或(C0-C8烷基)NR24(O)OH；
R6为氢、C1-C18烷基、C2-C18链烯基、C2-C18炔基、杂烷基、(C0-C8烷基)芳基、(C0-C8烷基)杂芳基、(C0-C8烷基)C(O)C1-C18烷基、(C0-C8烷基)C(O)C2-C18链烯基、(C0-C8烷基)C(O)C2-C18炔基、(C0-C8烷基)C(O)H、(C0-C8烷基)C(O)芳基、(C0-C8烷基)C(O)杂芳基、(C0-C8烷基)C(O)OC1-C18烷基、(C0-C8烷基)C(O)OC2-C18链烯基、(C0-C8烷基)C(O)OC2-C18炔基、(C0-C8烷基)C(O)OH、C0-C8烷基)C(O)O芳基、(C0-C8烷基)C(O)O杂芳基、(C0-C8烷基)C(O)NR24C1-C18烷基、(C0-C8烷基)C(O)NR24C2-C18链烯基、(C0-C8烷基)C(O)NR24C2-C18炔基、(C0-C8烷基)C(O)NR24H2、(C0-C8烷基)C(O)NR24芳基或(C0-C8烷基)C(O)NR24杂芳基；
R7为氢、C1-C18烷基、C2-C18链烯基、C2-C18炔基、杂烷基、(C0-C8烷基)芳基、(C0-C8烷基)杂芳基、(C0-C8烷基)C(O)C1-C18烷基、(C0-C8烷基)C(O)C2-C18链烯基、(C0-C8烷基)C(O)C2-C18炔基、(C0-C8烷基)C(O)H、(C0-C8烷基)C(O)芳基、(C0-C8烷基)C(O)杂芳基、(C0-C8烷基)C(O)OC1-C18烷基、(C0-C8烷基)C(O)OC2-C18链烯基、(C0-C8烷基)C(O)OC2-C18炔基、(C0-C8烷基)C(O)OH、C0-C8烷基)C(O)O芳基、(C0-C8烷基)C(O)O杂芳基、(C0-C8烷基)C(O)NR24C1-C18烷基、(C0-C8烷基)C(O)NR24C2-C18链烯基、(C0-C8烷基)C(O)NR24C2-C18炔基、(C0-C8烷基)C(O)NR24H2、(C0-C8烷基)C(O)NR24芳基或(C0-C8烷基)C(O)NR24杂芳基；
R8为氢、(C0-C8烷基)卤代、C1-C18烷基、C2-C18链烯基、C2-C18炔基、杂烷基、(C0-C8烷基)芳基、(C0-C8烷基)杂芳基；
R9为氢、(C0-C8烷基)卤代、C1-C18烷基、C2-C18链烯基、C2-C18炔基、杂烷基、(C0-C8烷基)芳基、(C0-C8烷基)杂芳基；
R10为氢、(C0-C8烷基)卤代、C1-C18烷基或(C0-C8烷基)OH；和
R24为氢或C1-C18烷基。
在某些实施方案中，Y包括式C结构，其中
R2为氢、卤代、OH或C1-C7烷基；
R3为氢、卤代、OH或C1-C7烷基；
R6为氢、C1-C8烷基、C2-C8链烯基、C2-C8炔基、杂烷基、(C0-C8烷基)芳基、(C0-C8烷基)杂芳基、(C0-C8烷基)C(O)C1-C8烷基、(C0-C8烷基)C(O)C2-C8链烯基、(C0-C8烷基)C(O)C2-C8炔基、(C0-C8烷基)C(O)H、(C0-C8烷基)C(O)芳基、(C0-C8烷基)C(O)杂芳基、(C0-C8烷基)C(O)OC1-C8烷基、(C0-C8烷基)C(O)OC2-C8链烯基、(C0-C8烷基)C(O)OC2-C8炔基、(C0-C8烷基)C(O)OH、C0-C8烷基)C(O)O芳基、(C0-C8烷基)C(O)O杂芳基、(C0-C8烷基)C(O)NR24C1-C8烷基、(C0-C8烷基)C(O)NR24C2-C8链烯基、(C0-C8烷基)C(O)NR24C2-C8炔基、(C0-C8烷基)C(O)NR24H2、(C0-C8烷基)C(O)NR24芳基或(C0-C8烷基)C(O)NR24杂芳基；
R7为氢、C1-C8烷基、C2-C8链烯基、C2-C8炔基、杂烷基、(C0-C8烷基)芳基、(C0-C8烷基)杂芳基、(C0烷基)C(O)C1-C8烷基、(C0烷基)C(O)C2-C8链烯基、(C0烷基)C(O)C2-C8炔基、(C0)C(O)芳基、(C0)C(O)杂芳基、(C0)C(O)OC1-C8烷基、(C0烷基)C(O)OC2-C8链烯基、(C0烷基)C(O)OC2-C8炔基或(C0烷基)C(O)OH；
R8为氢或C1-C7烷基；
R9为氢或C1-C7烷基；
R10为氢或OH；和
R24为氢或C1-C7烷基。
例如，R2为氢或甲基；R3为氢、氟代、氯代或甲基；R6为氢或C(O)C1-C7烷基；R7为氢、C(O)CH3，或C(O)CH2CH3；R8为氢或甲基；R9为氢或甲基；和R10为羟基。
式C结构的非限制性实例包括：
Figure BPA00001673726800471
及其衍生物。
在其中Y包括式C结构的实施方案中，Y在能与Q或L反应的式C的任何位置缀合至L(例如当L是连接基团时)或Q(例如当L是键时)。本领域的技术人员可鉴于一般知识和本文提供的公开易于确定式C上的缀合位置和式C与Q或L的缀合方式。在某些实施方案中，式C在式C的位置1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22或23中的任何位置缀合至L或Q。在某些实施方案中，式C在式C的位置3、10、16或17缀合至L或Q。
在某些实施方案中，Y作用于盐皮质激素受体(MR)。在某些实施方案中，Y包括允许或促进对MR的激动剂活性的任何结构，而在其它实施方案中，Y是MR的拮抗剂。在示例性实施方案中，Y包括式D的结构：
Figure BPA00001673726800481
其中R2、R3、R7和R10各独立地为在式D化合物结合至MR时允许或促进激动剂或拮抗剂活性的部分；和虚线表示任选的双键。在某些实施方案中，式D在位置1、2、4、5、6、7、8、11、12、14、15、16和17中的一个或多个位置上进一步包括一个或多个取代基。
在某些实施方案中，Y包括式D的结构，其中
R2为氢、(C0-C8烷基)卤代、C1-C18烷基、C2-C18链烯基、C2-C18炔基、杂烷基、(C0-C8烷基)芳基、(C0-C8烷基)杂芳基、(C0-C8烷基)OC1-C18烷基、(C0-C8烷基)OC2-C18链烯基、(C0-C8烷基)OC2-C18炔基、(C0-C8烷基)OH、(C0-C8烷基)SH、(C0-C8烷基)NR24C1-C18烷基、(C0-C8烷基)NR24C2-C18链烯基、(C0-C8烷基)NR24C2-C18炔基、(C0-C8烷基)NR24H2、(C0-C8烷基)C(O)C1-C18烷基、(C0-C8烷基)C(O)C2-C18链烯基、(C0-C8烷基)C(O)C2-C18炔基、(C0-C8烷基)C(O)H、(C0-C8烷基)C(O)芳基、(C0-C8烷基)C(O)杂芳基、(C0-C8烷基)C(O)OC1-C18烷基、(C0-C8烷基)C(O)OC2-C18链烯基、(C0-C8烷基)C(O)OC2-C18炔基、(C0-C8烷基)C(O)OH、(C0-C8烷基)C(O)O芳基、(C0-C8烷基)C(O)O杂芳基、(C0-C8烷基)OC(O)C1-C18烷基、(C0-C8烷基)OC(O)C2-C18链烯基、(C0-C8烷基)OC(O)C2-C18炔基、(C0-C8烷基)C(O)NR24C1-C18烷基、(C0-C8烷基)C(O)NR24C2-C18链烯基、(C0-C8烷基)C(O)NR24C2-C18炔基、(C0-C8烷基)C(O)NR24H2、(C0-C8烷基)C(O)NR24芳基、(C0-C8烷基)C(O)NR24杂芳基、(C0-C8烷基)NR24C(O)C1-C18烷基、(C0-C8烷基)NR24C(O)C2-C8链烯基或(C0-C8烷基)NR24C(O)C2-C18炔基、(C0-C8烷基)NR24C(O)OH、(C0-C8烷基)OC(O)OC1-C18烷基、(C0-C8烷基)OC(O)OC2-C18链烯基、(C0-C8烷基)OC(O)OC2-C18炔基、(C0-C8烷基)OC(O)OH、(C0-C8烷基)OC(O)NR24C1-C18烷基、(C0-C8烷基)OC(O)NR24C2-C18链烯基、(C0-C8烷基)OC(O)NR24C2-C18炔基、(C0-C8烷基)OC(O)NR24H2、(C0-C8烷基)NR24(O)OC1-C18烷基、(C0-C8烷基)NR24(O)OC2-C18链烯基、(C0-C8烷基)NR24(O)OC2-C18炔基或(C0-C8烷基)NR24(O)OH；
R3为氢、(C0-C8烷基)卤代、C1-C18烷基、C2-C18链烯基、C2-C18炔基、杂烷基、(C0-C8烷基)芳基、(C0-C8烷基)杂芳基、(C0-C8烷基)OC1-C18烷基、(C0-C8烷基)OC2-C18链烯基、(C0-C8烷基)OC2-C18炔基、(C0-C8烷基)OH、(C0-C8烷基)SH、(C0-C8烷基)NR24C1-C18烷基、(C0-C8烷基)NR24C2-C18链烯基、(C0-C8烷基)NR24C2-C18炔基、(C0-C8烷基)NR24H2、(C0-C8烷基)C(O)C1-C18烷基、(C0-C8烷基)C(O)C2-C18链烯基、(C0-C8烷基)C(O)C2-C18炔基、(C0-C8烷基)C(O)H、(C0-C8烷基)C(O)芳基、(C0-C8烷基)C(O)杂芳基、(C0-C8烷基)C(O)OC1-C18烷基、(C0-C8烷基)C(O)OC2-C18链烯基、(C0-C8烷基)C(O)OC2-C18炔基、(C0-C8烷基)C(O)OH、(C0-C8烷基)C(O)O芳基、(C0-C8烷基)C(O)O杂芳基、(C0-C8烷基)OC(O)C1-C18烷基、(C0-C8烷基)OC(O)C2-C18链烯基、(C0-C8烷基)OC(O)C2-C18炔基、(C0-C8烷基)C(O)NR24C1-C18烷基、(C0-C8烷基)C(O)NR24C2-C18链烯基、(C0-C8烷基)C(O)NR24C2-C18炔基、(C0-C8烷基)C(O)NR24H2、(C0-C8烷基)C(O)NR24芳基、(C0-C8烷基)C(O)NR24杂芳基、(C0-C8烷基)NR24C(O)C1-C18烷基、(C0-C8烷基)NR24C(O)C2-C8链烯基或(C0-C8烷基)NR24C(O)C2-C18炔基、(C0-C8烷基)NR24C(O)OH、(C0-C8烷基)OC(O)OC1-C18烷基、(C0-C8烷基)OC(O)OC2-C18链烯基、(C0-C8烷基)OC(O)OC2-C18炔基、(C0-C8烷基)OC(O)OH、(C0-C8烷基)OC(O)NR24C1-C18烷基、(C0-C8烷基)OC(O)NR24C2-C18链烯基、(C0-C8烷基)OC(O)NR24C2-C18炔基、(C0-C8烷基)OC(O)NR24H2、(C0-C8烷基)NR24(O)OC1-C18烷基、(C0-C8烷基)NR24(O)OC2-C18链烯基、(C0-C8烷基)NR24(O)OC2-C18炔基或(C0-C8烷基)NR24(O)OH；
R7为氢、C1-C18烷基、C2-C18链烯基、C2-C18炔基、杂烷基、(C0-C8烷基)芳基、(C0-C8烷基)杂芳基、(C0-C8烷基)C(O)C1-C18烷基、(C0-C8烷基)C(O)C2-C18链烯基、(C0-C8烷基)C(O)C2-C18炔基、(C0-C8烷基)C(O)H、(C0-C8烷基)C(O)芳基、(C0-C8烷基)C(O)杂芳基、(C0-C8烷基)C(O)OC1-C18烷基、(C0-C8烷基)C(O)OC2-C18链烯基、(C0-C8烷基)C(O)OC2-C18炔基、(C0-C8烷基)C(O)OH、C0-C8烷基)C(O)O芳基、(C0-C8烷基)C(O)O杂芳基、(C0-C8烷基)C(O)NR24C1-C18烷基、(C0-C8烷基)C(O)NR24C2-C18链烯基、(C0-C8烷基)C(O)NR24C2-C18炔基、(C0-C8烷基)C(O)NR24H2、(C0-C8烷基)C(O)NR24芳基或(C0-C8烷基)C(O)NR24杂芳基；
R10为氢、(C0-C8烷基)卤代、C1-C18烷基或(C0-C8烷基)OH；和
R24为氢或C1-C18烷基。
在某些实施方案中，Y包括式D结构，其中
R2为氢、卤代、OH或C1-C7烷基；
R3为氢、卤代、OH或C1-C7烷基；
R7为氢、C1-C8烷基、C2-C8链烯基、C2-C8炔基、杂烷基、(C0-C8烷基)芳基、(C0-C8烷基)杂芳基、(C0烷基)C(O)C1-C8烷基、(C0烷基)C(O)C2-C8链烯基、(C0烷基)C(O)C2-C8炔基、(C0)C(O)芳基、(C0)C(O)杂芳基、(C0)C(O)OC1-C8烷基、(C0烷基)C(O)OC2-C8链烯基、(C0烷基)C(O)OC2-C8炔基或(C0烷基)C(O)OH；
R10为氢或OH；和
R24为氢或C1-C7烷基。
例如，R2为氢或甲基；R3为氢、氟代、氯代或甲基；R7为氢、C(O)CH3或C(O)CH2CH3；和R10为羟基。
式D化合物的非限制性实例包括：
Figure BPA00001673726800511
及其衍生物。
在其中Y包括式D结构的实施方案中，Y在能与Q或L反应的式D的任何位置缀合至L(例如当L是连接基团时)或Q(例如当L是键时)。本领域的技术人员可鉴于一般知识和本文提供的公开易于确定式D上的缀合位置和式D与Q或L的缀合方式。在某些实施方案中，式D在式D的位置1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24中的任何位置上缀合至L或Q。在某些实施方案中，式D在式D的位置3、10、13或17上缀合至L或Q。
在某些实施方案中，Y作用于孕酮受体(PR)。在某些实施方案中，Y包括允许或促进对PR的激动剂活性的任何结构，而在其它实施方案中，Y是PR的拮抗剂。在示例性实施方案中，Y包括式E结构：
Figure BPA00001673726800521
其中R2、R3、R4和R7各独立地为在式E化合物结合至PR时允许或促进激动剂拮抗剂活性的部分；和虚线表示任选的双键。在某些实施方案中，式E进一步包括位置1、2、4、5、6、7、8、11、12、14、15、16和17中的一个或多个位置上的一个或多个取代基(例如位置6的甲基)。
在某些实施方案中，Y包括式E结构，其中
R2为氢、(C0-C8烷基)卤代、C1-C18烷基、C2-C18链烯基、C2-C18炔基、杂烷基、(C0-C8烷基)芳基、(C0-C8烷基)杂芳基、(C0-C8烷基)OC1-C18烷基、(C0-C8烷基)OC2-C18链烯基、(C0-C8烷基)OC2-C18炔基、(C0-C8烷基)OH、(C0-C8烷基)SH、(C0-C8烷基)NR24C1-C18烷基、(C0-C8烷基)NR24C2-C18链烯基、(C0-C8烷基)NR24C2-C18炔基、(C0-C8烷基)NR24H2、(C0-C8烷基)C(O)C1-C18烷基、(C0-C8烷基)C(O)C2-C18链烯基、(C0-C8烷基)C(O)C2-C18炔基、(C0-C8烷基)C(O)H、(C0-C8烷基)C(O)芳基、(C0-C8烷基)C(O)杂芳基、(C0-C8烷基)C(O)OC1-C18烷基、(C0-C8烷基)C(O)OC2-C18链烯基、(C0-C8烷基)C(O)OC2-C18炔基、(C0-C8烷基)C(O)OH、(C0-C8烷基)C(O)O芳基、(C0-C8烷基)C(O)O杂芳基、(C0-C8烷基)OC(O)C1-C18烷基、(C0-C8烷基)OC(O)C2-C18链烯基、(C0-C8烷基)OC(O)C2-C18炔基、(C0-C8烷基)C(O)NR24C1-C18烷基、(C0-C8烷基)C(O)NR24C2-C18链烯基、(C0-C8烷基)C(O)NR24C2-C18炔基、(C0-C8烷基)C(O)NR24H2、(C0-C8烷基)C(O)NR24芳基、(C0-C8烷基)C(O)NR24杂芳基、(C0-C8烷基)NR24C(O)C1-C18烷基、(C0-C8烷基)NR24C(O)C2-C8链烯基或(C0-C8烷基)NR24C(O)C2-C18炔基、(C0-C8烷基)NR24C(O)OH、(C0-C8烷基)OC(O)OC1-C18烷基、(C0-C8烷基)OC(O)OC2-C18链烯基、(C0-C8烷基)OC(O)OC2-C18炔基、(C0-C8烷基)OC(O)OH、(C0-C8烷基)OC(O)NR24C1-C18烷基、(C0-C8烷基)OC(O)NR24C2-C18链烯基、(C0-C8烷基)OC(O)NR24C2-C18炔基、(C0-C8烷基)OC(O)NR24H2、(C0-C8烷基)NR24(O)OC1-C18烷基、(C0-C8烷基)NR24(O)OC2-C18链烯基、(C0-C8烷基)NR24(O)OC2-C18炔基或(C0-C8烷基)NR24(O)OH；R24为氢或C1-C18烷基。
R3为氢、(C0-C8烷基)卤代、C1-C18烷基、C2-C18链烯基、C2-C18炔基、杂烷基、(C0-C8烷基)芳基、(C0-C8烷基)杂芳基、(C0-C8烷基)OC1-C18烷基、(C0-C8烷基)OC2-C18链烯基、(C0-C8烷基)OC2-C18炔基、(C0-C8烷基)OH、(C0-C8烷基)SH、(C0-C8烷基)NR24C1-C18烷基、(C0-C8烷基)NR24C2-C18链烯基、(C0-C8烷基)NR24C2-C18炔基、(C0-C8烷基)NR24H2、(C0-C8烷基)C(O)C1-C18烷基、(C0-C8烷基)C(O)C2-C18链烯基、(C0-C8烷基)C(O)C2-C18炔基、(C0-C8烷基)C(O)H、(C0-C8烷基)C(O)芳基、(C0-C8烷基)C(O)杂芳基、(C0-C8烷基)C(O)OC1-C18烷基、(C0-C8烷基)C(O)OC2-C18链烯基、(C0-C8烷基)C(O)OC2-C18炔基、(C0-C8烷基)C(O)OH、(C0-C8烷基)C(O)O芳基、(C0-C8烷基)C(O)O杂芳基、(C0-C8烷基)OC(O)C1-C18烷基、(C0-C8烷基)OC(O)C2-C18链烯基、(C0-C8烷基)OC(O)C2-C18炔基、(C0-C8烷基)C(O)NR24C1-C18烷基、(C0-C8烷基)C(O)NR24C2-C18链烯基、(C0-C8烷基)C(O)NR24C2-C18炔基、(C0-C8烷基)C(O)NR24H2、(C0-C8烷基)C(O)NR24芳基、(C0-C8烷基)C(O)NR24杂芳基、(C0-C8烷基)NR24C(O)C1-C18烷基、(C0-C8烷基)NR24C(O)C2-C8链烯基或(C0-C8烷基)NR24C(O)C2-C18炔基、(C0-C8烷基)NR24C(O)OH、(C0-C8烷基)OC(O)OC1-C18烷基、(C0-C8烷基)OC(O)OC2-C18链烯基、(C0-C8烷基)OC(O)OC2-C18炔基、(C0-C8烷基)OC(O)OH、(C0-C8烷基)OC(O)NR24C1-C18烷基、(C0-C8烷基)OC(O)NR24C2-C18链烯基、(C0-C8烷基)OC(O)NR24C2-C18炔基、(C0-C8烷基)OC(O)NR24H2、(C0-C8烷基)NR24(O)OC1-C18烷基、(C0-C8烷基)NR24(O)OC2-C18链烯基、(C0-C8烷基)NR24(O)OC2-C18炔基或(C0-C8烷基)NR24(O)OH；
R4为氢、(C0-C8烷基)卤代、C1-C18烷基、C2-C18链烯基、C2-C18炔基、杂烷基、(C0-C8烷基)芳基、(C0-C8烷基)杂芳基、(C0-C8烷基)OC1-C18烷基、(C0-C8烷基)OC2-C18链烯基、(C0-C8烷基)OC2-C18炔基、(C0-C8烷基)OH、(C0-C8烷基)SH、(C0-C8烷基)NR24C1-C18烷基、(C0-C8烷基)NR24C2-C18链烯基、(C0-C8烷基)NR24C2-C18炔基、(C0-C8烷基)NR24H2、(C0-C8烷基)C(O)C1-C18烷基、(C0-C8烷基)C(O)C2-C18链烯基、(C0-C8烷基)C(O)C2-C18炔基、(C0-C8烷基)C(O)H、(C0-C8烷基)C(O)芳基、(C0-C8烷基)C(O)杂芳基、(C0-C8烷基)C(O)OC1-C18烷基、(C0-C8烷基)C(O)OC2-C18链烯基、(C0-C8烷基)C(O)OC2-C18炔基、(C0-C8烷基)C(O)OH、(C0-C8烷基)C(O)O芳基、(C0-C8烷基)C(O)O杂芳基、(C0-C8烷基)OC(O)C1-C18烷基、(C0-C8烷基)OC(O)C2-C18链烯基、(C0-C8烷基)OC(O)C2-C18炔基、(C0-C8烷基)C(O)NR24C1-C18烷基、(C0-C8烷基)C(O)NR24C2-C18链烯基、(C0-C8烷基)C(O)NR24C2-C18炔基、(C0-C8烷基)C(O)NR24H2、(C0-C8烷基)C(O)NR24芳基、(C0-C8烷基)C(O)NR24杂芳基、(C0-C8烷基)NR24C(O)C1-C18烷基、(C0-C8烷基)NR24C(O)C2-C8链烯基或(C0-C8烷基)NR24C(O)C2-C18炔基、(C0-C8烷基)NR24C(O)OH、(C0-C8烷基)OC(O)OC1-C18烷基、(C0-C8烷基)OC(O)OC2-C18链烯基、(C0-C8烷基)OC(O)OC2-C18炔基、(C0-C8烷基)OC(O)OH、(C0-C8烷基)OC(O)NR24C1-C18烷基、(C0-C8烷基)OC(O)NR24C2-C18链烯基、(C0-C8烷基)OC(O)NR24C2-C18炔基、(C0-C8烷基)OC(O)NR24H2、(C0-C8烷基)NR24(O)OC1-C18烷基、(C0-C8烷基)NR24(O)OC2-C18链烯基、(C0-C8烷基)NR24(O)OC2-C18炔基或(C0-C8烷基)NR24(O)OH；
R7为氢、C1-C18烷基、C2-C18链烯基、C2-C18炔基、杂烷基、(C0-C8烷基)芳基、(C0-C8烷基)杂芳基、(C0-C8烷基)C(O)C1-C18烷基、(C0-C8烷基)C(O)C2-C18链烯基、(C0-C8烷基)C(O)C2-C18炔基、(C0-C8烷基)C(O)H、(C0-C8烷基)C(O)芳基、(C0-C8烷基)C(O)杂芳基、(C0-C8烷基)C(O)OC1-C18烷基、(C0-C8烷基)C(O)OC2-C18链烯基、(C0-C8烷基)C(O)OC2-C18炔基、(C0-C8烷基)C(O)OH、C0-C8烷基)C(O)O芳基、(C0-C8烷基)C(O)O杂芳基、(C0-C8烷基)C(O)NR24C1-C18烷基、(C0-C8烷基)C(O)NR24C2-C18链烯基、(C0-C8烷基)C(O)NR24C2-C18炔基、(C0-C8烷基)C(O)NR24H2、(C0-C8烷基)C(O)NR24芳基或(C0-C8烷基)C(O)NR24杂芳基；和
R24为氢或C1-C18烷基。
在某些实施方案中，Y包括式E结构，其中
R2为氢、卤代、OH或C1-C7烷基；
R3为氢、卤代、OH或C1-C7烷基；
R4为氢、(C0-C8烷基)卤代、C1-C8烷基、C2-C8链烯基、C2-18炔基、杂烷基、(C0-C8烷基)芳基、(C0-C8烷基)杂芳基、(C0-C8烷基)OC1-C8烷基、(C0-C8烷基)OC2-C8链烯基、(C0-C8烷基)OC2-C8炔基、(C0-C8烷基)OH、(C0-C8烷基)SH、(C0-C8烷基)NR24C1-C8烷基、(C0-C8烷基)NR24C2-C8链烯基、(C0-C8烷基)NR24C2-C8炔基、(C0-C8烷基)NR24H2、(C0-C8烷基)C(O)C1-C8烷基、(C0-C8烷基)C(O)C2-C8链烯基、(C0-C8烷基)C(O)C2-C8炔基、(C0-C8烷基)C(O)H、(C0-C8烷基)C(O)芳基、(C0-C8烷基)C(O)杂芳基、(C0-C8烷基)C(O)OC1-C8烷基、(C0-C8烷基)C(O)OC2-C8链烯基、(C0-C8烷基)C(O)OC2-C8炔基、(C0-C8烷基)C(O)OH、(C0-C8烷基)C(O)O芳基、(C0-C8烷基)C(O)O杂芳基、(C0-C8烷基)OC(O)C1-C8烷基、(C0-C8烷基)OC(O)C2-C8链烯基、(C0-C8烷基)OC(O)C2-C18炔基、(C0-C8烷基)C(O)NR24C1-C8烷基、(C0-C8烷基)C(O)NR24C2-C8链烯基、(C0-C8烷基)C(O)NR24C2-C8炔基、(C0-C8烷基)C(O)NR24H2、(C0-C8烷基)C(O)NR24芳基、(C0-C8烷基)C(O)NR24杂芳基、(C0-C8烷基)NR24C(O)C1-C8烷基、(C0-C8烷基)NR24C(O)C2-C8链烯基或(C0-C8烷基)NR24C(O)C2-C8炔基、(C0-C8烷基)NR24C(O)OH、(C0-C8烷基)OC(O)OC1-C8烷基、(C0-C8烷基)OC(O)OC2-C8链烯基、(C0-C8烷基)OC(O)OC2-C8炔基、(C0-C8烷基)OC(O)OH、(C0-C8烷基)OC(O)NR24C1-C8烷基、(C0-C8烷基)OC(O)NR24C2-C8链烯基、(C0-C8烷基)OC(O)NR24C2-C8炔基、(C0-C8烷基)OC(O)NR24H2、(C0-C8烷基)NR24(O)OC1-C8烷基、(C0-C8烷基)NR24(O)OC2-C8链烯基、(C0-C8烷基)NR24(O)OC2-C8炔基或(C0-C8烷基)NR24(O)OH；
R7为氢、C1-C8烷基、C2-C8链烯基、C2-C8炔基、杂烷基、(C0-C8烷基)芳基、(C0-C8烷基)杂芳基、(C0烷基)C(O)C1-C8烷基、(C0烷基)C(O)C2-C8链烯基、(C0烷基)C(O)C2-C8炔基、(C0)C(O)芳基、(C0)C(O)杂芳基、(C0)C(O)OC1-C8烷基、(C0烷基)C(O)OC2-C8链烯基、(C0烷基)C(O)OC2-C8炔基或(C0烷基)C(O)OH；和
R24为氢或C1-C7烷基。
例如，R2为氢或甲基；R3为氢或甲基；R4为(C1烷基)C(O)C1-C4烷基、乙酸酯、环戊丙酸酯、半琥珀酸酯、庚酸酯或丙酸酯；和R7为氢、C(O)CH3或C(O)CH2CH3。
式E化合物的非限制性实例包括：
Figure BPA00001673726800561
及其衍生物。
在其中Y包括式E结构的实施方案中，Y在能与Q或L反应的式E的任何位置的缀合至L(例如当L是连接基团时)或Q(例如当L是键时)。本领域的技术人员可鉴于-般知识和本文提供的公开易于确定式E上的缀合位置和式E与Q或L的缀合方式。在某些实施方案中，式E在式E位置1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24中的任何位置缀合至L或Q。在某些实施方案中，式E经式E的位置3或17缀合至L或Q。
在其它实施方案中，Y作用于孕酮受体但不被式E所涵盖。例如，Y可包括以下结构及其类似物：
Figure BPA00001673726800571
在某些实施方案中，Y作用于雄激素受体(AR)。在某些实施方案中，Y包括允许或促进对AR的激动剂活性的任何结构，而在其它实施方案中，Y是AR的拮抗剂。在示例性实施方案中，Y包括式F的结构：
Figure BPA00001673726800572
其中R1(当存在时)、R2、R3和R6各独立地为在式F化合物结合至AR时允许或促进激动剂或拮抗剂活性的部分；和各虚线表示任选的双键、前提是不超过一个任选的碳-碳双键出现在位置5。在某些实施方案中，式F进一步包括位置1、2、4、5、6、7、8、11、12、14、15、16和17中的一个或多个位置上的一个或多个取代基。
在某些实施方案中，Y包括式F的结构，其中
R1存在并为氢、C1-C18烷基、C2-C18链烯基、C2-C18炔基、杂烷基、(C0-C8烷基)芳基、(C0-C8烷基)杂芳基、(C0-C8烷基)C(O)C1-C18烷基、(C0-C8烷基)C(O)C2-C 18链烯基、(C0-C8烷基)C(O)C2-C 18炔基、(C0-C8烷基)C(O)H、(C0-C8烷基)C(O)芳基、(C0-C8烷基)C(O)杂芳基、(C0-C8烷基)C(O)OC1-C18烷基、(C0-C8烷基)C(O)OC2-C18链烯基、(C0-C8烷基)C(O)OC2-C18炔基、(C0-C8烷基)C(O)OH、C0-C8烷基)C(O)O芳基、(C0-C8烷基)C(O)O杂芳基、(C0-C8烷基)C(O)NR24C1-C18烷基、(C0-C8烷基)C(O)NR24C2-C18链烯基、(C0-C8烷基)C(O)NR24C2-C18炔基、(C0-C8烷基)C(O)NR24H2、(C0-C8烷基)C(O)NR24芳基、(C0-C8烷基)C(O)NR24杂芳基或SO3H；
R2为氢、(C0-C8烷基)卤代、C1-C18烷基、C2-C18链烯基、C2-C18炔基、杂烷基、(C0-C8烷基)芳基、(C0-C8烷基)杂芳基、(C0-C8烷基)OC1-C18烷基、(C0-C8烷基)OC2-C18链烯基、(C0-C8烷基)OC2-C18炔基、(C0-C8烷基)OH、(C0-C8烷基)SH、(C0-C8烷基)NR24C1-C18烷基、(C0-C8烷基)NR24C2-C18链烯基、(C0-C8烷基)NR24C2-C18炔基、(C0-C8烷基)NR24H2、(C0-C8烷基)C(O)C1-C18烷基、(C0-C8烷基)C(O)C2-C18链烯基、(C0-C8烷基)C(O)C2-C18炔基、(C0-C8烷基)C(O)H、(C0-C8烷基)C(O)芳基、(C0-C8烷基)C(O)杂芳基、(C0-C8烷基)C(O)OC1-C18烷基、(C0-C8烷基)C(O)OC2-C18链烯基、(C0-C8烷基)C(O)OC2-C18炔基、(C0-C8烷基)C(O)OH、(C0-C8烷基)C(O)O芳基、(C0-C8烷基)C(O)O杂芳基、(C0-C8烷基)OC(O)C1-C18烷基、(C0-C8烷基)OC(O)C2-C18链烯基、(C0-C8烷基)OC(O)C2-C18炔基、(C0-C8烷基)C(O)NR24C1-C18烷基、(C0-C8烷基)C(O)NR24C2-C18链烯基、(C0-C8烷基)C(O)NR24C2-C18炔基、(C0-C8烷基)C(O)NR24H2、(C0-C8烷基)C(O)NR24芳基、(C0-C8烷基)C(O)NR24杂芳基、(C0-C8烷基)NR24C(O)C1-C18烷基、(C0-C8烷基)NR24C(O)C2-C8链烯基或(C0-C8烷基)NR24C(O)C2-C18炔基、(C0-C8烷基)NR24C(O)OH、(C0-C8烷基)OC(O)OC1-C18烷基、(C0-C8烷基)OC(O)OC2-C18链烯基、(C0-C8烷基)OC(O)OC2-C18炔基、(C0-C8烷基)OC(O)OH、(C0-C8烷基)OC(O)NR24C1-C18烷基、(C0-C8烷基)OC(O)NR24C2-C18链烯基、(C0-C8烷基)OC(O)NR24C2-C18炔基、(C0-C8烷基)OC(O)NR24H2、(C0-C8烷基)NR24(O)OC1-C18烷基、(C0-C8烷基)NR24(O)OC2-C18链烯基、(C0-C8烷基)NR24(O)OC2-C18炔基或(C0-C8烷基)NR24(O)OH；
R3为氢、(C0-C8烷基)卤代、C1-C18烷基、C2-C18链烯基、C2-C18炔基、杂烷基、(C0-C8烷基)芳基、(C0-C8烷基)杂芳基、(C0-C8烷基)OC1-C18烷基、(C0-C8烷基)OC2-C18链烯基、(C0-C8烷基)OC2-C18炔基、(C0-C8烷基)OH、(C0-C8烷基)SH、(C0-C8烷基)NR24C1-C18烷基、(C0-C8烷基)NR24C2-C18链烯基、(C0-C8烷基)NR24C2-C18炔基、(C0-C8烷基)NR24H2、(C0-C8烷基)C(O)C1-C18烷基、(C0-C8烷基)C(O)C2-C18链烯基、(C0-C8烷基)C(O)C2-C18炔基、(C0-C8烷基)C(O)H、(C0-C8烷基)C(O)芳基、(C0-C8烷基)C(O)杂芳基、(C0-C8烷基)C(O)OC1-C18烷基、(C0-C8烷基)C(O)OC2-C18链烯基、(C0-C8烷基)C(O)OC2-C18炔基、(C0-C8烷基)C(O)OH、(C0-C8烷基)C(O)O芳基、(C0-C8烷基)C(O)O杂芳基、(C0-C8烷基)OC(O)C1-C18烷基、(C0-C8烷基)OC(O)C2-C18链烯基、(C0-C8烷基)OC(O)C2-C18炔基、(C0-C8烷基)C(O)NR24C1-C18烷基、(C0-C8烷基)C(O)NR24C2-C18链烯基、(C0-C8烷基)C(O)NR24C2-C18炔基、(C0-C8烷基)C(O)NR24H2、(C0-C8烷基)C(O)NR24芳基、(C0-C8烷基)C(O)NR24杂芳基、(C0-C8烷基)NR24C(O)C1-C18烷基、(C0-C8烷基)NR24C(O)C2-C8链烯基或(C0-C8烷基)NR24C(O)C2-C18炔基、(C0-C8烷基)NR24C(O)OH、(C0-C8烷基)OC(O)OC1-C18烷基、(C0-C8烷基)OC(O)OC2-C18链烯基、(C0-C8烷基)OC(O)OC2-C18炔基、(C0-C8烷基)OC(O)OH、(C0-C8烷基)OC(O)NR24C1-C18烷基、(C0-C8烷基)OC(O)NR24C2-C18链烯基、(C0-C8烷基)OC(O)NR24C2-C18炔基、(C0-C8烷基)OC(O)NR24H2、(C0-C8烷基)NR24(O)OC1-C18烷基、(C0-C8烷基)NR24(O)OC2-C18链烯基、(C0-C8烷基)NR24(O)OC2-C18炔基或(C0-C8烷基)NR24(O)OH；
R6为氢、C1-C18烷基、C2-C18链烯基、C2-C18炔基、杂烷基、(C0-C8烷基)芳基、(C0-C8烷基)杂芳基、(C0-C8烷基)C(O)C1-C18烷基、(C0-C8烷基)C(O)C2-C18链烯基、(C0-C8烷基)C(O)C2-C18炔基、(C0-C8烷基)C(O)H、(C0-C8烷基)C(O)芳基、(C0-C8烷基)C(O)杂芳基、(C0-C8烷基)C(O)OC1-C18烷基、(C0-C8烷基)C(O)OC2-C18链烯基、(C0-C8烷基)C(O)OC2-C18炔基、(C0-C8烷基)C(O)OH、C0-C8烷基)C(O)O芳基、(C0-C8烷基)C(O)O杂芳基、(C0-C8烷基)C(O)NR24C1-C18烷基、(C0-C8烷基)C(O)NR24C2-C18链烯基、(C0-C8烷基)C(O)NR24C2-C18炔基、(C0-C8烷基)C(O)NR24H2、(C0-C8烷基)C(O)NR24芳基、(C0-C8烷基)C(O)NR24杂芳基或SO3H；和
R24为氢或C1-C18烷基。
在某些实施方案中，Y包括式E的结构，其中
R1为氢、C1-C7烷基；(C0-C3烷基)C(O)C1-C7烷基、(C0-C3烷基)C(O)芳基或SO3H；
R2为氢、卤代、OH或C1-C7烷基；
R3为氢、卤代、OH或C1-C7烷基；
R6为氢、C1-C8烷基、C2-C8链烯基、C2-C8炔基、杂烷基、(C0-C8烷基)芳基、(C0-C8烷基)杂芳基、(C0-C8烷基)C(O)C1-C8烷基、(C0-C8烷基)C(O)C2-C8链烯基、(C0-C8烷基)C(O)C2-C8炔基、(C0-C8烷基)C(O)H、(C0-C8烷基)C(O)芳基、(C0-C8烷基)C(O)杂芳基、(C0-C8烷基)C(O)OC1-C8烷基、(C0-C8烷基)C(O)OC2-C8链烯基、(C0-C8烷基)C(O)OC2-C8炔基、(C0-C8烷基)C(O)OH、C0-C8烷基)C(O)O芳基、(C0-C8烷基)C(O)O杂芳基、(C0-C8烷基)C(O)NR24C1-C8烷基、(C0-C8烷基)C(O)NR24C2-C8链烯基、(C0-C8烷基)C(O)NR24C2-C8炔基、(C0-C8烷基)C(O)NR24H2、(C0-C8烷基)C(O)NR24芳基或(C0-C8烷基)C(O)NR24杂芳基；和
R24为氢或C1-C7烷基。
例如，R1为氢或不存在；R2为氢或甲基；R3为氢或甲基；和R6是H或不存在。
式F化合物的非限制性实例包括：
Figure BPA00001673726800611
及其衍生物。
在各实施方案中，其中Y包括式F的结构，Y在能与Q或L反应的式F的任何位置缀合至L(例如当L是连接基团时)或Q(例如当L是键时)。本领域的技术人员可鉴于一般知识和本文提供的公开易于确定式F上的缀合位置和式F与Q或L的缀合方式。在某些实施方案中，式F在式F的位置1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或22中的任何位置上缀合至L或Q。在某些实施方案中，式F在式F的位置3或17缀合至L或Q。
在某些实施方案中，NHR配体结合至I型核激素受体产生一些激动剂活性(或拮抗剂活性)，但并非全部细胞或组织都表达I型核激素受体。
作用于II型核激素受体的NHR配体
在本发明的某些实施方案中，NHR配体(Y)作用于II型核激素受体。在某些实施方案中，Y可具有在配体结合至II型核激素受体时允许或促进激动剂活性的任何结构，而在其它实施方案中，Y是II型核激素受体的拮抗剂。在示例性实施方案中，Y呈现对甲状腺激素受体(TR)、视黄酸受体(RAR)、过氧化物酶体增殖激活受体(PPAR)、肝X受体(LXR)、法呢酯衍生物(farnesoid)X受体(FXR)、维生素D受体(VDR)和/或娠烷X受体(PXR)激动剂(或拮抗剂)活性。
在某些实施方案中，Y作用于甲状腺激素受体(例如TRα、TRβ)。在某些实施方案中，Y包括允许或促进对TR的激动剂活性的任何结构，而在其它实施方案中，Y是TR的拮抗剂。Y的非限制性实例包括以下化合物：
Figure BPA00001673726800621
及其衍生物。
在其中Y包括允许或促进对TR的激动剂或拮抗剂活性的结构的实施方案中，Y在能与Q或L反应的Y的任何位置上缀合至L(例如当L是连接基团时)或Q(例如当L是键时)。本领域的技术人员可鉴于一般知识和本文提供的公开易于确定Y上的缀合位置和Y与Q或L的缀合方式。在某些实施方案中，Y经Y的任何位置缀合至L或Q。在某些实施方案中，Y经如下所示的羧酸或醇部分缀合至L或Q：
Figure BPA00001673726800622
在某些实施方案中，Y作用于视黄酸受体(例如RARα、RARβ、RARγ)。在某些实施方案中，Y包括允许或促进对RAR的激动剂活性的任何结构，而在其它实施方案中，Y是RAR的拮抗剂。在示例性实施方案中，Y包括式G结构：
Figure BPA00001673726800631
其中R11是在式G化合物结合至RAR时允许或促进激动剂或拮抗剂活性部分，和
Figure BPA00001673726800632
表示或者E或者Z立体化学。
在某些实施方案中，Y包括式G的结构，其中R11是C(O)OH、CH2OH或C(O)H。在某些实施方案中，Y包括式G结构，其中R11是羧酸衍生物(例如酰氯、酐和酯).
式G化合物的非限制性实例包括：
Figure BPA00001673726800633
及其衍生物。
在其中Y包括式G结构的实施方案中，Y在能与Q或L反应的式G的任何位置缀合至L(例如当L是连接基团时)或Q(例如当L是键时)。本领域的技术人员可鉴于一般知识和本文提供的公开易于确定Y上的缀合位置和Y与Q或L的缀合方式。在某些实施方案中，Y经Y的任何位置缀合至L或Q。在某些实施方案中，式G于R¨处缀合至L或Q。
在某些实施方案中，Y作用于过氧化物酶体增殖物(proliferator)激活受体(例如PPARα、PPARβ/δ、PPARγ)。在某些实施方案中，Y包括允许或促进对PPAR的激动剂活性的任何结构，而在其它实施方案中，Y是PPAR的拮抗剂。在某些实施方案中，Y是如式H描述的饱和或不饱和、卤代或非卤代的游离脂肪酸(FFA)：
Figure BPA00001673726800641
其中n为0-26和各R12，当存在时，独立地为在式H化合物结合至PPAR时允许或促进激动剂或拮抗剂活性的部分。
在某些实施方案中，Y包括式H结构，其中n为0-26和各R12，当存在时，独立地为氢、C1-C7烷基或卤素。在某些实施方案中，式B是饱和的，例如，甲酸、乙酸、正己酸、庚酸、辛酸、壬酸、癸酸、十一烷酸、月桂酸、十三烷酸、肉豆蔻酸、十五烷酸、棕榈酸、十七烷酸、硬脂酸、十九烷酸、花生酸、二十一烷酸、二十二烷酸、二十三烷酸、全氟壬酸(见下文)、全氟辛酸(见下文)及其衍生物。例如，在某些实施方案中，式H是不饱和的，具有或者顺式或者反式立体化学，例如二十碳三烯酸(mead acid)、肉豆蔻脑酸、棕榈油酸、十六碳烯酸(sapienic acid)、油酸、亚油酸、α-亚麻酸、反油酸、岩芹酸、花生四烯酸、二羟基二十碳四烯酸酸(DiHETE)、十八碳炔酸、二十碳三炔酸、二十碳二烯酸、二十碳三烯酸、二十碳五烯酸、芥酸、二高亚麻酸、二十二碳三烯酸、二十碳五烯酸、二十碳六烯酸、肾上腺酸及其衍生物。
在其中Y包括式H结构d实施方案中，Y在能与Q或L反应的式H的任何位置缀合至L(例如当L是连接基团时)或Q(例如当L是键时)。本领域的技术人员可鉴于一般知识和本文提供的公开易于确定式H上的缀合位置和式H与Q或L的缀合方式。在某些实施方案
中，式H在式H上的任何位置缀合至L或Q。在某些实施方案中，式H经末端羧酸部分缀合至L或Q。
在这些实施方案中的某些中，Y是类二十烷酸。在特定的实施方案中，Y是***素或白三烯。在某些示例性实施方案中，Y是具有如式J1-J6描述的结构的***素：
Figure BPA00001673726800651
其中各R13独立地为在式J化合物结合至PPAR时允许或促进激动剂或拮抗剂活性的部分(例如如下所示的PGJ2)。：
在某些实施方案中，当Y包括式J1-J6中的任何一种的结构时，各R13独立地为C7-C8烷基、C7-C8链烯基C7-C8炔基或杂烷基。
在各实施方案中，其中Y是类二十烷酸(eicosanoid)，Y在能与Q或L反应的类二十烷酸的任何位置缀合至L(例如当L是连接基团时)或Q(例如当L是键时)。本领域的技术人员可鉴于一般知识和本文提供的公开易于确定Y上的缀合位置和Y与Q或L的缀合方式。在某些实施方案中，Y经Y的任何位置缀合至L或Q。在某些实施方案中，类二十烷酸经末端羧酸部分或经侧位醇部分缀合至L或Q。
在某些示例性实施方案中，Y是具有如式K或式K的衍生形式描述的结构的白三烯：
Figure BPA00001673726800661
其中各R14独立地为在式化合物K结合至PPAR时允许或促进激动剂或拮抗剂活性的部分(例如如下所示的白三烯B4)：
Figure BPA00001673726800662
在某些实施方案中，当Y包括式K结构时，各R14独立地为C3-C13烷基、C3-C13链烯基、C3-C13炔基或杂烷基。
在其中Y包括式K结构的实施方案中，Y在能与Q或L反应的式K的任何位置缀合至L(例如当L是连接基团时)或Q(例如当L是键时)。本领域的技术人员可鉴于一般知识和本文提供的公开易于确定式K上的缀合位置和式K与Q或L的缀合方式。在某些实施方案中，式K在式K的任何位置上缀合至L或Q。在某些实施方案中，式K经末端羧酸部分或经侧位醇部分缀合至L或Q。
在某些示例性实施方案中，Y是包含如式L描述的结构的噻唑烷二酮：
Figure BPA00001673726800663
式L化合物的非限制性实例包括：
Figure BPA00001673726800671
及其衍生物。
在其中Y包括式L结构的实施方案中，Y在能与Q或L反应的式L的任何位置缀合至L(例如当L是连接基团时)或Q(例如当L是键时)。本领域的技术人员可鉴于一般知识和本文提供的公开易于确定式L上的缀合位置和式L与Q或L的缀合方式。在某些实施方案中，例如，式L在式L的任何位置，例如侧位醇部分，或经芳族取代基缀合至L或Q。
在某些实施方案中，Y作用于RAR相关孤儿受体(例如RORα、RORβ、RORγ)。在某些实施方案中，Y包括允许或促进对ROR的激动剂活性的任何结构，而在其它实施方案中，Y是ROR的拮抗剂。
Y的非限制性实例包括：
Figure BPA00001673726800681
及其衍生物。
在其中Y作用于ROR的实施方案中，Y在能与Q或L反应的Y的任何位置上缀合至L(例如当L是连接基团时)或Q(例如当L是键时)。本领域的技术人员可鉴于一般知识和本文提供的公开易于确定Y上的缀合位置和Y与Q或L的缀合方式。在某些实施方案中，例如，Y经Y的任何位置，诸如，本文先前描述的任何位置缀合至L或Q。
在某些实施方案中，Y作用于肝X受体(LXRα、LXRβ)。在某些实施方案中，Y包括允许或促进对LXR的激动剂活性的任何结构，而在其它实施方案中，Y是LXR的拮抗剂。在示例性实施方案中，Y是氧固醇(oxysterol)(即胆固醇的氧化衍生物)。在这些实施方案中，Y的非限制性实例包括22(R)-羟基胆固醇(参见下文)、24(S)-羟基胆固醇(参见下文)、27-羟基胆固醇、胆甾烯酸(cholestenoic acid)及其衍生物。
Figure BPA00001673726800682
在各实施方案中，其中Y作用于LXR，Y在能与Q或L反应的Y的任何位置上缀合至L(例如当L是连接基团时)或Q(例如当L是键时)。本领域的技术人员可鉴于一般知识和本文提供的公开易于确定Y上的缀合位置和Y缀合至Q或L的方式。在某些实施方案中，Y在式F的位置1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或26中的任何位置上缀合至L或Q。在某些实施方案中，式F在式F的位置3或17缀合至L或Q。
在某些实施方案中，Y作用于法呢酯衍生物X受体(FXR)。在某些实施方案中，Y包括允许或促进对FXR的激动剂活性的任何结构，而在其它实施方案中，Y是FXR的拮抗剂。在这些实施方案中的某些中，Y是胆酸。在示例性实施方案中，Y具有式M的结构：
Figure BPA00001673726800691
其中各R15、R16和R17独立地为在式M化合物结合至FXR时允许或促进激动剂拮抗剂活性的部分。
在某些实施方案中，当Y包括式M的结构时，各R15和R16独立地为氢、(C0-C8烷基)卤代、C1-C18烷基、C2-C18链烯基、C2-C18炔基、杂烷基或(C0-C8烷基)OH；和R17是OH、(C0-C8烷基)NH(C1-C4烷基)SO3H或(C0-C8烷基)NH(C1-C4烷基)COOH。
在某些实施方案中，当Y包括式M的结构，各R15和R16独立地为氢或OH；和R17是OH、NH(C1-C2烷基)SO3H或NH(C1-C2烷基)COOH。
式M化合物的非限制性实例包括：
Figure BPA00001673726800701
及其衍生物。
在各实施方案中，其中Y包括式M的结构，Y在能与Q或L反应的式M的任何位置缀合至L(例如当L是连接基团时)或Q(例如当L是键时)。本领域的技术人员可鉴于一般知识和本文提供的公开易于确定式M上的缀合位置和式M缀合至Q或L的方式。在某些实施方案中，式M在式M的位置1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25中的任何位置缀合至L或Q。在某些实施方案中，式M在式M的位置3、7、12或17缀合至L或Q。
在某些实施方案中，Y作用于维生素D受体(VDR)。在某些实施方案中，Y包括允许或促进对VDR的激动剂活性的任何结构，而在其它实施方案中，Y是VDR的拮抗剂。在示例性实施方案中，Y具有式N结构：
Figure BPA00001673726800711
其中各R18、R19、R20、R21、R22和R23是在式N化合物结合至VDR时允许或促进激动剂或拮抗剂活性的部分，例如，见于Bouillon等，Endocrine Reviews，16(2)：200-257(1995)的任何维生素D化合物。
在某些实施方案中，其中Y包括式N的结构，
R18和R19各独立地为氢、(C0-C8烷基)卤代、(C0-C8烷基)杂芳基或(C0-C8烷基)OH；
两个R20都是氢或两个R20结合在一起形成＝CH2；
R21和R22各自独立地为C1-C4烷基；和
R23是C4-C18烷基、C4-C18链烯基、C4-C18炔基、杂烷基、(C4-C18烷基)芳基、(C4-C18烷基)杂芳基、(C0-C8烷基)OC1-C18烷基、(C0-C8链烯基)OC1-C18烷基、(C0-C8炔基)OC1-C18烷基、(C0-C8烷基)OC2-C18链烯基、(C0-C8烷基)OC2-C18炔基、(C6-C18烷基)OH、(C6-C18烷基)SH、(C6-C18链烯基)OH、(C6-C18炔基)OH、(C0-C8烷基)NR24C1-C18烷基、(C0-C8链烯基)NR24C1-C18烷基、(C0-C8炔基)NR24C1-C18烷基、(C0-C8烷基)NR24C2-C18链烯基、(C0-C8烷基)NR24C2-C18炔基、(C0-C8烷基)C(O)C1-C18烷基、(C0-C8烷基)C(O)C2-C18链烯基、(C0-C8烷基)C(O)C2-C18炔基、(C0-C8烷基)C(O)H、(C0-C8烷基)C(O)芳基、(C0-C8烷基)C(O)杂芳基、(C0-C8烷基)C(O)OC1-C18烷基、(C0-C8烷基)C(O)OC2-C18链烯基、(C0-C8烷基)C(O)OC2-C18炔基、(C0-C8烷基)C(O)OH、(C0-C8烷基)C(O)O芳基、(C0-C8烷基)C(O)O杂芳基、(C0-C8烷基)OC(O)C1-C18烷基、(C0-C8烷基)OC(O)C2-C18链烯基、(C0-C8烷基)OC(O)C2-C18炔基、(C0-C8烷基)C(O)NR24C1-C18烷基、(C0-C8烷基)C(O)NR24C2-C18链烯基、(C0-C8烷基)C(O)NR24C2-C18炔基、(C0-C8烷基)C(O)NR24H2、(C0-C8烷基)C(O)NR24芳基、(C0-C8烷基)C(O)NR24杂芳基、(C0-C8烷基)NR24C(O)C1-C18烷基、(C0-C8烷基)NR24C(O)C2-C8链烯基或(C0-C8烷基)NR24C(O)C2-C18炔基、(C0-C8烷基)NR24C(O)OH、(C0-C8烷基)OC(O)OC1-C18烷基、(C0-C8烷基)OC(O)OC2-C18链烯基、(C0-C8烷基)OC(O)OC2-C18炔基、(C0-C8烷基)OC(O)OH、(C0-C8烷基)OC(O)NR24C1-C18烷基、(C0-C8烷基)OC(O)NR24C2-C18链烯基、(C0-C8烷基)OC(O)NR24C2-C18炔基、(C0-C8烷基)OC(O)NR24H2、(C0-C8烷基)NR24(O)OC1-C18烷基、(C0-C8烷基)NR24(O)OC2-C18链烯基、(C0-C8烷基)NR24(O)OC2-C18炔基或(C0-C8烷基)NR24(O)OH；和
R24为氢或C1-C18烷基。
式N化合物的非限制性实例包括：
Figure BPA00001673726800721
及其衍生物。
在其中Y包括式N结构的实施方案中，Y在能与Q或L反应的式N的任何位置缀合至L(例如当L是连接基团时)或Q(例如当L是键时)。本领域的技术人员可鉴于一般知识和本文提供的公开易于确定式N上的缀合位置和式N缀合至Q或L的方式。在某些实施方案中，式N在式N的位置1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或26中的任何位置缀合至L或Q。在某些实施方案中，式N在式N的位置1、3、19或25缀合至L或Q。
在某些实施方案中，Y作用于娠烷X受体(PXR)。在某些实施方案中，Y包括允许或促进对PXR的激动剂活性的任何结构，而在其它实施方案中，Y是PXR的拮抗剂。在某些实施方案中，Y是类固醇、抗生素、抗霉菌药、胆酸、贯叶金丝桃素(hyperforin)或草本化合物。在示例性实施方案中，Y是能介导CYP3A4、诸如***和利福平的化合物。在各实施方案中，其中Y包括作用于PXR的结构，Y在能与Q或L反应的Y的任何位置上缀合至L(例如当L是连接基团时)或Q(例如当L是键时)。本领域的技术人员可鉴于一般知识和本文提供的公开易于确定Y上的缀合位置和缀合至Q或L的方式。在某些实施方案中，Y在Y的任何位置缀合至L或Q。
NHR配体(Y)的修饰
在某些实施方案中，NHR配体被衍生或以其它方式经化学修饰，以包括能与胰高血糖素超家族肽(Q)或连接基团(L)反应的反应部分。在本文描述的各实施方案中，Y在能与Q或L反应的Y的任何位置上被衍生。Y上的衍生位置对本领域技术人员是显而易见的，并取决于所用NHR配体的类型和希望的活性。例如，在各实施方案中，其中Y具有包括三个6元环加入到一个5元环或其变体的四环骨架的结构，Y可在位置1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25中的任何位置被衍生化。其它衍生位置可为如本文先前所描述的。
可采用本领域技术人员已知或本文描述的任何试剂衍生NHR配体(例如参见连接基团章节和Q和/或Y的化学修饰小节)。例如，可用琥珀酸、琥珀酸酐、苯甲酸、2-溴乙酸乙酯或碘乙酸衍生***，生成以下***衍生物，其能缀合至Q或L。
Figure BPA00001673726800741
类似地，可用本领域已知的方法衍生上述任何NHR配体。此外，某些衍生的配体可市售得到并可购自化学公司诸如Sigma-Aldrich。
胰高血糖素超家族肽(Q)
在本文描述的Q-L-Y缀合物中，Q为胰高血糖素超家族肽。胰高血糖素超家族肽指的是在其N-末端和/或C-末端区域的结构相关的一组肽(参见例如Sherwood et al.，Endocrine Reviews 21：619-670(2000))。据认为C-末端通常作用于受体结合，并且N-末端通常作用于受体信号传导。N-末端和C-末端区域中的几种氨基酸在胰高血糖素超家族的成员中为高度保守的。这些保守的氨基酸中的一些包括His1、Gly4、Phe6、Phe22、Val23、Trp25和Leu26，在这些位置的氨基酸显示同一性、保守性取代或其氨基酸侧链结构的相似性。
胰高血糖素超家族肽包括胰高血糖素相关肽、生长激素释放激素(GHRH；SEQ ID NO：1619)、血管活性肠肽(VIP；SEQ ID NO：1620)、垂体腺苷酸环化酶激活多肽27(PACAP-27；SEQ ID NO：1621)、组氨酸异亮氨酸肽(PHI；SEQ ID NO：1542)、组氨酸蛋氨酸肽(PHM；SEQ ID NO：1622)、促胰液素(SEQ ID NO：1623)和/或其类似物、衍生物或缀合物。在一些实施方案中，Q包含具有最多1、2、3、4、5、6、7、8、9或10种氨基酸修饰的原生胰高血糖素、原生毒蜥外泌肽-4、原生GLP-1(7-37)、原生GLP-2、原生GHRH、原生VIP、原生PACAP-27、原生PHM、原生泌酸调节肽、原生分泌苏或原生GIP的氨基酸序列。
在本发明的一些方面，Q为胰高血糖素相关肽，例如胰高血糖素(SEQ ID NO：1601)、泌酸调节肽(SEQ ID NO：1606)、毒蜥外泌肽-4(SEQ ID NO：1618)、胰高血糖素样肽-1(GLP-1)(氨基酸7-36作为SEQ ID NO：1603提供，氨基酸7-37作为SEQ ID NO：1604提供)、胰高血糖素样肽-2(GLP-2，SEQ ID NO：1608)、抑胃多肽(GIP，SEQID NO：1607)或其类似物、衍生物和缀合物。胰高血糖素相关肽对胰高血糖素、GLP-1、GLP-2和GIP受体中的任何一种或多种具有生物活性(作为激动剂或拮抗剂)，并且在肽的长度(或在对应于胰高血糖素的位置，参见例如图1)上，包含与原生胰高血糖素、原生泌酸调节肽、原生毒蜥外泌肽-4、原生GLP-1(7-37)、原生GLP-2或原生GIP中的至少一个共有至少20％序列同一性(例如25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％)的氨基酸序列。
应该理解考虑胰高血糖素相关肽的所有可能的活性亚组，例如对胰高血糖素或GLP-1或GIP受体中的任何一种或多种具有生物活性(作为激动剂或拮抗剂)的肽，和与每一种列出的原生肽具有序列同一性的所有可能的子集一起，例如包含在原生GLP-1的长度，与原生GLP-1共有至少20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％序列同一性的氨基酸序列。在本发明的一些实施方案中，胰高血糖素相关肽为具有以下活性的肽：胰高血糖素受体激动剂活性、GLP-1受体激动剂活性、GIP受体激动剂活性、胰高血糖素受体/GLP-1受体协同激动剂活性、胰高血糖素受体/GIP受体协同激动剂活性、GLP-1受体/GIP受体协同激动剂活性、胰高血糖素受体/GLP-1受体/GIP受体三重激动剂活性、胰高血糖素受体拮抗剂活性或胰高血糖素受体拮抗剂/GLP-1受体激动剂活性。在一些实施方案中，肽在C-端半分子保留α-螺旋构象。在一些实施方案中，肽保留与受体相互作用或信号转导有关的位置，例如胰高血糖素的3位，或者GLP-1(7-37)的7、10、12、13、15或17-位。因此，胰高血糖素相关肽可为1类、2类、3类、4类和/或5类的肽，其每一类在本文被进一步描述述。
Q也可为本领域已知的胰高血糖素超家族肽中的任何一个，其中一些通过非限制性实施例在本文公开。各种GLP-1类似物为本领域已知的，并且为依据本发明的胰高血糖素相关肽，参见例如WO2008023050、WO 2007030519、WO 2005058954、WO 2003011892、WO 2007046834、WO 2006134340、WO 2006124529、WO 2004022004、WO 2003018516、WO 2007124461，对于GLP-1类似物或衍生物的每一个序列或式的公开，每一篇通过引用以其全文结合到本文中。在任何实施方案中，Q可为在WO 2007/056362、WO 2008/086086、WO2009/155527、WO 2008/101017、WO 2009/155258、WO 2009/058662、WO 2009/058734、WO 2009/099763、WO 2010/011439、PCT专利申请号US09/68745和美国专利申请号61/187578中公开的胰高血糖素相关肽，每一篇通过引用以其全文结合到本文中。在某些实施方案中，Q为如本文详细描述的1类、2类、3类、4类或5类胰高血糖素相关肽。在本文描述的任何实施方案中，Q为SEQ ID NOs：1-760、801-919、1001-1275、1301-1371、1401-1518、1601-1650中的任何一个。在某些实施方案中，Q为SEQ ID NOs：1647-1650中任一种。
胰高血糖素超家族肽(Q)的活性
对胰高血糖素受体的活性
在一些实施方案中，Q对胰高血糖素受体激活表现出以下EC50(或者对于胰高血糖素受体拮抗呈现为IC50)：约10mM或者更小、或1mM(1000μM)或者更小(例如约750μM或者更小、约500μM或者更小、约250μM或者更小、约100μM或者更小、约75μM或者更小、约50μM或者更小、约25μM或者更小、约10μM或者更小、约7.5μM或者更小、约6μM或者更小、约5μM或者更小、约4μM或者更小、约3μM或者更小、约2μM或者更小或约1μM或者更小)。在一些实施方案中，Q对胰高血糖素受体表现出约1000nM或者更小(例如约750nM或者更小、约500nM或者更小、约250nM或者更小、约100nM或者更小、约75nM或者更小、约50nM或者更小、约25nM或者更小、约10nM或者更小、约7.5nM或者更小、约6nM或者更小、约5nM或者更小、约4nM或者更小、约3nM或者更小、约2nM或者更小或约1nM或者更小)的EC50或IC50。在一些实施方案中，Q对胰高血糖素受体具有在皮摩尔范围内的EC50或IC50。因此，在一些实施方案中，Q对胰高血糖素受体表现出约1000pM或者更小(例如约750pM或者更小、约500pM或者更小、约250pM或者更小、约100pM或者更小、约75pM或者更小、约50pM或者更小、约25pM或者更小、约10pM或者更小、约7.5pM或者更小、约6pM或者更小、约5pM或者更小、约4pM或者更小、约3pM或者更小、约2pM或者更小或约1pM或者更小)的EC50或IC50。
在一些实施方案中，Q对胰高血糖素受体表现出约0.001pM或者更多、约0.01pM或者更多或约0.1pM或者更多的EC50或IC50。可通过测定过表达胰高血糖素受体的HEK293细胞中cAMP介导的体外试验，例如，如在实施例2中描述的，用编码胰高血糖素受体的DNA和连至cAMP响应元件的荧光素酶基因共转染试验HEK293细胞，测定胰高血糖素受体活化(胰高血糖素受体活性)。
在一些实施方案中，Q对胰高血糖素受体，相对于原生胰高血糖素(胰高血糖素功效)表现出约0.001％或者更多、约0.01％或者更多、约0.1％或者更多、约0.5％或者更多、约1％或者更多、约5％或者更多、约10％或者更多、约20％或者更多、约30％或者更多、约40％或者更多、约50％或者更多、约60％或者更多、约75％或者更多、约100％或者更多、约125％或者更多、约150％或者更多、约175％或者更多、约200％或者更多、约250％或者更多、约300％或者更多、约350％或者更多、约400％或者更多、约450％或者更多或约500％或者更高的活性。在一些实施方案中，Q对胰高血糖素受体相对于原生胰高血糖素表现出约5000％或者更小或约10000％或者更小的活性。相对于受体的原生配体，Q对受体的活性作为对Q的EC50s与原生配体相比较的反比来计算。
在一些实施方案中，Q仅对胰高血糖素受体表现出显著活性(功效)，并且对GLP-1受体或GIP受体呈现很小-没有活性。在一些实施方案中，Q被看作是“纯的胰高血糖素受体激动剂”或者不被看作是“胰高血糖素/GLP-1受体协同激动剂”或“胰高血糖素/GIP受体协同激动剂”。在一些实施方案中，Q对本文描述的胰高血糖素受体表现出任何水平的活性或功效，但是对GLP-1受体或GIP受体具有明显更低的活性(功效)。在一些实施方案中，Q对GLP-1受体呈现为对胰高血糖素受体的EC50的100倍或者更大的EC50。在一些实施方案中，Q对GIP受体呈现为对胰高血糖素受体的EC50的100倍或者更大的EC50。对GLP-1受体的活性
在一些实施方案中，Q对GLP-1受体激活表现出以下EC50(或者对于GLP-1受体拮抗为IC50)：约10mM或者更小、或约1mM(1000μM)或者更小(例如约750μM或者更小、约500μM或者更小、约250μM或者更小、约100μM或者更小、约75μM或者更小、约50μM或者更小、约25μM或者更小、约10μM或者更小、约7.5μM或者更小、约6μM或者更小、约5μM或者更小、约4μM或者更小、约3μM或者更小、约2μM或者更小或约1μM或者更小)。在一些实施方案中，Q对GLP-1受体激活表现出以下的EC50或IC50：约1000nM或者更小(例如约750nM或者更小、约500nM或者更小、约250nM或者更小、约100nM或者更小、约75nM或者更小、约50nM或者更小、约25nM或者更小、约10nM或者更小、约7.5nM或者更小、约6nM或者更小、约5nM或者更小、约4nM或者更小、约3nM或者更小、约2nM或者更小或约1nM或者更小)。在一些实施方案中，Q对GLP-1受体具有在皮摩尔范围内的EC50或IC50。因此，在一些实施方案中，Q对GLP-1受体激活表现出以下EC50或IC50：约1000pM或者更小(例如约750pM或者更小、约500pM或者更小、约250pM或者更小、约100pM或者更小、约75pM或者更小、约50pM或者更小、约25pM或者更小、约10pM或者更小、约7.5pM或者更小、约6pM或者更小、约5pM或者更小、约4pM或者更小、约3pM或者更小、约2pM或者更小或约1pM或者更小)。
在一些实施方案中，Q对GLP-1受体表现出约0.001pM或者更多、约0.01pM或者更多或约0.1pM或者更多的EC50或IC50。可通过测定过表达GLP-1受体的HEK293细胞中cAMP介导的体外试验，例如，如在实施例2中描述的用编码GLP-1受体的DNA和连至cAMP响应元件的荧光素酶基因共转染试验HEK293细胞，测定GLP-1受体活化(GLP-1受体活性)。
在一些实施方案中，Q对GLP-1受体，相对于原生GLP-1(GLP-1功效)表现出约0.001％或者更多、约0.01％或者更多、约0.1％或者更多、约0.5％或者更多、约1％或者更多、约5％或者更多、约10％或者更多、约20％或者更多、约30％或者更多、约40％或者更多、约50％或者更多、约60％或者更多、约75％或者更多、约100％或者更多、约125％或者更多、约150％或者更多、约175％或者更多、约200％或者更多、约250％或者更多、约300％或者更多、约350％或者更多、约400％或者更多、约450％或者更多或约500％或者更高的活性。在一些实施方案中，Q对GLP-1受体相对于原生GLP-1(GLP-1功效)表现出约5000％或者更小或约10000％或者更小的活性。
在一些实施方案中，Q仅对GLP-1受体表现出显著活性(功效)，并且对胰高血糖素受体或GIP受体呈现很小-没有活性。在一些实施方案中，Q被看作是“纯的GLP-1受体激动剂”或者不被看作是“胰高血糖素/GLP-1受体协同激动剂”或“GLP-1/GIP协同激动剂”。在一些实施方案中，Q对本文描述的GLP-1受体表现出任何水平的活性或功效，但是对胰高血糖素受体或GIP受体具有明显更低的活性(功效)。在一些实施方案中，Q对胰高血糖素受体呈现为对GLP-1受体的EC50的100倍或者更大的EC50。在一些实施方案中，Q对GIP受体呈现为对GLP-1受体的EC50的100倍或者更大的EC50。
对GIP受体的活性
在一些实施方案中，Q对GIP受体激活表现出以下EC50(或者对于GIP受体拮抗呈现为IC50)：约10mM或者更小、或约1mM(1000μM)或者更小(例如约750μM或者更小、约500μM或者更小、约250μM或者更小、约100μM或者更小、约75μM或者更小、约50μM或者更小、约25μM或者更小、约10μM或者更小、约7.5μM或者更小、约6μM或者更小、约5μM或者更小、约4μM或者更小、约3μM或者更小、约2μM或者更小或约1μM或者更小)。在一些实施方案中，Q对GIP受体的EC50或IC50为小于1000nM、小于900nM、小于800nM、小于700nM、小于600nM、小于500nM、小于400nM、小于300nM或小于200nM。在一些实施方案中，Q对GIP受体的EC50或IC50为约100nM或者更小，例如约75nM或者更小、约50nM或者更小、约25nM或者更小、约10nM或者更小、约8nM或者更小、约6nM或者更小、约5nM或者更小、约4nM或者更小、约3nM或者更小、约2nM或者更小或约1nM或者更小。在一些实施方案中，Q对GIP受体呈现具有在皮摩尔范围内的EC50或IC50。在示例性实施方案中，Q对GIP受体的EC50或IC50为小于1000pM、小于900pM、小于800pM、小于700pM、小于600pM、小于500pM、小于400pM、小于300pM或小于200pM。在一些实施方案中，Q对GIP受体的EC50或IC50为约100pM或者更小，例如约75pM或者更小、约50pM或者更小、约25pM或者更小、约10pM或者更小、约8pM或者更小、约6pM或者更小、约5pM或者更小、约4pM或者更小、约3pM或者更小、约2pM或者更小或约1pM或者更小。可通过测定过表达GIP受体的HEK293细胞中cAMP介导的体外试验，例如，如在实施例2中描述的用编码受体的DNA和连至cAMP响应元件的荧光素酶基因共转染试验HEK293细胞，测定受体活化。
在本公开的一些实施方案中，Q对GIP受体表现出原生GIP的至少或约0.1％的活性。在示例性实施方案中，Q对GIP受体表现出原生GIP的至少或约0.2％、至少或约0.3％、至少或约0.4％、至少或约0.5％、至少或约0.6％、至少或约0.7％、至少或约0.8％、至少或约0.9％、至少或约1％、至少或约5％、至少或约10％、至少或约20％、至少或约30％、至少或约40％、至少或约50％、至少或约60％、至少或约70％、至少或约75％、至少或约80％、至少或约90％、至少或约95％或者至少或约100％的活性。
在本公开的一些实施方案中，Q对GIP受体表现出大于原生GIP的活性。在示例性实施方案中，Q对GIP受体表现出原生GIP的活性的至少或约101％、至少或约105％、至少或约110％、至少或约125％、至少或约150％、至少或约175％、至少或约200％、至少或约300％、至少或约400％、至少或约500％或者更高的％。在一些实施方案中，相对于原生GIP，Q对GIP受体表现出不大于1000％、10000％、100000％或1000000％的活性。相对于原生GIP，肽对GIP受体的活性作为对GIP激动剂肽的EC50s与原生GIP相比较的反比来计算。
在一些实施方案中，Q仅对GIP受体表现出显著活性(功效)，并且对胰高血糖素受体或GLP-1受体呈现很小-没有活性。在一些实施方案中，Q被看作是“纯的GIP受体激动剂”或者不被看作是“胰高血糖素/GIP受体协同激动剂”或“GLP-1/GIP协同激动剂”。在一些实施方案中，Q对本文描述的GIP受体表现出任何水平的活性或功效，但是对胰高血糖素受体或GLP-1受体具有明显更低的活性(功效)。在一些实施方案中，Q对胰高血糖素受体呈现为对GIP受体的EC50的100倍或者更大的EC50，和对GLP-1受体呈现为对GIP受体的EC50的100倍或者更大的EC50。
对GLP-1受体和胰高血糖素受体的活性
在一些实施方案中，Q对GLP-1受体和胰高血糖素受体两者表现出活性(“胰高血糖素/GLP-1受体协同激动剂”)。在一些实施方案中，Q对胰高血糖素受体的活性(例如EC50或者相对活性或功效)与其对GLP-1受体的活性(例如EC50或者相对活性或功效)相差(更高或更低)约50倍、约40倍、约30倍、约20倍、约10倍或约5倍以内。在一些实施方案中，Q的胰高血糖素功效与其GLP-1功效相差(更高或更低)约25-、约20-、约15-、约10-或约5-倍以内。
在一些实施方案中，Q对胰高血糖素受体的相对活性或EC50或功效除以Q对GLP-1受体的相对活性或EC50或功效的比率少于或为约X，其中X选自100、75、60、50、40、30、20、15、10或5。在一些实施方案中，Q对胰高血糖素受体的EC50或功效或相对活性除以Q对GLP-1受体的EC50或功效或相对活性的比率为约1少于5(例如约4、约3、约2、约1)。在一些实施方案中，Q的胰高血糖素功效与Q的GLP-1功效相比较的比率少于或为约Z，其中Z选自100、75、60、50、40、30、20、15、10和5。在一些实施方案中，Q的胰高血糖素功效与Q的GLP-1功效相比较的比率少于5(例如约4、约3、约2、约1)。在一些实施方案中，Q对胰高血糖素受体具有为Q对GLP-1受体的EC50的2-10倍(例如2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍)的EC50。
在一些实施方案中，Q对GLP-1受体的相对活性或功效或EC50除以胰高血糖素类似物对胰高血糖素受体的相对活性或功效或EC50的比率少于或为约V，其中V选自100、75、60、50、40、30、20、15、10或5。在一些实施方案中，Q对GLP-1受体的EC50或功效或相对活性除以Q对胰高血糖素受体的EC50或功效或相对活性的比率少于5(例如约4、约3、约2、约1)。在一些实施方案中，Q的GLP-1功效与Q的胰高血糖素功效相比较的比率少于或为约W，其中W选自100、75、60、50、40、30、20、15、10和5。在一些实施方案中，Q的GLP-1功效与Q的胰高血糖素功效相比较的比率少于5(例如约4、约3、约2、约1)。在一些实施方案中，Q对GLP-1受体具有为对胰高血糖素受体的EC50的约2-约10倍(例如2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍)的EC50。
在一些实施方案中，Q对GLP-1受体表现出原生GLP-1的活性的至少0.1％(例如约0.5％或者更多、约1％或者更多、约5％或者更多、约10％或者更多)(GLP-1功效)，和对胰高血糖素受体表现出原生胰高血糖素的活性的至少0.1％(例如约0.5％或者更多、约1％或者更多、约5％或者更多、约10％或者更多)(胰高血糖素功效)。
Q对胰高血糖素受体与GLP-1受体相比较的选择性可描述为胰高血糖素/GLP-1活性的相对比率(Q相对于原生胰高血糖素对胰高血糖素受体的活性除以类似物相对于原生GLP-1对GLP-1受体的活性)。例如，对胰高血糖素受体表现出原生胰高血糖素的活性的60％和对GLP-1受体表现出原生GLP-1的活性的60％的Q具有胰高血糖素/GLP-1活性的1∶1比率。胰高血糖素/GLP-1活性的示例性比率包括约1∶1、1.5∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1、6∶1、7∶1、8∶1、9∶1或10∶1，或者约1∶10、1∶9、1∶8、1∶7、1∶6、1∶5、1∶4、1∶3、1∶2或1∶1.5。作为实例，胰高血糖素/GLP-1活性比率为10∶1表示对胰高血糖素受体与GLP-1受体相比较的选择性为10倍。类似地，GLP-1/胰高血糖素活性比率为10∶1表示对GLP-1受体与胰高血糖素受体相比较的选择性为10倍。[00209]在一些实施方案中，Q对胰高血糖素受体和GLP-1受体表现出显著活性(功效)，并且对GIP受体呈现很小-没有活性。在一些实施方案中，Q对本文描述的胰高血糖素受体和GLP-1受体表现出任何水平的活性或功效，但是对GIP受体具有明显更低的活性(功效)。在一些实施方案中，Q对GIP受体呈现为对胰高血糖素受体的EC50和对GLP-1受体的EC50的100倍或者更大的EC50。
对GLP-1受体和GIP受体的活性
在一些实施方案中，Q对GLP-1受体和GIP受体两者表现出活性(“GIP/GLP-1受体协同激动剂”)。在一些实施方案中，Q对GIP受体的活性(例如EC50或者相对活性或功效)与其对GLP-1受体的活性(例如EC50或者相对活性或功效)相差(更高或更低)约50倍、约40倍、约30倍、约20倍、约10倍或约5倍以内。在一些实施方案中，Q的GIP功效与其GLP-1功效相差(更高或更低)约25-、约20-、约15-、约10-或约5-倍以内。
在一些实施方案中，Q对GIP受体的相对活性或EC50或功效除以Q对GLP-1受体的相对活性或EC50或功效的比率少于或为约X，其中X选自100、75、60、50、40、30、20、15、10或5。在一些实施方案中，Q对GIP受体的EC50或功效或相对活性除以Q对GLP-1受体的EC50或功效或相对活性的比率为约1少于5(例如约4、约3、约2、约1)。在一些实施方案中，Q的GIP功效与Q的GLP-1功效相比较的比率少于或为约Z，其中Z选自100、75、60、50、40、30、20、15、10和5。在一些实施方案中，Q的GIP功效与Q的GLP-1功效相比较的比率少于5(例如约4、约3、约2、约1)。在一些实施方案中，Q对GIP受体具有为对GLP-1受体的EC50的2-10倍(例如2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍)的EC50。
在一些实施方案中，Q对GLP-1受体的相对活性或功效或EC50除以Q对GIP受体的相对活性或功效或EC50的比率少于或为约V，其中V选自100、75、60、50、40、30、20、15、10或5。在一些实施方案中，Q对GLP-1受体的EC50或功效或相对活性除以Q对GIP受体的EC50或功效或相对活性的比率少于5(例如约4、约3、约2、约1)。在一些实施方案中，Q的GLP-1功效与Q的GIP功效相比较的比率少于或为约W，其中W选自100、75、60、50、40、30、20、15、10和5。在一些实施方案中，Q的GLP-1功效与Q的GIP功效相比较的比率少于5(例如约4、约3、约2、约1)。在一些实施方案中，Q对GLP-1受体具有为对GIP受体的EC50的约2-约10倍(例如2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍)的EC50。
在一些实施方案中，Q对GLP-1受体表现出原生GLP-1的活性的至少0.1％(例如约0.5％或者更多、约1％或者更多、约5％或者更多、约10％或者更多、或者更多)(GLP-1功效)，和对GIP受体表现出原生GIP的活性的至少0.1％(例如约0.5％或者更多、约1％或者更多、约5％或者更多、约10％或者更多、或者更多)(GIP功效)。
Q对GIP受体与GLP-1受体相比较的选择性可描述为GIP/GLP-1活性的相对比率(Q相对于原生GIP对GIP受体的活性除以类似物对GLP-1受体相对于原生GLP-1的活性)。例如，对GIP受体表现出原生GIP的活性的60％和对GLP-1受体表现出原生GLP-1的活性的60％的Q具有GIP/GLP-1活性1∶1的比率。GIP/GLP-1活性的示例性比率包括约1∶1、1.5∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1、6∶1、7∶1、8∶1、9∶1或10∶1，或者约1∶10、1∶9、1∶8、1∶7、1∶6、1∶5、1∶4、1∶3、1∶2或1∶1.5。作为实例，GIP/GLP-1活性比率为10∶1表示对GIP受体与GLP-1受体相比较的选择性为10倍。类似地，10∶1的GLP-1/GIP活性比率表示对GLP-1受体与GIP受体相比较的选择性为10倍。
对胰高血糖素受体和GIP受体的活性
在一些实施方案中，Q对胰高血糖素受体和GIP受体两者表现出活性(“GIP/胰高血糖素受体协同激动剂”)。在一些实施方案中，Q对GIP受体的活性(例如EC50或者相对活性或功效)与其对胰高血糖素受体的活性(例如EC50或者相对活性或功效)相差(更高或更低)约50倍、约40倍、约30倍、约20倍、约10倍或约5倍以内。在一些实施方案中，Q的GIP功效与其胰高血糖素功效相差(更高或更低)约25-、约20-、约15-、约10-或约5-倍以内。
在一些实施方案中，Q对GIP受体的相对活性或EC50或功效除以Q对胰高血糖素受体的相对活性或EC50或功效的比率少于或为约X，其中X选自100、75、60、50、40、30、20、15、10或5。在一些实施方案中，Q对GIP受体的EC50或功效或相对活性除以Q对胰高血糖素受体的EC50或功效或相对活性的比率为约1少于5(例如约4、约3、约2、约1)。在一些实施方案中，Q的GIP功效与Q的胰高血糖素功效相比较的比率少于或为约Z，其中Z选自100、75、60、50、40、30、20、15、10和5。在一些实施方案中，Q的GIP功效与Q的胰高血糖素功效相比较的比率少于5(例如约4、约3、约2、约1)。在一些实施方案中，Q对GIP受体具有为对胰高血糖素受体的EC50的2-10倍(例如2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍)的EC50。
在一些实施方案中，Q对胰高血糖素受体的相对活性或功效或EC50除以Q对GIP受体的相对活性或功效或EC50的比率少于或为约V，其中V选自100、75、60、50、40、30、20、15、10或5。在一些实施方案中，Q对胰高血糖素受体的EC50或功效或相对活性除以Q对GIP受体的EC50或功效或相对活性的比率少于5(例如约4、约3、约2、约1)。在一些实施方案中，Q的胰高血糖素功效与Q的GIP功效相比较的比率少于或为约W，其中W选自100、75、60、50、40、30、20、15、10和5。在一些实施方案中，Q的胰高血糖素功效与Q的GIP功效相比较的比率少于5(例如约4、约3、约2、约1)。在一些实施方案中，Q对胰高血糖素受体具有为对GIP受体的EC50的约2-约10倍(例如2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍)的EC50。
在一些实施方案中，Q对胰高血糖素受体表现出原生胰高血糖素的活性的至少0.1％(例如约0.5％或者更多、约1％或者更多、约5％或者更多、约10％或者更多、或者更多)(胰高血糖素功效)，和对GIP受体表现出原生GIP的活性的至少0.1％(例如约0.5％或者更多、约1％或者更多、约5％或者更多、约10％或者更多、或者更多)(GIP功效)。
Q对GIP受体与胰高血糖素受体相比较的选择性可描述为GIP/胰高血糖素活性的相对比率(Q对GIP受体相对于原生GIP的活性除以类似物对胰高血糖素受体相对于原生胰高血糖素的活性)。例如，对GIP受体表现出原生GIP的活性的60％和对胰高血糖素受体表现出原生胰高血糖素的活性的60％的Q具有GIP/胰高血糖素活性的1∶1的比率。GIP/胰高血糖素活性的示例性比率包括约1∶1、1.5∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1、6∶1、7∶1、8∶1、9∶1或10∶1，或者约1∶10、1∶9、1∶8、1∶7、1∶6、1∶5、1∶4、1∶3、1∶2或1∶1.5。作为实例，10∶1的GIP/胰高血糖素活性比率表示对GIP受体与胰高血糖素受体相比较的选择性为10倍。类似地，10∶1的胰高血糖素/GIP活性比率表示对胰高血糖素受体与GIP受体相比较的选择性为10倍。
对胰高血糖素受体、GLP-1受体和GIP受体活性
在一些实施方案中，Q对胰高血糖素受体、GLP-1受体和GIP受体全部三者表现出活性(“胰高血糖素/GLP-1/GIP受体三重激动剂”)。在一些实施方案中，Q对胰高血糖素受体的活性(例如EC50或者相对活性或功效)与其对GLP-1受体和GIP受体两者的活性(例如EC50或者相对活性或功效)相差(更高或更低)约100倍、约75倍、约60倍、约50倍、约40倍、约30倍、约20倍、约10倍或约5倍以内。在一些实施方案中，Q对GLP-1受体的活性(例如EC50或者相对活性或功效)与其对胰高血糖素受体和GIP受体两者的活性(例如EC50或者相对活性或功效)相差(更高或更低)约100倍、约75倍、约60倍、约50倍、约40倍、约30倍、约20倍、约10倍或约5倍以内。在一些实施方案中，Q对GIP受体的活性(例如EC50或者相对活性或功效)与其对胰高血糖素受体和GLP-1受体两者的活性(例如EC50或者相对活性或功效)相差(更高或更低)约100倍、约75倍、约60倍、约50倍、约40倍、约30倍、约20倍、约10倍或约5倍以内。这种倍数差异或者可表示为以上胰高血糖素/GLP-1或GLP-1/GIP或胰高血糖素/GLP-1的比率。
胰高血糖素超家族肽(Q)的结构
本文描述的胰高血糖素超家族肽(Q)可包含基于原生人胰高血糖素(SEQ ID NO：1601)、原生人GLP-1(SEQ ID NOs：1603或1604)或原生人GIP(SEQ ID NO：1607)的氨基酸序列的氨基酸序列。
基于原生人胰高血糖素
在本发明的一些方面，胰高血糖素超家族肽(Q)包含基于原生人胰高血糖素(SEQ ID NO：1601)的氨基酸序列的氨基酸序列。在一些方面，Q包含SEQ ID NO：1601的修饰的氨基酸序列，其包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15，并且在一些情况中包含16或者更多(例如17、18、19、20、21、22、23、24、25等)个氨基酸修饰。在一些实施方案中，相对于原生人胰高血糖素序列(SEQ ID NO：1601)，Q包含总计1个，最多2个、最多3个、最多4个、最多5个、最多6个、最多7个、最多8个、最多9个或最多10个氨基酸修饰。在一些实施方案中，修饰为本文描述的那些修饰中的任何一种，例如在位置1、2、3、7、10、12、15、16、17、18、19、20、21、23、24、27、28和29中的一个或多个位置的氨基酸的酰化、烷基化、聚乙二醇化、在C-末端截短、取代。
在一些实施方案中，Q包含与原生人胰高血糖素(SEQ ID NO：1601)的氨基酸序列具有至少25％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，Q包含与SEQ ID NO：1601至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％或具有大于90％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，具有以上指定的％序列同一性的Q的氨基酸序列为Q的全长氨基酸序列。在一些实施方案中，具有以上指定的％序列同一性的Q的氨基酸序列仅为Q的一部分氨基酸序列。在一些实施方案中，Q包含与SEQ ID NO：1601的至少5个连续氨基酸(例如至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个氨基酸)的参比氨基酸序列具有约A％或者更大的序列同一性的氨基酸序列，其中参比氨基酸序列始于SEQ ID NO：1601的位置C的氨基酸，并且止于SEQ ID NO：1601的位置D的氨基酸，其中A为25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99；C为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27或28和D为5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28或29。设想上述参数的任何和全部可能的组合，包括，但不限于例如其中A为90％并且C和D为1和27、或6和27、或8和27、或10和27、或12和27、或16和27。
基于原生人GLP-1
在本发明的一些方面，胰高血糖素超家族肽(Q)包含基于原生人GLP-1(SEQ ID NO：1603)的氨基酸序列的氨基酸序列。在一些方面，Q包含SEQ ID NO：1603的修饰的氨基酸序列，其包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15，并且在一些情况中包含16或者更多(例如17、18、19、20、21、22、23、24、25等)个氨基酸修饰。在一些实施方案中，相对于原生人GLP-1序列(SEQID NO：1603)，Q包含总计1个，最多2个、最多3个、最多4个、最多5个、最多6个、最多7个、最多8个、最多9个或最多10个氨基酸修饰。在一些实施方案中，修饰为本文描述的那些修饰中的任何一种，例如在位置1、2、3、7、10、12、15、16、17、18、19、20、21、23、24、27、28和29中的一个或多个位置的氨基酸的酰化、烷基化、聚乙二醇化、在C-末端截短、取代。
在一些实施方案中，Q包含与原生人GLP-1(SEQ ID NO：1603)的氨基酸序列具有至少25％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，Q包含与SEQ ID NO：1603具有至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％或具有大于90％的序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，具有以上涉及的％序列同一性的Q的氨基酸序列为Q的全长氨基酸序列。在一些实施方案中，具有以上涉及的％序列同一性的Q的氨基酸序列仅为Q的一部分氨基酸序列。在一些实施方案中，Q包含与SEQID NO：1603的至少5个连续氨基酸(例如至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个氨基酸)的参比氨基酸序列具有约A％或者更大序列同一性的氨基酸序列，其中参比氨基酸序列始于SEQ ID NO：1603的位置C的氨基酸，并且止于SEQ ID NO：1603的位置D的氨基酸，其中A为25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99；C为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27或28和D为5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28或29。设想上述参数的任何和全部可能的组合，包括，但不限于例如其中A为90％并且C和D为1和27、或6和27、或8和27、或10和27、或12和27、或16和27。
基于原生人GIP
在本公开的一些实施方案中，Q为原生人GIP的类似物，其氨基酸序列本文作为SEQ ID NO：1607提供。因此，在一些实施方案中，Q包含基于SEQ ID NO：1607的氨基酸序列的氨基酸序列，但是用1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15，并且在一些情况中用16或者更多(例如17、18、19、20、21、22、23、24、25等)个氨基酸修饰进行修饰。在一些实施方案中，相对于原生人GIP序列(SEQ ID NO：1607)，Q包含总计1个，最多2个、最多3个、最多4个、最多5个、最多6个、最多7个、最多8个、最多9个或最多10个氨基酸修饰。在一些实施方案中，修饰为本文描述的那些修饰中的任何一种，例如在位置1、2、3、7、10、12、15、16、17、18、19、20、21、23、24、27、28和29中的一个或多个位置的氨基酸的酰化、烷基化、聚乙二醇化、在C-末端截短、取代。示例性的GIP受体激动剂为本领域已知的，参见例如，Irwin等，J Pharm and Expmt Ther314(3)：1187-1194(2005)；Salhanick等，Bioorg Med Chem Lett 15(18)：4114-4117(2005)；Green等，Dibetes 7(5)：595-604(2005)；O’Harte等，J Endocrinol 165(3)：639-648(2000)；O’Harte等，Diabetologia 45(9)：1281-1291(2002)；Gault等，Biochem J 367(Pt3)：913-920(2002)；Gault等，J Endocrin 176：133-141(2003)；Irwin等，Diabetes Obes Metab.11(6)：603-610(epub 2009)。
在一些实施方案中，Q包含与原生人GIP(SEQ ID NO：1607)的氨基酸序列具有至少25％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，Q包含与SEQ ID NO：1607具有至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％或具有大于90％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，具有以上提及的％序列同一性的Q的氨基酸序列为Q的全长氨基酸序列。在一些实施方案中，具有以上提及的％序列同一性的Q的氨基酸序列仅为Q的一部分氨基酸序列。在一些实施方案中，Q包含与SEQ ID NO：1607的至少5个连续氨基酸(例如至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个氨基酸)的参比氨基酸序列具有约A％或者更大序列同一性的氨基酸序列，其中参比氨基酸序列始于SEQ ID NO：1607的位置C的氨基酸，并且止于SEQ ID NO：1607的位置D的氨基酸，其中A为25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99；C为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27或28和D为5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28或29。设想上述参数的任何和全部可能的组合，包括，但不限于例如其中A为90％并且C和D为1和27、或6和27、或8和27、或10和27、或12和27、或16和27。
修饰
当Q为胰高血糖素相关肽时，Q可包含具有修饰的原生胰高血糖素氨基酸序列(SEQ ID NO：1601)。在示例性实施方案中，相对于原生胰高血糖素序列，胰高血糖素相关肽可包含总计1个，最多2个、最多3个、最多4个、最多5个、最多6个、最多7个、最多8个、最多9个或最多10个氨基酸修饰，例如保守或非保守的取代。本文描述的修饰和取代在某些方面在Q中的特定位置进行，其中位置编号对应于胰高血糖素(SEQ ID NO：1601)的编号。在一些实施方案中，1、2、3、4或5个非保守的取代在2、5、7、10、11、12、13、14、17、18、19、20、21、24、27、28或29位中的任何位置进行，并且最多5个其它的保守取代在这些位置中的任何位置进行。在一些实施方案中，1、2或3个氨基酸修饰在1-16位的氨基酸中进行，并且1、2或3个氨基酸修饰在17-26位的氨基酸中进行。在一些实施方案中，Q在原生胰高血糖素中的相应位置保留至少22、23、24、25、26、27或28个天然存在的氨基酸(例如相对于天然存在的胰高血糖素具有1-7、1-5或1-3个修饰)。
DPP-IV抗性
在其中Q为胰高血糖素超家族肽的一些实施方案中，Q在1或2位包含修饰，以减少对经二肽基肽酶IV(DPP-IV)裂解的敏感性。更具体地讲，在一些实施方案中，Q(例如选自图1中的那些)的1位用选自以下的氨基酸取代：D-组氨酸、α，α-二甲基咪唑乙酸(DMIA)、N-甲基组氨酸、α-甲基组氨酸、咪唑乙酸、脱氨基组氨酸、羟基组氨酸、乙酰基组氨酸和高组氨酸。更具体地讲，在一些实施方案中，Q的2位用选自以下的氨基酸取代：D-丝氨酸、D-丙氨酸、缬氨酸、甘氨酸、N-甲基丝氨酸和氨基异丁酸。在一些实施方案中，胰高血糖素相关肽的2位不为D-丝氨酸。
3位的胰高血糖素修饰
本文描述的1-3类的胰高血糖素相关肽可在3位进行修饰(根据野生型胰高血糖素的氨基酸编号)，以保持或增加对胰高血糖素受体的活性。
在其中Q为1类、2类或3类胰高血糖素相关肽的一些实施方案中，通过在3位用谷氨酰胺类似物修饰Gln可实现保持或增强对胰高血糖素受体的活性。例如，在3位包含谷氨酰胺类似物的1类、2类或3类胰高血糖素相关肽可对胰高血糖素受体表现出原生胰高血糖素(SEQ ID NO：1601)的约5％、约10％、约20％、约50％或约85％或者更大的活性。在一些实施方案中，在3位包含谷氨酰胺类似物的1类、2类或3类胰高血糖素相关肽，对胰高血糖素受体表现出相应的胰高血糖素肽的约20％、约50％、约75％、约100％、约200％或约500％或者更大的活性，所述相应的胰高血糖素肽与除了在3位修饰的氨基酸外包含谷氨酰胺类似物的肽具有相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，在3位包含谷氨酰胺类似物的1类、2类或3类胰高血糖素相关肽对胰高血糖素受体表现出增强的活性，但是这种增强的活性不多于原生胰高血糖素或相应的胰高血糖素相关肽的活性的1000％、10000％、100000％或1000000％，所述相应的胰高血糖素肽与除了在3位修饰的氨基酸外包含谷氨酰胺类似物的肽具有相同的氨基酸序列。
在一些实施方案中，谷氨酰胺类似物为包含以下结构I、II或III的侧链的天然存在或非天然存在的氨基酸：
Figure BPA00001673726800931
其中R1为C0-3烷基或C0-3杂烷基；R2为NHR4或C1-3烷基；R3为C1-3烷基；R4为H或C1-3烷基；X为NH、O或S；和Y为NHR4、SR3或OR3。在一些实施方案中，X为NH或Y为NHR4。在一些实施方案中，R1为C0-2烷基或C1杂烷基。在一些实施方案中，R2为NHR4或C1烷基。在一些实施方案中，R4为H或C1烷基。在其中Q为1类、2类或3类胰高血糖素相关肽的示例性实施方案中，提供了包含结构I的侧链的氨基酸，其中R1为CH2-S，X为NH和R2为CH3(乙酰氨基甲基半胱氨酸，C(Acm))；R1为CH2，X为NH和R2为CH3(乙酰基二氨基丁酸，Dab(Ac))；R1为C0烷基，X为NH，R2为NHR4和R4为H(氨基甲酰基二氨基丙酸，Dap(脲))；或者R1为CH2-CH2，X为NH和R2为CH3(乙酰鸟氨酸，Orn(Ac))。在示例性实施方案中，提供了包含结构II的侧链的氨基酸，其中R1为CH2，Y为NHR4和R4为CH3(甲基谷氨酰胺，Q(Me))；在示例性实施方案中，提供了包含结构III的侧链的氨基酸，其中R1为CH2和R4为H(蛋氨酸-亚砜，M(O))；在特别的实施方案中，3位的氨基酸用Dab(Ac)取代。
Q的酰化
在一些实施方案中，胰高血糖素相关肽(例如1类胰高血糖素相关肽、2类胰高血糖素相关肽、3类胰高血糖素相关肽、4类胰高血糖素相关肽、4类胰高血糖素相关肽或5类胰高血糖素相关肽)，Q被修饰以包含酰基。酰基可共价直接连接于肽Q的氨基酸，或者经间隔区间接连接于Q的氨基酸，其中所述间隔区定位于Q的氨基酸与酰基之间。Q可在连接亲水性部分的相同氨基酸位置或在不同的氨基酸位置被酰化。如本文描述的那样，Q可为胰高血糖素超家族肽、胰高血糖素相关肽，包括1、2、3、4或5类胰高血糖素相关肽，或者为骨钙蛋白、降钙素、糊精或其类似物、衍生物或缀合物。例如，Q可为1类、2类、3类、4类或5类中的一种，并可包含为非原生-天然存在的氨基酸的酰基。酰化可在Q中的任何位置实施。当Q为胰高血糖素相关肽时，酰化可发生在包括1-29位的任何位置、C-末端延伸中的位置或C-末端氨基酸中的位置，条件是在酰化时保留由非酰化的胰高血糖素相关肽呈现的活性。例如，如果未酰化的肽具有胰高血糖素激动剂活性，那么酰化的肽保留胰高血糖素激动剂活性。而且例如，如果未酰化的肽具有胰高血糖素拮抗剂活性，那么酰化的肽保留胰高血糖素拮抗剂活性。例如，如果未酰化的肽具有GLP-1激动剂活性，那么酰化的肽保留GLP-1激动剂活性。非限制性实例包括在5、7、10、11、12、13、14、16、17、18、19、20、21、24、27、28或29位(根据野生型胰高血糖素的氨基酸编号)的酰化。关于1类、2类和3类胰高血糖素相关肽，酰化可发生于5、7、10、11、12、13、14、16、17、18、19、20、21、24、27、28、29、30、37、38、39、40、41、42或43位(根据野生型胰高血糖素的氨基酸编号)中的任何位置。关于胰高血糖素相关肽(例如1、2、3、4或5类)的其它非限制性实例包括在10位(根据野生型胰高血糖素的氨基酸编号)的酰化，和在胰高血糖素肽的C-末端部分中的一个或多个位置的聚乙二醇化，例如24、28或29位(根据野生型胰高血糖素的氨基酸编号)、在C-末端延伸中或在C-末端的(例如通过增加C-末端Cys)。
羟基或硫醇的任何氨基酸的至少一个氨基酸进行修饰。在本发明的一些特别的实施方案中，其中Q为胰高血糖素相关肽，通过10位(根据野生型胰高血糖素的氨基酸编号)氨基酸的侧链胺、羟基或硫醇发生Q的直接酰化。
在一些实施方案中，包含侧链胺的肽Q(例如胰高血糖素超家族肽、胰高血糖素相关肽；1、2、3、4或5类胰高血糖素相关肽，或者骨钙蛋白、降钙素、糊精或其类似物、衍生物或缀合物)的氨基酸为以下式I的氨基酸：
Figure BPA00001673726800951
其中n＝1-4
[式I]
在某些示例性实施方案中，式I氨基酸是其中n是4的氨基酸(Lys)或n是3的氨基酸(Orn)。
在其它的实施方案中，包含侧链羟基的肽Q的氨基酸为式II的氨基酸：
Figure BPA00001673726800961
其中n＝1-4
[式II]
在一些示例性实施方案中，式II的氨基酸为其中n为1的氨基酸(Ser)。
在其它实施方案中，包含侧链硫醇的肽Q的氨基酸是式III氨基酸：
其中n＝1-4
[式III]
在一些示例性实施方案中，式III氨基酸为其中n为1的氨基酸(Cys)。
在另外的其它实施方案中，除了键合于式I、式II或式III氨基酸的α碳的氢用第二个侧链替代，包含侧链胺、羟基或硫醇的肽Q的氨基酸为包含式I、式II或式III的相同结构的二取代的氨基酸。
在本发明的一些实施方案中，酰化的肽Q(例如胰高血糖素超家族肽、胰高血糖素相关肽；1、2、3、4或5类胰高血糖素相关肽，或者骨钙蛋白、降钙素、糊精或其类似物、衍生物或缀合物)在肽和酰基之间包含间隔区。在一些实施方案中，Q共价键合于间隔区，后者被共价键合于酰基。在一些示例性实施方案中，Q被修饰以通过酰化间隔区的胺、羟基或硫醇包含酰基，其间隔区(其中Q为胰高血糖素相关肽，例如1、2、3、4或5类)在胰高血糖素相关肽的10、20、24或29位(根据野生型胰高血糖素的氨基酸编号)或在C-末端氨基酸连接于氨基酸的侧链。间隔区被连接的肽Q的氨基酸可为包含允许连接于所述间隔区的部分的任何氨基酸。例如，包含侧链-NH2、-OH或-COOH的氨基酸(例如Lys、Orn、Ser、Asp或Glu)为合适的。包含侧链-NH2、-OH或-COOH的肽Q的氨基酸(例如单或双α-取代的氨基酸)(例如Lys、Orn、Ser、Asp或Glu)也为合适的。在其中Q为胰高血糖素相关肽(例如1、2、3、4或5类)的一些实施方案中，酰化的胰高血糖素相关肽可包含SEQ ID NO：1601的氨基酸序列、或其包含一个或多个本文描述的氨基酸修饰的被修饰的氨基酸序列，在10、20、24或29位(根据野生型胰高血糖素的氨基酸编号)对包含侧链胺、羟基或羧酸酯的任何氨基酸的至少一个氨基酸进行修饰。
在某些实施方案中，肽Q和酰基之间的间隔区是包含侧链胺、羟基或硫醇的氨基酸，或包含含有侧链胺、羟基或硫醇的氨基酸的二肽或三肽。在某些实施方案中，氨基酸间隔区并非γ-Glu。在某些实施方案中，二肽间隔区并非γ-Glu-γ-Glu。
当通过间隔区的氨基酸的胺基发生酰化时，所述酰化可通过氨基酸的α胺或侧链胺发生。在其中α胺被酰化的情况中，间隔区氨基酸可为任何氨基酸。例如，间隔区氨基酸可为疏水性氨基酸，例如Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Trp、Met、Phe、Tyr。在一些实施方案中，间隔区氨基酸可为例如疏水性氨基酸，例如Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Trp、Met、Phe、Tyr、6-氨基己酸、5-氨基戊酸、7-氨基庚酸、8-氨基辛酸。或者，间隔区氨基酸可为酸性残基，例如Asp和Glu。在其中间隔区氨基酸的侧链胺被酰化的情况中，间隔区氨基酸为包含侧链胺的氨基酸，例如式I的氨基酸(例如Lys或Orn)。在这种情况下，间隔区氨基酸的α胺和侧链胺两者被酰化是可能的，使得所述肽被二酰化。本发明的实施方案包括这样的二酰化的分子。
当酰化经间隔区氨基酸的羟基发生时，该氨基酸或二肽或三肽的一个氨基酸可为式II氨基酸。在特定的示例性实施方案中，氨基酸是Ser。
当酰化经间隔区氨基酸的硫醇基团发生时，该氨基酸或二肽或三肽的一个氨基酸可为式III氨基酸。在特定的示例性实施方案中，氨基酸是Cys。
在在一些实施方案中，间隔区包含亲水性双功能间隔区。在一个特别的实施方案中，间隔区包含氨基聚(烷氧基)羧酸酯。在这方面，间隔区可包含例如NH2(CH2CH2O)n(CH2)mCOOH，其中m为1-6的任何整数和n为2-12的任何整数，例如8-氨基-3，6-二氧杂辛酸，其可市售得自Peptides International，Inc.(Louisville，KY)。
在一些实施方案中，在肽Q和酰基之间的间隔区包含亲水性双功能间隔区。在某些实施方案中，亲水性双功能间隔区包含两个或更多个反应性基团，例如胺、羟基、硫醇和羧基或其任何组合。在某些实施方案中，亲水性双功能间隔区包含羟基和羧酸酯。在其它的实施方案中，亲水性双功能间隔区包含胺基和羧酸酯。在其它的实施方案中，亲水性双功能间隔区包含硫醇基和羧酸酯。
在一些实施方案中，在肽Q和酰基之间的间隔区为疏水性双功能间隔区。疏水性双功能间隔区为本领域已知的，参见例如Bioconjugate Techniques，G.T.Hermanson(Academic Press，San Diego，CA，1996)，其通过引用以其全文结合到本文中。在某些实施方案中，疏水性双功能间隔区包含两个或更多个反应性基团，例如胺、羟基、硫醇和羧基或其任何组合。在某些实施方案中，疏水性双功能间隔区包含羟基和羧酸酯。在其它的实施方案中，疏水性双功能间隔区包含胺基和羧酸酯。在其它的实施方案中，疏水性双功能间隔区包含硫醇基和羧酸酯。包含羧酸酯和羟基或硫醇基的合适的疏水性双功能间隔区为本领域已知的，并且包括例如8-羟基辛酸和8-巯基辛酸。
在一些实施方案中，双功能间隔区不为在羧酸酯基之间包含无支链的1-7个碳原子的亚甲基的二羧酸。在一些实施方案中，双功能间隔区为在羧酸酯基之间包含无支链的1-7个碳原子的亚甲基的二羧酸。
在其中Q为1类、2类或3类胰高血糖素相关肽的特别的实施方案中，间隔区(例如氨基酸、二肽、三肽、亲水性双功能间隔区或疏水性双功能间隔区)长度为3-10个原子(例如6-10个原子(例如6、7、8、9或10个原子)。在其中Q为1类、2类或3类胰高血糖素相关肽的更特别的实施方案中，间隔区长度为约3-10个原子(例如6-10个原子)，并且酰基为C12-C18脂肪酰基，例如C14脂肪酰基、C16脂肪酰基，使得间隔区和酰基的总长度为14-28个原子，例如约14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27或28个原子。在一些实施方案中，其中Q为1类、2类或3类胰高血糖素相关肽，间隔区和酰基的长度为17-28(例如19-26、19-21)个原子。
根据其中Q为1类、2类或3类胰高血糖素相关肽的某些实施方案，双功能间隔区可为合成或天然存在的氨基酸(包括但不限于本文描述的那些氨基酸中的任何一种)，这样的氨基酸包含长度为3-10个原子的氨基酸骨架(例如6-氨基己酸、5-氨基戊酸、7-氨基庚酸和8-氨基辛酸)。或者，连接于1类、2类或3类胰高血糖素相关肽的间隔区可为具有长度为3-10个原子(例如6-10个原子)的肽骨架的二肽或三肽间隔区。连接于1类、2类或3类胰高血糖素相关肽的二肽或三肽间隔区的每一个氨基酸，可与二肽或三肽的其它氨基酸相同或者不同，并可独立地选自：天然存在和/或非天然存在的氨基酸，包括例如天然存在的氨基酸(Ala、Cys、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp、Tyr)的D或L异构体中的任何一种，或者选自以下的非天然存在的氨基酸的任何D或L异构体：β-丙氨酸(β-Ala)、N-α-甲基-丙氨酸(Me-Ala)、氨基丁酸(Abu)、α-氨基丁酸(γ-Abu)、氨基己酸(ε-Ahx)、氨基异丁酸(Aib)、氨甲基吡咯羧酸、氨基哌啶羧酸、氨基丝氨酸(Ams)、氨基四氢吡喃-4-羧酸、精氨酸N-甲氧基-N-甲基酰胺、β-天冬氨酸(β-Asp)、氮杂环丁烷羧酸、3-(2-苯并噻唑基)丙氨酸、α-叔丁基甘氨酸、2-氨基-5-脲基-正戊酸(瓜氨酸，Cit)、β-环己基丙氨酸(Cha)、乙酰氨基甲基-半胱氨酸、二氨基丁酸(Dab)、二氨基丙酸(Dpr)、二羟基苯基丙氨酸(DOPA)、二甲基噻唑烷(DMTA)、γ-谷氨酸(γ-Glu)、高丝氨酸(Hse)、羟基脯氨酸(Hyp)、异亮氨酸N-甲氧基-N-甲基酰胺、甲基异亮氨酸(Melle)、异哌啶酸(Isn)、甲基亮氨酸(MeLeu)、甲基赖氨酸、二甲基赖氨酸、三甲基赖氨酸、甲醇基脯氨酸、蛋氨酸亚砜(Met(O))、蛋氨酸砜(Met(O2))、正亮氨酸(Nle)、甲基正亮氨酸(Me-Nle)、正缬氨酸(Nva)、鸟氨酸(Orn)、对-氨基苯甲酸(PABA)、青霉胺(Pen)、甲基苯丙氨酸(MePhe)、4-氯苯丙氨酸(Phe(4-Cl))、4-氟苯丙氨酸(Phe(4-F))、4-硝基苯丙氨酸(Phe(4-NO2))、4-氰基苯丙氨酸((Phe(4-CN))、苯基甘氨酸(Phg)、哌啶基丙氨酸、哌啶基甘氨酸、3，4-脱氢脯氨酸、吡咯烷基丙氨酸、肌氨酸(Sar)、硒代半胱氨酸(Sec)、O-苄基-磷酸丝氨酸、4-氨基-3-羟基-6-甲基庚酸(Sta)、4-氨基-5-环己基-3-羟基戊酸(ACHPA)、4-氨基-3-羟基-5-苯基戊酸(AHPPA)、1，2，3，4，-四氢异喹啉-3-羧酸(Tic)、四氢吡喃甘氨酸、噻吩基丙氨酸(Thi)、O-苄基-磷酸酪氨酸、O-磷酸酪氨酸、甲氧基酪氨酸、乙氧基酪氨酸、O-(双-二甲基氨基-膦酰)-酪氨酸、硫酸酪氨酸四丁基铵、甲基缬氨酸(MeVal)、1-氨基-1-环己烷羧酸(Acx)、氨基戊酸、β-环丙基丙氨酸(Cpa)、丙炔基甘氨酸(Prg)、烯丙基甘氨酸(Alg)、2-氨基-2-环己基-丙酸(2-Cha)、叔丁基甘氨酸(Tbg)、乙烯基甘氨酸(Vg)、1-氨基-1-环丙烷羧酸(Acp)、1-氨基-1-环戊烷羧酸(Acpe)、烷基化3-巯基丙酸、1-氨基-1-环丁烷羧酸(Acb)。
在其中Q为1类、2类或3类胰高血糖素相关肽的一些实施方案中，间隔区包含总负电荷，例如包含1或2个荷负电的氨基酸。在其中Q为1类、2类或3类胰高血糖素相关肽的一些实施方案中，二肽不为任何一种通用结构A-B的二肽，其中A选自Gly、Gln、Ala、Arg、Asp、Asn、Ile、Leu、Val、Phe和Pro，其中B选自Lys、His、Trp。在其中Q为1类、2类或3类胰高血糖素相关肽的一些实施方案中，二肽间隔区选自Ala-Ala、β-Ala-β-Ala、Leu-Leu、Pro-Pro、γ-氨基丁酸-γ-氨基丁酸和γ-Glu-γ-Glu。
肽Q可通过酰化长链烷烃进行修饰以包含酰基。在具体的方面，长链烷烃包含与肽Q的羧基或其活化形式反应的胺、羟基或硫醇基(例如十八烷基胺、十四醇和十六烷硫醇)。Q的羧基或其活化形式可为Q的氨基酸(例如谷氨酸、天冬氨酸)侧链的部分，或者可为肽骨架的部分。
在某些实施方案中，肽Q通过用连接于Q的间隔区酰化长链烷烃进行修饰以包含酰基。在具体的方面，长链烷烃包含与间隔区的羧基或其活化形式反应的胺、羟基或硫醇基。包含羧基或其活化形式的合适间隔区在本文中描述，并且包括例如双功能间隔区，例如氨基酸、二肽、三肽、亲水性双功能间隔区和疏水性双功能间隔区。
如本文用的术语“羧基的活化形式”指带通式R(C＝O)X的羧基，其中X是离去基团和R是Q或间隔区。例如，羧基的活化形式可包括，但不限于，酰氯、酐和酯。在某些实施方案中，活化羧基为带N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)离去基团的酯。
关于本发明的这些方面，其中长链烷烃被肽Q或间隔区酰化，长链烷烃可具有任何大小并可包含任何长度的碳链。长链烷烃可为直链或支链的。在某些方面，长链烷烃为C4-C30烷烃。例如长链烷烃可为C4烷烃、C6烷烃、C8烷烃、C10烷烃、C12烷烃、C14烷烃、C16烷烃、C18烷烃、C20烷烃、C22烷烃、C24烷烃、C26烷烃、C28烷烃或C30烷烃中的任何一种。在一些实施方案中，长链烷烃包含C8-C20烷烃，例如C14烷烃、C16烷烃或C18烷烃。
在一些实施方案中，Q的胺、羟基或硫醇基用胆固醇酸进行酰化。在特别的实施方案中，肽通过烷基化的脱氨基Cys间隔区，即烷基化的3-巯基丙酸间隔区连接于胆固醇酸。
经胺、羟基和硫醇酰化肽的适用的方法为本领域所知。参见，例如，Miller，Biochem Biophys Res Commun 218：377-382(1996)；Shimohigashi和Stammer，Int J Pept Protein Res 19：54-62(1982)；和Previero等，Biochim Biophys Acta 263：7-13(1972)(关于经羟基酰化的方法)；和San and Silvius，J Pept Res 66：169-180(2005)(关于经硫醇酰化的方法)；Bioconjugate Chem.″蛋白的化学修饰：历史和应用(Chemical Modifications of Proteins：History and Applications″1，2-12页(1990)；Hashimoto等，Pharmacuetical Res.″胰岛素棕榈酰衍生物的合成及其生物活性(Synthesis of Palmitoyl Derivatives of Insulin andtheir Biological Activity)″第6卷，2期171-176页(1989)。
酰化的肽Q的酰基可具有任何大小，例如任何长度的碳链，并可为直链或支链的。在本发明的一些特别的实施方案中，酰基为C4-C30脂肪酸。例如酰基可为C4脂肪酸、C6脂肪酸、C8脂肪酸、C10脂肪酸、C12脂肪酸、C14脂肪酸、C16脂肪酸、C18脂肪酸、C20脂肪酸、C22脂肪酸、C24脂肪酸、C26脂肪酸、C28脂肪酸或C30脂肪酸中的任何一种。在一些实施方案中，酰基为C8-C20脂肪酸，例如C14脂肪酸或C16脂肪酸。
在备选的实施方案中，酰基为胆汁酸。胆汁酸可为任何合适的胆汁酸，包括但不限于胆酸、鹅去氧胆酸、去氧胆酸、石胆酸、牛磺胆酸、甘氨胆酸和胆固醇酸。
本文描述的酰化的肽Q可被进一步修饰以包含亲水性部分。在一些特别的实施方案中，亲水性部分可包含聚乙二醇(PEG)链。加入亲水性部分可通过任何合适的手段，例如任何一种本文描述的方法实现。在一些涉及1、2、3、4或5类胰高血糖素相关肽的实施方案中，酰化的胰高血糖素相关肽可包含包括本文描述的任何一种修饰的SEQ ID NO：1601，其中在10、20、24或29位(根据野生型胰高血糖素的氨基酸编号)的至少一个氨基酸包含酰基，并且在16、17、21、24或29位(根据野生型胰高血糖素的氨基酸编号)、C-末端延伸中的位置的至少一个氨基酸，或者C-末端氨基酸被修饰为Cys、Lys、Orn、同型-Cys或Ac-Phe，并且氨基酸的侧链被共价键合于亲水性部分(例如PEG)。在一些涉及1、2、3、4或5类胰高血糖素相关肽的实施方案中，酰基任选地通过包含Cys、Lys、Orn、同型-Cys或Ac-Phe的间隔区被连接于10位(根据野生型胰高血糖素的氨基酸编号)，并且亲水性部分在24位的Cys残基加入。
作为选择，酰化的肽(Q)可包含间隔区，其中间隔区被酰化和修饰以包含亲水性部分。合适的间隔区的非限制性实例包括包含一个或多个选自Cys、Lys、Orn、同型-Cys和Ac-Phe的氨基酸的间隔区。Q的烷基化
在一些实施方案中，Q被修饰以包含烷基。烷基可共价直接连接于肽Q的氨基酸，或者经间隔区间接连接于Q的氨基酸，其中所述间隔区位于Q的氨基酸与烷基之间。烷基可例如经醚、硫醚或氨基键被连接Q。Q可在其中连接亲水性部分的相同氨基酸位置或在不同的氨基酸位置被烷基化。如本文描述的那样，Q可为胰高血糖素超家族肽、胰高血糖素相关肽，包括1、2、3、4或5类胰高血糖素相关肽，或者为骨钙蛋白、降钙素、糊精或其类似物、衍生物或缀合物。例如，Q可为1类、2类或3类胰高血糖素相关肽，并可包含为非原生-天然存在的氨基酸的烷基。
烷基化可在Q中的任何位置实施。当Q为胰高血糖素相关肽时，烷基化可发生在包括1-29位的任何位置、C-末端延伸中的位置或C-末端氨基酸的任何位置，条件是在烷基化时保留未烷基化的肽对胰高血糖素、GLP-1、GIP或其它胰高血糖素相关肽受体的激动剂活性。在一些实施方案中，如果未烷基化的肽具有胰高血糖素激动剂活性，那么烷基化的肽保留胰高血糖素激动剂活性。在一些实施方案中，如果未烷基化的肽具有GLP-1激动剂活性，那么烷基化的肽保留GLP-1激动剂活性。非限制性实例包括在5、7、10、11、12、13、14、16、17、18、19、20、21、24、27、28或29位(根据野生型胰高血糖素的氨基酸编号)的烷基化。关于1类、2类和3类胰高血糖素相关肽，烷基化可发生于5、7、10、11、12、13、14、16、17、18、19、20、21、24、27、28、29、30、37、38、39、40、41、42或43位(根据野生型胰高血糖素的氨基酸编号)。关于胰高血糖素相关肽(例如1、2、3、4或5类)的其它非限制性实例包括在10位(根据野生型胰高血糖素的氨基酸编号)的烷基化，和在胰高血糖素肽的C-末端部分中的一个或多个位置例如，位置24、28或29(根据野生型胰高血糖素的氨基酸编号)、C-末端延伸段内或在C-末端(例如，通过添加C-末端Cys)上的聚乙二醇化。
在本发明的一个特定的方面，肽Q(例如胰高血糖素超家族肽、胰高血糖素相关肽；1、2、3、4或5类胰高血糖素相关肽，或者骨钙蛋白、降钙素、糊精或其类似物、衍生物或缀合物)被修饰，以通过直接烷基化Q的氨基酸侧链的胺、羟基或硫醇包含烷基。在一些实施方案中，Q通过氨基酸的侧链胺、羟基或硫醇被直接烷基化。在一些实施方案中，其中Q为胰高血糖素相关肽，烷基化在10、20、24或29位(根据野生型胰高血糖素的氨基酸编号)进行。在这方面，烷基化的胰高血糖素相关肽可包含SEQ ID NO：1601的氨基酸序列、或其包含本文描述的一个或多个氨基酸修饰的被修饰的氨基酸序列，在10、20、24和29位(根据野生型胰高血糖素的氨基酸编号)对包含侧链胺、羟基或硫醇的任何氨基酸的至少一个氨基酸进行修饰。在本发明的一些特别的实施方案中，其中Q为胰高血糖素相关肽，通过10位(根据野生型胰高血糖素的氨基酸编号)氨基酸的侧链胺、羟基或硫醇发生Q的直接烷基化。
在一些实施方案中，包含侧链胺的肽Q(例如胰高血糖素超家族肽、胰高血糖素相关肽；1、2、3、4或5类胰高血糖素相关肽，或者骨钙蛋白、降钙素、糊精或其类似物、衍生物或缀合物)的氨基酸为式I的氨基酸。在某些示例性实施方案中，式I氨基酸为其中n是4的氨基酸(Lys)或n是3的氨基酸(Orn)。
在其它实施方案中，包含侧链羟基的肽Q的氨基酸为式II氨基酸。在某些示例性实施方案中，式II氨基酸是其中n是1的氨基酸(Ser)。
在其它实施方案中，包含侧链硫醇的肽Q的氨基酸为式III氨基酸。在某些示例性实施方案中，式II氨基酸为其中n是1的氨基酸(Cys)。
在另外的其它实施方案中，除了键合于式I、式II或式III氨基酸的α碳的氢用第二个侧链替代外，包含侧链胺、羟基或硫醇的肽Q的氨基酸为包含式I、式II或式III的相同结构的二取代氨基酸。
在本发明的一些实施方案中，烷基化的肽Q(例如胰高血糖素超家族肽、胰高血糖素相关肽；1、2、3、4或5类胰高血糖素相关肽，或者骨钙蛋白、降钙素、糊精或其类似物、衍生物或缀合物)在肽和烷基之间包含间隔区。在一些实施方案中，Q共价键合于间隔区，后者被共价键合于烷基。在一些示例性实施方案中，Q被修饰以通过烷基化间隔区的胺、羟基或硫醇包含烷基，其间隔区(其中Q为胰高血糖素相关肽，例如1、2、3、4或5类)在Q的10、20、24或29位(根据野生型胰高血糖素的氨基酸编号)连接于氨基酸的侧链。间隔区被连接的肽Q的氨基酸可为包含允许连接于所述间隔区的部分的任何氨基酸。间隔区被连接的肽Q的氨基酸可为包含允许连接于所述间隔区的部分的任何氨基酸(例如单α-取代的氨基酸或α，α-二取代的氨基酸)。包含侧链-NH2、-OH或-COOH的肽Q的氨基酸(例如Lys、Orn、Ser、Asp或Glu)为合适的。在其中Q为胰高血糖素相关肽(例如1、2、3、4或5类)的一些实施方案中，烷基化的Q可包含SEQ ID NO：1601的氨基酸序列、或其包含一个或多个本文描述的氨基酸修饰的被修饰的氨基酸序列，其中位置10、20、24和29(根据野生型胰高血糖素的氨基酸编号)上的至少一个氨基酸被修饰为包含侧链胺、羟基或羧酸酯的氨基酸。
在一些实施方案中，在肽Q和烷基之间的间隔区为包含侧链胺、羟基或硫醇的氨基酸，或者为包含含有侧链胺、羟基或硫醇的氨基酸的二肽或三肽。在一些实施方案中，氨基酸间隔区不为γ-Glu。在一些实施方案中，二肽间隔区不为γ-Glu-γ-Glu。
当通过间隔区的氨基酸的胺基发生烷基化时，所述烷基化可通过氨基酸的α胺或侧链胺发生。在其中α胺被烷基化的情况中，间隔区氨基酸可为任何氨基酸。例如，间隔区氨基酸可为疏水性氨基酸，例如，Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Trp、Met、Phe、Tyr。作为选择，间隔区氨基酸可为酸性残基，例如，Asp和Glu。在示例性实施方案中，间隔区氨基酸可为疏水氨基酸，例如，Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Trp、Met、Phe、Tyr、6-氨基己酸、5-氨基戊酸、7-氨基庚酸、8-氨基辛酸。作为选择，间隔区氨基酸可为酸性残基，例如Asp和Glu，条件是烷基化发生于酸性残基的α胺。在其中间隔区氨基酸的侧链胺被烷基化的情况中，间隔区氨基酸为包含侧链胺的氨基酸，例如式I的氨基酸(例如Lys或Orn)。在这种情况下，间隔区氨基酸的α胺和侧链胺两者被烷基化是可能的，使得所述肽被二烷基化。本发明的实施方案包括这样的二烷基化的分子。
当通过间隔区的氨基酸的羟基发生烷基化时，氨基酸或者间隔区的一个氨基酸可为式II的氨基酸。在一个特别的示例性实施方案中，氨基酸为Ser。
当通过间隔区的氨基酸的硫醇基发生烷基化时，氨基酸或者间隔区的一个氨基酸可为式III的氨基酸。在一个特别的示例性实施方案中，氨基酸为Cys。
在一些实施方案中，间隔区包含亲水性双功能间隔区。在一个特别的实施方案中，间隔区包含氨基聚烷氧基羧酸酯。在这方面，间隔区可包含例如NH2(CH2CH2O)n(CH2)mCOOH，其中m为1-6的任何整数和n为2-12的任何整数，例如8-氨基-3，6-二氧杂辛酸，其可市售得自Peptides International，Inc.(Louisville，KY)。
在一些实施方案中，在肽Q和烷基之间的间隔区为亲水性双功能间隔区。在某些实施方案中，亲水性双功能间隔区包含两个或更多个反应性基团，例如胺、羟基、硫醇和羧基或其任何组合。在某些实施方案中，亲水性双功能间隔区包含羟基和羧酸酯。在其它的实施方案中，亲水性双功能间隔区包含胺基和羧酸酯。在其它的实施方案中，亲水性双功能间隔区包含硫醇基和羧酸酯。
在一些实施方案中，在肽Q和烷基之间的间隔区为疏水性双功能间隔区。在某些实施方案中，疏水性双功能间隔区包含两个或更多个反应性基团，例如胺、羟基、硫醇和羧基或其任何组合。在某些实施方案中，疏水性双功能间隔区包含羟基和羧酸酯。在其它的实施方案中，疏水性双功能间隔区包含胺基和羧酸酯。在其它的实施方案中，疏水性双功能间隔区包含硫醇基和羧酸酯。包含羧酸酯和羟基或硫醇基的合适的疏水性双功能间隔区为本领域已知的，并且包括例如8-羟基辛酸和8-巯基辛酸。
在其中Q为1类、2类或3类胰高血糖素相关肽的特别的实施方案中，间隔区(例如氨基酸、二肽、三肽、亲水性双功能间隔区或疏水性双功能间隔区)长度为3-10个原子(例如6-10个原子(例如6、7、8、9或10个原子))。在更特别的实施方案中，连接于1类、2类或3类胰高血糖素相关肽的间隔区长度为约3-10个原子(例如6-10个原子)，并且烷基为C12-C18烷基，例如C14烷基、C16烷基，使得间隔区和烷基的总长度为14-28个原子，例如，约14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27或28个原子。在Q是1类、2类或3类胰高血糖素相关肽的某些实施方案中，间隔区和烷基的长度为17-28(例如，19-26、19-21)个原子。
根据其中Q为1类、2类或3类胰高血糖素相关肽的某些上述实施方案，双功能间隔区可为合成或非天然存在的氨基酸，其包含长度为3-10个原子的氨基酸骨架(例如6-氨基己酸、5-氨基戊酸、7-氨基庚酸和8-氨基辛酸)。或者，连接于1类、2类或3类胰高血糖素相关肽的间隔区可为具有长度为3-10个原子(例如6-10个原子)的肽骨架的二肽或三肽间隔区。连接于1类、2类或3类胰高血糖素相关肽的二肽或三肽间隔区可由天然存在和/或非天然存在的氨基酸组成，这些氨基酸包括例如本文讲授的任何氨基酸。在其中Q为1类、2类或3类胰高血糖素相关肽的一些实施方案中，间隔区包含总体负电荷，例如包含1或2个荷负电的氨基酸。在其中Q为1类、2类或3类胰高血糖素相关肽的一些实施方案中，二肽间隔区选自Ala-Ala、β-Ala-β-Ala、Leu-Leu、Pro-Pro、γ-氨基丁酸-γ-氨基丁酸和γ-Glu-γ-Glu。在一些实施方案中，二肽间隔区不为γ-Glu-γ-Glu。
肽经氨、羟基和硫醇进行烷基化的合适方法为本领域已知的。例如Williamson醚合成可用于在胰高血糖素相关肽和烷基之间形成醚键。而且，肽与烷基卤化物的亲核取代反应可导致形成醚、硫醚或氨基键中的任何一种。
烷基化的肽Q的烷基可具有任何大小，例如任何长度的碳链，并可为直链或支链的。在本发明的一些特别的实施方案中，烷基为C4-C30烷基。例如烷基可为C4烷基、C6烷基、C8烷基、C10烷基、C12烷基、C14烷基、C16烷基、C18烷基、C20烷基、C22烷基、C24烷基、C26烷基、C28烷基或C30烷基中的任何一种。在一些实施方案中，烷基为C8-C20烷基，例如C14烷基或C16烷基。
在一些特定的实施方案中，烷基包含以下胆汁酸的甾体部分，例如胆酸、鹅去氧胆酸、去氧胆酸、石胆酸、牛磺胆酸、甘氨胆酸和胆固醇酸。
在本发明的一些实施方案中，肽Q通过使亲核的长链烷烃与Q反应进行修饰以包含烷基，其中Q包含适合于亲核的取代的离去基团。在具体的方面，长链烷烃的亲和性基团包含胺、羟基或硫醇基(例如十八烷基胺、十四醇和十六烷硫醇)。Q的离去基团可为氨基酸侧链的部分，或者可为肽骨架的部分。合适的离去基团包括例如N-羟基琥珀酰亚胺、卤素和磺酸酯。
在某些实施方案中，肽Q通过使核的长链烷烃与被连接于Q的间隔区反应进行修饰以包含烷基，其中间隔区包含离去基团。在具体的方面，长链烷烃包含胺、羟基或硫醇基。在某些实施方案中，包含离去基团的间隔区可为本文讨论的任何间隔区，例如进一步包含合适的离去基团的氨基酸、二肽、三肽、亲水性双功能间隔区和疏水性双功能间隔区。
关于其中长链烷烃用肽Q或间隔区烷基化的本发明的这些方面，长链烷烃可具有任何大小并可包含任何长度的碳链。长链烷烃可为直链或支链的。在某些方面，长链烷烃为C4-C30烷烃。例如长链烷烃可为C4烷烃、C6烷烃、C8烷烃、C10烷烃、C12烷烃、C14烷烃、C16烷烃、C18烷烃、C20烷烃、C22烷烃、C24烷烃、C26烷烃、C28烷烃或C30烷烃中的任何一种。在其中胰高血糖素相关肽为1类、2类或3类胰高血糖素相关肽的一些实施方案中，长链烷烃包含C8-C20烷烃，例如C14烷烃、C16烷烃或C18烷烃。
而且，在一些实施方案中，烷基化可发生于Q和胆固醇部分之间。例如，胆固醇的羟基可替代长链烷烃上的离去基团，以形成胆固醇-胰高血糖素肽产物。
本文描述的烷基化的肽(Q)可被进一步修饰以包含亲水性部分。在一些特定的实施方案中，亲水性部分可包含聚乙二醇(PEG)链。加入亲水性部分可通过任何合适的手段，例如任何一种本文描述的方法实现。在一些涉及1、2、3、4或5类胰高血糖素相关肽的实施方案中，烷基化的Q可包含SEQ ID NO：1601、或其包含一种或多种本文描述的氨基酸修饰的被修饰的氨基酸序列，其中在10、20、24和29位(根据野生型胰高血糖素的氨基酸编号)的至少一个氨基酸包含烷基，并且在16、17、21、24或29位、C-末端延伸中的位置的至少一个氨基酸，或者C-末端氨基酸被修饰为Cys、Lys、Orn、同型-Cys或Ac-Phe，并且氨基酸的侧链被共价键合于亲水性部分(例如PEG)。在一些涉及1、2、3、4或5类胰高血糖素相关肽的实施方案中，烷基任选地通过包含Cys、Lys、Orn、同型-Cys或Ac-Phe的间隔区被连接于10位(根据野生型胰高血糖素的氨基酸编号)，并且亲水性部分在24位的Cys残基处加入。
作为选择，烷基化的肽(Q)可包含间隔区，其中间隔区被烷基化和修饰以包含亲水性部分。合适的间隔区的非限制性实例包括包含一个或多个选自Cys、Lys、Orn、同型-Cys和Ac-Phe的氨基酸的间隔区。
α-螺旋结构的稳定
在某些实施方案中，在两个氨基酸侧链之间形成分子内桥，以稳定1、2、3、4或5类胰高血糖素相关肽Q的羧基末端部分(例如氨基酸12-29(根据野生型胰高血糖素的氨基酸编号))的三维结构。两个氨基酸侧链可通过氢键、离子相互作用例如形成盐桥，或者通过共价键相互连接。
在一些实施方案中，在相距3个氨基酸的两个氨基酸之间，例如在i和i+4位的氨基酸之间形成分子内桥，其中i为根据野生型胰高血糖素的氨基酸编号在12-25之间的任何整数(例如12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24和25)。更具体地讲，根据野生型胰高血糖素的氨基酸编号的氨基酸对12和16、16和20、20和24或24和28(其中i＝12、16、20或24的氨基酸对)的侧链相互连接，并因此稳定胰高血糖素α-螺旋。或者i可为17。
在一些特定的实施方案中，其中在i和i+4位的氨基酸通过分子内桥连接，连接基的大小为约8个原子或约7-9个原子。
在其它的实施方案中，在相距2个氨基酸的两个氨基酸之间，例如在j和j+3位的氨基酸之间形成分子内桥，其中j为根据野生型胰高血糖素的氨基酸编号在12-26之间的任何整数(例如12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25和26)。在一些特定的实施方案中，j为17。
在一些特定的实施方案中，其中在j和j+3位的氨基酸通过分子内桥连接，连接基的大小为约6个原子或约5-7个原子。
在另外的其它实施方案中，在相距6个氨基酸的两个氨基酸之间，例如在k和k+7位的氨基酸之间形成分子内桥，其中k为根据野生型胰高血糖素的氨基酸编号在12-22之间的任何整数(例如12、13、14、15、16、17、18、19、20、21和22)。在一些特定的实施方案中，k为12、13或17。在示例性实施方案中，k为17。
能够共价键合形成6原子连接桥的氨基酸配对的实例包括Orn和Asp、Glu和式I的氨基酸，其中n为2，和高谷氨酸和式I的氨基酸，其中n为1，其中式I为：
其中n＝1-4
[式I]
能够共价键合形成7原子连接桥的氨基酸配对的实例包括Orn-Glu(内酰胺环)、Lys-Asp(内酰胺)或高丝氨酸-高谷氨酸(内酯)。可形成8原子连接基的氨基酸配对的实例包括Lys-Glu(内酰胺)、高赖氨酸-Asp(内酰胺)、Orn-高谷氨酸(内酰胺)、4-氨基Phe-Asp(内酰胺)或Tyr-Asp(内酯)。可形成9原子连接基的氨基酸配对的实例包括高赖氨酸-Glu(内酰胺)、Lys-高谷氨酸(内酰胺)、4-氨基Phe-Glu(内酰胺)或Tyr-Glu(内酯)。这些氨基酸上的任何侧链可另外地用另外的化学基团取代，只要不破坏α-螺旋的三维结构。本领域的普通技术人员可设想备选的配对或备选的氨基酸类似物，包括产生相似大小的稳定结构和要求的作用的化学修饰的衍生物。例如，同型半胱氨酸-同型半胱氨酸二硫键桥为长度6个原子，并可被进一步修饰以提供要求的作用。即使没有共价键，以上描述的氨基酸配对或者本领域普通技术人员可设想的类似配对，也可通过非共价键，例如通过形成盐桥或氢键相互作用，提供增加的α-螺旋的的稳定性。
内酰胺环的大小可依氨基酸侧链的长度而变化，并且在一些实施方案中通过连接赖氨酸氨基酸的侧链与谷氨酸侧链形成内酰胺。其它的示例性实施方案(根据野生型胰高血糖素的氨基酸编号)包括任选地具有内酰胺桥的以下配对：12位的Glu与16位的Lys；12位的原生Lys与16位的Glu；16位的Glu与20位的Lys；16位的Lys与20位的Glu；20位的Glu与24位的Lys；20位的Lys与24位的Glu；24位的Glu与28位的Lys；24位的Lys与28位的Glu。或者，内酰胺环中的酰胺键顺序可以翻转(例如内酰胺环可在Lys12与Glu16或者在Glu12与Lys16的侧链之间形成)。
分子内桥(而并非内酰胺桥)可用于稳定Q的α-螺旋。在一些实施方案中，分子内桥为疏水桥。在这种情况下，分子内桥任选地在为Q的α-螺旋疏水面部分的两个氨基酸的侧链之间。例如，通过疏水桥连接的氨基酸中的一个可为在10、14和18位(根据野生型胰高血糖素的氨基酸编号)的氨基酸。
在一个特定的方面，烯烃复分解反应用于使用全烃交联***交联Q的α-螺旋的一个或两个转折。Q在这种情况下可包含具有不同长度的烯属侧链和在i和i+4或i+7位具有或者R或者S立体化学构型的α-甲基化氨基酸。例如烯属侧链可包含(CH2)n，其中n为1-6之间的任何整数。在一些实施方案中，对于8个原子的交联长度n为3。形成这样的分子内桥的合适方法在本领域中有描述。参见例如Schafmeister et al.，J.Am.Chem.Soc.122：5891-5892(2000)和Walensky et al.，Science 305：1466-1470(2004)。或者，Q可包含位于邻近螺旋转折的O-烯丙基Ser残基，其经钌催化的闭环复分解反应而被桥接在一起。这样的交联方法描述于例如Blackwell等，Angew，Chem.，Int.Ed.37：3281-3284(1998)。
在另一个特定的方面，使用非天然的硫代二丙氨酸氨基酸、羊毛硫氨酸(其已被广泛采纳为胱氨酸的肽模拟物)，用于交联α-螺旋的一个转折。基于羊毛硫氨酸环合的合适方法为本领域已知的。参见例如Matteucci等，Tetrahedron Letters 45：1399-1401(2004)；Mayer等，J.肽Res.51：432-436(1998)；Polinsky等，J.Med.Chem.35：4185-4194(1992)；Osapay等，J.Med.Chem.40：2241-2251(1997)；Fukase等，Bull.Chem.Soc.Jpn.65：2227-2240(1992)；Harpp等，J.Org.Chem.36：73-80(1971)；Goodman和Shao，Pure Appl.Chem.68：1303-1308(1996)；和Osapay和Goodman，J.Chem.Soc.Chem.Commun.1599-1600(1993)。
在一些实施方案中，在i和i+7位的两个Glu残基之间的α，ω-二氨基烷烃系链例如1，4-二氨基丙烷和1，5-二氨基戊烷用于稳定Q的α螺旋。这样的系链导致形成依二氨基烷烃系链的长度而定的长度为9个原子或者更多的桥。产生与这样的系链交联的肽的合适方法在本领域有描述。参见例如，Phelan等，J.Am.Chem.Soc.119：455-460(1997)。
在本发明的仍然另一个实施方案中，二硫桥键用于交联Q的α-螺旋的一个或两个转折。或者，其中一个或两个硫原子被亚甲基替代导致形成等排大环化的修饰的二硫桥键用于稳定Q的α螺旋。用二硫桥键或基于硫的环化修饰肽的合适方法描述于例如，Jackson等，J.Am.Chem.Soc.113：9391-9392(1991)及RudingerJost，Experientia20：570-571(1964)中。
在又一个实施方案中，通过用位于i和i+4的两个His残基或者His和Cys对键合金属原子来稳定Q的α螺旋。金属原子可为例如Ru(III)、Cu(II)、Zn(II)或Cd(II)。基于金属键合的α-螺旋稳定的合适方法为本领域已知的，参见例如，Andrews和Tabor，Tetrahedron 55：11711-11743(1999)；Ghadiri等，J.Am.Chem.Soc.112：1630-1632(1990)；和Ghadiri等，J.Am.Chem.Soc.119：9063-9064(1997)。
作为选择，Q的α-螺旋可通过其它的肽环化方法来稳定，该方法于Davies，J.Peptide.Sci.9：471-501(2003)中有评述。α螺旋可通过形成酰胺桥、硫醚桥、硫代酸酯桥、脲桥、氨基甲酸酯桥、磺酰胺桥等而被稳定。例如，可在Cys残基的C-末端和侧链之间形成硫代酸酯桥。作为选择，通过具有硫醇的氨基酸(Cys)的侧链和羧酸(例如Asp、Glu)可形成硫代酸酯。在另一种方法中，交联剂例如二羧酸，例如软木酸(suberic acid)(辛二酸)等可在氨基酸侧链的两个官能团例如游离氨基、羟基、硫醇基及其组合之间引入连接。
根据一些实施方案，通过在i和i+4位引入疏水性氨基酸稳定Q的α-螺旋。例如，i可为Tyr和i+4可为或者Val或者Leu；i可为Phe和i+4可为Cys或Met；i可为Cys和i+4可为Met；或者i可为Phe和i+4可为Ile。应该理解，为了本文的目的，以上氨基酸配对可翻转，使得所指明的i位氨基酸或者可位于i+4，而i+4氨基酸可位于i位。
根据本发明的其它实施方案，其中Q为胰高血糖素相关肽，α螺旋通过在Q的C-末端部分(根据野生型胰高血糖素的氨基酸编号的编号为约氨基酸12-29)引入(通过氨基酸取代或***)一个或多个稳定α-螺旋的氨基酸来稳定。在一个特别的实施方案中，稳定α-螺旋的氨基酸为α，α-二取代的氨基酸，α，α-二取代的氨基酸包括但不限于氨基异丁酸(Aib)、二取代氨基酸中的任何一种，这种二取代氨基酸用选自甲基、乙基、丙基和正丁基相同或不同基团，或用环辛烷或环庚烷(例如1-氨基环辛烷-1-羧酸)二取代。在一些实施方案中，胰高血糖素相关肽的16、17、18、19、20、21、24或29位中的1、2、3、4或更多个位置用α，α-二取代的氨基酸取代。在一个特别的实施方案中，16、20、21和24位中的1、2、3个或全部位置用Aib取代。
缀合物
在一些实施方案中，本文描述的肽(Q)被糖基化、酰胺化、羧基化、磷酸化、酯化、N-酰化、通过例如二硫桥键环化、或者转化为盐(例如酸加成盐、碱加成盐)和/或任选地二聚、多聚或聚合或者缀合。如本文描述的那样，Q可为胰高血糖素超家族肽、胰高血糖素相关肽，包括1、2、3、4或5类胰高血糖素相关肽，或者为骨钙蛋白、降钙素、糊精或其类似物、衍生物或缀合物。
本公开也包括其中Q-L-Y的Q进一步连接于异源部分的缀合物。在Q与异源部分之间的缀合可通过共价键合、非共价键合(例如静电相互作用、氢键、范德华相互作用、盐桥、疏水相互作用等)或者两种类型的键合。可使用各种非共价偶合***，包括生物素-亲和素、配体/受体、酶/底物、核酸/核酸结合蛋白、脂质/脂质结合蛋白、细胞粘附分子伴侣；或者任何结合伴侣或其彼此具有亲和性的碎片。在一些方面，共价键为肽键。Q与异源部分的缀合可为间接或直接的缀合，其前者可包含连接基团或间隔区。合适的连接基和间隔区为本领域已知的，并且包括但不限于本文在章节“酰化和烷基化”和“连接基团”和在小节“Q和/或L的化学修饰”中描述的任何连接基团或间隔区。
本文使用的术语“异源部分”与术语“缀合部分”同义，并且指的是与其连接的Q不同的任何分子(化学或生物化学的、天然存在或非编码的)。可连接于Q的示例性缀合部分包括但不限于异源的肽或多肽(包括例如血浆蛋白)、靶向剂、免疫球蛋白或其部分(例如可变区、CDR或Fc区)；诊断标记物例如放射性同位素、荧光团或酶标记物；包括水溶性聚合物的聚合物、或者其它的治疗或诊断剂。在一些实施方案中，提供包含Q和血浆蛋白的缀合物，其中血浆蛋白选自白蛋白、转铁蛋白、纤维蛋白原和球蛋白。在一些实施方案中，缀合物的血浆蛋白部分为白蛋白或转铁蛋白。在一些实施方案中，缀合物包含Q和一种或多种以下物质：多肽、核酸分子、抗体或其碎片、聚合物、量子点、小分子、毒素、诊断试剂、碳水化合物、氨基酸。
C-末端异源部分
在一些实施方案中，缀合于Q的异源部分为不同于Q的肽，并且缀合物为融合肽或嵌合肽。在一些实施方案中，其中Q为胰高血糖素超家族肽，异源部分为1-21个氨基酸的肽延伸。在特别的实施方案中，其中Q为胰高血糖素相关肽(例如1、2、3、4或5类胰高血糖素相关肽)，延伸连接于Q的C-末端，例如连接于29位的氨基酸。在一些实施方案中，延伸包含以下氨基酸序列：SEQ ID NO：1610(GPSSGAPPPS)，SEQ ID NO：1611(GGPSSGAPPPS-CONH2)、SEQ IDNO：1614(KRNRNNIA)、SEQ ID NO：1643(KRNR)或KGKKNDWKHNITQ(SEQ ID NO：1613)。在特定的方面，氨基酸序列通过Q的C-末端氨基酸例如29位的氨基酸连接。在一些实施方案中，SEQ ID NOs：1610、1611、1613、1614和1643的氨基酸序列通过肽键键合于肽的氨基酸29。在一些特定的实施方案中，胰高血糖素相关肽(例如1、2、3、4或5类胰高血糖素相关肽)的29位的氨基酸为Gly，并且Gly融合于SEQ ID NOs：1610、1611、1613、1614和1643中的一个氨基酸序列。
聚合物异源部分
在某些实施方案中，结合至Q的异源部分是聚合物。在某些实施方案中，聚合物选自：聚酰胺、聚碳酸酯、聚亚烷基及其衍生物包括聚亚烷基二醇、聚环氧烷、聚对苯二甲酸亚烷基酯、丙烯酸酯和甲基丙烯酸酯的聚合物包括聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(甲基丙烯酸乙酯)、聚(甲基丙烯酸丁酯)、聚(甲基丙烯酸异丁酯)、聚(甲基丙烯酸己酯)、聚(甲基丙烯酸异癸酯)、聚(甲基丙烯酸月桂酯)、聚(甲基丙烯酸苯酯)、聚(丙烯酸甲酯)、聚(丙烯酸异丙酯)、聚(丙烯酸异丁酯)和聚(丙烯酸十八烷基酯)、聚乙烯聚合物包括聚乙烯醇、聚乙烯醚、聚乙烯酯类、聚卤代乙烯、聚(乙烯基乙酸酯)和聚乙烯吡咯烷酮、聚乙交酯、聚硅氧烷、聚氨基甲酸酯和它们的共聚物纤维素，包括烷基纤维素、羟基烷基纤维素、纤维素醚、纤维素酯、硝基纤维素、甲基纤维素、乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羟丁基甲基纤维素、醋酸纤维素、丙酸纤维素、醋酸丁酸纤维素、邻苯二甲酸乙酸纤维素、羧乙基纤维素、三乙酸纤维素和硫酸纤维素钠盐；聚丙烯、聚乙烯，包括聚(乙二醇)、聚(环氧乙烷)和聚(对苯二甲酸乙二酯)和聚苯乙烯。
在一些方面，聚合物是可生物降解的聚合物，包括合成的可生物降解的聚合物(例如，乳酸和乙醇酸的聚合物、聚酐、聚(原酸)酯、聚氨基甲酸酯、聚(布狄克酸)(poly(butic acid))、聚(戊酸)和聚(丙交酯-共己内酯))和天然的可生物降解的聚合物(例如海藻酸盐和其它多糖，包括葡聚糖和纤维素、胶原、其化学衍生物(取代、增加化学基团，例如烷基、亚烷基、羟基化、氧化以及本领域技术人员通常进行的其它修饰)、白蛋白和其它亲水性蛋白(例如玉米蛋白和其它醇溶谷蛋白及疏水性蛋白))及其任何共聚物或混合物。通常，这些材料通过体内酶促水解或暴露于水、通过表面或本体侵蚀而降解。
在某些情况下，聚合物是生物粘附性聚合物，诸如H.S.Sawhney、C.P.Pathak和J.A.Hubbell在Macromolecules，1993，26，581-587中描述的可生物侵蚀的水凝胶，其讲授内容结合于本文中；聚透明质酸、酪蛋白、明胶、明胶蛋白、聚酐、聚丙烯酸、藻酸盐、壳聚糖、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(甲基丙烯酸乙酯)、聚(甲基丙烯酸丁酯)、聚(甲基丙烯酸异丁酯)、聚(甲基丙烯酸己酯)、聚(甲基丙烯酸异癸酯)、聚(甲基丙烯酸月桂酯)、聚(甲基丙烯酸苯酯)、聚(丙烯酸甲酯)、聚(丙烯酸异丙酯)、聚(丙烯酸异丁酯)和聚(丙烯酸十八烷酯)。
在一些实施方案中，聚合物为水溶性聚合物或亲水性聚合物。亲水性聚合物在本文的“亲水性异源部分”中进一步描述。合适的水溶性聚合物为本领域已知的，并且包括例如聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基纤维素(HPC；Klucel)、羟丙基甲基纤维素(HPMC；Methocel)、硝基纤维素、羟丙基乙基纤维素、羟丙基丁基纤维素、羟丙基戊基纤维素、甲基纤维素、乙基纤维素(Ethocel)、羟乙基纤维素、各种烷基纤维素和羟基烷基纤维素、各种纤维素醚、醋酸纤维素、羧甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、羧甲基纤维素钙、醋酸乙烯酯/巴豆酸共聚物、聚-甲基丙烯酸羟烷基酯、甲基丙烯酸羟甲基酯、甲基丙烯酸共聚物、聚甲基丙烯酸、聚甲基丙烯酸甲酯、马来酸酐/甲基乙烯基醚共聚物、聚乙烯醇、聚丙烯酸钠和钙、聚丙烯酸、酸性羧基聚合物、聚羧乙烯(carboxypolymethylene)、羧基乙烯基聚合物、聚氧乙烯聚氧丙烯共聚物、聚甲基乙烯基醚共聚马来酸酐、羧甲基酰胺、甲基丙烯酸钾二乙烯基苯共聚物、聚氧乙二醇、聚环氧乙烷及其衍生物、盐和组合。
在特定的实施方案中，聚合物为聚亚烷基二醇，包括例如聚乙二醇(PEG)。
在一些实施方案中，异源部分为碳水化合物。在一些实施方案中，碳水化合物为单糖(例如葡萄糖、半乳糖、果糖)、二糖(例如蔗糖、乳糖、麦芽糖)、寡糖(例如棉子糖、水苏糖)、多糖(淀粉、淀粉酶、支链淀粉、纤维素、甲壳素、胼胝质、海带多糖、木聚糖、甘露聚糖、岩藻依聚糖、半乳甘露聚糖)。
在一些实施方案中，异源部分为脂质。在一些实施方案中，
脂质为脂肪酸(类二十烷酸、***素、白三烯、血栓素、N-酰基乙醇胺)、甘油脂(例如单-、二-和三-取代的甘油)、甘油磷脂(例如磷脂酰胆碱、磷脂酰肌醇、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸)、鞘脂类(例如鞘氨醇、神经酰胺)、固醇类脂(例如类固醇、胆固醇)、孕烯醇酮脂质(prenollipid)、醣脂质、或者聚酮化合物、油、蜡、胆固醇、固醇、脂溶性维生素、单甘油酯、二甘油酯、三甘油酯、磷脂。
Fc融合异源部分
如上所述，在一些实施方案中，Q被结合于，例如，融合于免疫球蛋白或其部分(例如可变区、CDR或Fc区)。如本文描述的那样，Q可为胰高血糖素超家族肽、胰高血糖素相关肽，包括1、2、3、4或5类胰高血糖素相关肽，或者为骨钙蛋白、降钙素、糊精或其类似物、衍生物或缀合物。已知类型的免疫球蛋白(Ig)包括IgG、IgA、IgE、IgD或IgM。Fc区为Ig重链的C-末端区，其负责结合于Fc受体，该受体实施诸如循环利用(这造成半衰期延长)、抗体依赖性的细胞介导的细胞毒作用(ADCC)和补体依赖细胞毒性(CDC)的活性。
例如，根据一些定义，人IgG重链Fc区自Cys226向重链的C-末端延伸。″铰链区″通常自Glu216向人IgG1的Pro230延伸(其它IgG同种型(isotype)的铰链区可通过比对参与半胱氨酸键合的半胱氨酸与IgG1序列进行比对)。IgG的Fc区包括两个恒定域，CH2和CH3。人IgG Fc区的CH2域通常自氨基酸231向氨基酸341延伸。人IgG Fc区的CH3域通常自氨基酸342向447延伸。对免疫球蛋白或免疫球蛋白碎片或区的氨基酸编号所做的参照，为全部基于Kabat et al.1991，Sequences of Proteins of Immunological Interest，U.S.Department ofPublic Health，Bethesda，Md.。在相关的实施方案中，Fc区可包含除CH1外的来自免疫球蛋白重链的一个或多个原生或者修饰的恒定区，例如IgG和IgA的CH2和CH3区，或者IgE的CH3和CH4区。
合适的缀合部分包括包含FcRn结合位点的免疫球蛋白序列的部分。救援受体FcRn负责循环利用免疫球蛋白并使其返回至血液循环中。结合于FcRn受体的IgG的Fc部分区已经基于X-射线晶体学(Burmeister et al.1994，Nature 372：379)进行了描述。Fc与FcRn的主要接触区域在CH2和CH3域的接合点附近。Fc-FcRn接触全部在单一Ig重链中。主要接触位点包括CH2域的氨基酸残基248、250-257、272、285、288、290-291、308-311和314以及CH3域的氨基酸残基385-387、428和433-436。
一些缀合部分可或不可包括FcγR结合位点。FcγR负责ADCC和CDC。Fc区中与FcγR直接接触的位置的实例为氨基酸234-239(低铰链区)、氨基酸265-269(B/C环)、氨基酸297-299(C’/E环)和氨基酸327-332(F/G)环(Sondermann et al.，Nature 406：267-273，2000)。IgE的较低铰链区也已参与FcRI结合(Henry，et al.，Biochemistry 36，15568-15578，1997)。参与IgA受体结合的残基被描述于Lewis et al.，(JImmunol.175：6694-701，2005)中。参与IgE受体结合的氨基酸残基被描述于Sayers et al.(J Biol Chem.279(34)：35320-5，2004)中。
可对免疫球蛋白的Fc区进行氨基酸修饰。这样的变体Fc区包含Fc区的CH3域(残基342-447)中的至少一个氨基酸修饰和/或Fc区的CH2域(残基231-341)中的至少一个氨基酸修饰。认为赋予对FcRn的增加亲和性的突变包括T256A、T307A、E380A和N434A(Shields et al.2001，J.Biol.Chem.276：6591)。其它突变可减小Fc区与FcγRI、FcγRIIA、FcγRIIB和/或FcγRIIIA的结合，而不显著减小对FcRn的亲和性。例如，用Ala或另一种氨基酸取代Fc区的297位的Asn会去除高度保守的N-糖基化位点，并可造成免疫原性减小，伴随Fc区的半衰期延长，以及与FcγRs的结合减少(Routledge et al.1995，Transplantation 60：847；Friend et al.1999，Transplantation 68：1632；Shields et al.1995，J.Biol.Chem.276：6591)。对IgG1的233-236位进行氨基酸修饰减少与FcγRs的结合(Ward and Ghetie 1995，TherapeuticImmunology 2：77和Armour et al.1999，Eur.J.Immunol.29：2613)。一些示例性的氨基酸取代描述于美国专利7355008和7381408中，其每一篇通过引用以其全文结合到本文中。
亲水性异源部分
在一些实施方案中，本文描述的Q共价键合于亲水性部分。如本文描述的那样，Q可为胰高血糖素超家族肽、胰高血糖素相关肽，包括1、2、3、4或5类胰高血糖素相关肽，或者为骨钙蛋白、降钙素、糊精或其类似物、衍生物或缀合物。亲水性部分可在用于使蛋白与激活聚合物分子反应的任何合适的条件下连接于Q。可使用本领域已知的任何手段，包括通过酰化、还原烷基化、Michael加成、硫醇烷基化或其它化学选择性缀合/连接方法，通过PEG部分上的反应性基团(例如醛、氨基、酯、硫醇、α-卤代乙酰基、马来酰亚胺基或肼基)连接于靶标化合物上的反应性基团(例如醛、氨基、酯、硫醇、α-卤代乙酰基、马来酰亚胺基或肼基)。可用于把水溶性聚合物连接于一种或多种蛋白的活化基团包括但不限于砜、马来酰亚胺、巯基、硫醇、三氟甲磺酸酯、三氟乙磺酸酯(tresylate)、氮丙啶、环氧乙烷、5-吡啶基和α-卤代酰基(例如α-碘乙酸、α-溴乙酸、α-氯乙酸)。如果通过还原烷基化连接于肽，所选择的聚合物应具有单反应性醛，使得能够控制聚合的程度。参见例如，Kinstler等，Adv.Drug.Delivery Rev.54：477-485(2002)；Roberts等，Adv.Drug Delivery Rev.54：459-476(2002)；和Zalipsky等，Adv.Drug Delivery Rev.16：157-182(1995)。
可用于把亲水性部分(水溶性聚合物)连接于蛋白的其它活化基团包括α-卤代酰基(例如α-碘乙酸、α-溴乙酸、α-氯乙酸)。在具体的方面，具有硫醇的肽的氨基酸残基用亲水性部分例如PEG修饰。在一些实施方案中，包含硫醇的Q上的氨基酸用马来酰亚胺活化的PEG以Michael加成反应进行修饰，导致形成包含以下显示的硫醚键的PEG化的肽：
Figure BPA00001673726801211
在一些实施方案中，Q的氨基酸的硫醇与卤代乙酰基-活化的PEG以亲核取代反应进行修饰，导致形成包含以下显示的硫醚键的PEG化的肽：
Figure BPA00001673726801212
合适的亲水性部分包括聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇、聚氧乙基化多元醇(例如POG)、聚氧乙基化山梨醇、聚氧乙基化葡萄糖、聚氧乙基化甘油(POG)、聚氧化烯、聚乙二醇丙醛、乙二醇/丙二醇的共聚物、单甲氧基-聚乙二醇、单(C1-C10)烷氧基-或芳氧基-聚乙二醇、羧甲基纤维素、聚缩醛、聚乙烯醇(PVA)、聚乙烯基吡咯烷酮、聚1，3-二氧戊环、聚1，3，6-三噁烷、乙烯/马来酸酐共聚物、聚β-氨基酸(均聚物或或无规共聚物)、聚(N-乙烯基吡咯烷酮)聚乙二醇、丙二醇均聚物(PPG)及其它聚环氧烷、环氧丙烷/环氧乙烷共聚物、可拉酸(colonicacids)或其它多糖聚合物、聚蔗糖或葡聚糖及其混合物。葡聚糖为葡萄糖亚单位主要通过α1-6键接的多糖聚合物。葡聚糖可以许多分子量范围得到，例如约1kD-约100kD，或者从约5、10、15或20kD至约20、30、40、50、60、70、80或90kD。
根据一些实施方案，亲水性部分例如聚乙二醇链具有选自约500-约40000道尔顿范围的分子量。在一些实施方案中，聚乙二醇链具有选自约500-约5000道尔顿、或约1000-约5000道尔顿范围的分子量。在另一个实施方案中，亲水性部分例如聚乙二醇链具有约10000-约20000道尔顿的分子量。在另一个其它的实施方案中，亲水性部分例如聚乙二醇链具有约20000-约40000道尔顿的分子量。
考虑直链或支链的亲水性聚合物。生成的缀合物的制剂基本上可为单分散体或多分散体，并且每一个肽可具有约0.5、0.7、1、1.2、1.5或2个聚合物部分。
在一些实施方案中，肽的原生氨基酸用具有适合于与亲水性部分交联的侧链的氨基酸取代，以便于亲水性部分与肽的键合。示例性的氨基酸包括Cys、Lys、Orn、同型Cys或乙酰基苯丙氨酸(Ac-Phe)。在其它的实施方案中，在肽的C-末端增加被修饰以包含亲水性基团的氨基酸。
在一些实施方案中，缀合物的肽通过肽的氨基酸侧链与亲水性部分之间的共价键缀合于亲水性部分例如PEG。在一些实施方案中，其中Q为1、2、3、4或5类胰高血糖素相关肽，肽通过16、17、21、24、29、40位、C-末端延伸中的位置或C-末端氨基酸或者这些位置的组合的氨基酸的侧链缀合于亲水性部分。在一些方面，共价连接于亲水性部分(例如包含亲水性部分的氨基酸)的氨基酸为Cys、Lys、Orn、同型Cys或Ac-Phe，并且氨基酸的侧链被共价键合于亲水性部分(例如PEG)。
rPEG异源部分
在一些实施方案中，本发明的缀合物包含融合于附属肽的Q，所述肽能够形成与化学PEG(例如重组PEG(rPEG)分子)相似的延伸构象，例如在国际专利申请公布号WO 2009/023270和美国专利申请公布号US 2008/0286808中描述的那些。rPEG分子不是聚乙二醇。在一些方面，rPEG分子为包含甘氨酸、丝氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、丙氨酸或脯氨酸中的一种或多种的多肽。在一些方面，rPEG为均聚物，例如聚甘氨酸、聚丝氨酸、聚谷氨酸、聚天冬氨酸、聚丙氨酸或聚脯氨酸。在其它的实施方案中，rPEG包含两种类型的重复氨基酸，例如聚(Gly-Ser)、聚(Gly-Glu)、聚(Gly-Ala)、聚(Gly-Asp)、聚(Gly-Pro)、聚(Ser-Glu)等。在一些方面，rPEG包含三种不同类型的氨基酸，例如聚(Gly-Ser-Glu)。在具体的方面，rPEG增大Q的半衰期。在一些方面，rPEG包含净正电荷或净负电荷。在一些方面，rPEG缺乏二级结构。在一些实施方案中，rPEG的长度大于或等于10个氨基酸，并且在一些实施方案中长度为约40-约50个氨基酸。在一些方面，附属肽通过肽键或蛋白酶裂解位点融合于本发明的肽的N-或C-末端，或者***到发明的肽环中。在一些方面，rPEG包含亲和标记物，或者连接于大于5kDa的PEG。在一些实施方案中，rPEG给予本发明的缀合物增大的流体动力学半径、血清半衰期、蛋白酶抗性或溶解性，并且在一些方面给予缀合物减小的免疫原性。
Q可通过使肽的靶向氨基酸残基与有机衍化剂(derivatizingagent)反应，经直接的共价键合连接于缀合物部分，所述有机衍化剂能够与这些靶向氨基酸的选择的侧链或者N-或C-末端残基反应。肽或缀合物部分上的反应性基团包括例如醛、氨基、酯、硫醇、α-卤代乙酰基、马来酰亚胺基或肼基。衍化剂包括例如马来酰亚胺基苯甲酰基磺基琥珀酰亚胺酯(通过半胱氨酸残基缀合)、N-羟基琥珀酰亚胺(通过赖氨酸残基)、戊二醛、琥珀酸酐或本领域已知的其它试剂。或者，缀合物部分可通过中间载体例如多糖或多肽载体间接连接于肽。多糖载体的实例包括氨基葡聚糖。合适的多肽载体的实例包括聚赖氨酸、聚谷氨酸、聚天冬氨酸、其共聚物，以及这些氨基酸与其它氨基酸例如丝氨酸的混合聚合物，以给予生成的负载载体合乎需要的溶解性。多聚体
关于1类、2类和3类胰高血糖素相关肽，Q可为包含至少两种、三种或更多种经连接基键合的肽的二聚体、三聚体或更高级多聚体的部分，其中至少一种或两种肽为胰高血糖素相关肽。二聚体可为同型二聚体或杂二聚体。在一些实施方案中，连接基选自双功能硫醇交联剂和双功能胺交联剂。在某些实施方案中，连接基为PEG，例如5kDa PEG、20kDa PEG。在一些实施方案中，连接基为二硫键。例如，二聚体的每一种单体可包含Cys残基(例如末端或内部位置的Cys)，并且每一个Cys残基的硫原子参与二硫键的形成。在本发明的一些方面，单体经末端氨基酸(例如N-末端或C-末端)、经内部氨基酸、或经至少一种单体的末端氨基酸和至少一种其它单体的内部氨基酸连接。在特定的方面，单体不经N-末端氨基酸连接。在一些方面，多聚体的单体以“尾-尾”定向连接在一起，其中每一种单体的C-末端氨基酸连接在一起。缀合物部分可共价连接于本文描述的任何一种胰高血糖素相关肽，包括二聚体、三聚体或更高级多聚体。
异源部分与Q的缀合
异源部分根据在“连接基团”章节和“Q和/或Y的化学修饰”小节中描述的键合和缀合方法结合于肽(Q)。
Q的制备方法
本文公开的肽(Q)可通过标准合成方法、重组DNA技术或者制备肽和融合蛋白的任何其它方法来制备。尽管某些非天然氨基酸不能通过标准重组DNA技术表达，用于其制备的技术为本领域已知的。除标准肽化学反应以外，在适用时，包括非肽部分的本发明化合物还可通过标准有机化学反应合成。
可通过本领域已知的方法得到本公开的肽，重新合成肽的适用方法描述于，例如，Chan等，Fmoc固相肽合成，牛津大学出版社，Oxford，英国，2005；肽和蛋白药物分析，Reid，R.，Marcel Dekker编辑，Inc.，2000；表位作图，Westwood等，编辑.牛津大学出版社，Oxford，英国，2000；和美国专利号5,449,752。
同样，在其中该公开的肽不包含任何非编码或非天然氨基酸的情况中，肽可采用标准重组方法，使用编码肽的氨基酸序列的核酸重组产生。参见例如，Sambrook等，分子克隆：实验室手册.3版，ColdSpring Harbor Press，Cold Spring Harbor，NY 2001；和Ausubel等，分子生物学通用方案，Greene Publishing Associates and John Wiley&Sons，NY，1994。
在一些实施方案中，该公开的肽被分离。在一些实施方案中，该公开的肽被纯化。应该认识到，“纯度”为相对术语，并且不必视为绝对纯度或绝对富集或绝对选择。在一些方面，纯度为至少或约50％、为至少或约60％、至少或约70％、至少或约80％、至少或约90％(例如至少或约91％、至少或约92％、至少或约93％、至少或约94％、至少或约95％、至少或约96％、至少或约97％、至少或约98％、至少或约99％或为约100％)。
在某些实施方案中，诸如Synpep(Dublin，CA)，PeptideTechnologies Corp.(Gaithersburg，MD)，和Multiple Peptide Systems(San Diego，CA)的公司商业上合成本文描述的肽。在这方面，肽可被合成、重组、分离和/或纯化。
以下详细描述胰高血糖素相关肽(Q)的分类。关于涉及1类、2类、3类、4类和5类胰高血糖素相关肽的公开的每一个章节，描述了对于以上详细描述的Q-L-Y缀合物的胰高血糖素相关肽部分(Q)的修饰。因此，关于胰高血糖素相关肽的分类描述的结构元素为Q的结构元素，其然后被进一步修饰以产生如以上描述的Q-L-Y缀合物。
1类胰高血糖素相关肽
在某些实施方案中，胰高血糖素相关肽是1类胰高血糖素相关肽，其描述于本文和国际专利公开号WO 2009/155257(2009年12月23日公开)、国际专利申请公开号WO 2008/086086(2008年7月17日公开)和国际专利申请公开号WO 2007/056362(2007年5月18日公开)，其内容通过全文引用结合于本文中。
在以下章节中提及的涉及1类胰高血糖素相关肽的生物序列(SEQ ID NOs：801-915)对应于国际专利出版物第WO 2009/155257号中的SEQ ID NOs：1-115。
活性
1类胰高血糖素肽相对于原生胰高血糖素肽(SEQ ID NO：801)保留胰高血糖素受体活性。例如胰高血糖素肽可保留原生胰高血糖素的活性的至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、75％活性、80％活性、85％活性或90％(作为胰高血糖素肽与胰高血糖素相比较的EC50s的反比来计算，如使用在实施例2中一般性描述的试验通过cAMP产生测量的那样)。在一些实施方案中，1类胰高血糖素相关肽比胰高血糖素具有相同或者更大的活性(本文与术语“功效”同义使用)。在一些实施方案中，本文描述的胰高血糖素肽表现出不大于约100％、1000％、10000％、100000％或1000000％的原生胰高血糖素肽的活性。
当例如使用实施例2的试验，在过表达胰高血糖素受体的HEK293细胞中测试cAMP诱导时，本文描述的任何一种1类胰高血糖素相关肽可对人胰高血糖素受体表现出约100nM、75nM、50nM、40nM、30nM、20nM、10nM、5nM、1nM或者更小的EC50。典型地聚乙二醇化的肽与未聚乙二醇化的肽相比较表现出更高的EC50。例如，本文描述的1类胰高血糖素相关肽在未聚乙二醇化时，可对胰高血糖素受体呈现为原生胰高血糖素(SEQ ID NO：801)对胰高血糖素受体的活性的至少20％(例如至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少75％，、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％、100％、150％，200％、400％、500％或者更高)的活性。在某些实施方案中，本文描述的1类胰高血糖素相关肽在缺乏亲水性部分时，表现出原生胰高血糖素对胰高血糖素受体的指明％的活性，但是在包含亲水性部分时，表现出原生胰高血糖素对胰高血糖素受体的降低的％活性。例如，本文描述的1类胰高血糖素相关肽在聚乙二醇化时，可对胰高血糖素受体呈现为原生胰高血糖素的活性的至少2％(例如至少3％、至少4％、至少5％、至少6％、至少7％、至少8％、至少9％或至少10％)的活性。在一些实施方案中，本文描述的1类胰高血糖素相关肽可表现出任何以上指明的活性，但是不大于原生胰高血糖素对胰高血糖素受体的活性的1000％、10000％、100000％或1000000％。
在一些实施方案中，1类胰高血糖素相关肽表现出少于约5％、4％、3％、2％或1％的原生GLP-1对GLP-1受体的活性和/或对胰高血糖素受体与GLP-1受体相比较的约5倍、10倍或15倍的选择性。例如，在一些实施方案中，1类胰高血糖素相关肽表现出少于5％的原生GLP-1对GLP-1受体的活性，并且表现出对胰高血糖素受体与GLP-1受体相比较的5倍的选择性。
改进的溶解性
原生胰高血糖素在水溶液中，特别是在生理pH下呈现出差的溶解性，具有随着时间的推移而聚集和沉淀的趋势。相比之下，在一些实施方案中，在6-8之间或在6-9之间的pH下，例如在pH7下，于25℃下24小时后，1类胰高血糖素相关肽表现出与原生胰高血糖素相比较的至少2倍、5倍或者甚至更高的溶解性。
因此，在一些实施方案中，1类胰高血糖素相关肽相对于His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr的野生型肽(SEQ ID NO：801)被修饰，以改善肽在水溶液中，特别是在从约5.5升至约8.0范围内的pH下的溶解性，同时保留原生肽的生物活性。
例如，通过把亲水性部分连接于肽可进一步改善本文描述的任何一种1类胰高血糖素相关肽的溶解性。引入这样的基团也增加作用持续时间，例如如通过延长的循环半衰期所测量的那样。本文进一步描述亲水性部分。
用荷电残基修饰
在一些实施方案中，通过用选自赖氨酸、精氨酸、组氨酸、
天冬氨酸和谷氨酸的荷电氨基酸取代原生非荷电氨基酸，或者通过在肽的氨基或羧基末端加入荷电氨基酸，在1类胰高血糖素相关肽中加入电荷来改善溶解性。
根据一些实施方案，由于肽通过氨基酸取代和/或增加进行修饰，在肽的C-末端部分，并且在一些实施方案中为在SEQ ID NO：801的C-末端位置至27位引入荷电氨基酸的事实，1类胰高血糖素相关肽具有改善的溶解性。任选地，可在C-末端部分内，并且在一些实施方案中为在C-末端至27位，引入1、2或3个荷电氨基酸。根据一些实施方案，28和/或29位的原生氨基酸用荷电氨基酸取代，和/或在肽的C-末端，例如在27、28或29位之后增加1-3个荷电氨基酸。在示例性实施方案中，1、2、3个或全部的荷电氨基酸为荷负电的。在其它的实施方案中，1、2、3个或全部的荷电氨基酸为荷正电的。
在特定的示例性实施方案中，1类胰高血糖素相关肽可包含任何一种或两种以下的修饰：N28用E取代、N28用D取代、T29用D取代、T29用E取代；在27、28或29位之后***E；在27、28或29位之后***D。例如，D28E29、E28E29、E29E30、E28E30、D28E30。
根据一个示例性实施方案，1类胰高血糖素相关肽包含SEQID NO：811的氨基酸序列，或其相对于原生胰高血糖素含有1-3个其它氨基酸修饰的类似物(本文参照胰高血糖素激动剂描述)、或其胰高血糖素激动剂类似物。SEQ ID NO：811代表修饰的1类胰高血糖素相关肽，其中原生蛋白的28位的天冬酰胺残基已被天冬氨酸取代。在另一个示例性实施方案中，1类胰高血糖素相关肽包含SEQ ID NO：838的氨基酸序列，其中原生蛋白的28位的天冬酰胺残基已被谷氨酸取代。其它示例性实施方案包括SEQ ID NOs：824、825、826、833、835、836和837的1类胰高血糖素相关肽。
用荷电氨基酸取代28和/或29位的正常存在的氨基酸，和/或在1类胰高血糖素相关肽的羧基末端增加1-2个荷电氨基酸，增强胰高血糖素肽在生理学上相关的pHs(即约6.5-约7.5的pH)下的水溶液中的溶解性和稳定性至至少5倍，并且多达30倍。因此，一些实施方案的1类胰高血糖素肽保留胰高血糖素活性，并且在约5.5-8之间的给定pH例如pH7下，当在25℃下于24小时之后测量时，相对于原生胰高血糖素，表现出至少2倍、5倍、10倍、15倍、25倍、30倍或者更大的溶解性。
可对1类胰高血糖素相关肽进行另外的修饰例如保守取代，其修饰在本文进一步描述，这种修饰仍使它能够保留胰高血糖素活性。
改善的稳定性
任何一种1类胰高血糖素肽可另外表现出改善的稳定性和/或减少的降解，例如在25℃下于24小时之后保留至少95％的原始肽。此外，本文公开的任何一种1类胰高血糖素相关肽可在5.5-8范围内的pH下表现出改善的稳定性，例如当在25℃下于24小时之后保留至少75％、80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的原始肽。在一些实施方案中，本发明的1类胰高血糖素相关肽表现出改善的稳定性，使得例如在至少20℃(例如21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、至少27.5℃、至少30℃、至少35℃、至少40℃、至少50℃)和低于100℃、低于85℃、低于75℃或低于70℃的温度下的溶液中，在约1或多周(例如约2周、约4周、约1个月、约2个月、约4个月、约6个月、约8个月、约10个月、约12个月)之后，用紫外(UV)检测器在280nm下可检测到至少75％(例如至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、多于95％，最多100％)的肽浓度，或者少于约25％(例如少于20％、少于15％、少于10％、少于5％、4％、3％、2％、1％，低至0％)的分解肽。1类胰高血糖素相关肽可包括改变其以下药用性能的另外的修饰：例如功效增大、循环半衰期延长、储藏寿命增加、沉淀或聚集减少和/或降解减少，例如储藏之后裂解或化学修饰的发生减少。
在另外的其它示例性实施方案中，通过修饰SEQ ID NO：801的15位氨基酸，以减少随着时间推移，尤其是在酸性或碱性缓冲液中的肽降解，任何的上述1类胰高血糖素相关肽可被进一步修饰，以改善稳定性。在示例性实施方案中，15位的Asp用Glu、高-Glu、半胱氨酸或同型半胱氨酸取代。
作为选择，通过修饰SEQ ID NO：801的16位氨基酸，本文描述的任何一种1类胰高血糖素相关肽可被进一步修饰，以改善稳定性。在示例性实施方案中，16位的Ser用Thr或Aib、或者本文对于1类胰高血糖素相关肽描述的增强对胰高血糖素受体的功效的任何一种氨基酸取代进行取代。这样的修饰减少Asp15-Ser16之间的肽键的裂解。
在一些实施方案中，通过修饰20、21、24或27位中的1、2、3或全部4个位置，本文描述的任何一种1类胰高血糖素相关肽可被进一步修饰，以减少在各氨基酸位置的降解。示例性实施方案包括20位的Gln用Ser、Thr、Ala或Aib取代；21位的Asp用Glu取代；24位的Gln用Ala或Aib取代；27位的Met用Leu或Nle取代。去除或取代蛋氨酸由于蛋氨酸的氧化减少降解。去除或取代Gln或Asn由于Gln或Asn的脱酰胺作用减少降解。去除或取代Asp减少通过Asp脱水形成环状琥珀酰亚胺中间体，随后异构化为异天冬氨酸发生的降解。
增强的功效
根据另一个实施方案，提供对胰高血糖素受体具有增强的功效的1类胰高血糖素相关肽，其中这些肽在原生胰高血糖素(SEQ IDNO：801)的16位包含氨基酸修饰。通过非限制性实例，通过用谷氨酸或用具有4个原子长度的侧链的另一种荷负电的氨基酸、或者，作为选择，用谷氨酰胺、高谷氨酸或同型半胱氨酸，或荷电氨基酸(具有包含至少一个杂原子(例如N、O、S、P)的侧链并具有约4(或3-5)个原子的侧链长度)中的任何一种取代16位的天然存在的丝氨酸，可提供这种功效增强。用谷氨酸取代16位的丝氨酸，增强胰高血糖素对胰高血糖素受体的活性至至少2倍、4倍、5倍和最多10倍。在一些实施方案中，1类胰高血糖素相关肽保留对胰高血糖素受体相对于GLP-1受体的选择性，例如至少5倍、10倍或15倍的选择性。
DPP-IV抗性
在一些实施方案中，本文公开的1类胰高血糖素肽在1或2位被进一步修饰，以减小对经二肽基肽酶IV裂解的敏感性。更具体地讲，在一些实施方案中，1类胰高血糖素相关肽的1位和/或2位用本文描述的DPP-IV抗性氨基酸取代。在一些实施方案中，类似物肽的2位用氨基异丁酸取代。在一些实施方案中，类似物肽的2位用选自D-丝氨酸、D-丙氨酸、甘氨酸、N-甲基丝氨酸和ε-氨基丁酸的氨基酸取代。在另一个实施方案中，1类胰高血糖素相关肽的2位用选自D-丝氨酸、甘氨酸和氨基异丁酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，2位的氨基酸不为D-丝氨酸。
通过稳定胰高血糖素肽的C-末端部分(约氨基酸12-29)的α-螺旋结构，可恢复在修饰胰高血糖素肽的1位和/或2位氨基酸时胰高血糖素活性减小。通过例如形成共价或非共价分子内桥(例如在“i”和“i+4”位的氨基酸侧链之间的内酰胺桥，其中i为12-25的整数)、在约12-29位用稳定α螺旋的氨基酸(例如α，α-二取代的氨基酸)取代和/或***氨基酸，可稳定α螺旋结构，如本文进一步描述的那样。
位置3上的修饰
通过3位的氨基酸修饰(根据野生型胰高血糖素的氨基酸编号)，例如用酸性、碱性或疏水性氨基酸取代3位天然存在的谷氨酰胺，可减小胰高血糖素受体活性。例如3位用谷氨酸、鸟氨酸或正亮氨酸取代显著减小或破坏胰高血糖素受体活性。
通过用本文描述的谷氨酰胺类似物修饰3位的Gln，可实现保持或增强的对胰高血糖素受体的活性。例如，胰高血糖素激动剂可包含SEQ ID NO：863、SEQ ID NO：869、SEQ ID NO：870、SEQ ID NO：871、SEQ ID NO：872、SEQ ID NO：873和SEQ ID NO：874的氨基酸序列。
用C-末端酰胺和酯提高GLP-1活性
通过用电荷中性的基团例如酰胺或酯替代C-末端氨基酸的羧酸，提供对GLP-1受体的增强的活性。相反，保留肽的C-末端的原生羧酸，保持1类胰高血糖素相关肽对胰高血糖素受体与GLP-1受体相比较的相对更大的选择性(例如大于约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20倍)。
进一步修饰和组合
可对1类胰高血糖素相关肽进行另外的修饰，这种修饰可进一步增加溶解性和/或稳定性和/或胰高血糖素活性。作为选择，1类胰高血糖素相关肽可包含不显著影响溶解性或稳定性，并且不显著降低胰高血糖素活性的其它修饰。在示例性实施方案中，相对于原生胰高血糖素序列，1类胰高血糖素相关肽可包含总计最多11、或最多12、或最多13或最多14个氨基酸修饰。例如，可在2、5、7、10、11、12、13、14、17、18、19、20、21、24、27、28或29位中的任何位置进行保守或非保守的取代、增加或者缺失。
1类胰高血糖素相关肽的示例性修饰包括但不限于：
(a)非保守的取代、保守的取代、增加或缺失，同时保留至少部分的胰高血糖素激动剂活性，例如在2、5、7、10、11、12、13、14、16、17、18、19、20、21、24、27、28或29位中的一个或多个位置的保守取代；用Val或Phe取代10位的Tyr；用Arg取代12位的Lys；用Ala取代这些位置中的一个或多个位置；
(b)在29和/或28位以及任选地27位的氨基酸缺失，同时保留至少部分的胰高血糖素激动剂活性；
(c)例如通过用谷氨酸、高谷氨酸、半胱氨酸或同型半胱氨酸取代，修饰15位的天冬氨酸，这种修饰可减少降解；或者例如通过用苏氨酸、Aib或谷氨酸，或用另一种具有4个原子长度的侧链的荷负电氨基酸，或者作为选择，用谷氨酰胺、高谷氨酸或同型半胱氨酸中的任何一种取代，修饰16位的丝氨酸，这种修饰同样可减少由于Asp15-Ser16键裂解引起的降解；
(d)如本文描述的，例如在16、17、20、21、24、29、40位或在C-末端氨基酸增加亲水性部分例如水溶性聚合物聚乙二醇，这种修饰可增加溶解性和/或半衰期；
(e)例如通过用亮氨酸或正亮氨酸取代，修饰27位的蛋氨酸，以减少氧化降解；
(f)例如通过用Ser、Thr、Ala或Aib取代，修饰20或24位的Gln，以减少通过Gln的脱酰胺作用发生的降解；
(g)例如通过用Glu取代，修饰21位的Asp，以减少通过Asp的脱水形成环状琥珀酰亚胺中间体的降解，随后异构化为异天冬氨酸酯；
(h)本文描述的改善对DPP-IV裂解的抗性的1或2位修饰，这种修饰任选地与分子内桥例如在“i”和“i+4”位之间的内酰胺桥组合，其中i为12-25的整数，例如12、16、20、24；
(i)如本文描述的那样酰化或烷基化胰高血糖素肽，这种修饰可增大对胰高血糖素受体和/或GLP-1受体的活性，增加循环半衰期和/或延长作用持续时间和/或延迟起效，任选地结合增加亲水性部分，另外或者任选地结合选择性地减小对GLP-1肽的活性的修饰，例如修饰7位的Thr，例如用缺乏羟基的氨基酸例如Abu或Ile取代7位的Thr；氨基酸C-末端-27位氨基酸缺失(例如缺失28和29位的1或2个氨基酸，得到长度为肽27或28个氨基酸)；
(j)如本文描述的C-末端延伸；
(k)如本文描述的均二聚作用或杂二聚作用；
以及(a)-(k)的组合。
在一些实施方案中，1类胰高血糖素相关肽的示例性修饰包括选自A组的至少一种氨基酸修饰和选自B组和/或C组的一种或多种氨基酸修饰，其中A组为：
用荷电氨基酸取代28位的Asn；
用选自Lys、Arg、His、Asp、Glu、半胱氨酸和同型半胱氨酸的荷电氨基酸取代28位的Asn；
用Asn、Asp或Glu取代28位；
用Asp取代28位；
用Glu取代28位；
用荷电氨基酸取代29位的Thr；
用选自Lys、Arg、His、Asp、Glu、半胱氨酸和同型半胱氨酸的荷电氨基酸取代29位的Thr；
用Asp、Glu或Lys取代29位；
用Glu取代29位；
在29位之后***1-3个荷电氨基酸；
在29位之后***Glu或Lys；
在29位之后***Gly-Lys或Lys-Lys；
或其组合；
其中B组为：
用Glu取代15位的Asp；
用Thr或Aib取代16位的Ser；
并且其中C组为：
用减小胰高血糖素肽对经二肽基肽酶IV(DPP-IV)裂解的敏感性的非原生氨基酸取代1位的His；
用减小胰高血糖素肽对经二肽基肽酶IV(DPP-IV)裂解的敏感性的非原生氨基酸取代2位的Ser；
用Arg取代12位的Lys；
用Ser、Thr、Ala或Aib取代20位的Gln；
用Glu取代21位的Asp；
用Ser、Thr、Ala或Aib取代24位的Gln；
用Leu或Nle取代27位的Met；
27-29位的氨基酸缺失；
28-29位的氨基酸缺失；
29位的氨基酸缺失；
或其组合。
在示例性实施方案中，用Arg取代12位的Lys。在其它示例性实施方案中，29和/或28位以及任选地27位的氨基酸缺失。
在一些特定的实施方案中，胰高血糖素肽包含(a)赋予DPP-IV抗性的1和/或2位的氨基酸修饰，例如在1位用DMIA或在2位用Aib取代，(b)12-29位中，例如16和20位的分子内桥，或者在16、20、21和24位的氨基酸用α，α-二取代氨基酸的一个或多个取代，任选地(c)例如通过24、29位或C-末端氨基酸的Cys连接于亲水性部分例如PEG，任选地(d)在27位用例如Nle取代Met的氨基酸修饰，任选地(e)在20、21和24位减少降解的氨基酸修饰，和任选地(f)连接于SEQ ID NO：820。当胰高血糖素肽连接于SEQ ID NO：820时，在某些实施方案中，29位的氨基酸为Thr或Gly。在其它特别的实施方案中，胰高血糖素肽包含(a)Asp28Glu29、或Glu28Glu29、或Glu29Glu30、或Glu28Glu30或Asp28Glu30，和任选地(b)在16位用例如Thr或Aib取代Ser的氨基酸修饰，和任选地(c)在27位用例如Nle取代Met的氨基酸修饰，和任选地(d)在20、21和24位减少降解的氨基酸修饰。在一个特别的实施方案中，胰高血糖素肽为T16、A20、E21、A24、Nle27、D28、E29。
在某些实施方案中，1类胰高血糖素相关肽包括氨基酸序列：
其上具有1-3处氨基酸修饰的
X1-X2-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Z(SEQ ID NO：839)。
其中X1和/或X2是减少胰高血糖素肽被二肽基肽酶IV(DPP-IV)裂解的敏感性(或增加其对胰高血糖素肽被二肽基肽酶IV(DPP-IV)裂解的抗性)的非原生氨基酸，
其中Z选自-COOH(天然存在的C-末端羧酸)、-Asn-COOH、Asn-Thr-COOH和Y-COOH，其中Y为1-2个氨基酸，和
其中优选地为共价键的分子内桥连接i位的氨基酸和i+4位的氨基酸的侧链，其中i为12、16、20或24。
在一些实施方案中，分子内桥为内酰胺桥。在一些实施方案中，SEQ ID NO：839的i和i+4位的氨基酸为Lys和Glu，例如Glu16和lys20。在一些实施方案中，X1选自D-His、N-甲基-His、α-甲基-His、咪唑乙酸、脱氨基-His、羟基-His、乙酰基-His、高-His和α，α-二甲基咪唑乙酸(DMIA)。在其它的实施方案中，X2选自D-Ser、D-Ala、Gly、N-甲基-Ser、Val和α-氨基异丁酸(Aib)。在一些实施方案中，胰高血糖素肽在16、17、20、21、24、29、40位的氨基酸、C-末端延伸中或在C-末端氨基酸中的任何位置共价连接于亲水性部分。在示例性实施方案中，亲水性部分在这些位置中的任何位置共价连接于Lys、Cys、Orn、同型半胱氨酸或乙酰基苯丙氨酸残基。示例性的亲水性部分包括例如约1000道尔顿-约40000道尔顿、或约20000道尔顿-约40000道尔顿的分子量的聚乙二醇(PEG)。
在其它实施方案中，类I胰高血糖素相关肽包括氨基酸序列：
X1-X2-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Z(SEQ ID NO：839)，
其中X1和/或X2是减少胰高血糖素肽被二肽基肽酶IV(DPP-IV)裂解的敏感性(或增加其对胰高血糖素肽被二肽基肽酶IV(DPP-IV)裂解的抗性)的非原生氨基酸，
其中胰高血糖素肽的位置16，20，21和24中的一个、两个、三个、四个或更多个被α，α-双取代氨基酸取代，和
其中Z选自-COOH(天然存在的C-末端羧酸)、-Asn-COOH、Asn-Thr-COOH和Y-COOH，其中Y为1-2个氨基酸。
对上述1类胰高血糖素相关肽或类似物的示例性的其它氨基酸修饰包括用缺乏羟基的氨基酸例如氨基丁酸(Abu)、Ile取代7位的Thr，任选地，与包含共价连接于(任选地，通过间隔区)酰基或烷基的侧链的氨基酸的取代或增加组合，其酰基或烷基对天然存在氨基酸是非原生的；用Arg取代12位的Lys；用Glu取代15位的Asp；用Thr或Aib取代16位的Ser；用Ser、Thr、Ala或Aib取代20位的Gln；用Glu取代21位的Asp；用Ser、Thr、Ala或Aib取代24位的Gln；用Leu或Nle取代27位的Met；用荷电氨基酸取代28位的Asn；用选自Lys、Arg、His、Asp、Glu、半胱氨酸和同型半胱氨酸的荷电氨基酸取代28位的Asn；用Asn、Asp或Glu在位置28取代；用Asp在位置28取代；用Glu在位置28取代；用荷电氨基酸取代29位的Thr；用选自Lys、Arg、His、Asp、Glu、半胱氨酸和同型半胱氨酸的荷电氨基酸取代29位的Thr；用Asp、Glu或Lys在29位取代；用Glu在29位取代；在29位之后***1-3个荷电氨基酸；在30位(即在29位之后)***Glu或Lys；任选地在31位***Lys；在C-末端增加SEQ ID NO：820，任选地，其中29位的氨基酸为Thr或Gly；氨基酸共价连至亲水部分的取代或加成；或其组合。
关于1类胰高血糖素激动剂的以上描述的任何修饰(这些修饰增大胰高血糖素受体活性，保留部分胰高血糖素受体活性，改善溶解性，增加稳定性或减少降解)可单独或组合用于1类胰高血糖素肽。因此，可制备1类胰高血糖素相关肽，其保留原生胰高血糖素对胰高血糖素受体的活性的至少20％，并且在6-8之间或在6-9之间的pH(例如pH7)下可以至少1mg/mL的浓度溶解，并且任选地在25℃下24小时之后，保留至少95％的原始肽(例如5％或更少的原始肽降解或裂解)。或者，可制备高功效1类胰高血糖素相关肽，其表现出原生胰高血糖素对胰高血糖素受体的活性的至少约100％、125％、150％、175％、200％、250％、300％、350％、400％、450％、500％、600％、700％、800％、900％或者10倍或更多，并且任选地在6-8之间或在6-9之间的pH(例如pH7)下可以至少1mg/mL的浓度溶解，并且任选地在25℃下24小时之后，保留至少95％的原始肽(例如5％或更少的原始肽降解或裂解)。在一些实施方案中，本文描述的1类胰高血糖素肽可对胰高血糖素受体表现出至少任何上述相对水平的活性，但是不大于原生胰高血糖素对胰高血糖素受体的活性的1000％、5000％或10000％。1类胰高血糖素相关肽的实施方案的实施例
根据一些实施方案，通过用荷负电的氨基酸(例如天冬氨酸或谷氨酸)取代28和/或29位的原生氨基酸，和任选地在肽的羧基末端增加荷负电的氨基酸(例如天冬氨酸或谷氨酸)，修饰SEQ ID NO：801的原生胰高血糖素肽。在备选的实施方案中，通过用荷正电的氨基酸(例如赖氨酸、精氨酸或组氨酸)取代29位的原生氨基酸，和任选地在肽的羧基末端增加1或2个荷正电的氨基酸(例如赖氨酸、精氨酸或组氨酸)，修饰SEQ ID NO：801的原生胰高血糖素肽。根据一些实施方案，提供了具有改善的溶解性和稳定性的胰高血糖素类似物，其中类似物包含SEQ ID NO：834的氨基酸序列，条件是28或29位的至少一个氨基酸被酸性氨基酸取代，和/或在SEQ ID NO：834的羧基末端增加另外的酸性氨基酸。在一些实施方案中，酸性氨基酸选自Asp、Glu、半胱氨酸和同型半胱氨酸。
根据一些实施方案，提供了具有改善的溶解性和稳定性的胰高血糖素激动剂，其中激动剂包含SEQ ID NO：833的氨基酸序列，其中27、28或29位的至少一个氨基酸被非原生氨基酸残基取代(即存在于类似物的27、28或29位的至少一个氨基酸为不同于存在于SEQID NO：801的相应位置的氨基酸的酸性氨基酸)。根据一些实施方案，提供了包含SEQ ID NO：833的序列的胰高血糖素激动剂，条件是当28位的氨基酸为天冬酰胺和29位的氨基酸为苏氨酸时，肽进一步包含增加到胰高血糖肽的羧基末端的独立地选自Lys、Arg、His、Asp或Glu的1或2个氨基酸。
已经报道，可修饰原生胰高血糖素肽的某些位置，同时保留母体肽的至少一些活性。因此，本申请人预期，位于SEQ ID NO：811肽的2、5、7、10、11、12、13、14、16、17、18、19、20、21、24、27、28或29位的一个或多个氨基酸，可用不同于存在于原生胰高血糖素肽的氨基酸的氨基酸取代，并且仍然保留母体胰高血糖素肽的增强的功效、生理pH稳定性和生物活性。例如，根据一些实施方案，存在于原生肽的27位的蛋氨酸残基变为亮氨酸或正亮氨酸，以防止肽的氧化分解。
在一些实施方案中，提供了SEQ ID NO：833的胰高血糖素类似物，其中选自类似物的1、2、5、7、10、11、12、13、14、16、17、18、19、20、21或24位的1-6个氨基酸不同于SEQ 1D NO：801的相应氨基酸。根据另一个实施方案，提供了SEQ ID NO：833的胰高血糖素类似物，其中选自类似物的1、2、5、7、10、11、12、13、14、16、17、18、19、20、21或24位的1-3个氨基酸不同于SEQ 1D NO：801的相应氨基酸。在另一个实施方案中，提供了SEQID NO：807、SEQ ID NO：808或SEQ ID NO：834的胰高血糖素类似物，其中选自类似物的1、2、5、7、10、11、12、13、14、16、17、18、19、20、21或24位的1-2个氨基酸不同于SEQ 1D NO：801的相应氨基酸，并且在其它的实施方案中，那些1或2个不同的氨基酸代表相对于存在于原生序列(SEQ ID NO：801)中的氨基酸的保守氨基酸取代。在一些实施方案中，提供了SEQ ID NO：811或SEQ IDNO：813的胰高血糖素肽，其中胰高血糖素肽在选自2、5、7、10、11、12、13、14、16、17、18、19、20、21、24、27或29位的位置进一步包含1、2、或3个氨基酸取代。在一些实施方案中，2、5、7、10、11、12、13、14、16、17、18、19、20、27或29位的取代为保守氨基酸取代。
在一些实施方案中，提供了包含SEQ ID NO：801的类似物肽的胰高血糖素激动剂，其中类似物与SEQ ID NO：801的不同之处在于：在2位具有非丝氨酸的氨基酸，且在位置28或29上具有取代原生氨基酸的酸性氨基酸或具有加至SEQ ID NO：801肽的羧基末端的酸性氨基酸。在一些实施方案中，酸性氨基酸为天冬氨酸或谷氨酸。在一些实施方案中，提供了SEQ ID NO：809、SEQ ID NO：812、SEQ ID NO：813或SEQ ID NO：832的胰高血糖素类似物，其中的类似物与母体分子的区别在于位置2上的取代。更具体地讲，类似物肽的2位用选自D-丝氨酸、丙氨酸、D-丙氨酸、甘氨酸、n-甲基丝氨酸和氨基异丁酸的氨基酸取代。
在另一个实施方案中，提供包含类似肽SEQ ID NO：801的胰高血糖素激动剂，其中的类似物与SEQ ID NO：801的不同之处在于：在位置1具有不同于组氨酸的氨基酸和具有在位置28或29上具有取代原生氨基酸的酸性氨基酸或具有加至SEQ ID NO：801肽的羧基末端的酸性氨基酸。在某些实施方案中，酸性氨基酸是天冬氨酸或谷氨酸。在一些实施方案中，酸性氨基酸为天冬氨酸或谷氨酸。在一些实施方案中，提供了SEQ ID NO：809、SEQ ID NO：812、SEQ ID NO：813或SEQ ID NO：832的胰高血糖素类似物，其中的类似物与母体分子的区别在于位置1上的取代。更具体说来，类似肽的位置1被选自DMIA，D-组氨酸，去氨基组氨酸，羟基-组氨酸，乙酰基-组氨酸和高组氨酸氨基酸取代。
根据一些实施方案，修饰的胰高血糖素肽包含选自SEQ IDNO：809、SEQ ID NO：812、SEQ ID NO：813和SEQ ID NO：832的序列。在其它的实施方案中，提供了包含SEQ ID NO：809、SEQ ID NO：812、SEQ ID NO：813或SEQ ID NO：832的序列的胰高血糖素肽，所述肽进一步包含1-2个增加到SEQ ID NO：809、SEQ ID NO：812、SEQ ID NO：813或SEQ ID NO：832的C-末端的氨基酸，其中另外的氨基酸独立地选自Lys、Arg、His、Asp、Glu、半胱氨酸或同型半胱氨酸。在一些实施方案中，另外的增加到羧基末端的氨基酸选自Lys、Arg、His、Asp或Glu，或者在其它的实施方案中，另外的氨基酸为Asp或Glu。
在另一个实施方案中，胰高血糖素肽包含序列SEQ ID NO：807或其胰高血糖素激动剂类似物。在一些实施方案中，肽包含选自SEQ ID NO：808、SEQ ID NO：810、SEQ ID NO：811、SEQ ID NO：812和SEQ ID NO：813的序列。在另一个实施方案中，肽包含选自SEQ ID NO：808、SEQ ID NO：810和SEQ ID NO：811的序列。在一些实施方案中，胰高血糖素肽包含SEQ ID NO：808、SEQ ID NO：810和SEQ ID NO：811的序列，所述肽进一步包含增加到胰高血糖素肽的C-末端的选自Asp和Glu的另外氨基酸。在一些实施方案中，胰高血糖素肽包含SEQ ID NO：811或SEQ ID NO：813的序列，并且在其它的实施方案中，胰高血糖素肽包含SEQ ID NO：811的序列。
根据一些实施方案，提供包含选自以下的修饰的胰高血糖素肽的胰高血糖素激动剂：
NH2-His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Xaa-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Xaa-Xaa-Xaa-R(SEQID NO：834)，
NH2-His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-
Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-
Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asp-Thr-R(SEQ IDNO：811)和
NH2-His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Xaa-Tyr-Leu-Glu-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asp-Thr-R(SEQID NO：813)
其中15位的Xaa为Asp、Glu、半胱氨酸、高谷氨酸或同型半胱氨酸，28位的Xaa为Asn或酸性氨基酸，和29位的Xaa为Thr或酸性氨基酸，并且R为酸性氨基酸、COOH或CONH2，条件是酸性酸残基存在于28、29或30位中的一个位置。在一些实施方案中，R为COOH和在另一个实施方案中R为CONH2。
本公开还包括胰高血糖素融合肽，其中第二肽已经稠合至胰高血糖素肽的C-末端以增加胰高血糖素肽的稳定性和溶解性。更具体说来，融合胰高血糖素肽可包括胰高血糖素激动剂类似物，其包含胰高血糖素肽
NH2-His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Xaa-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Xaa-Xaa-Xaa-R(SEQ IDNO：834)，其中R为酸性氨基酸或键和连接于胰高血糖素肽的羧基末端氨基酸的SEQ ID NO：820(GPSSGAPPPS)、SEQ ID NO：821(KRNRNNIA)或SEQ ID NO：822(KRNR)的氨基酸序列。在一些实施方案中，胰高血糖素肽选自SEQ ID NO：833、SEQ ID NO：807或SEQID NO：808，所述肽进一步包含连接于胰高血糖素肽的羧基末端氨基酸的SEQ ID NO：820(GPSSGAPPPS)、SEQ ID NO：821(KRNRNNIA)或SEQ ID NO：822(KRNR)的氨基酸序列。在一些实施方案中，胰高血糖素融合肽包含SEQ ID NO：802、SEQ ID NO：803、SEQ ID NO：804、SEQ ID NO：805和SEQ ID NO：806或其胰高血糖素激动剂类似物，所述肽进一步包含连接于胰高血糖素肽的氨基酸29的NO：820(GPSSGAPPPS)、SEQ ID NO：821(KRNRNNIA)或SEQ ID NO：822(KRNR)的氨基酸序列。根据一些实施方案，融合肽进一步包含连接于16、17、21、24、29位、C-末端延伸段内或C-末端氨基酸的氨基酸的PEG链，其中PEG链选自500-40000道尔顿的范围。在一些实施方案中，SEQ ID NO：820(GPSSGAPPPS)、SEQ ID NO：821(KRNRNNIA)或SEQ ID NO：822(KRNR)的氨基酸序列通过肽键键合于胰高血糖素肽的氨基酸29。在一些实施方案中，胰高血糖素融合肽的胰高血糖素肽部分包含选自SEQ ID NO：810、SEQ ID NO、811和SEQ ID NO：813的序列。在一些实施方案中，胰高血糖素融合肽的胰高血糖素肽部分包含SEQ ID NO：811或SEQ ID NO：813的序列，其中PEG链分别连接于21、24、29位，C-末端延伸段内或C-末端氨基酸。
在另一个实施方案中，融合肽的胰高血糖素肽序列包含SEQID NO：811的序列，其进一步包含连接于胰高血糖素肽的氨基酸29的SEQ ID NO：820(GPSSGAPPPS)、SEQ ID NO：821(KRNRNNIA)或SEQ ID NO：822(KRNR)的氨基酸序列。在一些实施方案中，胰高血糖素融合肽包含选自SEQ ID NO：824、SEQ ID NO：825和SEQ IDNO：826的序列。通常，本发明的融合肽具有包含标准羧酸基团的C-末端氨基酸。然而，其中C-末端氨基酸具有取代羧酸的酰胺的那些序列的类似物也被包括为实施方案。根据一些实施方案，融合胰高血糖素肽包含选自SEQ ID NO：810、SEQ ID NO：811和SEQ ID NO：813的胰高血糖素激动剂类似物，其进一步包含连接于胰高血糖素肽的氨基酸29的SEQ ID NO：823(GPSSGAPPPS-CONH2)的氨基酸序列。
本发明的胰高血糖素激动剂可被进一步修饰，以改善肽在水溶液中的溶解性和稳定性，同时保留胰高血糖素肽的生物活性。根据一些实施方案，预期在选自SEQ ID NO：811肽或其胰高血糖素激动剂类似物的16、17、20、21、24和29位的一个或多个位置引入亲水性基团能改善pH稳定胰高血糖素类似物的溶解性和稳定性。更具体地讲，在一些实施方案中，SEQ ID NO：810、SEQ ID NO：811、SEQ IDNO：813或SEQ ID NO：832的胰高血糖素肽被修饰，以包含共价连接于存在于胰高血糖素肽的21和24位氨基酸的侧链的一个或多个亲水性基团。
根据一些实施方案，修饰SEQ ID NO：811的胰高血糖素肽，以在16、17、20、21、24和/或29位含有一个或多个氨基酸取代，其中原生氨基酸用具有适合于与亲水性部分交联的侧链的氨基酸取代，亲水性部分包括例如PEG。原生肽可用天然存在的氨基酸或合成(非天然存在的)氨基酸取代。合成或非天然存在的氨基酸指的是不是体内天然存在的，但是可加入到本文描述的肽结构中的氨基酸。
在一些实施方案中，提供SEQ ID NO：810、SEQ ID NO：811或SEQ ID NO：813的胰高血糖素激动剂，其中原生胰高血糖素肽序列被修饰，以在原生序列的16、17、21、24、29位、C-末端延伸段内或在C-末端氨基酸中的至少一个位置含有天然存在或合成的氨基酸，其中氨基酸取代物进一步包含亲水性部分。在一些实施方案中，取代在21或24位，并且在其它的实施方案中，亲水性部分为PEG链。在一些实施方案中，SEQ ID NO：811的胰高血糖素肽用至少一个半胱氨酸残基取代，其中半胱氨酸残基的侧链用包括以下的硫醇反应性试剂进一步修饰：例如马来酰亚胺基、乙烯基砜、2-吡啶基硫基、卤代烷基和卤代酰基。这些硫醇反应性试剂可含有羧基、酮、羟基和醚基以及其它亲水性部分例如聚乙二醇单位。在备选的实施方案中，原生胰高血糖素肽用赖氨酸取代，并且取代赖氨酸残基的侧链使用以下胺反性试剂进一步修饰：例如羧酸的活性酯(琥珀酰亚胺基、酐等)或亲水性部分例如聚乙二醇的醛。在一些实施方案中，胰高血糖素肽选自SEQ ID NO：814、SEQ ID NO：815、SEQ ID NO：816、SEQ ID NO：817、SEQ ID NO：818和SEQ ID NO：819。
根据一些实施方案，聚乙二醇化的胰高血糖素肽包含共价键合于胰高血糖素肽的两个或更多个聚乙二醇链，其中胰高血糖素链的总分子量为约1000-约5000道尔顿。在一些实施方案中，聚乙二醇化的胰高血糖素激动剂包含SEQ ID NO：806的肽，其中PEG链共价连接于21位和24位的氨基酸残基，并且其中两个PEG链的合并分子量为约1000-约5000道尔顿。在另一个实施方案中，聚乙二醇化的胰高血糖素激动剂包含SEQ ID NO：806的肽，其中PEG链共价连接于21位和24位的氨基酸残基，并且其中两个PEG链的合并分子量为约5000-约20000道尔顿。
聚乙二醇链可以直链的形式存在，或者其可为分支的。根据一些实施方案，聚乙二醇链具有选自约500-约40000道尔顿的范围的平均分子量。在一些实施方案中，聚乙二醇链具有选自约500-约5000道尔顿的范围的分子量。在另一个实施方案中，聚乙二醇链具有约20000-约40000道尔顿的分子量。
任何一种以上描述的胰高血糖素肽可被进一步修饰，以在胰高血糖素肽的C-末端部分(12-29位氨基酸)中包括共价或非共价分子内桥或者稳定α-螺旋的氨基酸。根据一些实施方案，除了16、20、21或24位(或其组合)的氨基酸取代以外，胰高血糖素肽还包含任何一种或多种用α，α-二取代氨基酸例如Aib的以上讨论的修饰。根据另一个实施方案，除了分子内桥，例如胰高血糖素肽的16和20位的氨基酸侧链之间的内酰胺，胰高血糖素肽包含任何一种或多种以上讨论的修饰。
根据一些实施方案，胰高血糖素肽还包含SEQ ID NO：877的氨基酸序列，其中3位的Xaa为包含以下结构I、II或III的侧链的氨基酸：
其中R1为C0-C3烷基或C0-C3杂烷基；R2为NHR4或C1-C3烷基；R3为C1-C3烷基；R4为H或C1-C3烷基；X为NH、O或S；和Y为NHR4、SR3或OR3。在一些实施方案中，X为NH或Y为NHR4。在一些实施方案中，R1为C0-C2烷基或C1杂烷基。在一些实施方案中，R2为NHR4或C1烷基。在一些实施方案中，R4为H或C1烷基。在示例性实施方案中，提供包含结构I侧链的氨基酸，其中R1为CH2-S，X为NH，和R2为CH3(乙酰氨基甲基-半胱氨酸，C(Acm))；R1为CH2，X为NH，和R2为CH3(乙酰基二氨基丁酸，Dab(Ac))；R1为C0烷基，X为NH，R2为NHR4和R4为H(氨基甲酰基二氨基丙酸，Dap(脲))；或者R1为CH2-CH2，X为NH和R2为CH3(乙酰鸟氨酸，Orn(Ac))。在示例性实施方案中，提供了包含结构II的侧链的氨基酸，其中R1为CH2，Y为NHR4和R4为CH3(甲基谷氨酰胺，Q(Me))；在示例性实施方案中，提供了包含结构III的侧链的氨基酸，其中R1为CH2和R4为H(蛋氨酸亚砜，M(O))；在特定的实施方案中，3位的氨基酸用Dab(Ac)取代。例如，胰高血糖素激动剂包含SEQ ID NO：863、SEQ IDNO：869、SEQ ID NO：871、SEQ ID NO：872、SEQ ID NO：873和SEQID NO：874的氨基酸序列。
在某些实施方案中，胰高血糖素肽为SEQ ID NO：877的胰高血糖素肽的类似物。在特定的方面，类似物包括本文描述的任何氨基酸修饰，包括，但不限于：用荷电氨基酸取代28位的Asn；用选自Lys、Arg、His、Asp、Glu、半胱氨酸和同型半胱氨酸的荷电氨基酸取代28位的Asn；用Asn、Asp或Glu在位置28取代；用Asp在位置28取代；用Glu在位置28上取代；用荷电氨基酸取代29位的Thr；用选自Lys、Arg、His、Asp、Glu、半胱氨酸和同型半胱氨酸的荷电氨基酸取代29位的Thr；用Asp、Glu或Lys在29位取代；用Glu在29位取代；在29位之后***1-3个荷电氨基酸；在29位之后***Glu或Lys；在29位之后***Gly-Lys或Lys-Lys；及其组合。
在某些实施方案中，SEQ ID NO：877的胰高血糖素肽的类似物在16、20、21和24位中的1、2、3个或全部位置包含α，α-二取代的氨基酸，例如Aib。
在某些实施方案中，SEQ ID NO：877的胰高血糖素肽的类似物包含以下中的一种或多种：用减小胰高血糖素肽被二肽基肽酶IV(DPP-IV)裂解的敏感性的非原生氨基酸取代1位的His；用减小胰高血糖素肽被二肽基肽酶IV(DPP-IV)裂解的敏感性的非原生氨基酸取代2位的Ser；用缺乏羟基的氨基酸例如Abu或Ile取代7位的Thr；用Phe或Val取代10位的Thr；用Arg取代12位的Lys；用Glu取代15位的Asp；用Thr或Aib取代16位的Ser；用Ala或Aib取代20位的Gln；用Glu取代21位的Asp；用Ala或Aib取代24位的Gln；用Leu或Nle取代27位的Met；27-29位的氨基酸缺失；28-29位的氨基酸缺失；29位的氨基酸缺失；在C-末端增加SEQ ID NO：820的氨基己酸序列，其中29位的氨基酸为Thr或Gly，或其组合。
根据特别的实施方案，胰高血糖素肽包含SEQ ID NOs：862-867和869-874中任何一种的氨基酸序列。
在某些实施方案中，包含SEQ ID NO：877的胰高血糖素肽的类似物包含共价连接于16、17、20、21、24和29位中任何位置的氨基酸或C-末端氨基酸的亲水性部分，例如PEG。
在某些实施方案中，包含SEQ ID NO：877的胰高血糖素肽的类似物包含氨基酸，所述氨基酸包含共价连接于(任选地通过间隔区)酰基或烷基的侧链，其酰基或烷基对天然存在氨基酸而言是非原生的。在一些实施方案中，酰基为C4-C30脂肪酰基。在其它的实施方案中，烷基为C4-C30烷基。在特定的方面，酰基或烷基共价连接于10位的氨基酸侧链。在一些实施方案中，7位的氨基酸为Ile或Abu。
胰高血糖素激动剂可为包含SEQ ID NOs：801-919中任何一种的氨基酸序列的肽，这种肽任选地具有最多1、2、3、4或5个保留胰高血糖素激动剂活性的其它修饰。在某些实施方案中，胰高血糖素激动剂包含SEQ ID NOs：859-919中任何一种的氨基酸。
2类胰高血糖素相关肽
在某些实施方案中，胰高血糖素相关肽是2类胰高血糖素相关肽，其描述于本文和国际专利公开号WO 2010/011439和美国申请号61/187,578(2009年6月16日提交)，它们的内容通过全文引用结合于本文中。
在涉及2类胰高血糖素相关肽的以下章节中提及的生物序列(SEQ ID NOs：1001-1262)对应于国际专利出版物第WO 2010/011439号中的SEQ ID NOs：1-262。涉及2类胰高血糖素相关肽的SEQ IDNOs：1263-1275对应于美国申请第61/187578号中的SEQ ID NOs：657-669。
活性
原生胰高血糖素不激活GIP受体，并且通常具有约1％的原生GLP-1对GLP-1受体的活性。本文描述的对原生胰高血糖素序列的修饰产生2类胰高血糖素相关肽，其可表现出比原生胰高血糖素(SEQ ID NO：1001)的活性相当或更好的有效胰高血糖素活性，比原生GIP(SEQ ID NO：1004)的活性相当或更好的有效GIP活性，和/或比原生GLP-1的活性相当或更好的有效GLP-1活性。在这方面，2类胰高血糖素相关肽可为胰高血糖素/GIP协同激动剂、胰高血糖素/GIP/GLP-1三重激动剂、GIP/GLP-1协同激动剂或GIP激动剂胰高血糖素肽中的一种，如本文进一步描述的那样。
在一些实施方案中，本文描述的2类胰高血糖素相关肽对GIP受体激活活性表现出约100nM或者更小，或约75、50、25、10、8、6、5、4、3、2或1nM或者更小的EC50。在一些实施方案中，2类胰高血糖素相关肽对胰高血糖素受体激活表现出约100nM或者更小，或约75、50、25、10、8、6、5、4、3、2或1nM或者更小的EC50。在一些实施方案中，2类胰高血糖素相关肽对GLP-1受体激活表现出约100nM或者更小，或约75、50、25、10、8、6、5、4、3、2或1nM或者更小的EC50。可通过测定过表达GIP受体的HEK293细胞中cAMP介导的体外试验，例如，如在实施例2中描述的用编码受体的DNA和连至cAMP响应元件的荧光素酶基因共转染试验HEK293细胞，测定受体活化。
在一些实施方案中，相对于原生GIP，2类胰高血糖素相关肽对GIP受体表现出至少约0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、75％、100％、125％、150％、175％或200％或者更高的活性(GIP功效)。在一些实施方案中，相对于原生GIP，本文描述的胰高血糖素肽对GIP受体表现出不大于1000％、10000％、100000％或1000000％的活性。在一些实施方案中，相对于原生胰高血糖素，2类胰高血糖素相关肽对胰高血糖素受体表现出至少约1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、75％、100％、125％、150％、175％、200％、250％、300％、350％、400％、450％或500％或者更高的活性(胰高血糖素功效)。在一些实施方案中，相对于原生胰高血糖素，本文描述的胰高血糖素肽对胰高血糖素受体表现出不多于1000％、10000％、100000％或1000000％的活性。在一些实施方案中，相对于原生GLP-1，2类胰高血糖素相关肽对GLP-1受体表现出至少约0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、75％、100％、125％、150％、175％或200％或者更高的活性(GLP-1功效)。在一些实施方案中，相对于原生GLP-1，本文描述的胰高血糖素肽对GLP-1受体表现出不大于1000％、10000％、100000％或1000000％的活性。2类胰高血糖素相关肽对受体相对于受体的原生配体的活性作为2类胰高血糖素相关肽的EC50与原生配体相比较的反比来计算。
在一些实施方案中，2类胰高血糖素相关肽对胰高血糖素受体和GIP受体两者表现出活性(“胰高血糖素/GIP协同激动剂”)。这些2类胰高血糖素相关肽已经丧失原生胰高血糖素对胰高血糖素受体与GIP受体相比较的选择性。在一些实施方案中，2类胰高血糖素相关肽对GIP受体的EC50与其对胰高血糖素受体的EC50相差(更高或更低)少于约50倍、40倍、30倍或20倍。在一些实施方案中，2类胰高血糖素相关肽的GIP功效与其胰高血糖素功效相差(更高或更低)少于约500、450、400、350、300、250、200、150、100、75、50、25、20、15、10或5倍。在一些实施方案中，2类胰高血糖素相关肽对GIP受体的EC50除以2类胰高血糖素相关肽对胰高血糖素受体的EC50的比率为少于约100、75、60、50、40、30、20、15、10或5。在一些实施方案中，对GIP受体的EC50除以对胰高血糖素受体的EC50的比率为约1或少于约1(例如约0.01、0.013、0.0167、0.02、0.025、0.03、0.05、0.067、0.1、0.2)。在一些实施方案中，2类胰高血糖素相关肽的GIP功效与2类胰高血糖素相关肽的胰高血糖素功效的比率少于约500、450、400、350、300、250、200、150、100、75、60、50、40、30、20、15、10或5。在一些实施方案中，对GIP受体的功效除以对胰高血糖素受体的功效的比率为约1或少于约1(例如约0.01、0.013、0.0167、0.02、0.025、0.03、0.05、0.067、0.1、0.2)。在一些实施方案中，例如通过7位氨基酸修饰、氨基酸C-末端至27或28位氨基酸缺失，得到27或28个氨基酸的肽或其组合，其显著减小或破坏GLP-1活性。
另一方面，2类胰高血糖素相关肽对胰高血糖素、GIP和GLP-1受体表现出活性(“胰高血糖素/GIP/GLP-1三重激动剂”)。这些2类胰高血糖素相关肽已经丧失原生胰高血糖素对胰高血糖素受体与GLP-1和GIP受体两者相比较的选择性。在一些实施方案中，2类胰高血糖素相关肽对GIP受体的EC50与其对胰高血糖素和GLP-1受体的相应EC50相差(更高或更低)少于约50倍、40倍、30倍或20倍。在一些实施方案中，2类胰高血糖素相关肽的GIP功效与其胰高血糖素和GLP-1功效相差(更高或更低)少于约500、450、400、350、300、250、200、150、100、75、50、25、20、15、10或5倍。在一些实施方案中，三重激动剂对GIP受体的EC50除以三重激动剂对GLP-1受体的EC50的比率少于约100、75、60、50、40、30、20、15、10或5。在一些实施方案中，对GIP受体的EC50除以对GLP-1受体的EC50的比率为约1或少于约1(例如约0.01、0.013、0.0167、0.02、0.025、0.03、0.05、0.067、0.1、0.2)。在一些实施方案中，三重激动剂的GIP受体功效与三重激动剂的GLP-1功效相比较的比率少于约100、75、60、50、40、30、20、15、10或5。在一些实施方案中，对GIP受体的功效除以对GLP-1受体的功效的比率为约1或少于约1(例如约0.01、0.013、0.0167、0.02、0.025、0.03、0.05、0.067、0.1、0.2)。在相关的实施方案中，三重激动剂对GIP受体EC50除以三重激动剂对胰高血糖素受体的EC50的比率少于约100、75、60、50、40、30、20、15、10或5。在一些实施方案中，对GIP受体的EC50除以对胰高血糖素受体的EC50的比率为约1或少于约1(例如约0.01、0.013、0.0167、0.02、0.025、0.03、0.05、0.067、0.1、0.2)。在一些实施方案中，三重激动剂的GIP功效与三重激动剂的胰高血糖素功效相比较的比率少于约500、450、400、350、300、250、200、150、100、75、60、50、40、30、20、15、10或5。在一些实施方案中，对GIP受体的功效除以对胰高血糖素受体的功效的比率为约1或少于约1(例如约0.01、0.013、0.0167、0.02、0.025、0.03、0.05、0.067、0.1、0.2)。在一些实施方案中，三重激动剂对GLP-1受体的EC50除以三重激动剂对胰高血糖素受体的EC50的比率少于约100、75、60、50、40、30、20、15、10或5。在一些实施方案中，对GLP-1受体的EC50除以对胰高血糖素受体的EC50的比率为约1或少于约1(例如约0.01、0.013、0.0167、0.02、0.025、0.03、0.05、0.067、0.1、0.2)。在一些实施方案中，三重激动剂的GLP-1功效与三重激动剂的胰高血糖素功效相比较的比率少于约100、75、60、50、40、30、20、15、10或5。在一些实施方案中，对GLP-1受体的功效除以对胰高血糖素受体的功效的比率为约1或少于约1(例如约0.01、0.013、0.0167、0.02、0.025、0.03、0.05、0.067、0.1、0.2)。
在又一方面，2类胰高血糖素相关肽对GLP-1和GIP受体呈现活性，但是其中例如通过3位的氨基酸修饰，显著减小或破坏胰高血糖素活性(“GIP/GLP-1协同激动剂”)。例如，该位置用酸性、碱性或疏水性氨基酸(谷氨酸、鸟氨酸、正亮氨酸)取代可减小胰高血糖素活性。在一些实施方案中，胰高血糖素肽对GIP受体的EC50与其对GLP-1受体的EC50相差(更高或更低)少于约50倍、40倍、30倍或20倍。在一些实施方案中，2类胰高血糖素相关肽的GIP功效与其GLP-1功效相差(更高或更低)少于约25、20、15、10或5倍。在一些实施方案中，在一些实施方案中，2类胰高血糖素相关肽具有原生胰高血糖素对胰高血糖素受体的活性的约10％或者更少，例如约1-10％或约0.1-10％，或者大于约0.1％但是少于约10％。在一些实施方案中，2类胰高血糖素相关肽对GIP受体的EC50除以2类胰高血糖素相关肽对GLP-1受体的EC50的比率少于约100、75、60、50、40、30、20、15、10或5，并且不少于1。在一些实施方案中，2类胰高血糖素相关肽的GIP功效与2类胰高血糖素相关肽的GLP-1功效的比率少于约100、75、60、50、40、30、20、15、10或5，并且不少于1。
在另一方面，2类胰高血糖素相关肽对GIP受体呈现活性，其中例如通过在3位用Glu和7位用Ile进行氨基酸修饰，显著减小或破坏胰高血糖素和GLP-1活性(“GIP激动剂胰高血糖素肽”)。在一些实施方案中，这些2类胰高血糖素相关肽具有原生胰高血糖素对胰高血糖素受体的活性的约10％或者更少，例如约1-10％、或约0.1-10％，或者大于约0.1％、0.5％或1％，但是少于约1％、5％或10％。在一些实施方案中，这些2类胰高血糖素相关肽也具有原生GLP-1对GLP-1受体的约10％或者更少的活性，例如约1-10％、或约0.1-10％，或者大于约0.1％、0.5％或1％，但是少于约1％、5％或10％。
在一些实施方案中，当2类胰高血糖素相关肽未被聚乙二醇化时，2类胰高血糖素相关肽对GIP受体激活的EC50为约4、2、1nM或者更小，或者类似物具有原生GIP对GIP受体的至少约1％、2％、3％、4％或5％的活性。在相关的实施方案中，未被聚乙二醇化的2类胰高血糖素相关肽对GLP-1受体激活的EC50为约4、2、1nM或者更小，或者具有原生GLP-1对GLP-1受体的至少约1％、2％、3％、4％或5％的活性。在另外的其它相关的实施方案中，未被聚乙二醇化的2类胰高血糖素相关肽对胰高血糖素受体激活的EC50为约4、2、1nM或者更小，或者原生胰高血糖素对胰高血糖素受体的至少约5％、10％、15％或20％的活性。在一些实施方案中，未被聚乙二醇化的2类胰高血糖素相关肽具有原生胰高血糖素对胰高血糖素受体的少于约1％的活性。在其它的实施方案中，未被聚乙二醇化的2类胰高血糖素相关肽具有原生GLP-1对GLP-1受体的少于约10％、5％或1％的活性。
在其中2类胰高血糖素相关肽连接于亲水性部分比如PEG的实施方案中，对一种或多种受体的相对EC50s可为更高，例如高约10倍。例如，聚乙二醇化的类似物对GIP受体激活的EC50为约10nM或者更小，或者2类胰高血糖素相关肽具有原生GIP对GIP受体的至少约0.1％、0.2％、0.3％、0.4％或0.5％的活性。在相关的实施方案中，聚乙二醇化的2类胰高血糖素相关肽对GLP-1受体激活的EC50为约10nM或者更小，或者具有原生GLP-1对GLP-1受体的至少约0.1％、0.2％、0.3％、0.4％或0.5％的活性。在另外的其它相关的实施方案中，聚乙二醇化的2类胰高血糖素相关肽对胰高血糖素受体激活的EC50为约10nM或者更小，或者为原生胰高血糖素对胰高血糖素受体的至少约0.5％、1％、1.5％或2％的活性。在一些实施方案中，2类胰高血糖素相关肽具有原生胰高血糖素对胰高血糖素受体的少于约1％的活性。在其它的实施方案中，2类胰高血糖素相关肽具有原生GLP-1对GLP-1受体的少于约10％、5％或1％的活性。
修饰
本文关于2类胰高血糖素相关肽公开的修饰允许调控胰高血糖素(SEQ ID NO：1001)，以产生呈现增大的GIP活性、胰高血糖素活性和/或GLP-1活性的胰高血糖素肽。本文关于2类胰高血糖素相关肽公开的其它修饰延长半衰期、增大溶解性或增加生成的肽的稳定性。本文关于2类胰高血糖素相关肽公开的另外的其它修饰对活性没有影响，或者可不破坏所要求的一种或多种活性。关于用于相同目的(例如增大活性)的2类胰高血糖素相关肽的任何组合可单独或组合使用。关于给予性能增强的2类胰高血糖素相关肽的任何单一或多套组合可单独或组合使用，例如增大GIP和/或GLP-1活性可与增加半衰期相结合。在相关的实施方案中，1、2、3、4、5、6个或者更多的氨基酸修饰可为非保守的取代、增加或缺失。在一些实施方案中，1、2、3、4、5、6个或者更多的氨基酸修饰可为保守取代。
影响GIP活性的修饰
通过1位的氨基酸修饰提供对GIP受体的增强的活性。例如，1位的His用大的芳族氨基酸，任选地用Tyr、Phe、Trp、氨基-Phe、硝基-Phe、氯-Phe、磺基-Phe、4-吡啶基-Ala、甲基-Tyr或3-氨基-Tyr取代。1位的Tyr与对应于氨基酸12-29的区域中的α-螺旋稳定相结合，提供激活GIP受体以及GLP-1受体和胰高血糖素受体的2类胰高血糖素相关肽。通过例如形成共价或非共价分子内桥，或者在约12-29位用稳定α螺旋的氨基酸(例如α，α-二取代氨基酸)取代和/或***氨基酸，可稳定α螺旋结构。
通过27和/或28位以及任选地在29位的氨基酸修饰也提供对GIP受体的增强的活性。例如27位的Met用大的芳族氨基酸，任选地用Leu取代，28位的Asn用小的脂肪族氨基酸，任选地用Ala取代，和29位的Thr用小的脂肪族氨基酸，任选地用Gly取代。相对于那些位置的原生MNT序列，在27-29位用LAG取代可提供增加的GIP活性。
通过12位的氨基酸修饰也提供对GIP受体的增强的活性。例如12位用大的脂肪族非极性氨基酸取代，任选地用Ile取代。
通过17和/或18位的氨基酸修饰也提供对GIP受体的增强的活性。例如，17位用极性残基，任选地用Gln取代，和18位用小的脂肪族氨基酸，任选地用Ala取代。相对于那些位置的原生RR序列，在17和18位用QA取代可提供增加的GIP活性。
通过允许在12-29位的氨基酸侧链之间形成分子内桥的修饰，提供对GIP受体的增加的活性。例如，通过在i和i+4位的两个氨基酸侧链之间或在j和j+3位之间、或在k和k+7位之间的共价键可形成分子内桥。在示例性实施方案中，这种桥在12和16、16和20、20和24、24和28或者17和20位之间。在其它的实施方案中，可在那些位置的荷正和负电的氨基酸之间形成非共价相互作用比如盐桥。
增加GIP受体活性的以上描述的任何修饰可单独或组合应用。增加GIP受体活性的修饰的组合比单独采用任何一种这样的修饰提供更高的GIP活性。
影响胰高血糖素活性的修饰
在一些实施方案中，通过原生胰高血糖素(SEQ ID NO：1001)的16位氨基酸修饰，提供胰高血糖素功效增强。通过非限制性实例，通过用谷氨酸或用具有4个原子长度的侧链的另一种荷负电的氨基酸、或者用谷氨酰胺、高谷氨酸或同型半胱氨酸或荷电氨基酸(具有包含至少一个杂原子(例如N、O、S、P)的侧链并具有约4(或3-5)个原子的侧链长度)中的任何一种取代16位的天然存在的丝氨酸，可提供这种功效增强。在一些实施方案中，胰高血糖素肽保留其对胰高血糖素受体相对于GLP-1受体的原始选择性。
通过3位的氨基酸修饰，例如用酸性、碱性或疏水性氨基酸取代3位的天然存在的谷氨酰胺，可减小胰高血糖素受体活性。例如用谷氨酸、鸟氨酸或正连氨酸在位置3取代显著减小或破坏胰高血糖素受体活性。
通过用谷氨酰胺类似物修饰3位的Gln，可实现保持或增强对胰高血糖素受体的活性，如本文描述的那样。例如，胰高血糖素激动剂可包含SEQ ID NOs：1243-1248、1250、1251和1253-1256中任何一种的氨基酸序列。
通过稳定胰高血糖素肽或其类似物的C-末端部分(氨基酸
12-29)的α-螺旋结构的修饰，提供由于1和2位的氨基酸修饰减小的胰高血糖素活性的恢复。例如，通过在i和i+4位的两个氨基酸侧链之间或在j和j+3位之间、或在k和k+7位之间的共价键可形成分子内桥。在其它的实施方案中，可在那些位置的荷正和负电的氨基酸之间形成非共价相互作用比如盐桥。在另外的其它实施方案中，在保留要求的活性的位置的该C-末端部分(氨基酸12-29)***或取代一个或多个α，α-二取代氨基酸。例如，16、20、21或24位中的1、2、3个或全部位置用α，α-二取代氨基酸例如Aib取代。
影响GLP-1活性的修饰
通过用电荷中性基团，诸如酰胺或酯置换C-末端氨基酸的羧酸提供对GLP-1的增强的活性。
通过稳定胰高血糖素肽的C-末端部分(约氨基酸12-29)的α-螺旋结构，例如通过在两个氨基酸的侧链之间形成分子内桥，或者用稳定α-螺旋的氨基酸(例如α，α-二取代氨基酸)取代和/或***约12-29位的氨基酸，也提供对GLP-1受体的增强的活性，如本文进一步描述的那样。在示例性实施方案中，氨基酸对12和16、13和17、16和20、17和21、20和24或24和28(其中i＝12、16、20或24的氨基酸对)的侧链相互连接，并因此稳定胰高血糖素α-螺旋。在一些实施方案中，桥或连接基长度为约8(或约7-9)个原子，特别是当桥在i和i+4位之间时。在一些实施方案中，桥或连接基长度为约6(或约5-7)个原子，特别是当桥在j和j+3位之间时。
在一些实施方案中，通过以下方式形成分子内桥：(a)用谷氨酸或用具有4个原子长度的侧链的另一种荷负电的氨基酸、或者作为选择，用谷氨酰胺、高谷氨酸或同型半胱氨酸或荷电氨基酸(具有包含至少一个杂原子(例如N、O、S、P)的侧链并具有约4(或3-5)个原子的侧链长度)中的任何一种取代16位的天然存在的丝氨酸，和(b)用另一种亲水性氨基酸(具有荷电或具有氢键键合能力和长度为至少约5(或约4-6)个原子的侧链)例如赖氨酸、瓜氨酸、精氨酸或鸟氨酸取代20位的天然存在的谷氨酰胺，形成分子内桥。16和20位的这类氨基酸的侧链可形成盐桥，或者可共价连接。在一些实施方案中，两个氨基酸相互键合形成内酰胺环。
在一些实施方案中，通过形成非内酰胺桥的分子内桥，实现胰高血糖素肽的C-末端部分中的α-螺旋结构的稳定。例如，合适的共价键合方法包括烯烃复分解反应、基于羊毛硫氨酸的环化、二硫桥键或形成改性含硫桥、使用α，ω-二氨基烷烃系链、形成金属-原子桥中的任何一种或多种，并且其它肽环化手段用于稳定α-螺旋。
在另外的其它的实施方案中，在保留要求的活性的位置的该C-末端部分(氨基酸12-29)***或取代一个或多个α，α-二取代氨基酸。例如，16、20、21或24位中的1、2、3个或全部位置用α，α-二取代氨基酸例如Aib取代。
如本文描述的，通过位置20上的氨基酸修饰，提供对GLP-1受体的增加的活性。
通过在C-末端增加GPSSGAPPPS(SEQ ID NO：1095)或XGPSSGAPPPS(SEQ ID NO：1096)，提供对GLP-1受体的增加的活性。如本文描述的那样，通过修饰18、28或29位、或者18和29位的氨基酸，可进一步增加这种类似物中的GLP-1活性。
通过把10位的氨基酸修饰为大的芳族氨基酸残基，任选地为Trp，提供GLP-1功效的进一步的适度增加。
如本文描述的那样，例如通过7位的氨基酸修饰，提供对GLP-1受体的减小的活性。
通过丙氨酸取代18位的原生精氨酸，可进一步增强对GLP-1受体的功效。
关于增加GLP-1受体活性的2类胰高血糖素相关肽的上述任何一种修饰可单独或组合应用。增加GLP-1受体活性的修饰的组合通常比单独采用这种修饰中的任何一种提供更高的GLP-1活性。例如，本发明提供在16位、在20位、和在C-末端羧酸基团包含修饰，任选地在16和20位的氨基酸之间具有共价键的胰高血糖素肽；在16位和C-末端羧酸基团包含修饰的胰高血糖素肽；在16和20位包含修饰，任选地在16和20位的氨基酸之间具有共价键的胰高血糖素肽；和在20位和C-末端羧酸基团包含修饰的胰高血糖素肽。
增强DPP-IV抗性的修饰
在1和/或2位的修饰可增加肽对二肽基肽酶IV(DPP IV)裂解的抗性。例如，可用本文描述的DPP-IV抗性氨基酸在1位和/或2位取代。在一些实施方案中，2位的氨基酸用N-甲基丙氨酸取代。在1和/或2位的修饰可增加肽对二肽基肽酶IV(DPP IV)裂解的抗性。例如，可用本文描述的DPP-IV抗性氨基酸在1位和/或2位取代。在一些实施方案中，2位的氨基酸用N-甲基丙氨酸取代。
据观察，2位的修饰(例如2位的Aib)并且在一些情况中为1位的修饰(例如1位的DMIA)可降低胰高血糖素活性，有时是显著的，出人意外地，通过稳定胰高血糖素的C-末端部分(约氨基酸12-29)的α-螺旋结构，例如通过在两个氨基酸的侧链之间形成共价键，可恢复这种胰高血糖素活性的减小，如本文描述的那样。在一些实施方案中，共价键在“i ”和“i+4”位，或“j”和“j+3”位的氨基酸之间，例如在12和16、16和20、20和24、24和28或17和20位之间。在示例性实施方案中，这种共价键为16位的谷氨酸和20位的赖氨酸之间的内酰胺桥。在一些实施方案中，这种共价键为非内酰胺桥的分子内桥，如本文描述的那样。
减少降解的修饰
在另外的其它示例性实施方案中，任何一种2类胰高血糖素相关肽可被进一步修饰，以通过修饰SEQ ID NO：1001的15和/或16位的氨基酸改善稳定性，减少肽随着时间推移，尤其是在酸性或碱性缓冲液中的降解。这样的修饰减少Asp15-Ser16肽键的裂解。在示例性实施方案中，15位的氨基酸修饰为缺失或用谷氨酸、高谷氨酸、半胱氨酸或同型半胱氨酸取代Asp。在其它示例性实施方案中，16位的氨基酸修饰为缺失或者用Thr或Aib取代Ser。在其它示例性实施方案中，16位的Ser用谷氨酸或用具有4个原子长度的侧链的另一种荷负电氨基酸、或者用谷氨酰胺、高谷氨酸或同型半胱氨酸中的任何一种取代。
在一些实施方案中，存在于原生肽的27位的蛋氨酸残基例如通过缺失或取代进行修饰。这样的修饰可防止肽的氧化降解。在一些实施方案中，27位的Met用亮氨酸、异亮氨酸或正亮氨酸取代。在一些特别的实施方案中，27位的Met用亮氨酸或正亮氨酸取代。
在一些实施方案中，20和/或24位的Gln通过例如缺失或取代进行修饰。这样的修饰可减少通过Gln的脱酰胺作用发生的降解。在一些实施方案中，20和/或24位的Gln用Ser、Thr、Ala或Aib取代。在一些实施方案中，20和/或24位的Gln用Lys、Arg、Orn或瓜氨酸取代。
在一些实施方案中，21位的Asp例如通过缺失或取代进行修饰。这样的修饰可减少通过Asp的脱水形成环状琥珀酰亚胺中间体，随后异构化为异天冬氨酸酯而发生的降解。在一些实施方案中，21位用Glu、高谷氨酸或同型半胱氨酸取代。在一些特别的实施方案中，21位用Glu取代。
α-螺旋结构的稳定
2类胰高血糖素相关肽的C-末端部分(约氨基酸12-29)中的α-螺旋结构的稳定提供GLP-1和/或GIP活性增强，并且恢复通过1和/或2位的氨基酸修饰减少的胰高血糖素活性。通过例如形成共价或非共价分子内桥，或者用稳定α螺旋的氨基酸(例如α，α-二取代氨基酸)取代和/或***约12-29位的氨基酸，来稳定α螺旋结构。可如本文描述的那样实现稳定GIP激动剂的α螺旋结构。
酰化和烷基化
根据一些实施方案，本文公开的胰高血糖素肽被修饰，以包含酰基或烷基，例如，对如本文描述的天然存在的氨基酸而言酰基或烷基是非原生的。酰化或烷基化可增加胰高血糖素肽在循环中的半衰期。酰化或烷基化可有利地延迟起效作用和/或延长对胰高血糖素和/或GLP-1受体的作用持续时间，和/或改善对蛋白酶例如DPP-IV的抗性，和/或改善溶解性。酰化后可保持胰高血糖素肽对胰高血糖素和/或GLP-1和/或GIP受体的活性。在一些实施方案中，酰化的胰高血糖素肽的功效与胰高血糖素肽的未酰化版本相当。2类胰高血糖素相关肽可如本文描述的那样，在其中连接亲水性部分的相同的氨基酸位置，或在不同的氨基酸位置进行酰化烷基化。
在一些实施方案中，本发明提供被修饰以包含共价连接于胰高血糖素肽的10位氨基酸的酰基或烷基的胰高血糖素肽。胰高血糖素肽可在胰高血糖素肽的10位氨基酸和酰基或烷基之间进一步包含间隔区。在一些实施方案中，酰基为脂肪酸或胆汁酸或其盐，例如C4-C30脂肪酸、C8-C24脂肪酸、胆酸、C4-C30烷基、C8-C24烷基、或包含胆汁酸的甾体部分的烷基。间隔区为具有合适的连接酰基或烷基的反应性基团的任何部分。在示例性实施方案中，间隔区包含氨基酸、二肽、三肽、亲水性双功能或疏水性双功能间隔区。在一些实施方案中，间隔区选自Trp、Glu、Asp、Cys和包含NH2(CH2CH2O)n(CH2)mCOOH的间隔区，其中m为1-16的任何整数和n为2-12的任何整数。这种酰化或烷基化的胰高血糖素肽也可进一步包含亲水性部分，任选地为聚乙二醇。任何上述胰高血糖素肽可包含两个酰基或两个烷基或其组合。
缀合物和融合体
GIP激动剂可任选经共价连接和任选经连接基连着如本文描述的缀合物部分。
在其它实施方案中，第二肽是XGPSSGAPPPS(SEQ ID NO：1096)，其中X选自20种常见氨基酸中的一种，例如谷氨酸、天冬氨酸或甘氨酸。在一些实施方案中，X代表氨基酸，例如Cys，其进一步包含共价连接于该氨基酸的侧链的亲水性部分。这种C-末端延伸段改善溶解性，并且也可改善GIP或GLP-1活性。在其中胰高血糖素肽进一步包含羧基末端延伸段的一些实施方案中，延伸段的羧基末端氨基酸终止于酰胺基或酯基而不是羧酸。
在一些实施方案中，例如在包含C-末端延伸的胰高血糖素肽中，原生胰高血糖素肽的29位苏氨酸被甘氨酸替代。例如，具有取代29位苏氨酸的甘氨酸并包含GPSSGAPPPS(SEQ ID NO：1095)的C-末端延伸的胰高血糖素肽对GLP-1受体的功效为被修饰包含相同C-末端延伸的原生胰高血糖素的4倍。这种T29G取代可与本文公开的增强胰高血糖素肽对GLP-1受体的亲和性的其它修饰结合使用。例如，T29G取代可与S16E和N20K氨基酸取代组合，任选地在16和20氨基酸之间具有内酰胺桥，和任选地增加本文描述的PEG链。
在某些实施方案中，将氨基酸加至C-末端，外加的氨基酸选自谷氨酸、天冬氨酸和甘氨酸。
提高溶解性的修饰
在另一个实施方案中，通过氨基酸取代和/或增加，在肽的C-末端部分，优选地在SEQ ID NO：1001的C-末端位置至27位引入荷电氨基酸，可改善任何胰高血糖素肽的溶解性。任选地，可在C-末端部分中，优选地在C-末端-27位引入1、2或3个荷电氨基酸。在一些实施方案中，28和/或29位的原生氨基酸用1或2个荷电氨基酸取代，和/或在其它的实施方案中，也在肽的C-末端增加1-3个荷电氨基酸。在示例性实施方案中，1、2个或全部的荷电氨基酸荷负电。在一些实施方案中，荷负电的(酸性氨基酸)为天冬氨酸或谷氨酸。
可对仍然使其保留GIP活性(和任选地GLP-1活性和/或胰高血糖素活性)的胰高血糖素肽进行另外的修饰例如保守取代。
其它修饰
关于增加或降低GIP活性，增加或降低胰高血糖素受体活性，和增加GLP-1受体活性的2类肽的上述任何修饰，可单独或组合应用。关于2类胰高血糖素相关肽以上描述的任何修饰，也可与给予其它合乎需要的性能的其它修饰相组合，这种其它合乎需要的性能包括例如增大溶解性和/或稳定性和/或作用持续时间，如本文关于2类胰高血糖素相关肽描述的那样。作为选择，关于2类胰高血糖素相关肽的上述任何修饰，可与关于基本不影响溶解性或稳定性或活性的2类胰高血糖素相关肽本文描述的其它修饰相组合。示例性的修饰包括但不限于：
(A)例如，通过在原生胰高血糖素的C-末端部分，优选地在C-末端位至27位引入1、2、3或更多个荷电氨基酸改善溶解性。通过例如在28或29位用荷电氨基酸取代原生氨基酸，或者通过例如在27、28或29位之后增加荷电氨基酸，可引入这样的荷电氨基酸。在示例性实施方案中，1、2、3个或全部的荷电氨基酸荷负电。在其它的实施方案中，1、2、3个或全部的荷电氨基酸荷正电。这样的修饰增大溶解性，例如在约5.5-8之间的给定pH例如pH 7下，当在25℃下24小时之后测量时，提供相对于原生胰高血糖素至少2倍、5倍、10倍、15倍、25倍、30倍或者更大的溶解性；
(B)如本文描述的，通过例如在肽的位置16，17，20，21，24或29、在C-末端延伸段内或在C-末端氨基酸加入亲水部分诸如聚乙二醇链，提高溶解性和延长作用时间或循环半衰期。
(C)如本文描述的，通过酰化或烷基化胰高血糖素肽，提高溶解性和/或延长作用时间或循环半衰期和/或延迟开始作用时间；
(D)如本文描述的，通过引入对二肽基肽酶IV(DPP IV)裂解的抗性，修饰位置1或2的氨基酸，延长作用时间或循环半衰期。
(E)通过修饰15位的Asp，例如通过缺失或用谷氨酸、高谷氨酸、半胱氨酸或同型半胱氨酸取代增加稳定性。这样的修饰可减少在5.5-8范围内的pH下降解或裂解，例如在25℃下24小时之后保留至少75％、80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％，最多100％的原始肽。这样的修饰减少Asp15-Ser16之间的肽键裂解。
(F)通过例如用Thr或Aib取代来修饰16位的Ser，增加稳定性。这样的修饰也减少Asp15-Ser16之间的肽键裂解。
(G)通过例如用亮氨酸或正亮氨酸取代来修饰27位的蛋氨酸以增加稳定性。这样的修饰可减少氧化降解。通过例如用Ser、Thr、Ala或Aib取代来修饰20或24位的Gln，也可增加稳定性。这样的修饰可减少通过Gln的脱酰胺作用发生的降解。通过例如用Glu取代来修饰21位的Asp可增加稳定性。这样的修饰可减少通过Asp脱水形成环状琥珀酰亚胺中间体，随后异构化为异天冬氨酸发生的降解。
(H)基本不影响活性的非保守或保守的取代、增加或缺失，例如在2、5、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、24、27、28或29位中一个或多个位置的保守取代；用Ala取代这些位置中的一个或多个位置；27、28或29位中一个或多个位置的氨基酸缺失；或者氨基酸29缺失，任选地结合替代C-末端羧酸基团的C-末端酰胺或酯；用Arg取代12位的Lys；用Val或Phe取代10位的Tyr；
通过在C-末端增加GPSSGAPPPS(SEQ ID NO：1095)提供在聚乙二醇化之后保存活性。
原生胰高血糖素肽的一些位置可被修饰，同时保留母体肽的至少一些活性。因此，申请人预期位于2、5、10、11、12、13、14、17、18、19、20、21、24、27、28或29位的位置的一个或多个氨基酸可用不同于存在于原生胰高血糖素肽中的氨基酸取代，并且仍然保留对胰高血糖素受体的活性。
在一些实施方案中，18位用选自Ala、Ser或Thr的氨基酸取代。在一些实施方案中，20位的氨基酸用Ser、Thr、Lys、Arg、Orn、瓜氨酸或Aib取代。在一些实施方案中，21位用Glu、高谷氨酸或同型半胱氨酸取代。在一些实施方案中，胰高血糖素肽包含1-10个选自16、17、18、20、21、23、24、27、28和29位的氨基酸修饰。在示例性实施方案中，修饰为选自Gln17、Ala18、Glu21、Ile23、Ala24、Val27和Gly29的一个或多个氨基酸取代。在某些实施方案中，选自位置17-26的1-2个氨基酸不同于母体肽。在其它实施方案中，选自位置17-22的1-2个氨基酸不同于母体肽。在另外的其它实施方案中，修饰为Gln17、Ala18、Glu21、Ile23和Ala24。
在一些实施方案中，在胰高血糖素肽的羧基末端增加一个或多个氨基酸。氨基酸通常选自20种常见氨基酸中的一种，并且在一些实施方案中，氨基酸具有替代原生氨基酸的羧酸的酰胺基团。在示例性实施方案中，增加的氨基酸选自谷氨酸和天冬氨酸和甘氨酸。
不破坏活性的其它修饰包括W10或R20。
在某些实施方案中，通过截短C-末端一个或两个氨基酸残基，修饰本文公开的2类胰高血糖素相关肽，同时保留对胰高血糖素、GLP-1和/或GIP受体的类似活性和功效。在这点上，位置29和/或28的氨基酸可缺失。
示例性实施方案
根据本发明的一些实施方案，具有GIP激动剂活性的胰高血糖素(SEQ ID NO：1001)的类似物包含SEQ ID NO：1001：其具有(a)给予GIP激动剂活性的1位氨基酸修饰，(b)稳定类似物的C-末端部分(氨基酸12-29)的α-螺旋结构的修饰，和(c)任选地，1-10(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10)个其它的氨基酸修饰。在一些实施方案中，类似物呈现原生GIP对GIP受体的至少约1％的活性或对GIP受体的本文描述的任何其它活性水平。
在某些实施方案中，稳定α螺旋结构的修饰为提供或引入包括例如共价分子内桥，例如本文描述的那些中的任何一种的分子内桥的修饰。在一些实施方案中，共价分子内桥为内酰胺桥。这些实施方案的类似物的内酰胺桥可为本文描述的内酰胺桥。参见例如在章节“α螺旋结构的稳定”下的内酰胺桥的讲授内容。例如，内酰胺桥可为其在i和i+4位的氨基酸侧链之间，或在j和j+3位的氨基酸侧链之间的内酰胺桥，其中i为12、13、16、17、20或24，和其中j为17。在某些实施方案中，内酰胺桥可在16和20位的氨基酸之间，其中16和20位的氨基酸中的一个用Glu取代并且16和20位的氨基酸中的另一个用Lys取代。
在备选的实施方案中，稳定α-螺旋结构的修饰为在类似物的16、20、21和24位引入1、2、3或4个α，α-二取代氨基酸。在一些实施方案中，α，α-二取代氨基酸为Aib。在某些方面，α，α-二取代氨基酸(例如Aib)在20位，并且16位的氨基酸用荷正电的氨基酸例如本文描述的式IV的氨基酸取代。式IV的氨基酸可为高Lys、Lys、Orn或2，4-二氨基丁酸(Dab)。
在本发明的具体方面，1位的氨基酸修饰为His用缺乏咪唑侧链的氨基酸，例如大的芳族氨基酸(例如Tyr)取代。
在某些方面，胰高血糖素的类似物在27、28和29位中的1、2个或全部位置包含氨基酸修饰。例如，27位的Met可用大的脂肪族氨基酸，任选地用Leu取代，28位的Asn可用小的脂肪族氨基酸，任选地用Ala取代，29位的Thr可用小的脂肪族氨基酸，任选地用Gly取代，或者为上述中两或三种取代的组合。在特别的实施方案中，胰高血糖素的类似物包含27位的Leu、28位的Ala和29位的Gly或Thr。
在本发明的某些实施方案中，胰高血糖素的类似物包含在29位氨基酸的1-21个氨基酸C-末端的延伸。这种延伸可包含例如SEQID NO：1095或1096的氨基酸序列。此外或者作为选择，胰高血糖素的类似物可包含其1-6个氨基酸延伸的延伸为荷正电的氨基酸。荷正电的氨基酸可为包括但不限于Lys、高Lys、Orn和Dab的式IV的氨基酸。
在一些实施方案中，胰高血糖素的类似物如本文描述的那样被酰化或烷基化。例如，酰基或烷基可在类似物的10或40位用或不用间隔区连接于胰高血糖素的类似物，如本文进一步描述的那样。类似物可另外或者作为选择被修饰以包含如本文进一步描述的亲水性部分。另外，在一些实施方案中，类似物包含以下修饰中的任何一种或组合：
(a)2位的Ser用D-Ser、Ala、D-Ala、Gly、N-甲基-Ser、Aib、Val或α-氨基-N-丁酸取代；
(b)10位的Tyr用Trp、Lys、Orn、Glu、Phe或Val取代；
(c)酰基键合于10位的Lys；
(d)12位的Lys用Arg或Ile取代；
(e)16位的Ser用Glu、Gln、高谷氨酸、同型半胱氨酸、Thr、Gly或Aib取代；
(f)17位的Arg用Gln取代；
(g)18位的Arg用Ala、Ser、Thr或Gly取代；
(h)20位的Gln用Ser、Thr、Ala、Lys、瓜氨酸、Arg、Orn或Aib取代；
(i)21位的Asp用Glu、高谷氨酸、同型半胱氨酸取代；
(j)23位的Val用Ile取代；
(k)24位的Gln用Asn、Ser、Thr、Ala或Aib取代；
(l)2、5、9、10、11、12、13、14、15、16、8、19、20、21、24、27、28和29位中任何位置的保守取代。
在示例性实施方案中，具有GIP激动剂活性的胰高血糖素
(SEQ ID NO：1001)类似物包括以下修饰：
(a)赋予GIP激动剂活性的1位氨基酸修饰，
(b)在i和i+4位的氨基酸侧链之间，或在j和j+3位的氨基酸侧链之间的内酰胺桥，其中i为12、13、16、17、20或24，和其中j为17，(c)在27、28和29位中的1、2个或全部位置的氨基酸修饰，例如在27和/或28位的氨基酸修饰，和
(d)1-9或1-6个其它的氨基酸修饰，例如1、2、3、4、5、6、7、8或9个其它的氨基酸修饰，
并且类似物对GIP受体激活的EC50为约10nM或者更少。
这些实施方案的类似物的内酰胺桥可为本文描述的内酰胺桥。参见例如在章节“α-螺旋结构的稳定”下的内酰胺桥的讲授。例如内酰胺桥可在16和20位的氨基酸之间，其中16和20位的氨基酸中的一个用Glu取代并且16和20位的氨基酸中的另一个用Lys取代。
根据这些实施方案，类似物可包含例如SEQ ID NOs：1005-1094中任何一种的氨基酸序列。
在其它示例性实施方案中，具有GIP激动剂活性的胰高血糖素(SEQ ID NO：1001)的类似物包含以下修饰：
(a)赋予GIP激动剂活性的1位氨基酸修饰，
(b)类似物的16、20、21和24位的1、2、3个或全部氨基酸用α，α-二取代氨基酸取代，
(c)在27、28和29位中的1、2个或全部位置的氨基酸修饰，例如在27和/或28位的氨基酸修饰，和
(d)1-9或1-6个其它的氨基酸修饰，例如1、2、3、4、5、6、7、8或9个其它的氨基酸修饰，
并且类似物对GIP受体激活的EC50为约10nM或者更少。
这些实施方案的类似物的α，α-二取代氨基酸可为任何α，α-二取代氨基酸，包括，但不限于，氨基异丁酸(Aib)；用选自甲基、乙基、丙基和正丁基的相同或不同基团，或者用环辛烷或环庚烷二取代的氨基酸(例如1-氨基环辛烷-1-羧酸)。在某些实施方案中，α，α-二取代氨基酸为Aib。在某些实施方案中，20位的氨基酸用α，α-二取代氨基酸例如Aib取代。
根据这些实施方案，类似物可包含例如SEQ ID NOs：1099-1141、1144-1164、1166-1169和1173-1178中任何氨基酸序列。
在另外的其它示例性实施方案中，具有GIP激动剂活性的胰高血糖素(SEQ ID NO：1001)的类似物包含以下修饰：
(a)赋予GIP激动剂活性的1位氨基酸修饰，
(b)16位的Ser用以下式IV的氨基酸的氨基酸取代：
Figure BPA00001673726801681
其中n为1-16、或1-10、或1-7、或1-6、或2-6，R1和R2中的每一个独立地选自H、C1-C18烷基、(C1-C18烷基)OH、(C1-C18烷基)NH2、(C1-C18烷基)SH、(C0-C4烷基)(C3-C6)环烷基、(C0-C4烷基)(C2-C5杂环)、(C0-C4烷基)(C6-C10芳基)R7和(C1-C4烷基)(C3-C9杂芳基)，其中R7为H或OH，并且式IV的氨基酸侧链包含游离氨基，
(c)20位的Gln用α，α-二取代氨基酸的氨基酸取代，
(d)在27、28和29位中的1、2个或全部位置的氨基酸修饰，例如在27和/或28位的氨基酸修饰，和
(e)1-9或1-6个其它的氨基酸修饰，例如1、2、3、4、5、6、7、8或9个其它的氨基酸修饰，
并且类似物对GIP受体激活的EC50为约10nM或者更少。
这些实施方案的类似物的式IV氨基酸可为任何氨基酸，例如式IV的氨基酸，其中n为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16。在某些实施方案中，n为2、3、4或5，在其情况中，氨基酸分别为Dab、Orn、Lys或高Lys。
这些实施方案的类似物的α，α-二取代氨基酸可为任何α，α-二取代氨基酸，包括，但不限于，氨基异丁酸(Aib)；用选自甲基、乙基、丙基和正丁基的相同或不同基团，或者用环辛烷或环庚烷二取代的氨基酸(例如1-氨基环辛烷-1-羧酸)。在某些实施方案中，α，α-二取代氨基酸为Aib。
根据这些实施方案，类似物可包含例如SEQ ID NOs：1099-1165中任何氨基酸序列。
在另外的其它示例性实施方案中，具有GIP激动剂活性的胰高血糖素(SEQ ID NO：1001)的类似物包含：
(a)赋予GIP激动剂活性的1位氨基酸修饰，和
(b)在29位氨基酸的约1-约21个的氨基酸C-末端延伸，其中所述延伸中的至少一个氨基酸被酰化或烷基化，
其中类似物对GIP受体激活的EC50为约10nM或者更少。
在一些实施方案中，酰化或烷基化的氨基酸为式I、II或III的氨基酸。在更特别的实施方案中，式I的氨基酸为Dab、Orn、Lys或高Lys。而且，在一些实施方案中，约1-约21个氨基酸的延伸包含GPSSGAPPPS(SEQ ID NO：1095)或XGPSSGAPPPS(SEQ ID NO：1096)的氨基酸序列，其中X为任何氨基酸，或者包含GPSSGAPPPK(SEQ ID NO：1170)或XGPSSGAPPPK(SEQ ID NO：1171)或XGPSSGAPPPSK(SEQ ID NO：1172)，其中X为Gly或小的脂肪族或非极性或略带极性的氨基酸。在一些实施方案中，约1-约21个氨基酸可包含相对于SEQ ID NO：1095、1096、1170、1171或1172含有一个或多个保守取代的序列。在一些实施方案中，酰化或烷基化的氨基酸位于C-末端延伸的类似物的37、38、39、40、41、42或43位。在某些实施方案中，酰化或烷基化的氨基酸位于C-末端延伸的类似物的40位。
在某些实施方案中，具有GIP激动剂活性的类似物进一步包括位置27、28和29中的一个、两个或全部位置的氨基酸修饰，例如，位置27和/或28的氨基酸修饰。
在任何以上的示例性实施方案中，赋予GIP激动剂活性的1位氨基酸修饰可为His经缺乏咪唑侧链的氨基酸的取代。1位的氨基酸修饰可为例如His经大的芳族氨基酸取代。在一些实施方案中，大的芳族氨基酸为然后本文描述的那些氨基酸，包括例如Tyr。
在某些方面，类似物不包含其修饰赋予GIP激动剂活性的1位氨基酸修饰。在一些方面，1位氨基酸不为大的芳族氨基酸例如Tyr。在一些实施方案中，1位的氨基酸为包含咪唑环的氨基酸例如His、His的类似物。在某些实施方案中，类似物不为在国际专利申请出版物第WO 2010/011439号中公开的任何化合物。在某些方面，类似物包含SEQ ID NOs：1263-1275中任何氨基酸序列。
同样，关于以上示例性实施方案，在27、28和29位中的1、2个或全部位置的氨基酸修饰可为这些位置的本文描述的任何修饰。例如，27位的Met可用大的脂肪族氨基酸，任选地用Leu取代，28位的Asn可用小的脂肪族氨基酸，任选地用Ala取代，和/或29位的Thr可用小的脂肪族氨基酸，任选地用Gly取代。作为选择，类似物可在27和/或28位包含氨基酸修饰。
以上示例性实施方案的类似物可进一步包含1-9或1-6个其它的另外氨基酸修饰，例如1、2、3、4、5、6、7、8或9个其它的氨基酸修饰，例如增加或降低对GIP、GLP-1和胰高血糖素受体中任何一种的活性；改善溶解性、改善作用持续时间或循环中的半衰期、延迟起效或增加稳定性的本文描述的任何修饰。类似物可进一步包含例如任选地用Ile取代的12位氨基酸修饰，和/或任选地用17位的Q和18位的A取代的17和18位氨基酸修饰，和/或在C-末端增加GPSSGAPPPS(SEQ ID NO：1095)或XGPSSGAPPPS(SEQ ID NO：1096)或者相对于SEQ ID NO：1095或1096含有一个或多个保守取代的序列。类似物可包含一种或多种以下修饰：
(i)2位的Ser用D-Ser、Ala、D-Ala、Gly、N-甲基-Ser、Aib、Val或α-氨基-N-丁酸取代；
(ii)10位的Tyr用Trp、Lys、Orn、Glu、Phe或Val取代；
(iii)酰基键合于10位的Lys；
(iv)12位的Lys用Arg取代；
(v)16位的Ser用Glu、Gln、高谷氨酸、同型半胱氨酸、Thr、Gly或Aib取代；
(vi)17位的Arg用Gln取代；
(vii)18位的Arg用Ala、Ser、Thr或Gly取代；
(viii)20位的Gln用Ala、Ser、Thr、Lys、瓜氨酸、Arg、Orn或Aib取代；
(ix)21位的Asp用Glu、高谷氨酸、同型半胱氨酸取代；
(x)23位的Val用Ile取代；
(xi)24位的Gln用Asn、Ala、Ser、Thr或Aib取代；和
(xii)2、5、9、10、11、12、13、14、15、16、8、19、20、21、24、27、28和29位中任何位置的保守取代。
在一些实施方案中，类似物包含修饰(i)-(xii)的组合。作为选择或另外，类似物可包含3位的氨基酸修饰(例如Gln用Glu的氨基酸取代)，其中类似物具有胰高血糖素对胰高血糖素受体的少于1％的活性。作为选择或另外，类似物可包含7位的氨基酸修饰(例如Thr用缺乏羟基的氨基酸例如Abu或Ile的氨基酸取代)，其中类似物具有GLP-1对GLP-1受体的少于约10％的活性。
关于示例性实施方案，类似物可共价连接于亲水性部分。在一些实施方案中，类似物在16、17、20、21、24、29、40位或C-末端氨基酸中的任何位置共价连接于亲水性部分。在某些实施方案中，类似物包含C-末端延伸(例如SEQ ID NO：1095的氨基酸序列)和增加包含亲水性部分的氨基酸，使得亲水性部分在40位共价连接于类似物。
在一些实施方案中，亲水性部分共价连接于类似物的Lys、Cys、Orn、同型半胱氨酸或乙酰基苯丙氨酸。Lys、Cys、Orn、同型半胱氨酸或乙酰基-苯丙氨酸可为胰高血糖素序列(SEQ ID NO：1001)的原生氨基酸，或者其可为替代SEQ ID NO：1001的原生氨基酸的氨基酸。在其中亲水性部分连接于Cys的一些实施方案中，与亲水性部分的连接可包含以下结构
Figure BPA00001673726801721
关于包含亲水性部分的类似物，亲水性部分可为本文描述的那些中的任何一种。参见例如在章节“亲水性部分的连接”下的讲授。在一些实施方案中，亲水性部分为聚乙二醇(PEG)。在某些实施方案中，PEG具有约1000道尔顿-约40000道尔顿，例如约20000道尔顿-约4000道尔顿的分子量。
关于示例性实施方案，类似物可包含其中侧链共价连接于酰基或烷基(例如，对天然存在氨基酸而言是非原生的酰基或烷基)的修饰的氨基酸。酰化或烷基化的类似物可与在章节“酰化和烷基化”中描述的酰化或烷基化的肽一致。在一些实施方案中，酰基为C4-C30脂肪酰基，例如C10脂肪酰基或烷基、C12脂肪酰基或烷基、C 14脂肪酰基或烷基、C16脂肪酰基或烷基、C18脂肪酰基或烷基、C20酰基或烷基或者C22酰基或烷基。酰基或烷基可共价连接于类似物的包括但不限于10或40位的氨基酸、或者C-末端氨基酸的任何氨基酸。在某些实施方案中，类似物包括C-末端延伸段(例如，氨基酸序列SEQ ID NO：1095)和包含酰基或烷基氨基酸的添加段，以致酰基或烷基在位置40共价连着类似物。在一些实施方案中，酰基或烷基共价连接于式I、II或III的氨基酸的侧链，例如Lys残基。基酸的侧链，例如，Lys残基。(SEQ ID NO：1001)而言是原生的氨基酸，或者可连接于增加到SEQ IDNO：1001序列，或增加到紧接SEQ ID NO：1095(在N-或C-末端)的SEQ ID NO：1001序列的氨基酸，或者可连接于替代原生氨基酸例如SEQ ID NO：1001的10位Tyr的氨基酸。
在以上示例性实施方案中，其中类似物包含酰基或烷基，类似物可如本文描述的那样经间隔区连接于酰基或烷基。间隔区例如长度可为3-10个原子，并可为例如氨基酸(例如6-氨基己酸、本文描述的任何氨基酸)、二肽(例如Ala-Ala、βAla-βAla、Leu-Leu、Pro-Pro、γ-Glu-γ-Glu)、三肽或者亲水性或疏水性双功能间隔区。在某些方面，间隔区和酰基或烷基的总长度为约14-约28个原子。在一些实施方案中，氨基酸间隔区不为γ-Glu。在一些实施方案中，二肽间隔区不为γ-Glu-γ-Glu。
在另外的其它示例性实施方案中，具有GIP激动剂活性的胰高血糖素类似物包含SEQ ID NOs：1227、1228、1229或1230中的任何一种氨基酸序列，其进一步包含以下修饰：
(a)任选地，赋予GIP激动剂活性的1位氨基酸修饰，
(b)29位氨基酸的约1-约21个氨基酸的C-末端延伸，其中延伸中的至少一个氨基酸被酰化或烷基化，和
(d)最多6个其它的氨基酸修饰，
其中类似物对GIP受体激活的EC50为约10nM或者更少。
在一些方面，酰化或烷基化的氨基酸为式I、II或III的氨基酸。在更特别的实施方案中，式I的氨基酸为Dab、Orn、Lys或高Lys。而且，在一些实施方案中，约1-约21个氨基酸包含GPSSGAPPPS(SEQID NO：1095)或XGPSSGAPPPS(SEQ ID NO：1096)的氨基酸序列，其中X为任何氨基酸，或者包含GPSSGAPPPK(SEQ ID NO：1170)或XGPSSGAPPPK(SEQ ID NO：1171)或XGPSSGAPPPSK(SEQ ID NO：1172)，其中X为Gly或小的脂肪族或非极性或略带极性的氨基酸。在一些实施方案中，约1-约21个氨基酸可包含相对于SEQ ID NO：1095、1096、1170、1171或1172的一个或多个保守取代的序列。在一些实施方案中，酰化或烷基化的氨基酸位于C-末端延伸的类似物的37、38、39、40、41、42或43位。在某些实施方案中，酰化或烷基化的氨基酸位于C-末端延伸的类似物的40位。
在任何以上示例性实施方案中，赋予GIP激动剂活性的1位氨基酸可为缺乏咪唑侧链的氨基酸。1位氨基酸可为例如大的芳族氨基酸。在一些实施方案中，大的芳族氨基酸为包括例如Tyr的本文描述的那些中的任何一种。
以上示例性实施方案的类似物可进一步包含1-6个其它的氨基酸修饰，例如本文描述的任何修饰，这样的修饰增加或降低对GIP、GLP-1和胰高血糖素受体中任何一种的活性、改善溶解性、改善作用持续时间或循环中的半衰期、延迟起效或者增加稳定性。
在某些方面，在以上示例性实施方案中描述的胰高血糖素类似物在27、28和29位中的1、2个或全部位置包含其它的氨基酸修饰。在这些位置的修饰可为相对于这些位置的本文描述的任何修饰。例如，相对于SEQ ID NO：1227、1228、1229或1230，27位可用大的脂肪族氨基酸(例如Leu、Ile或正亮氨酸)或Met取代，28位可用另一种小的脂肪族氨基酸(例如Gly或Ala)或Asn取代，和/或29位可用另一种小的脂肪族氨基酸(例如Gly或Ala)或Thr取代。作为选择，类似物可在27和/或28位包含这种氨基酸修饰。
类似物可进一步包括一种或多种以下的另外的修饰：
(i)2位的氨基酸为D-Ser、Ala、D-Ala、Gly、N-甲基-Ser、Aib、Val或α-氨基-N-丁酸中的任何一种；
(ii)10位的氨基酸为Tyr、Trp、Lys、Orn、Glu、Phe或Val；
(iii)酰基键合于10位的Lys；
(iv)12位的氨基酸为Ile、Lys或Arg；
(v)16位的氨基酸为Ser、Glu、Gln、高谷氨酸、同型半胱氨酸、Thr、Gly或Aib中的任何一种；
(vi)17位的氨基酸为Gln或Arg；
(vii)18位的氨基酸为Ala、Arg、Ser、Thr或Gly中的任何一种；
(viii)20位的氨基酸为Ala、Ser、Thr、Lys、瓜氨酸、Arg、Orn或者Aib或另一种α，α-二取代氨基酸中的任何一种；
(ix)21位的氨基酸为Glu、Asp、高谷氨酸、同型半胱氨酸中的任何一种；
(x)23位的氨基酸为Val或Ile；
(xi)24位的氨基酸为Gln、Asn、Ala、Ser、Thr或Aib中的任何一种；和
(xii)2、5、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、24、27、28和29位中任何位置的保守取代。
在一些实施方案中，类似物包含修饰(i)-(xii)的组合。作为选择或另外，类似物可包含3位的氨基酸修饰(例如Gln用Glu的氨基酸取代)，其中类似物具有胰高血糖素对胰高血糖素受体的少于1％的活性。作为选择或另外，类似物可包含7位的氨基酸修饰(例如Thr用缺乏羟基的氨基酸例如Abu或Ile的氨基酸取代)，其中类似物具有GLP-1对GLP-1受体的少于约10％的活性。
关于示例性实施方案，类似物可共价连接于亲水性部分。在一些实施方案中，类似物在16、17、20、21、24、29、40位或C-末端氨基酸中的任何位置共价连接于亲水性部分。在某些实施方案中，类似物包含在24位共价连接于类似物的亲水性部分。
在一些实施方案中，亲水性部分共价连接于类似物的Lys、Cys、Orn、同型半胱氨酸或乙酰基苯丙氨酸。Lys、Cys、Orn、同型半胱氨酸或乙酰基苯丙氨酸可为对SEQ ID NO：1001、1227、1228、1229或1230原生的氨基酸，或者其可为取代的氨基酸。在其中亲水性部分连接于Cys的一些实施方案中，连接键可包含以下结构
关于包含亲水性部分的类似物，亲水性部分可为本文描述的那些中的任何一种。参见例如在章节“亲水部分的连接”下的讲授。在一些实施方案中，亲水性部分为聚乙二醇(PEG)。PEG在某些实施方案中具有约1000道尔顿-约40000道尔顿，例如约20000道尔顿-约40000道尔顿的分子量。
关于示例性实施方案，类似物可在其中侧链共价连接于酰基或烷基的C-末端延伸中包含修饰的氨基酸。酰化或烷基化的类似物可与在章节“酰化和烷基化”中描述的酰化或烷基化的肽一致。在一些实施方案中，酰基为C4-C30脂肪酰基，例如C10脂肪酰基或烷基、C12脂肪酰基或烷基、C14脂肪酰基或烷基、C16脂肪酰基或烷基、C18脂肪酰基或烷基、C20酰基或烷基或者C22酰基或烷基。酰基或烷基可共价连接于类似物的包括但不限于10或40位的氨基酸、或者C-末端氨基酸的任何氨基酸。在一些实施方案中，酰基或烷基共价连接于式I、II或III的氨基酸的侧链，例如Lys残基。酰基或烷基共价连接于对SEQID NO：1001、1227、1228、1229或1230原生的氨基酸，或者其可连接于取代的氨基酸。酰基或烷基共价连接于对SEQ ID NO：1095、1096、1171或1172原生的氨基酸，或者其可连接于取代的氨基酸。
在以上示例性实施方案中，其中类似物包含酰基或烷基，类似物可如本文描述的那样经间隔区连接于酰基或烷基。间隔区例如长度可为3-10个原子，并可为例如氨基酸(例如6-氨基己酸、本文描述的任何氨基酸)、二肽(例如Ala-Ala、βAla-βAla、Leu-Leu、Pro-Pro、γ-Glu-γ-Glu)、三肽或者亲水性或疏水性双功能间隔区。在某些方面，间隔区和酰基或烷基的总长度为约14-约28个原子。在一些实施方案中，氨基酸间隔区不为γ-Glu。在一些实施方案中，二肽间隔区不为γ-Glu-γ-Glu。
在一些非常特别的实施方案中，本发明的类似物包含选自SEQ ID NOs：1099-1141、1144-1164、1166、1192-1207、1209-1221和1223或者选自SEQ ID NOs：1167-1169、1173-1178和1225的氨基酸序列。
进一步地，本发明的类似物特定的实例包括但不限于，表1-3中提及的那些中的任一种。
在另外的其它示例性实施方案中，具有GIP激动剂活性的胰高血糖素的类似物包含酰基或烷基(例如，对天然存在的氨基酸而言为非原生的酰基或烷基)，其中酰基或烷基连接于间隔区，其中(i)间隔区连接于类似物的10位氨基酸的侧链；或(ii)类似物包括C-末端至位置29的氨基酸的有1-21个氨基酸的延伸段，并且间隔区连接于对应于相对于SEQ ID NO：1001的37-43位中的一个位置的氨基酸的侧链，其中类似物对GIP受体激活的EC50为约10nM或者更少。
在这样的实施方案中，类似物可包含SEQ ID NO：1001的氨基酸序列，其中(i)赋予GIP激动剂活性的1位氨基酸修饰，(ii)在27、28和29位中的1、2个或全部位置的氨基酸修饰，(iii)以下的至少一种：
(A)类似物在i和i+4位的氨基酸侧链之间或在j和j+3位的氨基酸侧链之间包含内酰胺桥，其中i为12、13、16、17、20或24，和其中j为17；
(B)类似物的16、20、21和24位的1、2、3个或全部氨基酸用α，α-二取代的氨基酸取代；或
(C)类似物包含(i)16位的Ser用以下式IV的氨基酸的氨基酸取代：
Figure BPA00001673726801771
其中n为1-7，其中R1和R2中的每一个独立地选自H、C1-C18烷基、(C1-C18烷基)OH、(C1-C18烷基)NH2、(C1-C18烷基)SH、(C0-C4烷基)(C3-C6)环烷基、(C0-C4烷基)(C2-C5杂环)、(C0-C4烷基)(C6-C10芳基)R7和(C1-C4烷基)(C3-C9杂芳基)，其中R7为H或OH，和式IV的氨基酸侧链包含游离氨基；和(ii)20位的Gln用α，α-二取代氨基酸的氨基酸取代。和(iv)最多6个其它的氨基酸修饰。
这些实施方案的类似物的α，α-二取代氨基酸可为任何α，α-二取代氨基酸，包括但不限于氨基异丁酸(Aib)；用选自甲基、乙基、丙基和正丁基的相同或不同基团，或者用环辛烷或环庚烷二取代的氨基酸(例如1-氨基环辛烷-1-羧酸)。在某些实施方案中，α，α-二取代氨基酸为Aib。在某些实施方案中，20位的氨基酸用α，α-二取代氨基酸例如Aib取代。在某些实施方案中，α，α-二取代氨基酸为Aib。
这些实施方案的类似物的式IV氨基酸可为任何氨基酸，例如式IV的氨基酸，其中n为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16。在某些实施方案中，n为2、3、4或5，在其情况中，氨基酸分别为Dab、Orn、Lys或高Lys。
在任何以上的示例性实施方案中，赋予GIP激动剂活性的1位氨基酸修饰可为His用缺乏咪唑侧链的氨基酸取代。1位的氨基酸修饰可为例如用大的芳族氨基酸取代His。在一些实施方案中，所述大的芳族氨基酸为包括例如Tyr的本文描述的那些中的任何一。
同样，关于以上示例性实施方案，在27、28和29位中的1、2个或全部位置的氨基酸修饰可为本文描述的这些位置的任何修饰。例如，27位的Met可用大的脂肪族氨基酸，任选地用Leu取代，28位的Asn可用小的脂肪族氨基酸，任选地用Ala取代，和/或29位的Thr可用小的脂肪族氨基酸，任选地用Gly取代。或者，类似物可在27和/或28位包含这样的氨基酸修饰。
以上示例性实施方案的类似物可进一步包含1-9或1-6个其它的另外氨基酸修饰，例如1、2、3、4、5、6、7、8或9个其它的氨基酸修饰，例如增加或降低对GIP、GLP-1和胰高血糖素受体中任何一种的活性；改善溶解性、改善作用持续时间或循环中的半衰期、延迟起效或增加稳定性的本文描述的任何修饰。类似物可进一步包含例如任选地用Ile取代的12位氨基酸修饰，和/或任选地用17位的Q和18位的A取代的17和18位氨基酸修饰，和/或在C-末端增加GPSSGAPPPS(SEQ ID NO：1095)或XGPSSGAPPPS(SEQ ID NO：1096)或者含有相对于SEQ ID NO：1095或1096一个或多个保守取代的序列。类似物可包含一种或多种以下修饰：
(i)2位的Ser用D-Ser、Ala、D-Ala、Gly、N-甲基-Ser、Aib、Val或α-氨基-N-丁酸取代；
(ii)10位的Tyr用Trp、Lys、Orn、Glu、Phe或Val取代；
(iii)酰基键合于10位的Lys；
(iv)12位的Lys用Arg取代；
(v)16位的Ser用Glu、Gln、高谷氨酸、同型半胱氨酸、Thr、Gly或Aib取代；
(vi)17位的Arg用Gln取代；
(vii)18位的Arg用Ala、Ser、Thr或Gly取代；
(viii)20位的Gln用Ala、Ser、Thr、Lys、瓜氨酸、Arg、Orn或Aib取代；
(ix)21位的Asp用Glu、高谷氨酸、同型半胱氨酸取代；
(x)23位的Val用Ile取代；
(xi)24位的Gln用Asn、Ala、Ser、Thr或Aib取代；和
(xii)2、5、9、10、11、12、13、14、15、16、8、19、20、21、
24、27、28和29位中任何位置的保守取代。
在一些实施方案中，类似物包含修饰(i)-(xii)的组合。作为选择或另外，类似物可包含3位的氨基酸修饰(例如Gln用Glu的氨基酸取代)，其中类似物具有胰高血糖素对胰高血糖素受体的少于1％的活性。作为选择或另外，类似物可包含7位的氨基酸修饰(例如Thr用缺乏羟基的氨基酸例如Abu或Ile的氨基酸取代)，生成27-或28-氨基酸肽的C-末端至位置27或28氨基酸的氨基酸缺失，或其组合，其中类似物具有GLP-1对GLP-1受体的少于约10％的活性。
关于示例性实施方案，类似物可共价连接于亲水性部分。在一些实施方案中，类似物在16、17、20、21、24、29、40位或C-末端氨基酸中的任何位置共价连接于亲水性部分。在某些实施方案中，类似物包含C-末端延伸(例如SEQ ID NO：1095的氨基酸序列)和增加包含亲水性部分的氨基酸，使得亲水性部分在40位共价连接于类似物。
在一些实施方案中，亲水性部分共价连接于类似物的Lys、Cys、Orn、同型半胱氨酸或乙酰基苯丙氨酸。Lys、Cys、Orn、同型半胱氨酸或乙酰基苯丙氨酸可为胰高血糖素序列(SEQ ID NO：1001)的原生氨基酸，或者其可为替代SEQ ID NO：1001的原生氨基酸的氨基酸。在其中亲水性部分连接于Cys的一些实施方案中，与亲水性部分的连接键可包含以下结构
Figure BPA00001673726801801
关于包含亲水性部分的类似物，亲水性部分可为本文描述的那些中的任何一种。参见例如在章节“亲水部分的连接”下的讲授。在一些实施方案中，亲水性部分为聚乙二醇(PEG)。在某些实施方案中，PEG具有约1000道尔顿-约40000道尔顿，例如约20000道尔顿-约4000道尔顿的分子量。
在示例性实施方案中，其中类似物包含酰基或烷基，其酰基或烷基经间隔区连接于类似物，间隔区可为本文描述的任何间隔区。间隔区例如长度可为3-10个原子，并可为例如氨基酸(例如6-氨基己酸、本文描述的任何氨基酸)、二肽(例如Ala-Ala、βAla-βAla、Leu-Leu、Pro-Pro、γ-Glu-γ-Glu)、三肽或者亲水性或疏水性双功能间隔区。在某些方面，间隔区和酰基或烷基的总长度为约14-约28个原子。在一些实施方案中，氨基酸间隔区不为γ-Glu。在一些实施方案中，二肽间隔区不为γ-Glu-γ-Glu。
酰基或烷基为本文描述的任何酰基或烷基，例如为非原生-天然存在的氨基酸的酰基或烷基。在一些实施方案中，酰基或烷基为C4-C30脂肪酰基，例如C10脂肪酰基或烷基、C12脂肪酰基或烷基、C14脂肪酰基或烷基、C16脂肪酰基或烷基、C18脂肪酰基或烷基、C20酰基或烷基或者C22酰基或烷基、或者C4-C30烷基。在特别的实施方案中，酰基为C12-C18脂肪酰基(例如C14或C16脂肪酰基)。
在一些实施方案中，具有约类似物的C-末端至位置29的氨基酸的1-约21个氨基酸的延伸段包含GPSSGAPPPS(SEQ ID NO：1095)或XGPSSGAPPPS(SEQ ID NO：1096)的氨基酸序列，其中X为任何氨基酸，或者包含GPSSGAPPPK(SEQ ID NO：1170)或XGPSSGAPPPK(SEQ ID NO：1171)或XGPSSGAPPPSK(SEQ ID NO：1172)，其中X为Gly或小的脂肪族或非极性或略带极性的氨基酸。在一些实施方案中，约1-约21个氨基酸可包含相对于SEQ ID NO：1095、1096、1170、1171或1172含有一个或多个保守取代的序列。在一些实施方案中，酰化或烷基化的氨基酸位于C-末端延伸的类似物的37、38、39、40、41、42或43位。在某些实施方案中，酰化或烷基化的氨基酸位于C-末端延伸的类似物的40位。
GIP激动剂可为包含各氨基酸序列的任何一种的氨基酸序列的肽，例如SEQ ID NOs：1005-1094，任选地具有最多1、2、3、4或5个保留GIP激动剂活性的其它修饰。在某些实施方案中，GIP激动剂包含SEQ ID NOs：1099-1275中任何一种的氨基酸。
3类胰高血糖素相关肽
在某些实施方案中，胰高血糖素相关肽是3类胰高血糖素相关肽，其描述于本文和国际专利申请公开号WO 2009/155258、WO2008/101017和美国临时申请号61/288,248(2009年12月18日提交)，它们的内容通过全文引用结合于本文中。
在涉及3类胰高血糖素相关肽的以下章节中提及的一些生物序列(SEQ ID NOs：1-656)对应于国际专利申请出版物第W02009/155258号中的SEQ ID NOs：1-656。
活性
3类胰高血糖素相关肽可为对胰高血糖素受体呈现增加的活性，并且在其它的实施方案中呈现增强的生物物理稳定性和/或水溶解性的肽。另外，在一些实施方案中，3类胰高血糖素相关肽已经丧失原生胰高血糖素对胰高血糖素受体与GLP-1受体相比较的选择性，并因此代表那两种受体的协同激动剂。3类胰高血糖素相关肽中所选择的氨基酸修饰可控制肽对GLP-1受体与胰高血糖素受体相比较的相对活性。因此，3类胰高血糖素相关肽可为对胰高血糖素受体与GLP-1受体相比较具有更高活性的胰高血糖素/GLP-1协同激动剂，对两种受体具有约相同活性的胰高血糖素/GLP-1协同激动剂，或者对GLP-1受体与胰高血糖素受体相比较具有更高活性的胰高血糖素/GLP-1协同激动剂。后一个类别的协同激动剂可被设计处理以对胰高血糖素受体呈现很小至没有活性，而保留与原生GLP-1相同或比其更好的功效活化GLP-1受体的能。这些协同激动剂中的任何一种也可包括给予生物物理稳定性和/或水溶解性增强的修饰。
可对3类胰高血糖素相关肽进行修饰，以产生具有以下活性的胰高血糖素肽：相对于原生GLP-1对GLP-1受体至少约1％(包括至少约1.5％、2％、5％、7％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、75％、100％、125％、150％、175％)-约200％或者更高的活性，和相对于原生胰高血糖素对胰高血糖素受体至少约1％(包括约1.5％、2％、5％、7％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、75％、100％、125％、150％、175％、200％、250％、300％、350％、400％、450％)-约500％或者更高的活性。原生胰高血糖素的氨基酸序列为SEQ ID NO：1，GLP-1(7-36)酰胺的氨基酸序列为SEQ ID NO：52，和GLP-1(7-37)酸的氨基酸序列为SEQ ID NO：50。在示例性实施方案中，对3类胰高血糖素相关肽可呈现原生胰高血糖素对胰高血糖素受体的活性的至少10％和原生GLP-1对GLP-1受体的活性的至少50％，或原生胰高血糖素对胰高血糖素受体的活性的至少40％和原生GLP-1对GLP-1受体的活性的至少40％，或原生胰高血糖素对胰高血糖素受体的活性的至少60％和原生GLP-1对GLP-1受体的活性的至少60％。
3类胰高血糖素相关肽对胰高血糖素受体与GLP-1受体相比较的选择性可描述为胰高血糖素/GLP-1活性的相对比率(肽对胰高血糖素受体相对于原生胰高血糖素的活性除以肽对GLP-1受体相对于原生GLP-1的活性)。例如，呈现原生胰高血糖素对胰高血糖素受体的活性的60％和原生GLP-1对GLP-1受体的活性的60％的3类胰高血糖素相关肽具有1∶1比率的胰高血糖素/GLP-1活性。胰高血糖素/GLP-1活性的示例性比率包括约1∶1、1.5∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1、6∶1、7∶1、8∶1、9∶1或10∶1，或约1∶10、1∶9、1∶8、1∶7、1∶6、1∶5、1∶4、1∶3、1∶2或1∶1.5。作为实例，10∶1的胰高血糖素/GLP-1活性比率表明对胰高血糖素受体与GLP-1受体相比较的选择性为10倍。类似地，10∶1的GLP-1/胰高血糖素活性比率表明对GLP-1受体与胰高血糖素受体相比较的选择性为10倍。
在一些实施方案中，3类胰高血糖素相关肽具有原生胰高血糖素对胰高血糖素受体的活性的约10％或者更少，例如约1-10％，或约0.1-10％，或者大于约0.1％但是小于约10％，同时呈现GLP-1对GLP-1受体的活性的至少20％。例如，本文描述的示例性3类胰高血糖素相关肽具有原生胰高血糖素的活性的约0.5％、约1％或约7％，同时呈现原生GLP-1对GLP-1受体的活性的至少20％。
3类胰高血糖素相关肽可为对胰高血糖素受体或GLP-1受体或两者具有增加或降低的活性的胰高血糖素肽。3类胰高血糖素相关肽可为具有对胰高血糖素受体与GLP-1受体相比较有改变的选择性的胰高血糖素肽。
因此，提供本文公开的高功效3类胰高血糖素相关肽，这种肽也呈现改善的溶解性和/或稳定性。示例性的高功效3类胰高血糖素相关肽呈现原生胰高血糖素对胰高血糖素受体的至少200％的活性，并且任选地在6-8之间、或在6-9之间、或在7-9之间的pH(例如pH7)下可以至少1mg/mL的浓度溶解，并且任选地在25℃下24小时之后，保留至少95％的原始肽(例如5％或更少的原始肽降解或裂解)。作为另一个实例，示例性的3类胰高血糖素相关肽对胰高血糖素和GLP-1受体两者(以约1∶3-3∶1之间，或约1∶2-2∶1之间的比率)呈现大于约40％或大于约60％的活性，并且任选地在6-8之间、或在6-9之间、或在7-9之间的pH(例如pH7)下可以至少1mg/mL的浓度溶解，并且任选地在25℃下24小时之后，保留至少95％的原始肽。另一种示例性的3类胰高血糖素相关肽呈现原生胰高血糖素对胰高血糖素受体的活性的约175％或者更多，和原生GLP-1对GLP-1受体的活性的约20％或者更少，任选地在6-8之间、或在6-9之间、或在7-9之间的pH(例如pH7)下可以至少1mg/mL的浓度溶解，并且任选地在25℃下24小时之后，保留至少95％的原始肽。仍然另一种示例性的3类胰高血糖素相关肽呈现原生胰高血糖素对胰高血糖素受体的活性的约10％或者更少，和原生GLP-1对GLP-1受体的活性的至少约20％，任选地在6-8之间、或在6-9之间、或在7-9之间的pH(例如pH7)下可以至少1mg/mL的浓度溶解，并且任选地在25℃下24小时之后，保留至少95％的原始肽。仍然另一种示例性的3类胰高血糖素相关肽呈现原生胰高血糖素对胰高血糖素受体的活性的约10％或者更少，但是高于0.1％、0.5％或1％，和原生GLP-1对GLP-1受体的活性的至少约50％、60％、70％、80％、90％或100％或者更多，任选地在6-8之间、或在6-9之间、或在7-9之间的pH(例如pH7)下可以至少1mg/mL的浓度溶解，并且任选地在25℃下24小时之后，保留至少95％的原始肽。在一些实施方案中，这种3类胰高血糖素相关肽保留至少22、23、24、25、26、27或28个原生胰高血糖素中对应位置的天然存在的氨基酸(例如相对于天然存在的胰高血糖素具有1-7、1-5或1-3个修饰)。
影响胰高血糖素活性的修饰
通过原生胰高血糖素(SEQ ID NO：1)的16位氨基酸修饰，提供对胰高血糖素受体的增加的活性。在一些实施方案中，3类胰高血糖素相关肽为相对于
His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr(SEQ ID NO：1)的野生型肽的经修饰以增强肽对胰高血糖素受体的功效的胰高血糖素激动剂。根据其在验证性体外模型实验中刺激cAMP合成的能力(参见实施例2)，原生胰高血糖素(SEQ ID NO：1)的16位通常存在的丝氨酸可用选择酸性氨基酸取代，以增强胰高血糖素的功效。更具体地讲，这种取代提高类似物对胰高血糖素受体的功效至至少2倍、4倍、5倍和最多10倍。相对于原生胰高血糖素，这种取代也增强类似物对GLP-1受体的活性至至少5倍、10倍或者15倍，但是保持对胰高血糖素受体超过GLP-1受体的选择性。
通过非限制性实例，通过用谷氨酸或用具有4个原子长度的侧链的另一种荷负电的氨基酸、或者作为选择用谷氨酰胺、高谷氨酸或同型半胱氨酸或荷电氨基酸(具有包含至少一个杂原子(例如N、O、S、P)的侧链并具有约4(或3-5)个原子的侧链长度)中的任何一种取代16位的天然存在的丝氨酸，可提供这样的增强的功效。根据一些实施方案，原生胰高血糖素的16位丝氨酸残基用选自谷氨酸、谷氨酰胺、高谷氨酸、同型半胱氨酸、苏氨酸或甘氨酸的氨基酸取代。根据一些实施方案，原生胰高血糖素的16位丝氨酸残基用选自谷氨酸、谷氨酰胺、高谷氨酸和同型半胱氨酸的氨基酸取代，并且在一些实施方案中，丝氨酸残基用谷氨酸取代。
在一些实施方案中，增强功效的3类胰高血糖素相关肽包含SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQID NO：6、SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：5的胰高血糖素激动剂类似物的肽。根据一些实施方案，提供了相对于野生型胰高血糖素，对胰高血糖素受体具有增强的功效的3类胰高血糖素相关肽，其中肽包含SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：10的序列，其中胰高血糖素肽保留其对胰高血糖素受体相对于GLP-1受体的选择性。在一些实施方案中，对胰高血糖素受体具有增强的选择性的3类胰高血糖素相关肽包含SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10或其胰高血糖素激动剂类似物的肽，其中羧基末端氨基酸保留其原生羧酸基团。根据一些实施方案，3类胰高血糖素相关肽包含
NH2-His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Glu-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-COOH(SEQ ID NO：10)的序列，其中肽相对于原生胰高血糖素对胰高血糖素受体呈现约5倍的增强的功效，如通过实施例2的体外cAMP试验测量的那样。
通过3位的氨基酸修饰，例如取代3位天然存在的谷氨酰胺，可减小、保持或增强胰高血糖素受体活性。在一些实施方案中，用酸性、碱性或疏水性氨基酸(谷氨酸、鸟氨酸、正亮氨酸)取代3位氨基酸已经显示显著减小或破坏胰高血糖素受体活性。用例如谷氨酸、鸟氨酸或正亮氨酸取代的类似物具有原生胰高血糖素对胰高血糖素受体的约10％或者更少，例如约1-10％、或约0.1-10％的活性、或大于约0.1％但是少于约10％的活性，同时呈现原生GLP-1对GLP-1受体的至少20％的活性。例如，本文描述的示例性类似物具有原生胰高血糖素的约0.5％、约1％或约7％的活性，同时呈现GLP-1对GLP-1受体的至少20％的活性。具体地讲，可修饰任何一种3类胰高血糖素相关肽，包括本文描述的胰高血糖素类似物、胰高血糖素激动剂类似物、胰高血糖素协同激动剂和胰高血糖素/GLP-1协同激动剂分子，以含有3位修饰，例如Gln用Glu取代，以产生与对胰高血糖素受体的选择性相比较，对GLP-1受体具有高选择性例如10倍选择性的肽。
在另一个实施方案中，任何一种3类胰高血糖素肽的3位天然存在的谷氨酰胺可用谷氨酰胺类似物取代，而基本不丧失对胰高血糖素受体的活性，并且在一些情况中，增强胰高血糖素受体活性，如本文描述的那样。在特别的实施方案中，3位的氨基酸用Dab(Ac)取代。例如，胰高血糖素激动剂可包含SEQ ID NO：595、SEQ ID NO：601、SEQ ID NO：603、SEQ ID NO：604、SEQ ID NO：605和SEQ ID NO：606的氨基酸序列。
据观察，2位的修饰(例如2位的Aib)并且在一些情况中为1位的修饰可减小胰高血糖素活性。通过稳定胰高血糖素的C-末端部分的α-螺旋，例如通过本文描述的手段，例如通过在“i”和“i+4”，例如12和16、16和20或20和24位的氨基酸侧链之间的共价键，可恢复这种胰高血糖素活性减小。在一些实施方案中，这种共价键为16位的谷氨酸和20位的赖氨酸之间的内酰胺桥。在一些实施方案中，这种共价键为非内酰胺桥的分子内桥。例如，合适的共价键合方法包括烯烃复分解反应、基于羊毛硫氨酸的环化、二硫桥键或形成改性含硫桥、使用α，ω-二氨基烷烃系链、形成金属-原子桥以及其它肽环化手段中的一种或多种。
影响GLP-1活性的修饰
通过用电荷中性的基团例如酰胺或酯替代C-末端氨基酸的羧酸，提供对GLP-1受体的增强的活性。在一些实施方案中，这些3类胰高血糖素相关肽包含SEQ ID NO：20的序列，其中羧基末端氨基酸具有替代存在于原生氨基酸中的羧酸基团的酰胺基。这些3类胰高血糖素相关肽对胰高血糖素和GLP-1受体两者具有强的活性，并因此对两种受体起协同激动剂的作用。根据一些实施方案，3类胰高血糖素相关肽为胰高血糖素和GLP-1受体协同激动剂，其中肽包含SEQ IDNO：20的序列，其中28位的氨基酸为Asn或Lys和29位的氨基酸为Thr-酰胺。
通过稳定胰高血糖素的C-末端部分(例如大约残基12-29)中的α螺旋结构的修饰，提供对GLP-1受体的增加的活性。
在一些实施方案中，这样的修饰允许在两个氨基酸侧链之间形成分子内桥，这两个氨基由3个介于中间的氨基(即“i”位氨基酸和“i+4”位氨基酸，其中i为12-25之间的任何整数)、通过2个介于中间的氨基酸(即“j”位氨基酸和“j+3”位氨基酸，其中j为12-27之间的任何整数)或通过6个介于中间的氨基酸(即“k”位氨基酸和“k+7”位氨基酸，其中j为12-22之间的任何整数)分开。在示例性实施方案中，桥键或连接基长度为约8(或约7-9)个原子，并且在12和16位、或在16和20位、或在20和24位、或在24和28位的氨基酸侧链之间形成。两个氨基酸侧链通过非共价键，例如氢键、离子相互作用例如形成盐桥，或者通过共价键相互连接。
根据一些实施方案，3类胰高血糖素相关肽呈现胰高血糖素/GLP-1受体协同激动剂活性，并且包含选自SEQ ID NO：11、47、48和49的氨基酸序列。在一些实施方案中，侧链相互共价键合，并且在一些实施方案中，两个氨基酸相互键合形成内酰胺环。
根据一些实施方案，3类胰高血糖素相关肽包含SEQ ID NO：45，其中在氨基酸对的侧链之间形成的至少一个酰胺环选自氨基酸对12和16、16和20、20和24或24和28。在一些实施方案中，3类胰高血糖素相关肽包含SEQ ID NO：20的胰高血糖素肽类似物，其中肽包含在12和16位的氨基酸之间或在16和20位的氨基酸之间形成的分子内内酰胺桥。在一些实施方案中，3类胰高血糖素相关肽包含SEQID NO：20的序列，其中在12和16位的氨基酸之间、在16和20位的氨基酸之间或在20和24位的氨基酸之间形成分子内内酰胺桥，并且29位的氨基酸为甘氨酸，其中SEQ ID NO：29的序列连接于SEQ IDNO：20的C-末端氨基酸。在其它的实施方案中，28位的氨基酸为天冬氨酸。
在一些特别的实施方案中，通过形成非内酰胺桥的分子内桥，实现3类胰高血糖素相关肽的C-末端部分中的α-螺旋结构的稳定。例如，合适的共价键合方法包括烯烃复分解反应、基于羊毛硫氨酸的环化、二硫桥键或形成改性含硫桥、使用α，ω-二氨基烷烃系链、形成金属-原子桥中的一种或多种，并且其它肽环化手段用于稳定α-螺旋。
另外，通过在保留要求的活性的位置有目的的引入一个或多个α，α-二取代氨基酸，稳定胰高血糖素肽的C-末端部分(约氨基酸12-29)中的α-螺旋结构，可实现对GLP-1受体的增强的活性。这种肽本文可考虑作为缺乏分子内桥的肽。在一些方面，以没有引入分子内桥例如盐桥或共价键这种方式实现α-螺旋的稳定。在一些实施方案中，胰高血糖素肽的16、17、18、19、20、21、24或29位中的1、2、3、4或更多个位置用α，α-二取代氨基酸取代。例如，在不存在盐桥或内酰胺下，3类胰高血糖素相关肽的16位用氨基异丁酸(Aib)取代增强GLP-1活性。在一些实施方案中，16、20、21或24位中的1、2、3或更多个位置用Aib取代。
通过20位的氨基酸修饰可实现对GLP-1受体的增强的活性。在一些实施方案中，20位的谷氨酰胺用另一种亲水性氨基酸(具有荷电或具有氢键键合能力和长度为至少约5(或约4-6)个原予的侧链)例如赖氨酸、瓜氨酸、精氨酸或鸟氨酸替代。
包含SEQ ID NO：26的C-末端延伸的3类胰高血糖素相关肽表现出对GLP-1受体的增加的活性。如本文描述的那样，通过修饰18、28或29位或者18和29位的氨基酸可进一步增加这样的包含SEQID NO：26的3类胰高血糖素相关肽的GLP-1活性。
通过将位置10的氨基酸修饰成Trp可进一步适度提高GLP-1功效。
增加GLP-1受体活性的修饰的组合可比单独采用任何一种这样的修饰提供更高的GLP-1活性。例如，3类胰高血糖素相关肽可在16位、在20位和在C-末端羧酸基团包含修饰，任选地在16和20位的氨基酸之间具有共价键；可在16位和C-末端羧酸基团包含修饰；可在16位和20位包含修饰，任选地在16和20位的氨基酸之间具有共价键；或者可在20位和在C-末端羧酸基团包含修饰；任选地条件是12位的氨基酸不为Arg；或者任选地条件是9位的氨基酸不为Glu。影响溶解性的修饰
亲水部分的添加
可进一步修饰3类胰高血糖素相关肽，以改善肽在生理学pH下的水溶液中的溶解性和稳定性，同时保留相对于原生胰高血糖素的高生物学活性。本文讨论的亲水性部分可如本文进一步讨论的那样连接于3类胰高血糖素相关肽。
根据一些实施方案，在包含SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：10的3类胰高血糖素相关肽的17、21和24位引入亲水性基团，预计将改善高功效胰高血糖素类似物在具有生理pH的溶液中的溶解性和稳定性。引入这种基团也增加作用持续时间，例如如经循环中的半衰期延长测量的那样。
在一些实施方案中，3类胰高血糖素相关肽包含选自f SEQID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18和SEQID NO：19的序列，其中在所述3类胰高血糖素相关肽的16、17、21或24位中的一个位置的氨基酸残基的侧链进一步包含聚乙二醇链，这种聚乙二醇链具有选自约500-约40000道尔顿的范围的分子量。在一些实施方案中，聚乙二醇链具有选自约500-约5000道尔顿的范围的分子量。在另一个实施方案中，聚乙二醇链具有约10000-约20000道尔顿的分子量。在另外的其它示例性实施方案中，聚乙二醇链具有约20000-约40000道尔顿的分子量。
合适的亲水性部分包括本领域已知的任何水溶性聚合物，包括本文描述的亲水性部分、PEG的均-或共聚物以及PEG的一甲基取代聚合物(mPEG)。根据一些实施方案，亲水性基团包含聚乙烯(PEG)链。更具体地讲，在一些实施方案中，3类胰高血糖素相关肽包含SEQID NO：6或SEQ ID NO：7的序列，其中PEG链共价连接于存在于3类胰高血糖素相关肽的21和24位的氨基酸侧链，并且3类胰高血糖素相关肽的羧基末端氨基酸具有羧酸基团。根据一些实施方案，聚乙二醇链具有选自约500-约10000道尔顿的范围的平均分子量。
根据一些实施方案，聚乙二醇化的3类胰高血糖素相关肽包含共价键合于3类胰高血糖素相关肽的两个或更多个聚乙二醇链，其中胰高血糖素链的总分子量为约1000-约5000道尔顿。在一些实施方案中，聚乙二醇化的胰高血糖素激动剂包含由SEQ ID NO：5或SEQID NO：5的胰高血糖素激动剂类似物组成的肽，其中PEG链共价连接于21位和24位的氨基酸残基，并且其中两个PEG链的合并分子量为约1000-约5000道尔顿。
带电C-末端
例如通过在SEQ ID NO：20的胰高血糖素肽的C-末端部分，优选地在C-末端位至27位引入1、2、3或更多个荷电氨基酸，可进一步改善包含SEQ ID NO：20的3类胰高血糖素相关肽的溶解性。通过例如在28或29位用荷电氨基酸取代原生氨基酸，或者作为选择，通过例如在27、28或29位之后增加荷电氨基酸，可引入这种荷电氨基酸。在示例性实施方案中，1、2、3个或全部的荷电氨基酸荷负电。可对3类胰高血糖素相关肽进行仍然使其保留胰高血糖素活性的另外修饰例如保守取代。在一些实施方案中，提供了SEQ ID NO：20的3类胰高血糖素相关肽的类似物，其中类似物与SEQ ID NO：20的不同处在于17-26位的1-2个氨基酸取代，并且在一些实施方案中，类似物与SEQ ID NO：20的肽的不同之处为20位的氨基酸取代。
酰化/烷基化
根据一些实施方案，胰高血糖素肽被修饰以包含酰基或烷基，例如C4-C30酰基或烷基。在一些方面，酰基或烷基不是天然存在于氨基酸上。在特定的方面，酰基或烷基对任何天然存在氨基酸是非原生的。酰化或烷基化可增加循环中的半衰期和/或延迟起效和/或延长作用的持续时间和/或改善对蛋白酶例如DPP-IV的抗性。酰化后，即使不大大增强，3类胰高血糖素相关肽对胰高血糖素受体和GLP-1受体的活性也得以保持。而且，即使不大大增强，酰化类似物的功效也与3类胰高血糖素相关肽的未酰化形式相当。
在一些实施方案中，本发明提供经修饰以包含共价连着胰高血糖素肽的10位的氨基酸的酰基或烷基的3类胰高血糖素相关肽。胰高血糖素肽可在3类胰高血糖素相关肽的10位氨基酸和酰基或烷基之间进一步包含间隔区。上述3类胰高血糖素相关肽中的任何一种可包含两个酰基或两个烷基，或其组合。
在本发明的特定方面，酰化的3类胰高血糖素相关肽包括SEQ ID NOs：534-544和546-549中的任一个氨基酸序列。
C-末端截短
在一些实施方案中，通过截短或缺失胰高血糖素肽的C-末端(即29和/或28位)的1或2个氨基酸，进一步修饰本文描述的3类胰高血糖素相关肽，而不影响对胰高血糖素和GLP-1受体的活性和/或功效。在这方面，3类胰高血糖素相关肽可包含任选地具有本文描述的一或更多个修饰的原生胰高血糖素肽(SEQ ID NO：1)的氨基酸1-27或1-28。
在一些实施方案中，截短的3类胰高血糖素相关肽包含SEQID NO：550或SEQ ID NO：551。在另一个实施方案中，截短的胰高血糖素激动剂肽包含SEQ ID NO：552或SEQ ID NO：553。
C-末端延伸
根据一些实施方案，通过在胰高血糖素肽的羧基末端增加第二个肽，例如SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27或SEQ ID NO：28，修饰本文公开述的3类胰高血糖素相关肽。在一些实施方案中，具有选自SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：66、SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：68和SEQ ID NO：69的序列的3类胰高血糖素相关肽，通过肽键共价键合于第二个肽，其中第二个肽包含选自SEQ ID NO：26、SEQ IDNO：27和SEQ ID NO：28的序列。在其它的实施方案中，在包含C-末端延伸的3类胰高血糖素相关肽，原生胰高血糖素肽的29位苏氨酸用甘氨酸替代。具有取代29位苏氨酸的甘氨酸并包含SEQ ID NO：26的羧基末端延伸的3类胰高血糖素相关肽对GLP-1受体功效为经修饰包含SEQ ID NO：26的羧基末端延伸的原生胰高血糖素的4倍。通过丙氨酸取代18位的原生精氨酸，可进一步增强对GLP-1受体的功效。
因此，3类胰高血糖素相关肽可具有SEQ ID NO：27(KRNRNNIA)或SEQ ID NO：28的羧基末端延伸。根据一些实施方案，包含SEQ ID NO：33或SEQ ID NO：20的3类胰高血糖素相关肽进一步包含连接于胰高血糖素肽的氨基酸29的SEQ ID NO：27(KRNRNNIA)或SEQ ID NO：28的氨基酸序列。更具体地讲，3类胰高血糖素相关肽包含选自SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ IDNO：13、SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：15的序列，还包含连接于胰高血糖素肽的氨基酸29的SEQ ID NO：27(KRNRNNIA)或SEQ IDNO：28的氨基酸序列。更具体地讲，胰高血糖素肽包含选自SEQ IDNO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ IDNO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ IDNO：66、SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：69、SEQ IDNO：55和SEQ ID NO：56的序列，进一步包含连接于3类胰高血糖素相关肽的氨基酸29的SEQ ID NO：26(GPSSGAPPPS)或SEQ ID NO：29的氨基酸序列。在一些实施方案中，3类胰高血糖素相关肽包含SEQ ID NO：64的序列。
其它修饰
关于增加或降低胰高血糖素受体活性和增加GLP-1受体活性的3类胰高血糖素相关肽的以上描述的任何修饰，可单独或组合应用。增加GLP-1受体活性的修饰的组合通常比单独采用任何一种这样的修饰提供更高的GLP-1活性。以上描述的任何修饰也可与关于3类胰高血糖素相关肽赋予其它合乎需要的性能的本文描述的其它修饰相组合，这样的其它合乎需要的性能包括例如增大溶解性和/或稳定性和/或延长作用持续时间。作为选择，以上描述的任何修饰可与关于基本不影响溶解性或稳定性或活性的3类胰高血糖素相关肽本文描述的其它修饰相组合。示例性的修饰包括但不限于：
(A)例如通过在原生胰高血糖素的C-末端部分，优选地在C-末端位至27位引入1、2、3或更多个荷电氨基酸改善溶解性。通过例如在28或29位用荷电氨基酸取代原生氨基酸，或者通过例如在27、28或29位之后增加荷电氨基酸，可引入这种荷电氨基酸。在示例性实施方案中，1、2、3个或全部的荷电氨基酸荷负电。在其它的实施方案中，1、2、3个或全部的荷电氨基酸荷正电。这样的修饰增大溶解性，例如在约5.5-8之间的给定pH例如pH 7下，当在25℃下24小时之后测量时，提供相对于原生胰高血糖素至少2倍、5倍、10倍、15倍、25倍、30倍或者更大的溶解性。
(B)通过例如在肽的16、17、20、21、24或29位，或在C-末端氨基酸增加亲水性部分，例如本文描述的聚乙二醇链，增加溶解性和作用持续时间或循环中的半衰期。
(C)通过修饰15位的天冬氨酸，例如通过缺失或用谷氨酸、高谷氨酸、半胱氨酸或同型半胱氨酸取代来增加稳定性。这样的修饰可减少在5.5-8范围内的pH下，尤其是在酸性或碱性缓冲液中的降解或裂解，例如在25℃下24小时之后保留至少75％、80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的原始肽。
(D)通过例如用亮氨酸或正亮氨酸取代来修饰27位的蛋氨酸增加稳定性。这样的修饰可减少氧化降解。通过例如用Ser、Thr、Ala或Aib取代修饰20或24位的Gln，也可增加稳定性。这样的修饰可减少通过Gln的脱酰胺作用发生的降解。通过例如用Glu取代修饰21位的Asp可增加稳定性。这样的修饰可减少通过Asp脱水形成环状琥珀酰亚胺中间体，随后异构化为异天冬氨酸发生的降解。
(E)通过用本文描述的DPP-IV抗性的氨基酸修饰1或2位的氨基酸，并且包括用N-甲基-丙氨酸修饰2位的氨基酸，增加对二肽基肽酶IV(DPP IV)裂解的抗性。
(F)不影响活性的保守或非保守的取代、增加或缺失，例如在2、5、7、10、11、12、13、14、16、17、18、19、20、21、24、27、28或29位中一个或多个位置的保守取代；在27、28或29位中一个或多个位置的缺失；或者氨基酸29缺失，任选地结合替代C-末端羧酸基团的C-末端酰胺或酯；
(G)增加本文描述的C-末端延伸；
(H)例如通过如本文描述的那样酰化或烷基化胰高血糖素肽，增加循环中的半衰期和/或延长作用持续时间和/或或延迟起效。
(I)如本文描述的均二聚作用或杂二聚作用。
其它修饰包括用大的芳族氨基酸(例如Tyr、Phe、Trp或氨基-Phe)取代1位的His；用Ala取代2位的Ser；用Val或Phe取代10位的Tyr；用Arg取代12位的Lys；用Glu取代15位的Asp；用Thr或Aib取代16位的Ser。
具有GLP-1活性，含有用大的芳族氨基酸(例如Tyr)的非保守取代1位的His的3类胰高血糖素相关肽可保留GLP-1活性，条件是α-螺旋通过分子内桥例如本文描述的那些中的任何一种分子内桥来稳定。
缀合物和融合体
3类胰高血糖素相关肽可任选经共价连接和任选经连接基连接至缀合物部分。
3类胰高血糖素相关肽也可为融合肽或蛋白质的部分，其中第二个肽或多肽已经融合于3类胰高血糖素相关肽的末端例如羧基末端。
更具体地讲，融合3类胰高血糖素相关肽可包含SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：10的胰高血糖素激动剂，其进一步包含连接于胰高血糖素肽的氨基酸29的SEQ ID NO：26(GPSSGAPPPS)、SEQ ID NO：27(KRNRNNIA)或SEQ ID NO：28(KRNR)的氨基酸序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO：26(GPSSGAPPPS)、SEQ ID NO：27(KRNRNNIA)或SEQ ID NO：28(KRNR)的氨基酸序列通过肽键键合于3类胰高血糖素相关肽的氨基酸29。申请人已经发现，在包含毒蜥外泌肽-4(例如SEQ ID NO：26或SEQ ID NO：29)的C-末端延伸肽的3类胰高血糖素相关肽融合蛋白中，29位的原生苏氨酸残基用甘氨酸取代显著增加GLP-1受体活性。这种氨基酸取代可与本文关于3类胰高血糖素相关肽公开的其它修饰结合使用，以增强胰高血糖素类似物对GLP-1受体的亲和性。例如，T29G取代可与S16E和N20K氨基酸取代组合，任选地在氨基酸16和20之间具有内酰胺桥，和任选地增加本文描述的PEG链。在一些实施方案中，3类胰高血糖素相关肽包含SEQ ID NO：64的序列。在一些实施方案中，胰高血糖素融合蛋白的3类胰高血糖素相关肽部分选自SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5，其中PEG链当存在于17、21、24位或C-末端氨基酸或在21和24位时，选自500-40000道尔顿的范围。更具体地讲，在一些实施方案中，3类胰高血糖素相关肽节段选自SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：63，其中PEG链选自500-5000的范围。在一些实施方案中，3类胰高血糖素相关肽为包含SEQ ID NO：55和SEQ ID NO：65的序列的融合肽，其中SEQ ID NO：65的肽连接于SEQID NO：55的羧基末端。
根据一些实施方案，SEQ ID NO：10的3类胰高血糖素相关肽的另外的化学修饰赋予增加的GLP-1受体功效至对胰高血糖素和GLP-1受体的相对活性几乎相同的地步。因此，在一些实施方案中，3类胰高血糖素相关肽包含末端氨基酸，该末端氨基酸包含替代存在于原生氨基酸的羧酸基团的酰胺基。3类胰高血糖素相关肽对相应的胰高血糖素和GLP-1受体的相对活性可通过对3类胰高血糖素相关肽的其它修饰以产生类似物进行调节，这种类似物证明具有原生胰高血糖素对胰高血糖素受体的活性的约40％-约500％或者更多，和具有原生GLP-1对GLP-1受体的活性的约20％-约200％或者更多，例如相对于胰高血糖素对GLP-1受体的正常活性增加50倍、100倍或者更多。在一些实施方案中，本文描述的胰高血糖素肽呈现原生胰高血糖素对胰高血糖素受体的最多约100％、1000％、10000％、100,000％或1000000％的活性。在一些实施方案中，本文描述的胰高血糖素肽呈现原生GLP-1对GLP-1受体的最多约100％、1000％、10000％、100,000％或1000000％的活性。
示例性实施方案
根据一些实施方案，提供包含EQ ID NO：55的序列的胰高血糖素类似物，其中所述类似物与SEQ ID NO：55的不同之处为1-3个选自1、2、3、5、7、10、11、13、14、17、18、19、21、24、27、28和29位的氨基酸，其中所述胰高血糖素肽呈现原生GLP-1对GLP-1受体的至少20％的活性。
根据某些实施方案，提供包含以下序列的胰高血糖素/GLP-1受体协同激动剂：
NH2-His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Xaa-Xaa-Arg-Arg-Ala-Xaa-Asp-Phe-Val-Xaa-Trp-Leu-Met-Xaa-Xaa-R(SEQ ID NO：33)，其中15位的Xaa选自Asp、Glu、半胱氨酸、高谷氨酸和同型半胱氨酸的氨基酸，16位的Xaa选自Ser、Glu、Gln、高谷氨酸和同型半胱氨酸的氨基酸，20位的Xaa为Gln或Lys，24位的Xaa为Gln或Glu，28位的Xaa为Asn、Lys或酸性氨基酸，29位的Xaa为Thr、Gly或酸性氨基酸，和R为COOH或CONH2，条件是当16位为丝氨酸，20位为Lys，或者当16位为丝氨酸，24位为Glu和20位或28位为Lys。在一些实施方案中，胰高血糖素/GLP-1受体协同激动剂包含SEQ ID NO：33的序列，其中28位的氨基酸为天冬氨酸和29位的氨基酸为谷氨酸。在另一个实施方案中，28位的氨基酸为原生天冬酰胺，29位的氨基酸为甘氨酸和SEQ ID NO：29或SEQ IDNO：65的氨基酸序列共价连接于SEQ ID NO：33的羧基末端。
在一些实施方案中，提供包含SEQ ID NO：33的序列的协同激动剂，其中在肽的羧基末端增加另外的酸性氨基酸。在其它的实施方案中，胰高血糖素类似物的羧基末端氨基酸具有替代天然氨基酸的羧酸基团的酰胺。在一些实施方案中，胰高血糖素类似物包含选自SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：43和SEQ ID NO：44的序列。
根据一些实施方案，提供SEQ ID NO：33的胰高血糖素肽类似物，其中所述类似物与SEQ ID NO：33的不同之处为1-3个选自1、2、3、5、7、10、11、13、14、17、18、19、21和27位的氨基酸，条件是当16位的氨基酸为丝氨酸，那么或者20位为赖氨酸，或者在24位的氨基酸与20位或28位的氨基酸之间形成内酰胺桥。根据一些实施方案，类似物与SEQ ID NO：33的不同之处为1-3个选自1、2、3、21和27位的氨基酸。在一些实施方案中，SEQ ID NO：33的胰高血糖素肽类似物与该序列的不同之处是1-2个选自1、2、3、5、7、10、11、13、14、17、18、19、21和27位的氨基酸，或者在一些实施方案中为单个选自1、2、3、5、7、10、11、13、14、17、18、19、21和27位的氨基酸，条件是当16位的氨基酸为丝氨酸，那么或者20位为赖氨酸，或者在24位的氨基酸与20位或28位的氨基酸之间形成内酰胺桥。
根据另一个实施方案，提供包含序列
NH2-His-Ser-Xaa-Gly-Thr-Phe-
Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Xaa-Xaa-Arg-Arg-Ala-Xaa-Asp-Phe-Val-Xaa-Trp-Leu-Met-Xaa-Xaa-R(SEQ ID NO：53)的相对选择性GLP-1受体激动剂，其中3位的Xaa选自Glu、Orn或Nle的氨基酸，15位的Xaa选自Asp、Glu、半胱氨酸、高谷氨酸和同型半胱氨酸的氨基酸，16位的Xaa选自Ser、Glu、Gln、高谷氨酸和同型半胱氨酸的氨基酸，20位的Xaa为Gln或Lys，24位的Xaa为Gln或Glu，28位的Xaa为Asn、Lys或酸性氨基酸，29位的Xaa为Thr、Gly或酸性氨基酸，和R为COOH或CONH2、SEQ ID NO：26或SEQ ID NO：29，条件是当16位为丝氨酸，20位为Lys，或者当16位为丝氨酸，24位为Glu和20位或28位为Lys。在一些实施方案中，3位的氨基酸为谷氨酸。在一些实施方案中，28和/或29位取代的酸性氨基酸为天冬氨酸或谷氨酸。在一些实施方案中，包括协同激动剂肽的胰高血糖素肽包含SEQ ID NO：33的序列，进一步包含在肽的羧基末端增加的另外的酸性氨基酸。在其它的实施方案中，胰高血糖素类似物的羧基末端氨基酸具有替代天然氨基酸的羧酸基团的酰胺。
根据某些实施方案，提供包含选自以下的经修饰胰高血糖素肽的胰高血糖素/GLP-1受体协同激动剂：
NH2-His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Xaa-Xaa-Arg-Arg-Ala-Xaa-Asp-Phe-Val-Xaa-Trp-Leu-Met-Xaa-Xaa-R(SEQ ID NO：34)，其中15位的Xaa选自Asp、Glu、半胱氨酸、高谷氨酸和同型半胱氨酸的氨基酸，16位的Xaa选自Ser、Glu、Gln、高谷氨酸和同型半胱氨酸的氨基酸，20位的Xaa为Gln或Lys，24位的Xaa为Gln或Glu，和28位的Xaa为Asn、Asp或Lys，R为COOH或CONH2，29位的Xaa为Thr或Gly，和R为COOH、CONH2、SEQ ID NO：26或SEQ ID NO：29，条件是当16位为丝氨酸，20位为Lys，或者作为选择，当16位为丝氨酸，24位为Glu和20位或28位为Lys。在一些实施方案中，R为CONH2，15位的Xaa为Asp，16位的Xaa选自Glu、Gln、高谷氨酸和同型半胱氨酸的氨基酸，20和24位的Xaa各自为Gln，28位的Xaa为Asn或Asp和29位的Xaa为Thr。在一些实施方案中，15和16位的Xaa每一个为Glu，20和24位的Xaa每一个为Gln，28位的Xaa为Asn或Asp，29位的Xaa为Thr和R为CONH2。
据报道，原生胰高血糖素肽的某些位置可被修饰，同时保留母体肽的至少一些活性。因此，申请人预计，位于SEQ ID NO：11肽的2、5、7、10、11、12、13、14、17、18、19、20、21、24、27、28或29位的一个或多个氨基酸，可用不同于存在于原生胰高血糖素肽的氨基酸取代，并仍然保留对胰高血糖素受体的活性。在一些实施方案中，存在于原生肽的27位的蛋氨酸残基变为亮氨酸或正亮氨酸，以防止肽的氧化降解。在另一个实施方案中，20位的氨基酸用Lys、Arg、Orn或瓜氨酸取代和/或21位用Glu、高谷氨酸或同型半胱氨酸取代。
在一些实施方案中，提供SEQ ID NO：20的胰高血糖素类似物，其中选自类似物的1、2、5、7、10、11、13、14、17、18、19、21、27、28或29位1-6个氨基酸不同于SEQ ID NO：1的对应氨基酸，条件是16位的氨基酸为丝氨酸，20位为Lys，作为选择，当16位为丝氨酸，24位为Glu和20位或28位为Lys。根据另一个实施方案，提供SEQ ID NO：20的胰高血糖素类似物，其中选自类似物的1、2、5、7、10、11、13、14、17、18、19、20、21、27、28或29位的1-3个氨基酸不同于SEQ ID NO：1的对应氨基酸。在另一个实施方案中，提供SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：11的胰高血糖素类似物，其中选自类似物的1、2、5、7、10、11、13、14、17、18、19、20或21位的1-2个氨基酸不同于SEQ ID NO：1的对应氨基酸，并且在其它的实施方案中，1-2个不同的氨基酸代表相对于存在于原生胰高血糖素序列(SEQ ID NO：1)的氨基酸的保守氨基酸取代。在一些实施方案中，提供SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14或SEQ ID NO：15的胰高血糖素肽，其中胰高血糖素肽在选自2、5、7、10、11、13、14、17、18、19、20、21、27或29位的位置进一步包含1、2或3个氨基酸取代。在一些实施方案中，在2、5、7、10、11、13、14、16、17、18、19、20、21、27或29位的取代为保守的氨基酸取代。
根据一些实施方案，提供包含SEQ ID NO 33的序列变体的胰高血糖素/GLP-1受体协同激动剂，其中分别选自变体的16、17、18、20、21、23、24、27、28和29位的1-10个氨基酸不同于SEQ IDNO：1的对应氨基酸。根据一些实施方案，提供SEQ ID NO 33的序列变体，其中变体与SEQ ID NO：33的不同之处在于一个或多个选自Gln17、Ala18、Glu21、Ile23、Ala24、Val27和Gly29的氨基酸取代。根据一些实施方案，提供包含SEQ ID NO 33的序列变体的胰高血糖素/GLP-1受体协同激动剂，其中选自变体的17-26位的1-2个氨基酸不同于SEQ ID NO：1的对应氨基酸。根据一些实施方案，提供SEQ ID NO 33的序列变体，其中变体与SEQ ID NO：33的不同之处在于选自Gln17、Ala18、Glu21、Ile23和Ala24的氨基酸取代。根据一些实施方案，提供SEQ ID NO 33的序列变体，其中变体与SEQ IDNO：33的不同之处在于18位的氨基酸取代，其中取代的氨基酸选自Ala、Ser、Thr和Gly。根据一些实施方案，提供SEQ ID NO 33的序列变体，其中变体与SEQ ID NO：33的不同之处在于18位的Ala氨基酸取代。这种变化被SEQ ID NO：55包括在内。在另一个实施方案中，提供包含SEQ ID NO 33的序列变体的胰高血糖素/GLP-1受体协同激动剂，其中选自变体的17-22位的1-2个氨基酸不同于SEQ IDNO：1的对应氨基酸，并且在其它的实施方案中，提供SEQ ID NO 33的变体，其中变体与SEQ ID NO：33的不同之处在于20和21位的1或2个氨基酸取代。根据一些实施方案，提供包含以下序列的胰高血糖素/GLP-1受体协同激动剂：
NH2-His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Xaa-Xaa-Arg-Arg-Ala-Xaa-Xaa-Phe-Val-Xaa-Trp-Leu-Met-Xaa-Xaa-R(SEQ ID NO：51)，其中15位的Xaa为Asp、Glu、半胱氨酸、高谷氨酸或同型半胱氨酸，16位的Xaa为Ser、Glu、Gln、高谷氨酸或同型半胱氨酸，20位的Xaa为Gln、Lys、Arg、Orn或瓜氨酸，21位的Xaa为Asp、Glu、高谷氨酸或同型半胱氨酸，24位的Xaa为Gln或Glu，和28位的Xaa为Asn、Lys或酸性氨基酸，29位的Xaa为Thr或酸性氨基酸，和R为COOH或CONH2。在一些实施方案中R为CONH2。根据一些实施方案，提供包含SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：48或SEQ ID NO：49的变体的胰高血糖素/GLP-1受体协同激动剂，其中变体与所述序列相差20位的氨基酸取代。在一些实施方案中，20位的氨基酸取代选自Lys、Arg、Orn或瓜氨酸。
在一些实施方案中，提供包含SEQ ID NO：34的类似物肽的胰高血糖素激动剂，其中类似物与SEQ ID NO：34的不同之处为在2位具有非丝氨酸的氨基酸。在一些实施方案中，丝氨酸残基用氨基异丁酸、D-丙氨酸取代，和在一些实施方案中，丝氨酸残基用氨基异丁酸取代。这样的修饰抑制经二肽基肽酶IV的裂解，同时保留母体化合物的固有功效(例如母体化合物的功效的至少75、80、85、90、95％或者更多)。在一些实施方案中，例如通过在原生胰高血糖素的C-末端部分，优选地在C-末端位-27位引入1、2、3或更多个荷电氨基酸，增大类似物的溶解性。在示例性实施方案中，1、2、3个或全部的荷电氨基酸荷负电。在另一个实施方案中，类似物进一步包含取代28或29位的原生氨基酸的酸性氨基酸或者增加到SEQ ID NO：34的肽羧基末端的酸性氨基酸。
在一些实施方案中，本文公开的胰高血糖素类似物在1或2位被进一步修饰，以减少对经二肽基肽酶IV裂解的敏感性。在一些实施方案中，提供SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14或SEQ ID NO：15的胰高血糖素类似物，其中类似物与母体分子的不同之处为2位的取代，并且呈现对经二肽基肽酶IV裂解的敏感性(即抗性)减小。更具体地讲，在一些实施方案中，类似肽的2位用选自D-丝氨酸、D-丙氨酸、缬氨酸、氨基正丁酸、甘氨酸、N-甲基丝氨酸和氨基异丁酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，类似肽的2位用选自D-丝氨酸、D-丙氨酸、甘氨酸、N-甲基丝氨酸和氨基异丁酸的氨基酸取代。在另一个实施方案中，类似肽的2位用选自D-丝氨酸、甘氨酸、N-甲基丝氨酸和氨基异丁酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，2位的氨基酸不为D-丝氨酸。在一些实施方案中，胰高血糖素肽包含SEQ ID NO：21或SEQ ID NO：22的序列。
在一些实施方案中，提供SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14或SEQ ID NO：15的胰高血糖素类似物，其中类似物与母体分子的区别在于1位的取代，并且呈现对经二肽基肽酶IV裂解的敏感性(即抗性)减小。更具体地讲，类似肽的1位用选自以下的氨基酸取代：D-组氨酸、α，α-二甲基咪唑乙酸(DMIA)、N-甲基组氨酸、α-甲基组氨酸、咪唑乙酸、脱氨基组氨酸、羟基组氨酸、乙酰基组氨酸和高组氨酸。在另一个实施方案中，提供包含SEQ ID NO：34的类似物肽的胰高血糖素激动剂，其中类似物与SEQ ID NO：34差别为在1位具有非组氨酸的氨基酸。在一些实施方案中，例如通过在原生胰高血糖素的C-末端部分，优选地在C-末端位至27位引入1、2、3或更多个荷电氨基酸，增大类似物的溶解性。在示例性实施方案中，1、2、3个或全部的荷电氨基酸荷负电。在另一个实施方案中，类似物进一步包含取代28或29位的原生氨基酸的酸性氨基酸或者增加到SEQ ID NO：34的肽羧基末端的酸性氨基酸。在一些实施方案中，酸性氨基酸为天冬氨酸或谷氨酸。
在一些实施方案中，胰高血糖素/GLP-1受体协同激动剂包含SEQ ID NO：20的序列，其进一步包含选自SEQ ID NO：26、SEQ IDNO：27和SEQ ID NO：28的一个氨基酸或肽的另外的羧基末端延伸。在其中在SEQ ID NO：20的羧基末端增加单一氨基酸的实施方案中，氨基酸通常选自20种常见氨基酸中的一种，并且在一些实施方案中，另外的羧基末端氨基酸具有替代原生氨基酸的羧酸的酰胺基。在一些实施方案中，另外的氨基酸选自谷氨酸、天冬氨酸和甘氨酸。
在备选的实施方案中，提供胰高血糖素/GLP-1受体协同激动剂，其中肽包含在谷氨酸残基和赖氨酸残基的侧链之间形成的至少一个内酰胺环，其中谷氨酸残基和赖氨酸残基由3个氨基酸分开。在一些实施方案中，具有内酰胺的胰高血糖素肽的羧基末端氨基酸具有替代原生氨基酸的羧酸的酰胺基。更具体地讲，在一些实施方案中，提供包含选自以下的修饰的胰高血糖素肽的胰高血糖素和GLP-1协同激动剂：
NH2-His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Glu-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Xaa-Xaa-R(SEQ ID NO：66)
NH2-His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Glu-Arg-Arg-Ala-Lys-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Xaa-Xaa-R(SEQ ID NO：67)
NH2-His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Lys-Asp-Phe-Val-Glu-Trp-Leu-Met-Xaa-Xaa-R(SEQ ID NO：68)
NH2-His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Glu-Trp-Leu-Met-Lys-Xaa-R(SEQ ID NO：69)
NH2-His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Glu-Arg-Arg-Ala-Lys-Asp-Phe-Val-Glu-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-R(SEQID NO：16)
NH2-His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Glu-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Glu-Trp-Leu-Met-Lys-Thr-R(SEQ ID NO：17)
NH2-His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Glu-Arg-Arg-Ala-Lys-Asp-Phe-Val-Glu-Trp-Leu-Met-Lys-Thr-R(SEQ ID NO：18)
其中28位的Xaa为Asp或Asn，29位的Xaa为Thr或Gly，R选自COOH、CONH2、谷氨酸、天冬氨酸、甘氨酸、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27和SEQ ID NO：28，并且对SEQ ID NO：66在12位的Lys和16位的Glu之间，对SEQ ID NO：67在16位的Glu和20位的Lys之间，对SEQ ID NO：68在20位的Lys和24位的Glu之间，对SEQ ID NO：69在24位的Glu和28位的Lys之间，对SEQ ID NO：16在12位的Lys和16位的Glu之间及在20位的Lys和24位的Glu之间，对SEQ ID NO：17在12位的Lys和16位的Glu之间及在24位的Glu和28位的Lys之间，以及对SEQ ID NO：18在16位的Glu和20位的Lys之间及在24位的Glu和28位的Lys之间形成内酰胺桥。在一些实施方案中，R选自COOH、CONH2、谷氨酸、天冬氨酸、甘氨酸，28位的氨基酸为Asn，和29位的氨基酸为苏氨酸。在一些实施方案中，R选自CONH2，28位的氨基酸为Asn，和29位的氨基酸为苏氨酸。在另一个实施方案中，R选自SEQ ID NO：26、SEQ IDNO：29和SEQ ID NO：65，并且29位的氨基酸为甘氨酸。
在其它的实施方案中，胰高血糖素/GLP-1受体协同激动剂选自SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：18，其中肽进一步包含选自SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27和SEQID NO：28的一个氨基酸或肽的另外的羧基末端延伸。在一些实施方案中，末端延伸包含SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：29或SEQ ID NO：65的序列，和胰高血糖素肽包含SEQ ID NO：55的序列。在一些实施方案中，胰高血糖素/GLP-1受体协同激动剂包含SEQ ID NO：33的序列，其中16位的氨基酸为谷氨酸，20位的氨基酸为赖氨酸，28位的氨基酸为天冬酰胺和SEQ ID No：26或SEQ ID NO：29的氨基酸序列连接于SEQ ID NO：33的羧基末端。
在其中在SEQ ID NO：20的羧基末端增加单一氨基酸的实施方案中，氨基酸通常选自20种常见氨基酸中的一种，并且在一些实施方案中，氨基酸具有替代原生氨基酸的羧酸的酰胺基。在一些实施方案中，另外的氨基酸选自谷氨酸和天冬氨酸和甘氨酸。在其中胰高血糖素激动剂类似物进一步包含羧基末端延伸的的实施方案中，延伸的羧基末端氨基酸在一些实施方案中止于酰胺基或酯基而非羧酸。
在另一个实施方案中，胰高血糖素/GLP-1受体协同激动剂包括序列：
NH2-His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Glu-
Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-Xaa-CONH2(SEQ ID NO：19)，其中30位的Xaa代表任何氨基酸。在一些实施方案中，Xaa选自20种常见氨基酸中的一种，并且在一些实施方案中，氨基酸为谷氨酸、天冬氨酸或甘氨酸。通过把PEG共价连接于SEQ IDNO：19的17、21、24或30位的氨基酸侧链，可进一步改善该肽的溶解性。在其它的些实施方案中，肽包含选自SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27和SEQ ID NO：28的肽的另外的羧基末端延伸。根据一些实施方案，胰高血糖素/GLP-1受体协同激动剂包含SEQ ID NO：30、SEQ IDNO：31和SEQ ID NO：32的序列。
可对SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19和SEQ ID NO：64的胰高血糖素序列内部进行另外的位点特异性修饰，得到一组具有不同程度的GLP-1激动作用的胰高血糖素激动剂。因此，对每一种受体具有几乎相同的体外功效的肽已被制备和表征。类似地，对两种受体中的每一种具有10倍选择性增强的功效的肽已被鉴定和表征。以上指出的16位丝氨酸残基用谷氨酸取代增强原生胰高血糖素对胰高血糖素和GLP-1受体两者的功效，但是对胰高血糖素受体保持约10倍的选择性。另外，通过用谷氨酸取代3位的原生谷氨酰胺(SEQ ID NO：22)，产生对GLP-1受体呈现约10倍选择性的胰高血糖素类似物。
通过在肽的16、17、21和24位引入亲水性基团，或者通过在胰高血糖素/GLP-1协同激动剂肽的羧基末端增加单一修饰的氨基酸(即氨基酸被修饰以包含亲水性基团)，可进一步增强胰高血糖素/GLP-1协同激动剂肽在生理pH下的水溶液中的溶解性，同时保留相对于原生胰高血糖素的高生物学活性。根据一些实施方案，亲水性基团包含聚乙烯(PEG)链。更具体地讲，在一些实施方案中，胰高血糖素肽包含SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17或SEQ ID NO：18的序列，其中PEG链共价连接于胰高血糖素肽的16、17、21、24、29位氨基酸或C-末端氨基酸的侧链，条件是当肽包含SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：13，聚乙二醇链共价键合于17、21或24位的氨基酸残基，当肽包含SEQ ID NO：14或SEQ ID NO：15，聚乙二醇链共价键合于16、17或21位的氨基酸残基，和当肽包含SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17或SEQ ID NO：18，聚乙二醇链共价键合于17或21位的氨基酸残基。
在一些实施方案中，胰高血糖素肽包含SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：13的序列，其中PEG链共价连接于胰高血糖素肽的17、21、24位氨基酸或C-末端氨基酸的侧链，并且肽的羧基末端氨基酸具有替代原生氨基酸的羧酸的酰胺基。在一些实施方案中，胰高血糖素/GLP-1受体协同激动剂肽包含选自SEQ IDNO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ IDNO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18和SEQ ID NO：19的序列，其中PEG链共价连接于胰高血糖素肽的SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：19的17、21或24位，或者SEQ ID NO：14和SEQID NO：15的16、17或21位，或者SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：18的17或21位的氨基酸侧链。在另一个实施方案中，胰高血糖素/GLP-1受体协同激动剂肽包含SEQ ID NO：11或SEQID NO：19的序列，其中PEG链共价连接于胰高血糖素肽的17、21或24位氨基酸或C-末端氨基酸的侧链。
根据一些实施方案，并且受到前述段落中描述的条件限制，胰高血糖素协同激动剂肽被修饰，以在16、17、21、24或29位或C-末端氨基酸含有一个或多个氨基酸取代，其中原生氨基酸用具有适合于与包括例如PEG的亲水性部分交联的侧链的氨基酸取代。原生肽可用天然存在的氨基酸或合成(非天然存在的)氨基酸取代。合成或非天然存在的氨基酸指的是不天然存在于体内，但是可加入到本文描述的肽结构中的氨基酸。或者，可在本文公开的任何一种胰高血糖素类似物的羧基末端增加具有适合于与包括例如PEG的亲水性部分交联的侧链的氨基酸。根据一些实施方案，在胰高血糖素/GLP-1受体协同激动剂肽中，在选自16、17、21、24或29的位置进行氨基酸取代，用选自赖氨酸、半胱氨酸、鸟氨酸、同型半胱氨酸和乙酰基苯丙氨酸的氨基酸替代原生氨基酸，其中取代氨基酸进一步包含共价键合于氨基酸的侧链的PEG侧链。在一些实施方案中，选自SEQ ID NO：12、SEQID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ IDNO：17、SEQ ID NO：18和SEQ ID NO：19的胰高血糖素肽被进一步修饰，以包含共价连接于胰高血糖素肽的17或21位的氨基酸侧链的PEG链。在一些实施方案中，聚乙二醇化的胰高血糖素/GLP-1受体协同激动剂进一步包含SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27或SEQ ID NO：29的序列。
在另一个实施方案中，胰高血糖素肽包含SEQ ID NO：55或SEQ ID NO：56的序列，进一步包含连接于SEQ ID NO：55或SEQ IDNO：56的C-末端氨基酸的SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：29或SEQ IDNO：65的C-末端延伸，并且任选地进一步包含共价连接于肽的17、18、21、24或29位氨基酸或C-末端氨基酸的侧链的PEG链。在另一个实施方案中，胰高血糖素肽包含SEQ ID NO：55或SEQ ID NO：56的序列，其中PEG链共价连接于胰高血糖素肽的21或24位的氨基酸侧链，并且肽进一步包含SEQ ID NO：26或SEQ ID NO：29的C-末端延伸。
在另一个实施方案中，胰高血糖素肽包含SEQ ID NO：55或SEQ ID NO：33或SEQ ID NO：34的序列，其中在SEQ ID NO：33或SEQ ID NO：34的羧基末端增加另外的氨基酸，并且PEG链共价连接于所增加氨基酸的侧链。在其它的实施方案中，聚乙二醇化的胰高血糖素类似物进一步包含连接于SEQ ID NO：33或SEQ ID NO：34的C-末端氨基酸的SEQ ID NO：26或SEQ ID NO：29的C-末端延伸。在另一个实施方案中，胰高血糖素肽包含SEQ ID NO：19的序列，其中PEG链共价连接于胰高血糖素肽的30位氨基酸的侧链，并且肽进一步包含连接于SEQ ID NO：19的C-末端氨基酸的SEQ ID NO：26或SEQ ID NO：29的C-末端延伸。
聚乙二醇链可以直链的形式存在，或者其可为分支的。根据一些实施方案，聚乙二醇链具有选自约500-约10000道尔顿的范围的平均分子量。在一些实施方案中，聚乙二醇链具有选自约1000-约5000道尔顿的范围的平均分子量。在备选的实施方案中，聚乙二醇链具有选自约10000-约20000道尔顿的范围的平均分子量。根据一些实施方案，聚乙二醇化的胰高血糖素肽包含共价键合于胰高血糖素肽的两个或更多个聚乙二醇链，其中胰高血糖素链的总分子量为约1000-约5000道尔顿。在一些实施方案中，聚乙二醇化的胰高血糖素激动剂包含由SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：5的胰高血糖素激动剂类似物组成的肽，其中PEG链共价连接于21位和24位的氨基酸残基，并且其中两个PEG链的合并分子量为约1000-约5000道尔顿。
在某些示例性实施方案中，胰高血糖素肽包含SEQ ID NO：1的具有最多10个氨基酸修饰的氨基酸序列，并在10位包含被酰化或烷基化的氨基酸。在一些实施方案中，10位的氨基酸用C4-C30脂肪酸酰化或烷基化。在某些方面，10位的氨基酸包含为非原生-天然存在的氨基酸的酰基或烷基。
在某些实施方案中，在10位包含被酰化或烷基化的氨基酸的胰高血糖素肽包含被稳定的α-螺旋。因此，在某些方面，胰高血糖素肽包含本文描述的酰基或烷基和分子内桥，例如在i位氨基酸和i+4位氨基酸的侧链之间的共价分子内桥(例如内酰胺桥)，其中i为12、16、20或24。或者或另外地，胰高血糖素肽包含本文描述的酰基或烷基，并且胰高血糖素肽的16、20、21和/或24位中的1、2、3或更多个位置用α，α-二取代氨基酸例如Aib取代。在一些情况中，非原生的胰高血糖素肽包含16位的Glu和20位的Lys，其中任选地内酰胺桥连接Glu和Lys，并且任选地，胰高血糖素肽进一步包含选自以下的一种或多种修饰：17位的Gln，18位的Ala，21位的Glu，23位的Ile和24位的Ala。
同样，在任一实施方案中，在任何一个实施方案中，其中胰高血糖素肽在10位包含被酰化或烷基化的氨基酸，胰高血糖素肽可进一步包含C-末端酰胺替代C-末端α羧酸酯。
在一些实施方案中，包含本文描述的酰基或烷基的胰高血糖素肽在1位、在2位或在1和2位进一步包含氨基酸取代，其中氨基酸取代获得DPP-IV蛋白酶抗性。例如，1位的His可用选自以下的氨基酸取代：D-组氨酸、α，α-二甲基咪唑乙酸(DMIA)、N-甲基组氨酸、α-甲基组氨酸、咪唑乙酸、脱氨基组氨酸、羟基-组氨酸、乙酰基-组氨酸和高组氨酸。或者或另外地，2位的Ser可用选自以下的氨基酸取代：D-丝氨酸、丙氨酸、D-丙氨酸、缬氨酸、甘氨酸、N-甲基丝氨酸、N-甲基丙氨酸和氨基异丁酸。在一些实施方案中，2位的氨基酸不为D-丝氨酸。
在10位包含如本文描述的那样被酰化或烷基化的氨基酸的胰高血糖素肽可包含与SEQ ID NO：1显著相关的任何氨基酸序列。例如，胰高血糖素肽包含具有最多10个氨基酸修饰(例如0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个修饰)的SEQ ID NO：1。在某些实施方案中，酰化或烷基化的胰高血糖素肽的氨基酸序列与SEQ ID NO：1相同大于25％(例如与SEQ ID NO：1相同大于30％、35％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％，或者几乎100％)。在某些特别的实施方案中，胰高血糖素肽为包含在10位具有如本文描述的那样被酰化或烷基化的氨基酸的SEQ ID NOs：55的肽。胰高血糖素肽可为任何一种SEQ ID NOs：55，55具有1或2个氨基酸修饰2-4、9-18、20、23-25、33、40-44、53、56、61、62、64、66-514和534。
这些实施方案的酰基或烷基可为本文描述的任何酰基或烷基。例如，酰基可为C4-C30(例如C8-C24)脂肪酰基和烷基可为C4-C30(例如C8-C24)烷基。
酰基或烷基所连的氨基酸可为本文描述的任何氨基酸，例如，任何式I(例如，Lys)、式II和式III氨基酸。
在一些实施方案中，酰基或烷基被直接连接于10位的氨基酸。在一些实施方案中，酰基或烷基经间隔区，例如经长度为3-10个原子的间隔区，例如经氨基酸或二肽连接于10位氨基酸。本文描述了用于连接酰基或烷基的目的的合适间隔区。
根据一些实施方案，3类胰高血糖素相关肽可为本文描述的前述3类胰高血糖素相关肽中任何一种的类似物，其类似物对GIP受体呈现激动剂活性。类似物对胰高血糖素受体、GLP-1受体和GIP受体的活性水平，对这些受体中每一种的功效和对这些受体中每一种的选择性，可与本文描述的2类胰高血糖素相关肽的讲授一致。参见，在2类胰高血糖素相关肽章节的分部下标题为“活性”的讲授。
在本发明的一些实施方案中，提供了胰高血糖素肽的类似物，其类似物对GIP受体呈现激动剂活性。在某些实施方案中，类似物包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列，其序列具有至少一个氨基酸修饰(任选地最多15个氨基酸修饰)和在类似物的29位氨基酸的1-21个氨基酸C-末端延伸。
在某些方面，类似物包含至少一个氨基酸修饰和最多15个氨基酸修饰(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15个氨基酸修饰，最多10个氨基酸修饰)。在某些实施方案中，类似物包含至少一个氨基酸修饰至最多10个氨基酸修饰和另外的保守氨基酸修饰。本文描述了保守氨基酸修饰。
在一些方面，氨基酸修饰中的至少一个在类似物的C-末端部分给予稳定的α-螺旋结构。本文描述了获得稳定的α-螺旋结构的修饰。参见例如在标题为α-螺旋/分子内桥的稳定章节下的讲授。在一些方面，类似物在类似物的两个氨基酸侧链之间包含分子内桥(例如共价分子内桥、非共价分子内桥)。在某些方面，分子内桥连接i和i+4位的氨基酸侧链，其中i为12、13、16、17、20或24。在其它方面，分子内桥连接j和j+3位(其中j为17)，或者k和k+7位的氨基酸侧链，其中k为12-22之间的任何整数。在某些实施方案中，分子内桥为共价分子内桥例如内酰胺桥。在特定的方面，内酰胺桥连接16和20位的氨基酸侧链。在特定的方面，16和20位的氨基酸中的一个为荷正电的氨基酸和另一个为荷负电的氨基酸。例如，类似物可包含连接16位的Glu和20位的Lys的侧链的内酰胺桥。在其它方面，荷负电的氨基酸和荷正电的氨基酸形成盐桥。在这种情况下，分子内桥为非共价分子内桥。
在特定的方面，给予稳定的α-螺旋的氨基酸修饰为SEQ IDNO：1的氨基酸用α，α-二取代氨基酸的***或取代。本文描述了用于稳定α-螺旋的目的的合适的α，α-二取代氨基酸，并且包括例如Aib。在一些方面，SEQ ID NO：1的16、20、21和24位的1、2、3或更多个氨基酸用α，α-二取代氨基酸例如Aib取代。在特别的实施方案中，16位的氨基酸为Aib。
对GIP受体呈现激动剂活性的类似物可包含另外的修饰，例如本文描述的那些中的任何一种修饰。例如，氨基酸修饰可增加或降低对GLP-1受体和胰高血糖素受体中一种或两者的活性。氨基酸修饰可增加肽的稳定性，例如增加对DPP-IV蛋白酶降解的抗性，稳定氨基酸15和16之间的键。氨基酸修饰可增加肽的溶解性和/或改变类似物对GIP、胰高血糖素和GLP-1受体中任何一种的作用时间。在类似物中可存在对GIP受体呈现激动剂活性的这些类型修饰中的任何一种的组合。
因此，在一些方面，类似物包含具有以下一种或多种的SEQID NO：1的氨基酸序列：17位的Gln，18位的Ala，21位的Glu，23位的Ile，和24位的Ala或Cys，或其保守的氨基酸取代。在一些方面，类似物包含替代C-末端α羧酸酯的C-末端酰胺。在某些实施方案中，类似物在1位、2位或者1和2位包含氨基酸取代，其取代获得DPP-IV蛋白酶抗性。本文描述了合适的氨基酸取代。例如，1位的DMIA和/或2位的d-Ser或Aib。在一些实施方案中，2位的氨基酸不为D-丝氨酸。
另外作为选择，类似物可包含以下中的一种或组合：(a)2位的Ser用Ala取代；(b)3位的Gln用Glu或谷氨酰胺类似物取代；(c)7位的Thr用Ile取代；(d)10位的Thr用Trp或包含为非原生-天然存在的氨基酸的酰基或烷基的氨基酸取代；(e)12位的Lys用Ile取代；(f)15位的Asp用Glu取代；(g)16位的Ser用Glu取代；(h)20位的Gln用Ser、Thr、Ala、Aib取代；(i)24位的Gln用Ser、Thr、Ala、Aib取代；(j)27位的Met用Leu或Nle取代；(k)29位的Asn用荷电氨基酸，任选地用Asp或Glu取代；和(l)29位的Thr用Gly或荷电氨基酸，任选地用Asp或Glu取代。
关于对GIP受体呈现激动剂活性的类似物，类似物包含1-21个氨基酸(例如5-19、7-15、9-12个氨基酸)的延伸。类似物的延伸可包含任何氨基酸序列，条件是延伸为1-21个氨基酸。在一些方面，延伸为7-15个氨基酸，和在其它方面，延伸为9-12个氨基酸。在一些实施方案中，延伸包含：(i)SEQ ID NO：26或674的氨基酸序列，(ii)与SEQ ID NO：26或674的氨基酸序列具有高序列一致性(例如至少80％、85％、90％、95％、98％、99％)的氨基酸序列，或(iii)具有一个或多个保守氨基酸修饰的(i)或(ii)的氨基酸序列。
在一些实施方案中，延伸中的至少一个氨基酸被酰化或烷基化。包含酰基或烷基的氨基酸可位于类似物的延伸中的任何位置。在某些实施方案中，延伸的酰化或烷基化的氨基酸位于类似物的37、38、39、40、41或42位(根据SEQ ID NO：1的编号)中的一个位置。在某些实施方案中，酰化或烷基化的氨基酸位于类似物的40位。
在示例性实施方案中，酰基或烷基为其为非原生-天然存在的氨基酸的酰基或烷基。例如，酰基或烷基可为C4-C30(例如C12-C18)脂肪酰基或C4-C30(例如C12-C18)烷基。酰基或烷基可为本文讨论的那些中的任何一种。
在一些实施方案中，酰基或烷基例如通过氨基酸的侧链直接连接于氨基酸。在其它的实施方案中，酰基或烷基通过间隔区(例如氨基酸、二肽、三肽、亲水性双功能间隔区、疏水性双功能间隔区)连接于氨基酸。在某些方面，间隔区长度为3-10个原子。在一些实施方案中，氨基酸间隔区不为γ-Glu。在一些实施方案中，二肽间隔区不为γ-Glu-γ-Glu。
而且，在示例性实施方案中，酰基或烷基连接的氨基酸可为包括例如式I、II或III的氨基酸的本文描述的那些中的任何一种。被酰化或烷基化的氨基酸可为例如Lys。本文描述了包含酰基或烷基的合适氨基酸以及合适的酰基和烷基。参见例如在标题为酰化和烷基化的章节下的讲授。
在其它的实施方案中，延伸的1-6个氨基酸(例如1-2、1-3、1-4、1-5个氨基酸)为荷正电的氨基酸，例如式IV的氨基酸，例如Lys。本文使用的术语“荷正电的氨基酸”指的是在生理pH下在其侧链的原子上包含正电荷的天然存在或非天然存在的任何氨基酸。在某些方面，荷正电的氨基酸位于37、38、39、40、41、42和43位中的任何位置。在特别的实施方案中，荷正电的氨基酸位于40位。
在其它情况中，延伸段如本文描述的那样被酰化或烷基化，并且包含1-6个本文描述的荷正电的氨基酸。
在另外的其它实施方案中，对GIP受体呈现激动剂活性的类似物包含：(i)具有至少一个氨基酸修饰的SEQ ID NO：1，(ii)在类似物的的C-末端至29位氨基酸的1-21个氨基酸(例如5-18、7-15、9-12个氨基酸)延伸，和(iii)包含对天然存在氨基酸而言是非原生的且位于C-末端延伸段之外的酰基或烷基(例如1-29位中的任何位置)的氨基酸。在一些实施方案中，类似物在10位包含酰化或烷基化的氨基酸。在特定的方面，酰基或烷基为C4-C30脂肪酰基或C4-C30烷基。在一些实施方案中，酰基或烷基通过间隔区(例如氨基酸、二肽、三肽、亲水性双功能间隔区、疏水性双功能间隔区)连接。在某些方面，类似物包含稳定α-螺旋的氨基酸修饰，例如在16位的Glu和20位的Lys之间的盐桥，或者在16、20、21和24位中的任何1、2、3或更多个位置的α，α-二取代氨基酸。在特定的方面，类似物另外包含赋予DPP-IV蛋白酶抗性的氨基酸修饰，例如1位的DMIA、2位的Aib。本文考虑包含其它氨基酸修饰的类似物。
在某些实施方案中，具有GIP受体活性的类似物呈现原生GIP对GIP受体的至少0.1％(例如至少0.5％、1％、2％、5％、10％、15％或20％)的活性。在一些实施方案中，类似物呈现原生GIP对GIP受体的大于20％(例如大于50％、大于75％、大于100％、大于200％、大于300％、大于500％)的活性。在一些实施方案中，类似物对GLP-1和胰高血糖素受体中的一种或两者呈现可观的激动剂活性。在一些方面，对这些受体(GIP受体和GLP-1受体和/或胰高血糖素受体)的选择性在100倍以内。例如，具有GIP受体活性的类似物对GLP-1受体的选择性可少于对GIP受体和/或胰高血糖素受体的选择性(500倍、100倍、50倍以内、25倍以内、15倍以内、10倍以内)。
根据一些实施方案，3类胰高血糖素相关肽包含原生胰高血糖素(SEQ ID NO：1)的氨基酸序列，其包含以下修饰：2位的Aib，3位的Glu，10位的Lys，16位的Glu，17位的Gln，18位的Ala，20位的Lys，21位的Glu，23位的Ile，24位的Ala；其中10位的Lys用C14或C16脂肪酸酰化，并且其中C-末端羧酸酯用酰胺替代。在特别的实施方案中，3类胰高血糖素相关肽通过连接基(L)连接于GPCR配体(Y)。
根据一些实施方案，3类胰高血糖素相关肽包含、基本由或由SEQ ID NOs：70-514、517-534或554中任何一种的氨基酸序列组成，任选地具有最多1、2、3、4或5个保留GLP-1激动剂和/或胰高血糖素激动剂活性的其它修饰。在某些实施方案中，3类胰高血糖素相关肽包含SEQ ID NOs：562-760中任何一种的氨基酸。在一些实施方案中，3类胰高血糖素相关肽包含SEQ ID NOs：1301-1421中任何一种的氨基酸序列。
4类胰高血糖素相关肽
在某些实施方案中，Q为4类胰高血糖素相关肽(参见例如国际(PCT)专利申请公布号WO 2009/058662，通过引用以其全部结合到本文中)。
在以下章节中提及的所有生物序列(SEQ ID NOs：1301-1371)对应于WO 2009/058662中的SEQ ID NOs：1-71。
活性
根据一些实施方案，提供4类胰高血糖素相关肽(下文称为“4类肽”)。在某些方面，提供具有胰高血糖素拮抗剂活性的4类肽。胰高血糖素拮抗剂将用于其中需要抑制胰高血糖素激动作用的任何环境。最直接和明显的用途为治疗其中胰高血糖素拮抗已经在高血糖症的临床前模型得到证明的糖尿病，以得到降低的血糖。胰高血糖素拮抗剂可被进一步修饰，以改善化合物的生物物理稳定性和/或水溶性，同时保持母体化合物的拮抗剂活性。在某些方面，4类肽定义为纯的胰高血糖素拮抗剂。
术语″胰高血糖素拮抗剂″指的是阻碍胰高血糖素活性或防止胰高血糖素功能的化合物。例如，胰高血糖素拮抗剂对胰高血糖素受体呈现由胰高血糖素获得的最大应答的至少60％抑制作用(例如至少70％抑制作用)，并且优选地为至少80％抑制作用。在一些实施方案中，胰高血糖素拮抗剂对胰高血糖素受体呈现由胰高血糖素获得的最大应答的至少90％抑制作用。在特别的实施方案中，胰高血糖素拮抗剂对胰高血糖素受体呈现由胰高血糖素获得的最大应答的100％抑制作用。另外，以约1μM浓度存在的胰高血糖素拮抗剂对胰高血糖素受体呈现由胰高血糖素获得的最大激动剂活性的少于约20％。在一些实施方案中，胰高血糖素拮抗剂对胰高血糖素受体呈现由胰高血糖素获得的最大激动剂活性的少于约10％。在特别的实施方案中，胰高血糖素拮抗剂对胰高血糖素受体呈现由胰高血糖素获得的最大激动剂活性的少于约5％。在又一个特别的实施方案中，胰高血糖素拮抗剂对胰高血糖素受体呈现由胰高血糖素获得的最大激动剂活性的0％。
″纯胰高血糖素拮抗剂″为不产生任何可检测到的胰高血糖素或GLP-1受体活性刺激的胰高血糖素拮抗剂，如使用验证性体外模型实验通过cAMP产生测量的那样(参见例如WO 2009/058662)。例如纯的胰高血糖素拮抗剂对胰高血糖素受体呈现由胰高血糖素获得的最大激动剂活性的少于约5％(例如少于约4％、少于约3％、少于约2％、少于约1％、约0％)，并且对GLP-1受体呈现由GLP-1获得的最大激动剂活性的少于约5％(例如少于约4％、少于约3％、少于约2％、少于约1％和约0％)。
因此，在一些方面，提供呈现纯的胰高血糖素拮抗剂活性的4类肽。根据一些实施方案，当胰高血糖素受体同时与0.8nM胰高血糖素和胰高血糖素拮抗剂接触时，胰高血糖素拮抗剂呈现减少胰高血糖素受体胰高血糖素诱导的cAMP产生的活性达最大至少50％，如通过体外试验中cAMP产生测量的那样。在一些实施方案中，胰高血糖素拮抗剂减少胰高血糖素受体胰高血糖素诱导的cAMP产生达最大量至少80％。
确信4类肽适合于先前对胰高血糖素拮抗剂描述的任何用途。因此，本文描述的4类肽可用于治疗高血糖症，或治疗由高血液水平的胰高血糖素或高血糖水平造成的其它代谢性疾病。根据一些实施方案，要使用本文公开的4类肽治疗的患者为驯养动物，并且在另一个实施方案中，要治疗的患者为人。研究提示，在糖尿病患者中缺乏胰高血糖素抑制造成部分经肝糖降解加速的餐后高血糖。在口服葡萄糖耐量试验(OGTT)期间，并且在生长抑素诱导的胰高糖素抑制存在或不存在下的血糖分析已经显示，在具有较高胰高糖素水平的患者中显著增加葡萄糖。因此，本发明的4类肽可用于治疗高血糖症，并且期望用于治疗各种类型的糖尿病，包括1型糖尿病、I1型糖尿病或妊娠糖尿病(或者胰岛素依赖型或者非胰岛素依赖型的)，和减少糖尿病并发症，包括肾病、视网膜病变和血管疾病。
在一些实施方案中，毒蜥外泌肽-4的末端10个氨基酸(即SEQID NO：1319的序列(GPSSGAPPPS))连接于4类肽的羧基末端。期望这些融合蛋白对于抑制食欲和引起体重减轻/保持体重具有药理活性。根据一些实施方案，本文公开的4类肽可被进一步修饰，以包括连接于SEQ ID NO：1342的4类肽的氨基酸24的SEQ ID NO：1319的氨基酸序列(GPSSGAPPPS)，并且给予个体以引起体重减轻或者帮助保持体重。更具体地讲，4类肽包含选自SEQ ID NO：1302、SEQ ID NO：1303、SEQ ID NO：1304、SEQ ID NO：1305、SEQ ID NO：1306、SEQID NO：1307、SEQ ID NO：1308、SEQ ID NO：1336、SEQ ID NO：1339、SEQ ID NO：1340、SEQ ID NO：1341、SEQ ID NO：1342、SEQ ID NO：1343和SEQ ID NO：1344的序列，并且进一步包含连接于4类肽的氨基酸24的SEQ ID NO：1319的氨基酸序列(GPSSGAPPPS)，用于抑制食欲和引起体重减轻/保持体重。在一些实施方案中，给予的4类肽包含SEQ ID NO：1346或SEQ ID NO：1347的序列。
用于减少食欲或促进体重减轻的这类方法预计用于减轻体重，防止体重增加，或者治疗各种原因的肥胖症，包括药物引起的肥胖症，和减少与肥胖有关的并发症，包括血管疾病(冠状动脉疾病、中风、周围性血管疾病、缺血性再灌注等)、高血压、II型糖尿病的发生、高脂血症和肌肉骨骼***疾病。
本发明的4类肽可单独或与其它抗糖尿病或抗肥胖药物组合给药。本领域已知的或研究中的抗糖尿病药物包括胰岛素、磺酰脲类，例如甲苯磺丁脲((Orinase)、醋磺己脲(Dymelor)、甲磺氮 脲((Tolinase)、氯磺丙脲(Diabinese)、格列吡嗪(Glucotrol)、格列本脲(Diabeta，Micronase，Glynase)、格列美脲(Amaryl)或格列齐特(Diamicron)；美格列奈类(meglitinides)，例如瑞格列奈(Prandin)或那格列奈(Starlix)；双胍类例如二甲双胍(Glucophage)或苯乙双胍；噻唑烷二酮类例如罗格列酮(Avandia)、吡格列酮(Actos)或曲格列酮(Rezulin)或其它PPARγ抑制剂；抑制碳水化合物消化的α-葡萄糖苷酶抑制剂，例如米格列醇(Glyset)、阿卡波糖(Precose/Glucobay)；艾塞那肽(Byetta)或普兰林肽；二肽基肽酶-4(DPP-4)抑制剂例如维格列汀(vildagliptin)或西格列汀(sitagliptin)；SGLT(钠依赖性葡萄糖转运蛋白1)抑制剂；或FBPase(果糖1，6-二磷酸酶)抑制剂。
本领域已知的或研究中的抗肥胖药物包括食欲抑制剂，包括苯乙胺类***、芬特明(任选地与芬氟拉明或右芬氟拉明一起)、安非拉酮(Tenuate
Figure BPA00001673726802191
)、苯甲曲秦(Prelu-2
Figure BPA00001673726802192
Bontril
Figure BPA00001673726802193
)、苄非他明(Didrex
Figure BPA00001673726802201
)、***(Meridia
Figure BPA00001673726802202
Reductil)；利莫那班(Acomplia)，其它***素受体拮抗剂；泌酸调节肽；盐酸氟西汀(Prozac)；Qnexa(托吡酯和芬特明)、Excalia(安非他酮和唑尼沙胺)或Contrave(安非他酮和纳曲酮)；或者脂肪酶抑制剂，类似于赛尼可(奥利司他(Orlistat))或西替利司他(也称为ATL-962)或者GT 389-255。
本发明的4类肽也可给予患有分解代谢性消耗病的患者。据估计，超过一半的癌症患者经历了特征为非故意和进行性的体重减轻、衰弱及低身体脂肪和肌肉的分解代谢性消耗病。这种综合征在AIDS患者同样常见，并且也可存在于细菌和寄生虫病、类风湿性关节炎以及肠、肝、肺和心脏的慢性疾病中。其通常与厌食症有关，并可表现为衰老中的病症或者为物理创伤的结果。分解代谢性消耗病为降低生活质量、恶化基础条件的症状，并且为死亡的主要原因。申请人预计，本文公开的4类肽可给予患者以治疗分解代谢性消耗病。
使用标准的药学上可接受的载体和本领域技术人员已知的给药途径，可配制包含本文公开的4类肽的药用组合物并给予患者。因此本公开也包括包含一种或多种本文公开的4类肽与药学上可接受的载体组合的药用组合物。药用组合物可包含4类肽作为唯一的药用活性成分，或者4类肽可与一种或多种另外的活性物质组合。根据一些实施方案，提供包含本发明的4类肽和激活GLP-1受体的化合物(例如GLP-1、GLP-1类似物、毒蜥外泌肽-4类似物或其衍生物)的组合物。根据一些实施方案，提供包含本发明的4类肽和胰岛素或胰岛素类似物的组合物。或者，可提供引起体重减轻或防止体重增加的组合物，这种组合物包含SEQ ID NO：1342的序列，进一步包含连接于SEQ IDNO：1342的氨基酸24的SEQ ID NO：1319的氨基酸序列(GPSSGAPPPS)和抗肥胖肽。合适的抗肥胖肽包括在美国专利5691309，6436435或美国专利申请20050176643中公开的那些抗肥胖肽，并且包括但不限于GLP-1、GIP(抑胃多肽)、MP1、PYY、MC-4、来普汀(Leptin)。
4类肽结构
在一些实施方案中提供4类胰高血糖素相关肽，其中(胰高血糖素，SEQ ID NO：1301的)9位通常存在的天冬氨酸被谷氨酸或基于半胱氨酸的衍生物取代。更具体地讲，第一个氨基酸缺失(去-His)和9位的天冬氨酸被谷氨酸取代，在一些情况下产生4类肽。在胰高血糖素的9位氨基酸具有取代的磺酸取代基的4类胰高血糖素相关肽表现类似于基于羧酸的氨基酸，但是具有与物理性能例如溶解性相关的几个关键区别。同型半胱氨酸(hCysSO3)当取代常规des-His中的9位等排谷氨酸时，Glu94类肽保留部分拮抗剂和弱激动剂作用。
在一些实施方案中提供4类肽，其中去除头2-5个氨基酸，并且9位(根据SEQ ID NO：1301的编号)用hCys(SO3)、高谷氨酸、β-高谷氨酸或具有以下结构的半胱氨酸的烷基羧酸酯衍生物替代：
Figure BPA00001673726802211
其中X5为C1-C4烷基、C2-C4链烯基或C2-C4炔基，提供表现为高特异性、有效并且没有污染激动剂性能的激素拮抗剂的化合物。
根据一些实施方案提供4类肽，相对于SEQ ID NO：1301的野生型序列，该4类肽包含(通过从N-末端缺失2-5个氨基酸残基，并用谷氨酸、高谷氨酸、β-高谷氨酸、半胱氨酸的磺酸衍生物或具有以下结构的半胱氨酸的烷基羧酸酯衍生物取代原生蛋白的9位的天冬氨酸残基)修饰的胰高血糖素：
Figure BPA00001673726802221
其中X5为C1-C4烷基、C2-C4链烯基或C2-C4炔基。
在一个特别的实施方案中，包含从N-末端的2-5个氨基酸残基缺失和原生胰高血糖素的9位Asp取代的4类肽被进一步修饰达最多3个氨基酸修饰。例如，4类肽可包含1、2或3个保守的氨基酸修饰。作为选择或者或另外地，4类肽可包含一种或多种选自以下的氨基酸修饰：
A.用通过酯、醚、硫醚、酰胺或烷基胺连键共价连接于酰基或烷基的氨基酸取代4类肽的10、20和24位(根据SEQ ID NO：1301的氨基酸编号)的1或2个氨基酸或者N-或C-末端氨基酸；
B.用选自以下的氨基酸取代4类肽的16、17、20、21和24位(根据SEQ ID NO：1301的氨基酸编号)的1或2个氨基酸或者N-或C-末端氨基酸：Cys、Lys、鸟氨酸、同型半胱氨酸和乙酰基-苯丙氨酸(Ac-Phe)，其中基团的氨基酸共价键合于亲水性部分；
C.在4类肽的N-或C-末端增加共价键合于亲水性部分的氨基酸；
D.用半胱氨酸、谷氨酸、高谷氨酸和同型半胱氨酸取代15位(根据SEQ ID NO：1301的编号)的Asp；
E.用半胱氨酸、谷氨酸、高谷氨酸和同型半胱氨酸取代16位(根据SEQ ID NO：1301的编号)的Ser；
F.用Aib取代16、20、21和24位(根据SEQ ID NO：1301的氨基酸编号)中的一个或多个位置；
G.根据SEQ ID NO：1301的编号的29位氨基酸或者28和29位氨基酸缺失；
H.用荷电氨基酸取代28位的Asn和29位的Thr(根据SEQ ID NO：1301的氨基酸编号)中的每一个或两者；和/或在SEQ ID NO：1301的C-末端增加1-2个荷电氨基酸；
I.用Leu或正亮氨酸取代27位(根据SEQ ID NO：1301的编号)的Met；
J.在SEQ ID NO：1301的C-末端增加具有SEQ ID NOs：19-21和53中任何一种的氨基酸序列的肽，其中29位(根据SEQ ID NO：1301的编号)的Thr为Thr或Gly；和
K.用酰胺或酯替代C-末端羧酸酯。
在特别的实施方案中，4类肽包含以上描述的A、B或C的氨基酸修饰或其组合。在又一个特别的实施方案中，除了A、B和/或C的氨基酸修饰外，4类肽还包含以上描述的D-K中任何一种的氨基酸修饰或其组合。
在一些实施方案中，4类肽包含胰高血糖素肽，其中自N-末端除去头5个氨基酸，并且剩余的N-末端氨基用羟基替代(″PLA6类似物″)，产生SEQ ID NO：1339的肽。申请人已经发现，苯基-乳酸取代4类肽类似物中的苯基丙氨酸(这种4类肽类似物具有头5个氨基酸缺失)和9位的谷氨酸取代(相对于原生胰高血糖素)进一步增强那些4类肽类似物的功效。
在一些实施方案中，通过用以下通式结构的氨基酸取代4位(原生胰高血糖素的9位)的天冬氨酸残基，进一步修饰SEQ ID NO：1339的4类肽：
Figure BPA00001673726802231
其中X6为C1-C3烷基、C2-C3链烯或C2-C3炔基，并且在一些实施方案中，X6为C1-C3烷基，并且在另一个实施方案中，X6为C2烷基。在一些实施方案中，4类肽包含胰高血糖素肽，其中自N-末端除去头5个氨基酸，并且4位(原生胰高血糖素的9位)的天冬氨酸残基被半胱氨酸或同型半胱氨酸取代。在一些实施方案中，4类肽包含含有选自SEQ ID NO：1339、SEQ ID NO：1307和SEQ ID NO：1308的氨基酸序列的胰高血糖素肽。在一些实施方案中，4类肽包含选自SEQ ID NO：1308的氨基酸序列，其中4位的氨基酸为同型半胱氨酸。
在另一个实施方案中，SEQ ID NO：1339的4类肽通过用谷氨酸、高谷氨酸、β-高谷氨酸或具有以下结构的半胱氨酸的烷基羧酸酯衍生物取代4位(原生胰高血糖素的9位)的天冬氨酸残基进一步修饰：
Figure BPA00001673726802241
其中X5为C1-C4烷基、C2-C4链烯基或C2-C4炔基。在特别的实施方案中，X5为C1或C2烷基。
然而，申请人已经发现，不需要在des1-5胰高血糖素类似物(即缺失头5个氨基酸的胰高血糖素类似物)用PLA取代N-末端苯丙氨酸，进一步取代4位(原生胰高血糖素的9位)的原生天冬氨酸残基以产生呈现纯的拮抗作用的类似物。该结果从先前技术的讲授来看令人惊讶，先前技术的讲授认为4位原生天冬氨酸残基必须取代以产生高亲和性和有效的胰高血糖素(2-29)类似物的拮抗剂。使用PLA取代把Asp9类似物的相对功效改善至与Glu9和hCys(SO3H)9类似物相当的程度。
用包括3，4-2F-苯丙氨酸(3，4-2F-Phe)、2-萘基丙氨酸(2-Nal)、N-酰基-苯丙氨酸(Ac-Phe)、α-甲基氢化肉桂酸(MCA)和苄基丙二酸(BMA)的其它苯丙氨酸类似物取代苯丙氨酸残基，没有表现为象PLA取代一样有效。
在包括4和5位的非6位的位点(根据原生胰高血糖素的氨基酸编号)取代PLA显示，PLA6类似物为比具有稍微延伸的N-末端的胰高血糖素类似物明显更加有效的拮抗剂。本发明也包括其中N-末端氨基用酰化和烷基化的“O-末端”肽取代的类似物。
另外，PLA6取代不仅增加拮抗剂的功效，而且在聚乙二醇化中发挥关键作用。PLA6类似物可被选择性地聚乙二醇化而不恢复胰高血糖素激动作用。在不存在PLA取代时，类似物的聚乙二醇化出人意外地引起胰高血糖素激动作用。在聚乙二醇化的PLA6类似物不见这种胰高血糖素激动作用。研究了聚乙二醇化的几个位点，包括3、6和19位(原生胰高血糖素的8、11和19位)和N-末端氨基酸残基。在一些实施方案中，聚乙二醇化在19位(原生胰高血糖素的24位)，因为该位点呈现最有效和选择性的胰高血糖素拮抗作用。
在某些实施方案中，4类肽包括通用结构A-B-C，其中A选自：
(i)苯基乳酸(PLA)；
(ii)PLA的含氧衍生物；
(iii)2-6个氨基酸的肽，其中肽的两个连续氨基酸通过酯或醚键连接；B表示SEQ ID NO：1301的氨基酸i-26，其中i是3，4，5，6或7，任选包含选自以下的一处或多处氨基酸修饰：
(iv)9位的Asp(根据SEQ ID NO：1301的氨基酸编号)用Glu、Cys的磺酸衍生物、高谷氨酸、β-高谷氨酸或具有以下结构的半胱氨酸的烷基羧酸酯衍生物取代：
Figure BPA00001673726802251
其中X5为C1-C4烷基、C2-C4链烯基或C2-C4炔基；
(v)用通过酯、醚、硫醚、酰胺或烷基胺连接共价连接于酰基或烷基的氨基酸取代10、20和24位(根据SEQ ID NO：1301的氨基酸编号)的1或2个氨基酸；
(vi)用选自Cys、Lys、鸟氨酸、同型半胱氨酸和乙酰基-苯丙氨酸(Ac-Phe)的氨基酸取代16、17、20、21和24位(根据SEQ ID NO：1301的氨基酸编号)的1或2个氨基酸，其中基团的氨基酸共价连接于亲水性部分；
(vii)15位的Asp(根据SEQ ID NO：1301的编号)用半胱氨酸、谷氨酸、高谷氨酸和同型半胱氨酸取代；
(viii)16位的Ser(根据SEQ ID NO：1301的编号)用半胱氨酸、谷氨酸、高谷氨酸和同型半胱氨酸取代；
(ix)用Aib取代16、20、21和24位(根据SEQ ID NO：1301的氨基酸编号)中的一个或多个位置；
(x)X；
(xi)X-Y；
(xii)X-Y-Z；和
(xiii)X-Y-Z-R10，
其中X为Met、Leu或Nle；Y为Asn或荷电氨基酸；Z为Thr、Gly、Cys、Lys、鸟氨酸(Orn)、同型半胱氨酸、乙酰基苯丙氨酸(Ac-Phe)或荷电氨基酸；其中R10选自SEQ ID NOs：1319-1321和1353；和
(xiv)(x)-(xiii)中的任何一种，其中C-末端羧酸酯用酰胺替代。
在特定的方面，4类肽包含PLA的含氧衍生物。本文使用的“PLA的含氧衍生物”指的是包含修饰的PLA结构的化合物，其中羟基用O-R11替代，其中R11为化学部分。在这方面，PLA的含氧衍生物可为例如PLA的酯或PLA的醚。
制备PLA的含氧衍生物的方法为本领域已知的。例如，当含氧衍生物为PLA的酯，通过PLA的羟基与带有羰基的亲核试剂反应可形成酯。亲核试剂可为任何合适的亲核试剂，包括但不限于胺或羟基。因此，PLA的酯可包含以下式IV的结构：
其中R7为经PLA的羟基与带亲核试剂的羰基反应生成的酯。
带有羰基的亲核试剂(其与PLA的羟基反应形成酯)可为例如羧酸、羧酸衍生物或者活化的羧酸酯。羧酸衍生物非限制性地可为酰氯、酸酐、酰胺、酯或腈。活化的羧酸酯可为例如N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、甲苯磺酸酯(Tos)、碳二亚胺或六氟磷酸酯。在一些实施方案中，碳二亚胺为1，3-二环己基碳二亚胺(DCC)、1，1’-羰基二咪唑(CDI)、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)或1，3-二异丙基碳二亚胺(DICD)。在一些实施方案中，六氟磷酸盐选自六氟磷酸酯苯并***-1-基-氧基-三(二甲基氨基)膦鎓六氟磷酸盐(BOP)、苯并***-1-基-氧基三吡咯烷基膦鎓六氟磷酸盐(PyBOP)、2-(1H-7-氮杂苯并***-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲鎓六氟磷酸盐(HATU)和o-苯并***-N，N，N’，N’-四甲基-脲鎓-六氟磷酸盐(HBTU)。
从与羟基(例如PLA的羟基)的反应制备醚的方法也为本领域已知的。例如，PLA的羟基可与卤化烷基或甲苯磺酸酯化的烷基醇反应形成醚键。
通常，R11的化学部分是不减少4类肽的活性的部分。在某些实施方案中，化学部分提高4类肽的活性、稳定性和/或溶解性。
在一个具体实施方案中，经含氧键(例如，经酯或醚键)连至PLA的化学部分是聚合物(例如，聚亚烷基二醇)、碳水化合物、氨基酸、肽或脂质，例如，脂肪酸或类固醇。
在特别的实施方案中，化学部分为氨基酸，其任选地为肽的部分，使得式IV为缩酚酸肽。在这方面，PLA可在除4类肽的N-末端氨基酸残基的位置，使得4类肽在PLA残基包含一个或多个(例如1、2、3、4、5、6或更多个)氨基酸N-末端。例如，4类肽可在位置n包含PLA，其中n为4类肽的2、3、4、5或6位。
氨基酸N-末端至PLA残基可为合成或天然存在的。在特别的实施方案中，为N-末端PLA的氨基酸为天然存在的氨基酸。在一些实施方案中，为N-末端的氨基酸至PLA为原生胰高血糖素的N-末端氨基酸。例如，4类肽可在N-末端包含SEQ ID NOs：1354-1358中任何一种的氨基酸序列，其中PLA通过酯键连接于苏氨酸：
SEQ ID NO：1354His-Ser-Gln-Gly-Thr-PLA
SEQ ID NO：1355Ser-Gln-Gly-Thr-PLA
SEQ ID NO：1356Gln-Gly-Thr-PLA
SEQ ID NO：1357Gly-Thr-PLA
SEQ ID NO：1358Thr-PLA
在备选的实施方案中，一个或多个N-末端氨基酸可用除原生胰高血糖素的氨基酸以外的氨基酸取代。例如，当4类肽包含PLA作为5或6位的氨基酸时，1位和/或2位的氨基酸可为减小对经二肽基肽酶IV裂解的敏感性的氨基酸。更具体地讲，在一些实施方案中，4类肽的1位为选自以下的氨基酸：D-组氨酸、α，α-二甲基咪唑乙酸(DMIA)、N-甲基组氨酸、α-甲基组氨酸、咪唑乙酸、脱氨基组氨酸、羟基-组氨酸、乙酰基-组氨酸和高-组氨酸。更具体地讲，在一些实施方案中，拮抗剂肽的2位为选自以下的氨基酸：D-丝氨酸、D-丙氨酸、缬氨酸、甘氨酸、N-甲基丝氨酸、N-甲基丙氨酸和氨基异丁酸(Aib)。而且，例如，当4类肽包含PLA作为4、5或6位的氨基酸时，相对于原生胰高血糖素的原生谷氨酰胺残基，4类肽的3位氨基酸可为谷氨酸。在本发明的示例性实施方案中，4类肽在N-末端包含SEQ IDNOs：1359-1361中任何一种的氨基酸序列。
关于包含式IV化合物的4类肽，聚合物可为任何聚合物，条件是，其能与PLA的羟基反应。聚合物可为天然或通常包括带有亲核试剂的羰基的聚合物。作为选择，聚合物可为被衍生以包括带有羰基的羰基的取物。聚合物可被衍生为以下任何聚合物：聚酰胺、聚碳酸酯、聚亚烷基及其衍生物包括、聚亚烷基二醇、聚环氧烷、聚对苯二甲酸亚烷基酯、丙烯酸酯和甲基丙烯酸酯的聚合物包括聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(甲基丙烯酸乙酯)、聚(甲基丙烯酸丁酯)、聚(甲基丙烯酸异丁酯)、聚(甲基丙烯酸己酯)、聚(甲基丙烯酸异癸酯)、聚(甲基丙烯酸月桂酯)、聚(甲基丙烯酸苯酯)、聚(丙烯酸甲酯)、聚(丙烯酸异丙酯)、聚(丙烯酸异丁酯)和聚(丙烯酸十八烷酯)、聚乙烯聚合物包括聚乙烯醇类、聚乙烯醚类、聚乙烯酯类、聚卤代乙烯、聚(乙烯基醋酸酯)，和聚乙烯吡咯烷酮、聚乙交酯、聚硅氧烷、聚氨基甲酸酯及其共聚物、纤维素包括烷基纤维素，羟烷基纤维素、纤维素醚、纤维素酯，硝基纤维素、甲基纤维素，乙基纤维素，羟基丙基纤维素，羟基-丙基甲基纤维素，羟基丁基甲基纤维素，纤维素醋酸酯、纤维素丙酸酯、乙酸丁酸纤维素、邻苯二甲酸乙酸纤维素，羧基乙基纤维素、三乙酸纤维素和纤维素硫酸钠盐、聚丙烯、聚亚乙基包括聚(乙二醇)、聚(环氧乙烷)和聚(对苯二甲酸乙二酯)和聚苯乙烯。
聚合物可为可生物降解聚合物，包括合成的可生物降解聚合物(例如乳酸和乙醇酸的聚合物、聚酐、聚原酸酯、聚氨酯、聚布狄克酸)(poly(butic acid))、聚戊酸和聚丙交酯共聚己内酯)；和天然的可生物降解聚合物(例如海藻酸盐和其它多糖，包括葡聚糖和纤维素、胶原、其化学衍生物(取代、增加化学基团，例如烷基、亚烷基、羟基化、氧化以及本领域技术人员通常进行的其它修饰)、白蛋白和其它亲水性蛋白(例如玉米蛋白和其它醇溶谷蛋白及疏水性蛋白))及其任何共聚物或混合物。通常，这些材料通过体内酶促水解或暴露于水、通过表面或大量侵蚀而降解。
聚合物可为生物粘附性聚合物，例如H.S.Sawhney，C.P.Pathak和J.A.Hubbell在Macromolecule，1993，26，581-587中描述的可生物蚀解的水凝胶，其内容通过引用结合于本文中，聚透明质酸、酪蛋白，明胶，明胶蛋白、聚酐、聚丙烯酸，藻酸盐，壳聚糖、聚(甲基丙烯酸甲酯s)、聚(甲基丙烯酸乙酯)、聚(甲基丙烯酸丁酯)、聚(甲基丙烯酸异丁酯)、聚(甲基丙烯酸己酯)、聚(甲基丙烯酸异癸酯)、聚(甲基丙烯酸月桂酯)、聚(甲基丙烯酸苯酯)、聚(丙烯酸甲酯)、聚(丙烯酸异丙酯)、聚(丙烯酸异丁酯)，和聚(丙烯酸十八烷酯)。
在一些实施方案中，聚合物为水溶性聚合物。合适的水溶性聚合物为本领域已知的，并且包括例如聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基纤维素(HPC；Klucel)、羟丙基甲基纤维素(HPMC；Methocel)、硝基纤维素、羟丙基乙基纤维素、羟丙基丁基纤维素、羟丙基戊基纤维素、甲基纤维素、乙基纤维素(Ethocel)、羟乙基纤维素、各种烷基纤维素和羟基烷基纤维素、各种纤维素醚、醋酸纤维素、羧甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、羧甲基纤维素钙、醋酸乙烯酯/巴豆酸共聚物、聚-甲基丙烯酸羟烷基酯、甲基丙烯酸羟甲基酯、甲基丙烯酸共聚物、聚甲基丙烯酸、聚甲基丙烯酸甲酯、马来酸酐/甲基乙烯基醚共聚物、聚乙烯醇、聚丙烯酸钠和钙、聚丙烯酸、酸性羧基聚合物、聚羧乙烯、羧基乙烯基聚合物、聚氧乙烯聚氧丙烯共聚物、聚甲基乙烯基醚共聚马来酸酐、羧甲基酰胺、甲基丙烯酸钾二乙烯基苯共聚物、聚氧乙二醇、聚环氧乙烷及其衍生物、盐和组合。
在一个具体实施方案中，聚合物是聚亚烷基二醇，包括例如，聚乙二醇(PEG)。
碳水化合物可为任何碳水化合物，条件是其包含或被使得包含具有α离去基团的羰基。碳水化合物例如可为被衍化以包含具有α离去基团的羰基的碳水化合物。在这方面，碳水化合物可为以下的衍化形式：单糖(例如葡萄糖、半乳糖、果糖)、二糖(例如蔗糖、乳糖、麦芽糖)、寡糖(例如棉子糖、水苏糖)、多糖(淀粉、淀粉酶、支链淀粉、纤维素、甲壳素、胼胝质、海带多糖、木聚糖、甘露聚糖、褐藻糖胶、半乳甘露聚糖)。
关于包含式IV化合物的4类肽，脂质可为包含具有α离去基团的羰基的任何脂质。脂质例如可为被衍化以包含羰基的脂质。在这方面，脂质可为以下的衍生物：脂肪酸(例如C4-C30脂肪酸、类二十烷酸、***素、白三烯、血栓素、N-酰基乙醇胺)、甘油脂(例如单-、二-、三-取代的甘油)、甘油磷脂(例如磷脂酰胆碱、磷脂酰肌醇、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸)、鞘脂类(例如鞘氨醇、神经酰胺)、固醇类脂(例如类固醇、胆固醇)、异戊烯醇类脂、醣脂质或聚酮化合物。在一些实施方案中，脂质为油、蜡、胆固醇、固醇、脂溶性维生素、单甘油酯、二甘油酯、三甘油酯、磷脂。
在一些实施方案中，R7具有约100kDa或者更少，例如约90kDa或者更少、约80kDa或者更少、约70kDa或者更少、约60kDa或者更少、约50kDa或者更少、约40kDa或者更少的分子量。因此，R7可具有约35kDa或者更少、约30kDa或者更少、约25kDa或者更少、约20kDa或者更少、约15kDa或者更少、约10kDa或者更少、约5kDa或者更少或约1kDa的分子量。
在备选的实施方案中，4类肽包含A，2-6个氨基酸的肽，其中肽的两个连续氨基酸通过酯或醚键连接。酯或醚键例如可在氨基酸2和3、3和4、4和5或5和6之间。任选地，肽可通过包括连接于聚合物(例如亲水性聚合物)的共价键合于另一个化学部分、烷基化或酰化而被进一步修饰。
关于包含通式结构A-B-C的4类肽，B代表任选地包含一个或多个氨基酸修饰的原生胰高血糖素的氨基酸，例如SEQ ID NO：1301的i-26，其中i为3、4、5、6或7。在一个特别的实施方案中，B代表任选地进一步修饰的SEQ ID NO：1301的氨基酸7-26饰。
在一些实施方案中，通过不超过三处的氨基酸修饰修饰。例如，通过一处或多处保守性氨基酸修饰，修饰代表SEQ ID NO：1301的原生氨基酸序列的B。
在另一个实施方案中，B包含一个或多个选自(iv)-(ix)的氨基酸修饰，如本文描述的那样。在一个特别的实施方案中，B包含氨基酸修饰(v)和(vi)中的一个或两者。在其它特别的实施方案中，除了(v)和(vi)以外，B还包含选自(iv)、(vii)、(viii)和(ix)的氨基酸修饰中的一个或组合。
在另一个特别的实施方案中，4类肽在C-末端包含一个或多个荷电氨基酸。例如，Y和/或Z可为荷电氨基酸，例如Lys、Arg、His、Asp和Glu。在又一个实施方案中，4类肽在Z包含1-2个荷电氨基酸(例如Lys、Arg、His、Asp和Glu)C-末端。在特定的方面，随后为1-2个荷电氨基酸的Z不包含R10。
在一些实施方案中，4类肽包含共价键合于4类肽的氨基酸残基的亲水性部分，如本文描述的那样。例如，4类肽可包含共价连接于1、16、20、21或24位(根据SEQ ID NO：1301的编号)的氨基酸的亲水性部分。在另一个实施方案中，亲水性部分连接于4类肽的C-末端氨基酸，其在一些情况中为Z的1或11个氨基酸C-末端。在又一个实施方案中，当A为PLA、PLA-Phe或PLA-Thr-Phe时，亲水性部分连接于PLA，其中PLA被修饰以包含亲水性部分。在另一个实施方案中，在4类肽的N-或C-末端增加包含亲水性部分的氨基酸。在另一个实施方案中，4类肽包含本文描述的酰基或烷基。例如，酰化或烷基化可发生于远离10、20或24位(根据SEQ ID NO：1301的编号)的氨基酸侧链。在备选的实施方案中，酰化或烷基化发生于远离4类肽的C-末端氨基酸的侧链，其在一些情况中为Z的1或11个氨基酸C-末端。在又一个实施方案中，当A为PLA、PLA-Phe或PLA-Thr-Phe时，PLA被修饰以包含酰基或烷基。
示例性实施方案
4类肽可包含任何氨基酸，合成的或天然存在的，条件是肽的至少两个连续氨基酸通过酯或醚键连接。在一个特别的实施方案中，肽包含原生胰高血糖素的氨基酸。例如，肽可包含原生胰高血糖素(SEQ ID NO：1301)的j-6，其中j为1、2、3、4或5。或者，肽可包含基于SEQ ID NO：1301的N-末端，具有一个或多个氨基酸修饰的氨基酸序列。1位和/或2位的氨基酸可为减小对经二肽基肽酶IV裂解的敏感性的氨基酸。例如，肽可在4类肽的1位包含选自以下的氨基酸：D-组氨酸、α，α-二甲基咪唑乙酸(DMIA)、N-甲基组氨酸、α-甲基组氨酸、咪唑乙酸、脱氨基组氨酸、羟基组氨酸、乙酰基组氨酸和高组氨酸。更具体地讲，在一些实施方案中，拮抗剂肽的2位为选自以下的氨基酸：D-丝氨酸、D-丙氨酸、缬氨酸、甘氨酸、N-甲基丝氨酸、N-甲基丙氨酸和氨基异丁酸(Aib)。而且，例如，相对于原生胰高血糖素的原生谷氨酰胺残基，4类肽的3位氨基酸可为谷氨酸。因此，4类肽可包含以下氨基酸序列：
Xaa1-Xaa2-Xaa3-Thr-Gly-Phe(SEQ ID NO：1368)；
Xaa2-Xaa3-Thr-Gly-Phe(SEQ ID NO：1369)；或
Xaa3-Thr-Gly-Phe(SEQ ID NO：1370)；
其中Xaa1选自His、D-组氨酸、α，α-二甲基咪唑乙酸(DMIA)、N-甲基组氨酸、α-甲基组氨酸、咪唑乙酸、脱氨基组氨酸、羟基组氨酸、乙酰基组氨酸和高组氨酸；Xaa2选自Ser、D-丝氨酸、D-丙氨酸、缬氨酸、甘氨酸、N-甲基丝氨酸、N-甲基丙氨酸和氨基异丁酸(Aib)；和Xaa3为Gln或Glu。
本发明也包括其中4类肽的C-末端氨基酸具有取代存在于原生氨基酸的羧酸基团的酰胺基的实施方案。
在其中4类肽被PEG化的一些实施方案中，4类肽包含缩短的胰高血糖素肽，具体地讲为其中“N-末端”氨基酸为PLA(苯基-乳酸)的6-29。这种胰高血糖素衍生物呈现独特的优点。它们为比具有原生N-末端苯丙氨酸的那些更有效的肽，并且它们抑制由聚乙二醇化造
成，大致未见于原生苯丙氨酸的任何胰高血糖素激动作用。最后，尽管目前的文献表明对于拮抗剂活性需要取代9位的原生天冬氨酸，申请人已经发现令人惊讶的结果，即在PLA6-(6-29)胰高血糖素类似物不再需要这种取代。
在一些实施方案中，4类肽的氨基酸用至少一个半胱氨酸残基取代，其中半胱氨酸残基的侧链用包括例如马来酰亚胺基、乙烯砜、2-吡啶基硫基、卤代烷基和卤代酰基的硫醇反应性试剂进一步修饰。这些硫醇反应性试剂可含有羧基、酮、羟基和醚基以及其它亲水性部分例如聚乙二醇单位。在备选的实施方案中，4类肽的氨基酸用赖氨酸取代，并且取代赖氨酸残基的侧链使用以下胺反性试剂进一步修饰：例如亲水性部分例如聚乙二醇的羧酸或醛的活性酯(琥珀酰亚胺基、醛等)。根据一些实施方案，对应于原生肽12位的赖氨酸残基用精氨酸取代，并且在原生肽的1、16、17、20、21、24或29位的其中一个氨基酸***单一的赖氨酸取代，或者在4类肽的N-或C-末端增加赖氨酸。
在另一个实施方案中，对应于原生肽位置27的蛋氨酸残基被变为亮氨酸或正亮氨酸以抑制肽的氧化降解。
在一些实施方案中，通过截短或缺失胰高血糖素肽的C-末端1或2个氨基酸(即截短原生胰高血糖素的29位或28和29位的氨基酸)而不影响对胰高血糖素受体的活性和/或功效，进一步修饰本文描述的4类肽。在这方面，本文描述的4类肽可例如基本上由或由原生胰高血糖素肽(SEQ ID NO：1301)的氨基酸1-27、1-28、2-27、2-28、3-27、3-28、4-27、4-28、5-27、5-28、6-27或6-28组成，其具有造成本文描述的4类肽活性的一个或多个修饰。
目前公开的4类肽也在已知对胰高血糖素肽的功能不是关键性的位置包括氨基酸取代。在一些实施方案中，取代为在选自SEQ IDNO：1339的2、5、6、7、8、9、12、13、14、15、16、19、22、23或24的1、2或3个位置的保守氨基酸取代。在一些实施方案中，4类肽包含SEQ ID NO：1342的衍生物肽，其中相对于SEQ ID NO：1342，胰高血糖素肽在选自2、5、6、8、9、12、13和14位的1-3个氨基酸位置包含其它的氨基酸取代。在一些实施方案中，在SEQ IDNO：1342的2、5、6、8、9、12、13和14位的取代为保守的氨基酸取代。在一些实施方案中，对应于原生肽的16、17、20、21、24或29位，并且更具体地讲在21和/或24位的氨基酸用半胱氨酸或赖氨酸取代，其中PEG链共价连接于取代的半胱氨酸或赖氨酸残基。
根据一些实施方案，修饰的4类肽包含共价键合于肽的两个或更多个聚乙二醇链，其中胰高血糖素链的总分子量为约1000-约5000道尔顿。在一些实施方案中，聚乙二醇化的4类肽包含选自SEQID NO：1312和SEQ ID NO：1322的肽，其中所述肽包含连接于11和19位氨基酸的聚乙二醇链，并且两个PEG连的合并分子量约1000-约5000道尔顿。
根据某些实施方案，提供包含选自以下的经修饰胰高血糖素肽的4类肽：
R1-Phe-Thr-Ser-Xaa-Tyr-Ser-Xaa-Tyr-Leu-Xaa-Xaa-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Xaa-Asn-Thr-R2(SEQ ID NO：1309)，
R1-Phe-Thr-Ser-Xaa-Tyr-Ser-Xaa-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Xaa-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Xaa-Asn-Thr-R2(SEQ ID NO：1310)，
R1-Phe-Thr-Ser-Xaa-Tyr-Ser-Xaa-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Xaa-Trp-Leu-Xaa-Asn-Thr-R2(SEQ ID NO：1311)和
R1-Phe-Thr-Ser-Xaa-Tyr-Ser-Xaa-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Xaa-Phe-Val-Xaa-Trp-Leu-Xaa-Asn-Thr-R2(SEQ ID NO：1312)，
其中4位的Xaa＝天冬氨酸、谷氨酸、半胱氨酸或同型半胱氨酸，7位的Xaa＝Lys或Arg，10位的Xaa为天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、高谷氨酸和同型半胱氨酸；11位的Xaa为Ser、Lys、Cys、Orn、同型半胱氨酸或乙酰基苯丙氨酸，16位的Xaa为Asp、Lys、Cys、Orn、同型半胱氨酸或乙酰基苯丙氨酸，和19位的Xaa为Gln、Lys、Cys、Orn、同型半胱氨酸和乙酰基苯丙氨酸，22位的Xaa＝Met、Leu或Nle，R1为OH或NH2，和R2为COOH或CONH2，其中肽在SEQ IDNO：1309的11位、SEQ ID NO：1310的16位、SEQ ID NO：1311的19位和SEQ ID NO：1312的16和19位被聚乙二醇化，条件是当4位的Xaa＝天冬氨酸时，那么R1为OH。根据一些实施方案，肽包含SEQ ID NO：1309、SEQ ID NO：1310或SEQ ID NO：1311的序列，其中R1为OH和R2为CONH2。在一些实施方案中，肽包含SEQ ID NO：1309、SEQ ID NO：1310或SEQ ID NO：1311的序列，其中R1为OH，R2为CONH2和4位的氨基酸为天冬氨酸，并且在其它的实施方案中，这种肽包含含有SEQ ID NO：1319的序列的羧基末端延伸。
根据一些实施方案，肽包含选自SEQ ID NO：1309、SEQ IDNO：1310、SEQ ID NO：1313、SEQ ID NO：1314和SEQ ID NO：1316的序列，其中肽对SEQ ID NO：1309和SEQ ID NO：1313在11位被聚乙二醇化，对SEQ ID NO：1310在16位被聚乙二醇化，和对EQ IDNO：1310和SEQ ID NO：1314在19位被聚乙二醇化。在一些实施方案中，胰高血糖素激动剂包含SEQ ID NO：1313或SEQ ID NO：1314的肽。在一些实施方案中，本文公开的4类肽的C-末端氨基酸具有替代存在于原生氨基酸的羧酸基团的酰胺基。根据一些实施方案，4类肽包含SEQ ID NO：1318的序列。
根据一些实施方案提供4类肽，其中血浆蛋白共价连接于肽的氨基酸侧链，以改善胰高血糖素肽的溶解性、稳定性和/或药物(代谢)动力学。例如，血清白蛋白可共价键合于本文呈现的4类肽。在一些实施方案中，血浆蛋白共价键合于对应于原生胰高血糖素肽的16、17、20、21、24或29位的氨基酸。更具体地讲，在一些实施方案中，血浆蛋白键合于对应于原生胰高血糖素肽的16或24位的氨基酸，其中4类肽包含SEQ ID NO：1303、SEQ ID NO：1304、SEQ ID NO：1305、SEQ ID NO：1306、SEQ ID NO：1307、SEQ ID NO：1308、SEQ ID NO：1309、SEQ ID NO：1311、SEQ ID NO：1312、SEQ ID NO：1322、SEQID NO：1323、SEQ ID NO：1324、SEQ ID NO：1325、SEQ ID NO：1326、SEQ ID NO：1327、SEQ ID NO：1328、SEQ ID NO：1336和SEQ ID NO：1339的序列。在一些实施方案中，4类肽包含选自SEQ ID NO：1309、SEQ ID NO：1310、SEQ ID NO：1311和SEQ ID NO：1312的肽。
根据一些实施方案提供4类肽，其中代表免疫球蛋白分子的Fc部分的线性氨基酸序列共价连接于本文公开的4类肽的氨基酸侧链，以改善胰高血糖素肽的溶解性、稳定性和/或药物(代谢)动力学。例如代表免疫球蛋白分子的Fc部分的氨基酸序列可共价键合于SEQID NO：1307、SEQ ID NO：1339胰高血糖素肽或其胰高血糖素类似物的11、12、15、16、19、21或24位。在一些实施方案中，Fc肽共价键合于SEQ ID NO：1306、SEQ ID NO：1307、SEQ ID NO：1308或SEQID NO：1336的4类肽的11或19位。Fc部分通常自IgG分离，但是来自任何免疫球蛋白的Fc肽碎片应该功能等效。在一些实施方案中，胰高血糖素肽选自SEQ ID NO：1303、SEQ ID NO：1304、SEQ ID NO：1305、SEQ ID NO：1307、SEQ ID NO：1308和SEQ ID NO：1339，其中Fc部分连接于原生胰高血糖素肽的对应位置16、17、20、21、24或29。在一些实施方案中，4类肽包含选自SEQ ID NO：1309、SEQ IDNO：1310、SEQ ID NO：1311和SEQ ID NO：1312的胰高血糖素肽，其中Fc肽键合于分别位于SEQ ID NO：1309、SEQ ID NO：1310、SEQID NO：1311的11、16或19位，和对SEQ ID NO：1312在11和19两个位置的氨基酸侧链。
在本发明的某些实施方案中，4类肽包含SEQ ID NOs：1362、1364-1367和1371中任何一种的氨基酸序列。
提高溶解性的修饰
可进一步修饰4类肽，以改善肽在生理pH下的水溶液中的溶解性，同时，在一些方面保留胰高血糖素拮抗剂活性。在对应于原生肽的1、16、17、20、21、24和29位的位置，或在C-末端引入亲水性基团，可改善生成的4类肽在具有生理pH的溶液中的溶解性，同时保留母体化合物的拮抗剂活性。因此，在一些实施方案中，目前公开的4类肽被进一步修饰，以包含一个或多个共价连接于氨基酸侧链的亲水性基团，这种氨基酸侧链为对应于原生胰高血糖素肽的1、16、17、20、21、24和29位氨基酸或者N-或C-末端氨基酸的氨基酸侧链。在其它的实施方案中，对应于原生胰高血糖素肽的16和24位氨基酸的氨基酸侧链共价键合于亲水性基团，并且在一些实施方案中，亲水性基团为聚乙二醇(PEG)。
申请人也已经发现，原生胰高血糖素可通过在其羧基末端引入电荷进行修饰，以增强肽的溶解性，同时保留肽的激动剂活性。增强的溶解性使得能够以接近中性的pH制备和储存胰高血糖素溶液。以相对中性pHs(例如约6.0-约8.0的pH)配制的胰高血糖素溶液改善4类肽的长期稳定性。
此外，申请人预计本文公开的4类肽可被类似地进行修饰，以增强其在相对中性pH(例如约6.0-约8.0的pH)的水溶液中的溶解性，同时保留母体蛋白的拮抗剂活性。因此，本发明的一些实施方案涉及SEQ ID NO：1339的4类肽，该4类肽相对于存在于野生型胰高血糖素(SEQ ID NO：1301)的6-29位的原生氨基酸已被进一步修饰，以通过用荷电氨基酸取代原生的非荷电氨基酸，或者在羧基末端增加荷电氨基酸对肽增加电荷。根据一些实施方案，SEQ ID NO：1339的4类肽的1-3个非荷电原生氨基酸用荷电氨基酸替代。在一些实施方案中，荷电氨基酸选自赖氨酸、精氨酸、组氨酸、天冬氨酸和谷氨酸。更具体地讲，申请人已经发现，相对于原生胰高血糖素用荷电氨基酸取代在对应的28和/或29位通常存在的氨基酸，和/或在4类肽的羧基末端增加1-2个荷电氨基酸，增强4类肽在生理相关pHs(即约6.5-约7.5的pH)下的水溶液中的溶解性和稳定性。因此，本文公开的4类肽的这样的修饰预计对在水溶液中，特别是在约5.5-约8.0范围内的pH下的溶解性具有类似作用，同时保留母体肽的生物活性。
根据一些实施方案，通过相对于原生胰高血糖素用荷负电的氨基酸(例如天冬氨酸或谷氨酸)取代在对应的28和/或29位的原生氨基酸，和任选地在肽的羧基末端增加荷负电的氨基酸(例如天冬氨酸或谷氨酸)，修饰SEQ ID NO：1339的4类肽。在备选的实施方案中，通过相对于原生胰高血糖素用荷正电的氨基酸(例如赖氨酸、精氨酸或组氨酸)取代在对应的29位的原生氨基酸，和任选地在肽的羧基末端增加1或2个荷正电的氨基酸(例如赖氨酸、精氨酸或组氨酸)，修饰SEQID NO：1339的4类肽。根据一些实施方案，提供具有改善的溶解性和稳定性的4类肽，其中肽包含SEQ ID NO：1341的氨基酸序列，条件是SEQ ID NO：1341的23或24位的至少一个氨基酸被酸性氨基酸取代，和/或在SEQ ID NO：1341的羧基末端增加另外的酸性氨基酸。在一些实施方案中，酸性氨基酸独立地选自Asp、Glu、半胱氨酸和同型半胱氨酸。
根据一些实施方案，提供具有改善的溶解性和稳定性的4类肽，其中拮抗剂包含SEQ ID NO：1341、SEQ ID NO：1342、SEQ IDNO：1343或SEQ ID NO：1344的氨基酸序列，其中23或24位的至少一个氨基酸用非原生氨基酸残基取代(即存在于类似物的23或24位的至少一个氨基酸为不同于存在于SEQ ID NO：1307的对应位置的氨基酸的酸性氨基酸)。根据一些实施方案，提供包含SEQ ID NO：1341或1342的序列的胰高血糖素激动剂，条件是当23位的氨基酸为天冬酰胺和24位的氨基酸为苏氨酸，那么肽进一步包含增加到4类肽的羧基末端的1-2个独立地选自Lys、Arg、His、Asp或Glu的氨基酸。
在另一个实施方案中，通过把亲水性部分共价连接于11、12、15、16、19或24位的氨基酸残基，并且在一些实施方案中亲水性部分连接于11、16或19位的氨基酸，并且在其它的实施方案中亲水性部分连接于氨基酸19，可改善SEQ ID NO：1342的4类肽的溶解性。在一些实施方案中，亲水性部分为血浆蛋白或免疫球蛋白的Fc部分，并且在备选的实施方案中亲水性部分为亲水性烃链。在一些实施方案中，亲水性部分为具有选自约1000-约5000道尔顿的范围的分子量的聚乙二醇。在另一个实施方案中，亲水性部分为具有至少约20000道尔顿的分子量的聚乙二醇。在一些实施方案中，聚乙烯修饰的4类肽包含SEQ ID NO：1309、SEQ ID NO：1310、SEQ ID NO：1311、SEQ IDNO：1312、SEQ ID NO：1343、SEQ ID NO：1344或SEQ ID NO：1345的氨基酸序列。
提高稳定性的修饰
原生胰高血糖素的15-16位的Asp-Ser序列已被确定为导致原生激素在含水缓冲液中过早化学裂解的独特不稳定的二肽。例如，当在37℃下的0.01N HCl中保持2周时，多于50％的原生胰高血糖素可裂解为碎片。两种释放的裂解肽1-15和16-29没有胰高血糖素样生物活性，并且因此代表对胰高血糖素及其相关类似物的水成预配制的限制。原生胰高血糖素肽的15位Asp用Glu进行选择性的化学取代，观察到几乎消除15-16肽键的化学裂解。
因此，预计本发明的4类肽可被类似地修饰，以降低其对在含水缓冲液中过早化学裂解的敏感性。根据一些实施方案，通过用选自半胱氨酸、谷氨酸、高谷氨酸和同型半胱氨酸的氨基酸替代位于原生胰高血糖素肽的15位的原生天冬氨酸氨基酸，可进一步修饰本文描述的4类肽，以增强其在水溶液中的稳定性。根据一些实施方案，SEQ ID NO：1339的4类肽的10位天冬氨酸残基可用选自半胱氨酸、谷氨酸、高谷氨酸和同型半胱氨酸的氨基酸取代，并且在一些实施方案中，在SEQ ID NO：1339的10位的原生天冬氨酸用谷氨酸替代。根据一些实施方案，提供在水溶液中具有改善的稳定性的4类肽，其中拮抗剂包含选自SEQ ID NO：1336、SEQ ID NO：1340和SEQ ID NO：1342的序列。在其它的实施方案中，4类肽被酰胺化。
根据一些实施方案，通过用谷氨酸、半胱氨酸、高谷氨酸或同型半胱氨酸取代16位(根据原生胰高血糖素的编号)的丝氨酸，也可实现通过减少本文描述的4类肽的降解增加的稳定性。在特别的实施方案中，16位(根据原生胰高血糖素序列编号)的丝氨酸用谷氨酸替代。[00679]在更特定的方面，包含这样的修饰的4类肽包含C-末端羧酸酯并且未被酰胺化根据一些实施方案，提供包含选自SEQ ID NO：1307、SEQ ID NO：1336、SEQ ID NO：1339、SEQ ID NO：1340、SEQID NO：1341、SEQ ID NO：1342、SEQ ID NO：1343和SEQ ID NO：1344的胰高血糖素肽的4类肽，其通过在对应于原生胰高血糖素肽的11、12、15、16、19和/或24位的位置的一个或多个另外的氨基酸取代进一步修饰，其中氨基酸取代包含用具有适合于与包括例如PEG的亲水性部分交联的侧链的氨基酸取代。肽可用天然存在的氨基酸或合成(非天然存在的)氨基酸取代。合成或非天然存在的氨基酸指的是不天然存在于体内，但是可加入到本文描述的肽结构中的氨基酸。在一些实施方案中提供4类肽，其中肽包含SEQ ID NO：1307、SEQ ID NO：1336、SEQ ID NO：1339、SEQ ID NO：1340、SEQ ID NO：1341、SEQ ID NO：1342、SEQ ID NO：1343和SEQ ID NO：1344的序列，并且进一步包含键合于原生胰高血糖素肽的对应位置21或24的聚乙二醇链。在其它的实施方案中，4类肽的C-末端被修饰，以用酰胺基替代羧酸基团。融合肽和缀合物
本公开也包括4类肽融合肽，其中第二个肽被融合于4类肽的C-末端。更具体地讲，融合肽可包含SEQ ID NO：1344的4类肽，其进一步包含连接于4类肽的C-末端氨基酸的SEQ ID NO：1319(GPSSGAPPPS)、SEQ ID NO：1320(Lys Arg Asn Arg Asn Asn Ile Ala)或SEQ ID NO：1321(Lys Arg Asn Arg)的氨基酸序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO：1319的氨基酸序列(GPSSGAPPPS)通过肽键键合于SEQ ID NO：1342的4类肽的氨基酸24。在另一个实施方案中，融合肽包含SEQ ID NO：1307、SEQ ID NO：1336、SEQ ID NO：1339、SEQID NO：1340、SEQ ID NO：1341或SEQ ID NO：1343的4类肽，其进一步包含连接于4类肽的氨基酸24的SEQ ID NO：1319的氨基酸序列(GPSSGAPPPS)。在另一个实施方案中，融合肽包含SEQ ID NO：1307、SEQ ID NO：1336、SEQ ID NO：1337、SEQ ID NO：1338、SEQ ID NO：1339、SEQ ID NO：1341或SEQ ID NO：1343的4类肽，其进一步包含连接于4类肽的氨基酸24的SEQ ID NO：1320、SEQ ID NO：1321或SEQ ID NO：1353的氨基酸序列。在一些实施方案中，4类肽融合肽包含选自SEQ ID NO：1346和SEQ ID NO 1347的序列。在其它的实施方案中，融合肽的C-末端被修饰，以用酰胺基替代羧酸基团。
在一些实施方案中提供4类肽融合肽，其中融合肽的4类肽部分选自SEQ ID NO：1303、SEQ ID NO：1304、SEQ ID NO：1305、SEQ ID NO：1306、SEQ ID NO：1307、SEQ ID NO：1308、SEQ IDNO：1309、SEQ ID NO：1311、SEQ ID NO：1312、SEQ ID NO：1313、SEQ ID NO：1314、SEQ ID NO：1315、SEQ ID NO：1310、SEQ ID NO：1316、SEQ ID NO：1317、SEQ ID NO：1318和SEQ IDNO：1339，并且SEQ ID NO：1319的序列融合于4类肽部分的羧基末端，并且其中PEG链(当存在时)选自500-40000道尔顿的范围。更具体地讲，在一些实施方案中，4类肽节段选自SEQ ID NO：1313、SEQ ID NO：1314、SEQ ID NO：1315、SEQ ID NO：1316、SEQ IDNO：1346和SEQ ID NO：1347，其中PEG链选自约500-约5000道尔顿的范围，并且更具体地讲，在一些实施方案中PEG链为约1000道尔顿。在其它的实施方案中，C-末端被修饰，以用酰胺基替代羧酸基团。
4类肽可进一步包含增加到羧基末端的1-2个荷电氨基酸。在一些实施方案中，其中1-2个荷电氨基酸增加到SEQ ID NO：1344的羧基末端，氨基酸为荷负电的氨基酸，包括例如谷氨酸和天冬氨酸。在一些实施方案中，4类肽包含SEQ ID NO：1342的序列，其中相对于原生胰高血糖素肽的对应位置27和28中的至少一个位置包含选自天冬氨酸和谷氨酸的氨基酸，并且其中SEQ ID NO：1342任选地被修饰，以包括增加到羧基末端的增加1-2个荷负电氨基酸。在一些实施方案中，荷负电的氨基酸为谷氨酸或天冬氨酸。
本文公开的4类肽可与包括例如胰岛素的其它活性物质结合，以治疗其特征为过度胰高血糖素活性的疾病或病症。在一些实施方案中，已被修饰以共价键合于具有大于10000道尔顿的分子量的PEG链的4类肽可与胰岛素共同给药，以助于在糖尿病患者保持稳定的血糖水平。本公开的4类肽可作为单一组合物与胰岛素共同给药，作为分开的溶液同时给药，或者胰岛素和4类肽可相对于彼此在不同时间给药。在一些实施方案中，包含胰岛素的组合物和包含4类肽的组合物在彼此12小时内给药。4类肽相对于所给予的胰岛素的精确比率部分地取决于确定患者的胰高血糖素水平，并可通过常规试验确定。
二聚体肽
本公开也包括本文公开的修饰的4类肽的多聚体。两种或更多种修饰的4类肽可使用本领域技术人员已知的标准连接试剂和方法连接在一起。例如，通过使用双功能硫醇交联剂和双功能胺交联剂，特别是对于已用半胱氨酸、赖氨酸、鸟氨酸、同型半胱氨酸或乙酰基苯丙氨酸残基取代(例如在11、16或19位)的4类肽(例如SEQ ID NO：1309、SEQ ID NO：1310、SEQ ID NO：1311和SEQ ID NO：1312)，可在两个修饰的4类肽之间形成二聚体。二聚体可为同型二聚体或者可为异质二聚体。在一些实施方案中，在两个独立地选自SEQ ID NO：1308、SEQ ID NO：1309、SEQ ID NO：1310、SEQ ID NO：1311、SEQID NO：1312、SEQ ID NO：1345、SEQ ID NO：1346或SEQ ID NO：1347的4类肽之间形成二聚体，其中两个肽通过连接于每一个肽的11位、每一个肽的16位或每一个肽的19位或其任何组合的连接基彼此连接。在一些实施方案中，键合为各4类肽的Cys11-Cys11或Cys19-Cys19或Cys11-Cys19残基之间的二硫键。
类似地，在两个独立地选自SEQ ID NO：1303、SEQ ID NO：1304、SEQ ID NO：1305、SEQ ID NO：1306、SEQ ID NO：1307、SEQ ID NO：1308、SEQ ID NO：1309、SEQ ID NO：1310、SEQ IDNO：1311、SEQ ID NO：1312、SEQ ID NO：1336、SEQ ID NO：1337、SEQ ID NO：1338、SEQ ID NO：1339和SEQ ID NO：1342的4类肽之间形成二聚体，其中在关于原生胰高血糖素肽独立地选自16、21和24位的氨基酸位置之间形成键合。
根据一些实施方案，提供包含两种4类肽的4类肽二聚体，每一种包含SEQ ID NO：1346的序列，其中两种拮抗剂通过25位氨基酸的二硫键彼此连接。在另一个实施方案中，提供包含两种4类肽的4类肽二聚体，每一种包含SEQ ID NO：1347的序列，其中两种拮抗剂通过35位氨基酸的二硫键彼此连接。在一些实施方案中，自其中10位的氨基酸为谷氨酸的SEQ ID NO：1346和SEQ ID NO：1347的4类肽形成二聚体。
在一些实施方案中，二聚体包含选自SEQ ID NO：1307、SEQ ID NO：1308、SEQ ID NO：1336、SEQ ID NO：1337、SEQ IDNO：1340、SEQ ID NO：1339、NO：1340、SEQ ID NO：1341、SEQID NO：1342和所述4类肽的药学上可接受的盐的4类肽融合肽的同型二聚体。根据一些实施方案，提供包含通过连接基键合于第二个4类肽的第一个4类肽的的二聚体，其中二聚体的第一和第二个肽独立地选自SEQ ID NO：1307、SEQ ID NO：1308、SEQ ID NO：1336、SEQ ID NO：1337、SEQ ID NO：1339、SEQ ID NO：1340、SEQ IDNO：1341和SEQ ID NO：1342和所述胰高血糖素多肽的药学上可接受的盐。在另一个实施方案中，二聚体的第一和第二个4类肽独立地选自SEQ ID NO：1307、SEQ ID NO：1308、SEQ ID NO：1336和SEQ IDNO：1339。
在另一个实施方案中，二聚体包含选自SEQ ID NO：1323、SEQ ID NO：1324、SEQ ID NO：1325、SEQ ID NO：1326、SEQ IDNO：1327、SEQ ID NO：1328、SEQ ID NO：1329、SEQ ID NO：1330、SEQ ID NO：1331的4类肽的同型二聚体。在另一个实施方案中提供4类肽二聚体，其中二聚体的第一和第二个肽包含独立地选自SEQ ID NO：1323、SEQ ID NO：1324、SEQ ID NO：1325、SEQ IDNO：1326、SEQ ID NO：1327和SEQ ID NO：1328的氨基酸序列。在另一个实施方案中，二聚体包含选自SEQ ID NO：1309、SEQ ID NO：1311和SEQ ID NO：1312的4类肽的同型二聚体，其中肽进一步包含共价键合于胰高血糖素肽的11或19位的聚乙二醇链。
4类胰高血糖素相关肽可包含SEQ ID NOs：1301-1371中任何一种的氨基酸序列，其任选地具有最多1、2、3、4或5个保留胰高血糖素拮抗剂活性的其它修饰。
5类胰高血糖素相关肽
在某些实施方案中，胰高血糖素相关肽是5类胰高血糖素相关肽(参见，例如，国际专利申请公开号(PCT)WO 2009/058734，其通过全文引用结合于本文中)。
以下章节中提及的全部生物学序列(SEQ ID NOs：1401-1518)对应于国际专利申请公开号WO 2009/058734中的SEQ ID NOs.：1-118。
活性
在某些方面，5类胰高血糖素相关肽(下文称为“5类肽”)可为胰高血糖素拮抗剂/GLP-1激动剂。胰高血糖素拮抗剂/GLP-1激动剂用于其中需要抑制胰高血糖素激动，同时也需要同时刺激GLP-1活性的任何环境。例如，胰高血糖素拮抗剂活性连同GLP-1刺激可用于治疗糖尿病，其中胰高血糖素拮抗已经在高血糖症的临床前模型被证明得到血糖降低并且GLP-1活性与胰岛素产生有关。也已知证明GLP-1活性的化合物用于治疗肥胖症和防止体重增加。
在某些方面，认为5类肽适合于先前已经对其它胰高血糖素拮抗剂/GLP-1激动剂描述的任何用途。这两种活性已经分别显示对于治疗代谢综合征，具体地讲对于糖尿病和肥胖症为高度合乎需要的性质。胰高血糖素拮抗剂活性用于其中需要抑制胰高血糖素激动的任何环境。存在GLP-1激动进一步抑制胰高血糖素自胰腺的内源性分泌，同时刺激胰岛素合成和分泌。两种药理作用用于使代谢异常正常化的协同方式。因此，5类肽可用于治疗高血糖症，或治疗由高血液水平的胰高血糖素或高血糖水平造成的其它代谢性疾病。根据一些实施方案，要使用胰高血糖素拮抗剂/GLP-1激动剂例如本文公开的5类肽治疗的患者为驯养动物，并且在另一个实施方案中，要治疗的患者为人。研究提示，在糖尿病患者缺乏胰高血糖素抑制促使部分经肝糖分解加速的餐后高血糖。在口服葡萄糖耐量试验(OGTT)期间，并且在生长抑素诱导的胰高糖素抑制存在或不存在下的血糖分析已经显示，具有较高胰高糖素水平的患者显著增加葡萄糖。因此，胰高血糖素拮抗剂/GLP-1激动剂或本文描述的5类肽可用于治疗高血糖症，并且预计用于治疗各种类型的糖尿病，包括1型糖尿病、I1型糖尿病或妊娠糖尿病(胰岛素依赖型或非胰岛素依赖型的)，和减少糖尿病并发症，包括肾病、视网膜病变和血管疾病。
用于减少食欲或促进体重减轻的这种方法期望用于减轻体
重，防止体重增加，或者治疗各种原因的肥胖症，包括药物引起的肥胖症，和减少与肥胖有关的并发症，包括血管疾病(冠状动脉疾病、中风、周围性血管疾病、缺血再灌注等)、高血压、II型糖尿病的发生、高脂血症和肌肉骨骼***疾病。
使用标准药学上可接受的载体和本领域技术人员已知的给药途径，可配制包含5类肽的药用组合物并给予患者。因此，本公开也包括包含一种或多种本文公开的5类肽与药学上可接受的载体组合的药用组合物。药用组合物可包含5类肽作为唯一的药用活性成分，或者5类肽可与一种或多种另外的活性物质组合。根据一些实施方案，提供包含5类肽和和胰岛素或胰岛素类似物的组合物。或者，可提供引起体重减轻或防止体重增加的组合物，这种组合物包含SEQ ID NO：1415或SEQ ID NO：1451的序列，进一步包含连接于SEQ ID NO：1415或SEQ ID NO：1451的氨基酸24的SEQ ID NO：1421(GPSSGAPPPS)或SEQ ID NO：1450的氨基酸序列和抗肥胖肽。合适的抗肥胖肽包括在美国专利5691309、6436435或美国专利申请20050176643中公开的那些抗肥胖肽。
5类肽结构
根据一些实施方案，提供包含通过以下方式进行修饰的胰高血糖素肽的5类肽：自N-末端缺失头1-5个氨基酸残基(例如第一个氨基酸、头2个氨基酸、头3个氨基酸、头4个氨基酸、头5个氨基酸)；和例如通过氢键或离子相互作用例如形成盐桥或通过共价键，相互连接选自12和16、16和20、20和24以及24和28位(相对于原生胰高血糖素肽序列)的氨基酸对的侧链，稳定化合物的C-末端部分(根据野生型胰高血糖素SEQ ID NO：1401的氨基酸编号约12-29位氨基酸)中的α-螺旋结构。或者，通过在保留要求的活性的位置引入一个或多个α，α-二取代氨基酸，实现稳定约12-29残基的α-螺旋。在一些实施方案中，5类肽或其类似物的16、17、18、19、20、21、24或29位(根据野生型胰高血糖素的氨基酸编号)中的1、2、3、4或更多个位置用α，α-二取代氨基酸取代。例如，5类肽或其类似物的16位(根据野生型胰高血糖素的氨基酸编号)用氨基异丁酸(Aib)取代，在不存在盐桥或内酰胺下提供稳定的α-螺旋。在一些实施方案中，16、20、21或24位(根据野生型胰高血糖素的氨基酸编号)中的1、2、3或更多个位置用Aib取代。
根据一些实施方案提供5类肽，其中肽对GLP-1受体呈现由原生GLP-1获得的最大激动的至少80％，并且对胰高血糖素受体呈现减少最大胰高血糖素诱导的cAMP产生的胰高血糖素拮抗剂活性达至少约50％，如在体外实验中通过cAMP产生测量的那样。在一些实施方案中，5类肽呈现原生GLP-1对GLP-1受体的活性的至少90％，并且对胰高血糖素受体呈现减少最大胰高血糖素诱导的cAMP产生的胰高血糖素拮抗剂活性达至少约80％。
根据一些实施方案，5类肽包含SEQ ID NO：1402的衍生物肽，其中相对于SEQ ID NO：1402，肽在选自1、2、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、19、22和24位的1-3个氨基酸位置包含其它的氨基酸取代，并且呈现原生GLP-1对GLP-1受体的活性的至少90％，并且对胰高血糖素受体呈现减少最大胰高血糖素诱导的cAMP产生的胰高血糖素拮抗剂活性达至少约80％。
在一些实施方案中，通过例如形成共价或非共价分子内桥，或者在约12-29位用稳定α-螺旋的氨基酸(例如α，α-二取代氨基酸)取代和/或***氨基酸，稳定5类肽的C-末端部分(根据野生型胰高血糖素的氨基酸编号约氨基酸12-29)中的α-螺旋结构。在一些实施方案中，5类肽或其类似物的16、17、18、19、20、21、24或29位(根据野生型胰高血糖素的氨基酸编号)中的1、2、3、4或更多个位置用α，α-二取代氨基酸例如氨基异丁酸(Aib)取代。例如，5类肽或其类似物的16位(根据野生型胰高血糖素的氨基酸编号)用氨基异丁酸(Aib)取代，在不存在盐桥或内酰胺下提供稳定的α-螺旋。
在一些实施方案中，5类肽包含SEQ ID NO：1415或SEQ IDNO：1451，并且更具体地讲，包含选自EQ ID NO：1405、SEQ ID NO：1406、SEQ ID NO：1407、SEQ ID NO：1408、SEQ ID NO：1409、SEQ ID NO：1416、SEQ ID NO：1417、SEQ ID NO：1418、SEQ IDNO：1419、SEQ ID NO：1422、SEQ ID NO：1423、SEQ ID NO：1424和SEQ ID NO：1425的序列。在其它的实施方案中，5类肽包含SEQID NO：1415或SEQ ID NO：1451的衍生物肽，其中肽相对于SEQ IDNO：1415或SEQ ID NO：1451，在选自1、2、5、6、8、9、12、13和14位的1-3个氨基酸位置包含其它的氨基酸取代。在一些实施方案中，在1、2、5、6、8、9、12、13和14位的取代为保守的氨基酸取代。在一些实施方案中，在SEQ ID NO：1405或SEQ ID NO：1406的24位的苏氨酸用甘氨酸取代。
根据一些实施方案，5类肽代表肽的其它修饰，其中除了N-末端缺失，原生胰高血糖素肽的6位苯丙氨酸被修饰，例如包含替代N-末端氨基的羟基。在其它的实施方案中，C-末端氨基酸的天然羧酸用电荷中性的基团例如酰胺或酯替代。
根据一些实施方案制备了5类肽，其中缺失原生胰高血糖素的头3-5个氨基酸，相对于原生胰高血糖素肽，9位氨基酸用选自以下的氨基酸取代：谷氨酸、高谷氨酸、β-高谷氨酸、半胱氨酸的磺酸衍生物或具有以下结构的半胱氨酸的烷基羧酸酯衍生物：
Figure BPA00001673726802491
其中X5为C1-C4烷基、C2-C4链烯基或C2-C4炔基，并且例如通过相对于原生胰高血糖素肽，在氨基酸12和16的侧链之间或在氨基酸16和20之间形成内酰胺桥，稳定胰高血糖素的C-末端部分(根据野生型胰高血糖素的氨基酸编号约氨基酸12-29)中的α-螺旋结构。能够共价键合形成7原子连接桥的氨基酸配对的实例在整个本公开被详述。在一些实施方案中，半胱氨酸的磺酸衍生物为半胱氨酸或同型半胱氨酸。
在一些实施方案中，提供包含选自SEQ ID NO：1405、SEQID NO：1406、SEQ ID NO：1407或SEQ ID NO：1408的氨基酸序列的5类肽，其中所述肽包含在以下位置形成的内酰胺环：对SEQ ID NO：1405在氨基酸7和11的侧链之间，对SEQ ID NO：1406在11和15之间，对SEQ ID NO：1407在15和19位之间，和对SEQ ID NO：1408在19和24位之间，所述序列中每一种被进一步修饰，以包含共价键合于肽的亲水性部分。更具体地讲，在一些实施方案中，每一种带有内酰胺的5类肽通过共价连接聚乙二醇链进行修饰。例如，对于包含SEQ ID NO：1405的5类肽，肽在选自12、15、16、19和24的位置被聚乙二醇化；对于包含SEQ ID NO：1406的5类肽，肽在选自12、16、19和24的位置被聚乙二醇化；对于包含SEQ ID NO：1407的5类肽，肽在选自11、12、16和24的位置被聚乙二醇化；对于包含SEQID NO：1408的5类肽，肽在选自11、12、15和16的位置被聚乙二醇化。根据一些实施方案，提供包含SEQ ID NO：1447或SEQ ID NO：1448的5类肽，其中相对于SEQ ID NO：1447或SEQ ID NO：1448序列，肽在选自12、16、19和24的位置被聚乙二醇化。在其它的实施方案中，通过在肽的羧基末端增加SEQ ID NO：1421的序列，进一步修饰SEQ ID NO：1447或SEQ ID NO：1448的肽。
如以上详述的那样，在某些方面提供5类肽，其中缺失原生胰高血糖素的头5个氨基酸，N-末端氨基酸(苯丙氨酸)的氨基用羟基替代(即第一个氨基酸为苯基-乳酸)，并且一个或多个选自12和16、16和20、20和24及24和28位的氨基酸对的侧链相互连接，因此稳定5类肽的α-螺旋。
根据一些实施方案，提供包含SEQ ID NO：1402的序列的5类肽，其通过用选自谷氨酸、谷氨酰胺、高谷氨酸、同型半胱氨酸、苏氨酸或甘氨酸的氨基酸取代SEQ ID NO：1402的11位(16位，根据原生胰高血糖素的氨基酸编号)丝氨酸残基进行修饰。根据一些实施方案，SEQ ID NO：1402的11位丝氨酸残基用选自谷氨酸、谷氨酰胺、高谷氨酸和同型半胱氨酸的氨基酸取代，并且在一些实施方案中，丝氨酸残基用谷氨酸取代。根据一些实施方案，5类肽包含SEQ ID NO：1438的序列。
在一些实施方案中提供5类肽，其中在两个氨基酸侧链之间形成分子内桥，以稳定SEQ ID NO：1402的肽羧基末端的三维结构。更具体地讲，选自SEQ ID NO：1402的氨基酸对7和11、11和15、15和19或19和23的一个或多个氨基酸的侧链相互连接，因此稳定C-末端部分中的α-螺旋。两个侧链可通过氢键、离子相互作用(例如形成盐桥)或通过共价键相互连接。根据一些实施方案，连接基的大小为7-9个原子，并且在一些实施方案中连接基的大小为8个原子。在一些实施方案中，5类肽选自SEQ ID NO：1405、SEQ ID NO：1406、SEQID NO：1407和SEQ ID NO：1408。在一些实施方案中，5类肽的C-末端氨基酸具有取代存在于原生氨基酸的羧酸基团的酰胺基。
根据一些实施方案提供5类肽，其中类似物包含SEQ ID NO：1409的氨基酸序列。在一些实施方案中，通过在肽的侧链之间形成共价键，稳定SEQ ID NO：1409的肽羧基末端的三维结构。在一些实施方案中，两个氨基酸侧链彼此键合形成内酰胺环。内酰胺环的大小可依氨基酸侧链的长度而定变化，并且在一些实施方案中，通过连接赖氨酸氨基酸的侧链与谷氨酸侧链形成内酰胺。在一些实施方案中，5类肽的C-末端氨基酸具有取代存在于原生氨基酸的羧酸基团的酰胺基。
内酰胺环中的酰胺键顺序可以翻转(例如内酰胺环可在Lys12与Glu16的侧链之间或者在Glu12与Lys16之间形成)。根据一些实施方案提供SEQ ID NO：1409的胰高血糖素类似物，其中在选自SEQ IDNO：1409的氨基酸对7和11、11和15、15和19或19和23的氨基酸对的侧链之间形成至少一个内酰胺环。在一些实施方案中提供5类肽，其中肽包含SEQ ID NO：1410的序列，所述序列进一步包含在SEQID NO：1410的7和11位氨基酸之间、或在11和15位氨基酸之间、或在15和19位氨基酸之间形成的分子内内酰胺桥。在一些实施方案中提供5类肽，其中肽包含SEQ ID NO：1411的序列，所述序列进一步包含在SEQ ID NO：1411的7和11位氨基酸之间、或在11和15位氨基酸之间形成的分子内内酰胺桥。在一些实施方案中，5类肽包含SEQ ID NO：1417的序列。
提供包含SEQ ID NO：1405的衍生物的另外的5类肽，其中SEQ ID NO：1405的10位(原生胰高血糖素的15位)天冬氨酸用谷氨酸、以下通式结构的氨基酸取代：
Figure BPA00001673726802521
其中X6为C1-C3烷基、C2-C3链烯或C2-C3炔基，并且在一些实施方案中，X6为C1-C3烷基，并且在另一个实施方案中，X6为C2烷基。在一些实施方案中，提供SEQ ID NO：1409的5类肽衍生物，其中SEQID NO：1409的10位(原生胰高血糖素的15位)用选自谷氨酸、半胱氨酸、同型半胱氨酸和高谷氨酸的氨基酸取代。在其它的实施方案中，ID NO：1409的10位用选自半胱氨酸或同型半胱氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，提供SEQ ID NO：1406、SEQ ID NO：1407或SEQID NO：1408的5类肽衍生物，其中SEQ ID NO：1406、SEQ ID NO：1407或SEQ ID NO：1408的10位用选自谷氨酸、半胱氨酸、同型半胱氨酸和高谷氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，5类肽的C-末端氨基酸具有取代存在于原生氨基酸的羧酸基团的酰胺基。
在一些实施方案中，5类肽的氨基酸用至少一个半胱氨酸残基取代，其中半胱氨酸残基的侧链用包括以下的硫醇反应性试剂进一步修饰：例如马来酰亚胺基、乙烯砜、2-吡啶基硫基、卤代烷基和卤代酰基。这些硫醇反应性试剂可含有羧基、酮、羟基和醚基以及其它亲水性部分例如聚乙二醇单位。在备选的实施方案中，5类肽的氨基酸用赖氨酸取代，并且取代赖氨酸残基的侧链使用以下胺反性试剂进一步修饰：例如亲水性部分例如聚乙二醇的羧酸或醛的活性酯(琥珀酰亚胺基、醛等)。根据一些实施方案，对应于SEQ ID NO：1405的肽7位的赖氨酸残基用精氨酸取代，并且对于对应于SEQ ID NO：1405的12、15、16、19和24位的其中一个氨基酸***单一的赖氨酸取代。
在另一个实施方案中，将相应于本文公开的5类肽的位置22的蛋氨酸残基改变为亮氨酸或正亮氨酸，以抑制肽的氧化降解。
此外5类肽在一些方面也包括已知对胰高血糖素类似物的功能不是关键性的位置的氨基酸取代。在一些实施方案中，取代为在选自2、5、6、7、8、9、12、13、14、15、16、19、22、23或24的1、2或3个位置的保守氨基酸取代。在一些实施方案中，对应于原生胰高血糖素肽的16、17、20、21、24或29位，并且更具体地讲在相对于原生胰高血糖素的21和/或24位的氨基酸用半胱氨酸或赖氨酸取代，其中PEG链共价连接于取代的半胱氨酸或赖氨酸残基。
根据一些实施方案，提供包含由SEQ ID NO：1409组成的序列的5类肽，其在对应于肽的11、12、15、16、19和/或24位的位置用一个或多个另外的氨基酸取代(包括例如用半胱氨酸取代)进一步修饰，其中氨基酸取代包含具有适合于与包括例如PEG的亲水性部分交联的侧链的氨基酸。原生胰高血糖素可用天然存在的氨基酸或合成(非天然存在的)氨基酸取代。合成或非天然存在的氨基酸指的是不是体内天然存在的，但是可加入到本文描述的肽结构中的氨基酸。在一些实施方案中提供5类肽，其中肽包含SEQ ID NO：1409的序列，并且进一步包含键合于肽的16或19位的聚乙二醇链。在其它的实施方案中，胰高血糖素类似物的C-末端被修饰，以用酰胺基替代羧酸基团。
根据一些实施方案，提供包含选自以下的胰高血糖素类似物的5类肽：
R1-Phe-Thr-Ser-Xaa-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Xaa-Glu-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Xaa-Asn-Thr-R2(SEQ ID NO：1439)，
R1-Phe-Thr-Ser-Xaa-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Glu-Arg-Arg-Ala-Gln-Xaa-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Xaa-Asn-Thr-R2(SEQ ID NO：1413)，
R1-Phe-Thr-Ser-Xaa-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Glu-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Xaa-Trp-Leu-Xaa-Asn-Thr-R2(SEQ ID NO：1414)和
R1-Phe-Thr-S er-Xaa-Tyr-S er-Lys-Tyr-Leu-Asp-Glu-Arg-Arg-Ala-Gln-Xaa-Phe-Val-Xaa-Trp-Leu-Xaa-Asn-Thr-R2(SEQ ID NO：1412)，
其中4位的Xaa＝天冬氨酸、谷氨酸、半胱氨酸或同型半胱氨酸，10位的Xaa＝Asp、Glu、半胱氨酸、高谷氨酸和同型半胱氨酸，16位的Xaa为Asp、Cys、Orn、同型半胱氨酸或乙酰基苯丙氨酸，和19位的Xaa为Gln、Cys、Orn、同型半胱氨酸和乙酰基苯丙氨酸，22位的
Xaa＝Met、Leu或Nle，R1为OH或NH2，和R2为Gly Pro Ser Ser GlyAla Pro Pro Pro Ser(SEQ ID NO：1421)、Gly Pro Ser Ser Gly Ala ProPro Pro Ser Xaa(SEQ ID NO：1450；其中Xaa为Cys、Orn、同型半胱氨酸或乙酰基苯丙氨酸)、COOH或CONH2，其中肽任选地在SEQ IDNO：1413的16位、SEQ ID NO：1414的19位和在SEQ ID NO：1412的16和19位被聚乙二醇化。在一些实施方案中，在SEQ ID NOs：1412-1414和1439的24位Thr用Gly取代。根据一些实施方案，肽包含SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：1414的序列，其中R1为OH。根据一些实施方案，肽包含SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：1414的序列，其中R1为OH和R2为CONH2。根据一些实施方案，肽包含SEQID NO：13或SEQ ID NO：1414的序列，其中R1为OH，R2为CONH2和24位的苏氨酸用甘氨酸取代。
在一些实施方案中，5类肽被进一步修饰，以通过在对应的氨基酸位置取代原生胰高血糖素残基，包含原生GLP-1的一个或多个氨基酸。例如，5类肽可在2、3、17、18、21、23和24位(根据原生胰高血糖素的氨基酸编号)中的任何位置包含一个或多个氨基酸取代。在特别的实施方案中，5类肽用一个或多个以下氨基酸取代进行修饰：Ser2用Ala替代，Gln3用Glu替代，Arg17用Gln替代，18位的Arg用Ala替代，21位的Asp用Glu替代，23位的Val用Ile替代，和24位的Gln用Ala替代(根据原生胰高血糖素序列的氨基酸位置)。在特别的实施方案中，5类肽通过用Ala替代Ser2和用Glu替代Gln3(根据原生胰高血糖素的氨基酸编号)进行修饰。在另一个特别的实施方案中，5类肽用全部的以下氨基酸取代进行修饰：Arg17用Gln替代，18位的Arg用Ala替代，21位的Asp用Glu替代，23位的Val用Ile替代，和24位的Gln用Ala替代(根据原生胰高血糖素的氨基酸编号)。在又一个特别的实施方案中，5类肽被修饰以在21位仅包含Glu(根据SEQ ID NO：1401的编号)。因此，5类肽可包含SEQ ID NOs：1460-1470、1473-1478、1480-1488、1490-1496、1503、1504、1506和1514-1518中任何的氨基酸序列。
本文也提供5类肽或其包含以下的缀合物：(1)通过本文描述的手段(例如通过分子内桥，或加入一个或多个α，α-二取代氨基酸，或16位的酸性氨基酸(根据SEQ ID NO：1401的编号)或其组合稳定的α-螺旋；(2)替代C-末端羧酸酯的C-末端酰胺或酯，和(3)通式结构A-B-C，
其中A选自
(i)苯基乳酸(PLA)；
(ii)PLA的含氧衍生物；和
(iii)2-6个氨基酸的肽，其中肽的两个连续氨基酸通过酯或醚键连接；其中B代表SEQ ID NO：1401的氨基酸p-26，其中p为3、4、5、6或7，任选地包含一个或多个本文描述的氨基酸修饰，包括例如对5类肽描述的任何修饰。例如所述一个或多个修饰可选自：
(iv)9位的Asp(根据SEQ ID NO：1401的氨基酸编号)用Glu、Cys的磺酸衍生物、高谷氨酸、β-高谷氨酸或具有以下结构的半胱氨酸的烷基羧酸酯衍生物取代：
Figure BPA00001673726802551
其中X5为C1-C4烷基、C2-C4链烯基或C2-C4炔基；
(v)用通过酯、醚、硫醚、酰胺或烷基胺连接共价连接于酰基或烷基的氨基酸取代10、20和24位(根据SEQ ID NO：1401的氨基酸编号)的1或2个氨基酸；
(vi)用选自Cys、Lys、鸟氨酸、同型半胱氨酸和乙酰基-苯丙氨酸(Ac-Phe)的氨基酸取代16、17、20、21和24位(根据SEQ ID NO：1401的氨基酸编号)的1或2个氨基酸，其中基团的氨基酸共价连接于亲水性部分；
(vii)15位的Asp(根据SEQ ID NO：1401的编号)用半胱氨酸、谷氨酸、高谷氨酸和同型半胱氨酸取代；
(viii)16位的Ser(根据SEQ ID NO：1401的编号)用半胱氨酸、谷氨酸、高谷氨酸和同型半胱氨酸取代；
(ix)17位的Arg用Gln替代，18位的Arg用Ala替代，21位的Asp用Glu替代，23位的Val用Ile替代，和24位的Gln用Ala替代(根据SEQ ID NO：1401的氨基酸编号)；
(x)16位的Ser用Glu替代，20位的Gln用Glu替代，或24位的Gln用Glu替代(根据SEQ ID NO：1401的氨基酸编号)；
其中C(通式结构A-B-C的)选自：
(vii)X；
(viii)X-Y；
(ix)X-Y-Z；和
(x)X-Y-Z-R10，
其中X为Met、Leu或Nle；Y为Asn或荷电氨基酸；Z为Thr、Gly、Cys、Lys、鸟氨酸(Orn)、同型半胱氨酸、乙酰基苯丙氨酸(Ac-Phe)或荷电氨基酸；其中R10选自SEQ ID NOs：1421、1426、1427和1450。
在特定的方面，肽包含PLA的含氧衍生物。本文使用的“PLA的含氧衍生物”指的是包含修饰的PLA结构的化合物，其中羟基用O-R11替代，其中R11为化学部分。在这方面，PLA的含氧衍生物可为例如PLA的酯或PLA的。
制备PLA的含氧衍生物的方法为本领域已知的。例如，当含氧衍生物为PLA的酯，通过PLA的羟基与带有羰基的亲核试剂反应可形成酯。亲核试剂可为任何合适的亲核试剂，包括但不限于胺或羟基。因此，PLA的酯可包含以下式IV的结构：
Figure BPA00001673726802571
其中R7为当PLA的羟基与带羰基的亲核试剂反应时形成的酯。
带有羰基的亲核试剂(其与PLA的羟基反应形成酯)可为例如羧酸、羧酸衍生物或者活化的羧酸酯。羧酸衍生物非限制性地可为酰氯、酸酐、酰胺、酯或腈。活化的羧酸酯可为例如N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、甲苯磺酸酯(Tos)、碳二亚胺或六氟磷酸酯。在一些实施方案中，碳二亚胺为1，3-二环己基碳二亚胺(DCC)、1，1’-羰基二咪唑(CDI)、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)或1，3-二异丙基碳二亚胺(DICD)。在一些实施方案中，六氟磷酸盐(酯)选自六氟磷酸酯苯并***-1-基-氧基-三(二甲基氨基)膦鎓六氟磷酸盐(BOP)、苯并***-1-基-氧基三吡咯烷基膦鎓六氟磷酸盐(PyBOP)、2-(1H-7-氮杂苯并***-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲鎓六氟磷酸盐(HATU)和o-苯并***-N，N，N’，N’-四甲基-脲鎓-六氟磷酸盐(HBTU)。
从与羟基(例如，PLA的羟基)的反应制备醚的方法也为本领域所知。例如，PLA的羟基可与卤代烷基或甲苯磺酸化烷基醇反应形成醚键。
在一个具体实施方案中，经含氧键(例如，经酯或醚键)连至PLA的化学部分是聚合物(例如，聚亚烷基二醇)、碳水化合物、氨基酸、肽或脂质，例如，脂肪酸或类固醇。
在特别的实施方案中，化学部分为氨基酸，其任选地为肽的部分，使得式IV为缩酚肽。在这方面，PLA可在除肽的N-末端氨基酸残基的位置，使得肽在PLA残基包含一个或多个(例如1、2、3、4、5、6或更多个)氨基酸N-末端。例如，肽可在位置n包含PLA，其中n为肽的2、3、4、5或6。
PLA残基的氨基酸N-末端可为合成或天然存在的。在特别的实施方案中，为N-末端PLA的氨基酸为天然存在的氨基酸。在一些实施方案中，为PLA的N-末端的氨基酸为原生胰高血糖素的N-末端氨基酸。例如，肽可在N-末端包含SEQ ID NOs：1452-1456中任何一种的氨基酸序列，其中PLA通过酯键连接于苏氨酸：
SEQ ID NO：1452His-Ser-Gln-Gly-Thr-PLA
SEQ ID NO：1453Ser-Gln-Gly-Thr-PLA
SEQ ID NO：1454Gln-Gly-Thr-PLA
SEQ ID NO：1455Gly-Thr-PLA
SEQ ID NO：1456Thr-PLA
在备选的实施方案中，一个或多个N-末端氨基酸可用除原生胰高血糖素的氨基酸以外的氨基酸取代。例如，当肽包含PLA作为5或6位的氨基酸时，1位和/或2位的氨基酸可为减小对经二肽基肽酶IV裂解的敏感性的氨基酸。更具体地讲，在一些实施方案中，肽的1位为选自以下的氨基酸：D-组氨酸、α，α-二甲基咪唑乙酸(DMIA)、N-甲基组氨酸、α-甲基组氨酸、咪唑乙酸、脱氨基组氨酸、羟基-组氨酸、乙酰基-组氨酸和高-组氨酸。更具体地讲，在一些实施方案中，拮抗剂/激动剂肽的2位为选自以下的氨基酸：D-丝氨酸、D-丙氨酸、缬氨酸、甘氨酸、N-甲基丝氨酸、N-甲基丙氨酸和氨基异丁酸(Aib)。而且，例如，当肽包含PLA作为4、5或6位的氨基酸时，相对于原生胰高血糖素的原生谷氨酰胺残基，肽的3位氨基酸可为谷氨酸。在本发明的示例性实施方案中，肽在N-末端包含SEQ ID NOs：1457-1459中任何氨基酸序列。
关于包含式IV化合物的肽，聚合物可为任何聚合物，条件是，其可与PLA的羟基反应。聚合物可为天然，或通常包含带羰基的亲核试剂的聚合物。作为选择，聚合物可可为经衍生以包括带羰基的羰基的聚合物。聚合物可为以下中任一种的衍生聚合物：聚酰胺，聚碳酸酯，聚亚烷基及其衍生物包括，聚亚烷基二醇、聚环氧烷、聚对苯二甲酸亚烷基酯、丙烯酸酯和甲基丙烯酸酯的聚合物，包括聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(甲基丙烯酸乙酯)、聚(甲基丙烯酸丁酯)、聚(甲基丙烯酸异丁酯)、聚(甲基丙烯酸己酯)、聚(甲基丙烯酸异癸酯)、聚(甲基丙烯酸月桂酯)、聚(甲基丙烯酸苯酯)、聚(丙烯酸甲酯)、聚(丙烯酸异丙酯)、聚(丙烯酸异丁酯)和聚(丙烯酸十八烷酯)、聚乙烯聚合物包括聚乙烯醇类、聚乙烯醚类、聚乙烯酯类、聚卤代乙烯、聚(乙烯基醋酸酯)，和聚乙烯吡咯烷酮、聚乙交酯，聚硅氧烷，聚氨基甲酸酯和它们的共聚物，纤维素包括烷基纤维素，羟烷基纤维素、纤维素醚、纤维素酯、硝基纤维素、甲基纤维素，乙基纤维素，羟基丙基纤维素，羟基-丙基甲基纤维素，羟基丁基甲基纤维素、纤维素醋酸酯、纤维素丙酸酯、乙酸丁酸纤维素、邻苯二甲酸乙酸纤维素、羧乙基纤维素、纤维素三醋酸酯和纤维素硫酸钠盐、聚丙烯、聚亚乙基包括聚(乙二醇)、聚(环氧乙烷)和聚(对苯二甲酸乙二酯)和聚苯乙烯。
聚合物可为可生物降解聚合物，包括合成的可生物降解聚合物(例如乳酸和乙醇酸的聚合物、聚酐、聚原酸酯、聚氨酯、聚布狄克酸(poly(butic acid))、聚(戊酸)和聚丙交酯共聚己内酯)；和天然的可生物降解聚合物(例如海藻酸盐和其它多糖，包括葡聚糖和纤维素、胶原、其化学衍生物(取代、增加化学基团，例如烷基、亚烷基、羟基化、氧化以及本领域技术人员通常进行的其它修饰)、白蛋白和其它亲水性蛋白(例如玉米蛋白和其它醇溶谷蛋白及疏水性蛋白))及其任何共聚物或混合物。通常，这些材料通过体内酶促水解或暴露于水、通过表面或大量侵蚀而降解。
聚合物可为生物年附性聚合物，诸如H.S.Sawhney，C.P.Pathak和J.A.Hubbell在Macromolecule，1993，26，581-587中描述的可生物蚀解的水凝胶，其内容通过引用结合于本文中，聚透明质酸、酪蛋白，明胶，明胶蛋白、聚酐、聚丙烯酸，藻酸盐，壳聚糖、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(甲基丙烯酸乙酯)、聚(甲基丙烯酸丁酯)、聚(甲基丙烯酸异丁酯)、聚(甲基丙烯酸己酯)、聚(甲基丙烯酸异癸酯)、聚(甲基丙烯酸月桂酯)、聚(甲基丙烯酸苯酯)、聚(丙烯酸甲酯)、聚(丙烯酸异丙酯)、聚(丙烯酸异丁酯)和聚(丙烯酸十八烷酯)。
在一些实施方案中，聚合物为水溶性聚合物。合适的水溶性聚合物为本领域已知的，并且包括例如聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基纤维素(HPC；Klucel)、羟丙基甲基纤维素(HPMC；Methocel)、硝基纤维素、羟丙基乙基纤维素、羟丙基丁基纤维素、羟丙基戊基纤维素、甲基纤维素、乙基纤维素(Ethocel)、羟乙基纤维素、各种烷基纤维素和羟基烷基纤维素、各种纤维素醚、醋酸纤维素、羧甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、羧甲基纤维素钙、醋酸乙烯酯/巴豆酸共聚物、聚-甲基丙烯酸羟烷基酯、甲基丙烯酸羟甲基酯、甲基丙烯酸共聚物、聚甲基丙烯酸、聚甲基丙烯酸甲酯、马来酸酐/甲基乙烯基醚共聚物、聚乙烯醇、聚丙烯酸钠和钙、聚丙烯酸、酸性羧基聚合物、聚羧乙烯、羧基乙烯基聚合物、聚氧乙烯聚氧丙烯共聚物、聚甲基乙烯基醚共聚马来酸酐、羧甲基酰胺、甲基丙烯酸钾二乙烯基苯共聚物、聚氧乙二醇、聚环氧乙烷及其衍生物、盐和组合。
在特别的实施方案中，聚合物为聚亚烷基二醇，包括例如聚乙二醇(PEG)。
碳水化合物可为任何碳水化合物，条件是其包含或被使得包含具有α离去基团的羰基。碳水化合物例如可为被衍化以包含具有α离去基团的羰基的碳水化合物。在这方面，碳水化合物可为以下的衍化形式：单糖(例如葡萄糖、半乳糖、果糖)、二糖(例如蔗糖、乳糖、麦芽糖)、寡糖(例如棉子糖、水苏糖)、多糖(淀粉、淀粉酶、支链淀粉、纤维素、甲壳素、胼胝质、海带多糖、木聚糖、甘露聚糖、褐藻糖胶、半乳甘露聚糖)。
脂质可为包含具有α离去基团的羰基的任何脂质。脂质例如可为被衍化以包含羰基的脂质。在这方面，脂质可为以下的衍生物：脂肪酸(例如C4-C30脂肪酸、类二十烷酸、***素、白三烯、血栓素、N-酰基乙醇胺)、甘油脂(例如单-、二-、三-取代的甘油)、甘油磷脂(例如磷脂酰胆碱、磷脂酰肌醇、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸)、鞘脂类(例如鞘氨醇、神经酰胺)、固醇类脂(例如类固醇、胆固醇)、异戊烯醇类脂、醣脂质或聚酮化合物。在一些实施方案中，脂质为油、蜡、胆固醇、固醇、脂溶性维生素、单甘油酯、二甘油酯、三甘油酯或磷脂。
在一些实施方案中，R7具有约100kDa或者更少，例如约90kDa或者更少、约80kDa或者更少、约70kDa或者更少、约60kDa或者更少、约50kDa或者更少、约40kDa或者更少的分子量。因此，R7可具有约35kDa或者更少、约30kDa或者更少、约25kDa或者更少、约20kDa或者更少、约15kDa或者更少、约10kDa或者更少、约5kDa或者更少或约1kDa的分子量。
在备选的实施方案中，包含通式结构A-B-C的肽包含A，2-6个氨基酸的肽，其中A肽的两个连续氨基酸通过酯或醚键连接。酯或醚键例如可在氨基酸2和3、3和4、4和5或5和6之间。任选地，A肽可通过包括连接于聚合物(例如亲水性聚合物)的共价键合于另一个化学部分、烷基化或酰化而被进一步修饰。
在特别的实施方案中，以上描述的包含PLA的5类肽可被修饰，以包含PLA的含氧衍生物，例如PLA的酯或PLA的醚。例如5类肽可包含SEQ ID NOs：1402、1405-1420、1422-1425、1432-1436、1438、1439、1445、1446和1451中任何一种的氨基酸序列，其中PLA通过酯或醚键连接于氨基酸、肽、聚合物、酰基或烷基。氨基酸、肽、聚合物、酰基或烷基可为本文描述的那些中的任何一种。在PLA通过酯键连接于氨基酸或肽的情况中，5类肽可看作是缩酚肽。
同样，在另一个特别的实施方案中，以上描述的缺乏PLA的5类肽被修饰，以在为N-末端至7位(根据原生胰高血糖素的编号)氨基酸的两个连续氨基酸之间包含至少一个酯键或醚键。在特别的实施方案中，5类肽在两个连续的氨基酸之间包含至少一个酯或醚键。在更特别的实施方案中，5类肽包含SEQ ID NO：1401的N-末端6个氨基酸，并且N-末端6个氨基酸的两个连续氨基酸通过酯或醚键连接。
A的肽可包含任何氨基酸，合成的或天然存在的，条件是至少两个连续氨基酸通过酯或醚键连接。在一个特别的实施方案中，A的肽包含原生胰高血糖素的氨基酸。1位和/或2位的氨基酸可为减小对经二肽基肽酶IV裂解的敏感性的氨基酸。例如，A的肽可在1位包含选自以下的氨基酸：D-组氨酸、α，α-二甲基咪唑乙酸(DMIA)、N-甲基组氨酸、α-甲基组氨酸、咪唑乙酸、脱氨基组氨酸、羟基组氨酸、乙酰基组氨酸和高组氨酸。更具体地讲，在一些实施方案中，A肽的2位为选自以下的氨基酸：D-丝氨酸、D-丙氨酸、缬氨酸、甘氨酸、N-甲基丝氨酸、N-甲基丙氨酸和氨基异丁酸(Aib)。而且，例如，相对于原生胰高血糖素的原生谷氨酰胺残基，A肽的3位氨基酸可为谷氨酸。因此，通式结构A-B-C的肽可包含以下氨基酸序列：
Xaa1-Xaa2-Xaa3-Thr-Gly-Phe(SEQ ID NO：1507)；
Xaa2-Xaa3-Thr-Gly-Phe(SEQ ID NO：1508)；或
Xaa3-Thr-Gly-Phe(SEQ ID NO：1509)；
其中Xaa1选自His、D-组氨酸、α，α-二甲基咪唑乙酸(DMIA)、N-甲基组氨酸、α-甲基组氨酸、咪唑乙酸、脱氨基组氨酸、羟基组氨酸、乙酰基组氨酸和高组氨酸；Xaa2选自Ser、D-丝氨酸、D-丙氨酸、缬氨酸、甘氨酸、N-甲基丝氨酸、N-甲基丙氨酸和氨基异丁酸(Aib)；和Xaa3为Gln或Glu。
在一些实施方案中，B被修饰最多3个氨基酸修饰。例如，其代表SEQ ID NO：1401的原生氨基酸序列的B被修饰一个或多个保守的氨基酸修饰。
在另一个实施方案中，B包含一个或多个选自(iv)-(ix)的氨基酸修饰，如本文描述的那样。在一个特别的实施方案中，B包含氨基酸修饰(v)和(vi)中的一个或两者。在其它特别的实施方案中，除了(v)和(vi)以外，B还包含选自(iv)、(vii)、(viii)、(ix)和(x)的氨基酸修饰中的一个或组合。
如本文描述的那样，包含通式结构A-B-C的肽可在C-末端包含一个或多个荷电氨基酸，例如作为Y和/或Z，如本文描述的那样。或者或另外地，当C包含X-Y-Z时，包含通式结构A-B-C的肽可在Z进一步包含1-2个荷电氨基酸C-末端。荷电氨基酸可为例如Lys、Arg、His、Asp和Glu中的一种。在特别的实施方案中，Y为Asp。
在一些实施方案中，包含通式结构A-B-C的肽，在包含通式结构A-B-C的肽的1、16、20、21或24位(根据SEQ ID NO：1401的氨基酸编号)，或者在N-或C-末端残基，包含共价键合于氨基酸残基的亲水性部分。在特别的实施方案中，亲水性部分连接于包含通式结构A-B-C的肽的Cys残基。在这方面，原生胰高血糖素(SEQ ID NO：1401)的16、21、24或29位的氨基酸可用Cys残基取代。或者，例如当包含通式结构A-B-C的肽包含C-末端延伸时，可在包含通式结构A-B-C的肽的C-末端增加包含亲水性部分的Cys残基作为30位或作为40位(根据SEQ ID NO：1401的氨基酸编号的位置)。或者，亲水性部分可通过PLA的羟基部分连接于包含通式结构A-B-C的肽的PLA。亲水性部分可为本文描述的那些中的任何一种，例如聚乙二醇。
在特定的方面，包含通式结构A-B-C的肽通过加入分子内桥包含稳定的α-螺旋。在一些实施方案中，分子内桥为内酰胺桥。内酰胺桥可在9和12位的氨基酸、12和16位的氨基酸、16和20位的氨基酸、20和24位的氨基酸或24和28位的氨基酸之间(根据SEQ ID NO：1401的氨基酸编号)。在特定的方面，12和16位或16和20位的氨基酸(根据SEQ ID NO：1401的氨基酸编号)通过内酰胺桥连接。内酰胺桥的其它位置被考虑在内。
另外或者作为选择，包含通式结构A-B-C的肽可在例如16、20、21或24位(根据SEQ ID NO：1401的氨基酸编号)中的任何位置包含α，α-二取代氨基酸。在一些实施方案中，α，α-二取代氨基酸为Aib。在特定的方面，Aib位于16位(根据SEQ ID NO：1401的编号)。
作为选择或另外地，包含通式结构A-B-C的肽可被修饰，以在16位(根据SEQ ID NO：1401的编号)包含酸性氨基酸，其修饰增强α-螺旋的稳定性。在一些实施方案中，酸性氨基酸为包含侧链磺酸或侧链羧酸的氨基酸。在更特别的实施方案中，氨基酸选自Glu、Asp、高谷氨酸、Cys的磺酸衍生物、半胱氨酸、同型半胱氨酸、Asp和具有以下结构的Cys的烷基化衍生物：
Figure BPA00001673726802641
其中X5为C1-C4烷基、C2-C4链烯基或C2-C4炔基。
在特别的实施方案中，5类肽可包含SEQ ID NOs：1460-1470、1473-1478、1480-1488、1490-1496、1503、1504、1506和1514-1518中任何一种的氨基酸序列，或者包含表13的肽2-6、表14的肽1-8以及表15的肽2-6、8和9中任何氨基酸序列。
表13：内酰胺、Cex胰高血糖素(6-39)肽和胰高血糖素拮抗剂和GLP-1激动剂活性
Figure BPA00001673726802651
表14：内酰胺胰高血糖素(1-29、2-29、4-29和6-29)肽及其胰高血糖素拮抗剂和GLP-1激动剂活性(PA＝部分拮抗剂)
*对胰高血糖素受体的EC50
Figure BPA00001673726802671
Figure BPA00001673726802681
在一些实施方案中，包含通式结构A-B-C的肽为5类肽。在特别的实施方案中，肽对GLP-1受体呈现由原生GLP-1获得的最大激动的至少约50％，和对胰高血糖素受体呈现由原生胰高血糖素获得的最大应答的至少约50％抑制作用。在另一个特别的实施方案中，肽对GLP-1受体呈现由原生GLP-1获得的最大激动的至少约55％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、或约100％。或者或另外地，肽可对胰高血糖素受体呈现由原生胰高血糖素获得的最大应答的至少约55％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、或约100％抑制作用。
在某些实施方案中，提供具有5类肽或其结合的肽，其包含(1)赋予胰高血糖素拮抗剂活性包括但不限于以下的修饰：
(a)6位(根据野生型胰高血糖素的氨基酸编号)的Phe用PLA取代，任选地自野生型胰高血糖素的N-末端缺失1-5个氨基酸；或
(b)自野生型胰高血糖素的N-末端缺失2-5个氨基酸；任选地野生型胰高血糖素的9位Asp用谷氨酸、高谷氨酸或半胱氨酸的磺酸衍生物取代(根据野生型胰高血糖素的氨基酸编号)；和
(2)赋予GLP-1激动剂活性包括但不限于以下的修饰：
(a)在野生型胰高血糖素的氨基酸12-29中，例如在16、17、18、19、20、21、24或29位中的1、2、3、4或更多个位置(根据野生型胰高血糖素的氨基酸编号)***或取代α，α-二取代氨基酸；或
(b)在野生型胰高血糖素的氨基酸12-29中引入分子内桥，例如盐桥或内酰胺桥或者另一种类型的共价键；或
(c)用GLP-1的对应氨基酸取代2、3、17、18、21、23或24位中的一个或多个位置(根据原生胰高血糖素的氨基酸编号)的氨基酸，例如用Ala替代Ser2，用Glu替代Gln3，用Gln替代Arg17，用Ala替代18位的Arg，用Glu替代21位的Asp，用Ile替代23位的Val，和/或用Ala替代24位的Gln；或
(d)在约氨基酸12-29位(根据野生型胰高血糖素的氨基酸编号)稳定α-螺旋结构的其它修饰；和
(3)增强GLP-1激动剂活性的其它修饰，例如替代C-末端羧酸酯的
C-末端酰胺或酯；和任选地
(4)一种或多种以下修饰：
(a)例如在N-末端，或在6、16、17、20、21、24、29、40位，或者在C-末端氨基酸共价连接于亲水性部分例如聚乙二醇；和/或
(b)酰化或烷基化；和任选地
(5)一种或多种以下另外的修饰：
(a)任选地通过键合于6位(根据野生型胰高血糖素的编号)的PLA的酯键，把氨基酸共价连接于N-末端，例如把1-5个氨基酸共价连接于N-末端，任选地与本文描述的1或2位修饰一起，改善对DPP-IV裂解的抗性；
(b)缺失29和/或28位，并且任选地缺失27位(根据野生型胰高血糖素的编号)的氨基酸；
(c)把氨基酸共价连接于C-末端；
(d)非保守的取代、保守的取代、增加或缺失，同时保留要求的活性，例如在2、5、7、10、11、12、13、14、16、17、18、19、20、21、24、27、28或29位中一个或多个位置的保守取代，用Val或Phe取代10位的Tyr，用Arg取代12位的Lys，用Ala取代这些位置中的一个或多个位置；
(e)例如通过用谷氨酸、高谷氨酸、半胱氨酸或同型半胱氨酸取代，修饰15位的天冬氨酸，这样的修饰可减少降解；或者例如通过苏氨酸、Aib、谷氨酸或用具有4个原子长度的侧链的另一种荷负电的氨基酸，或者用谷氨酰胺、高谷氨酸或同型半胱氨酸中的任何一种取代，修饰16位的丝氨酸，这样的修饰同样可减少由于Asp15-Ser16键的裂解造成的降解；
(f)例如通过用亮氨酸或正亮氨酸取代，修饰27位的蛋氨酸，以减少氧化降解；
(g)例如通过用Ala或Aib取代，修饰20或24位的Gln，以减少通过Gln的脱酰胺作用发生的降解；
(h)例如通过用Glu取代修饰21位的Asp，减少通过Asp脱水形成环状琥珀酰亚胺中间体随后异构化为异天冬氨酸发生的降解；
(j)本文描述的均二聚作用或异源二聚作用；和
(k)以上的组合。
应该理解，相同类别中的任何修饰可组合在一起和/或不同类别中的修饰相组合。例如，(1)(a)修饰可与(2)(a)和(3)组合；(1)(a)可与(2)(b)组合，例如内酰胺桥或盐桥和(3)；(1)(a)可与(2)(c)和(3)组合；(1)(b)可与(2)(a)和(3)组合；(1)(b)可与(2)(b)组合，例如内酰胺桥或盐桥和(3)；(1)(b)可与(2)(c)和(3)组合；和上述中的任何一种可与(4)(a)和/或(4)(b)组合；以及上述中的任何一种可与(5)(a)-(5)(k)中的任何一种组合。
在示例性实施方案中，在16、20、21或24位中的1、2、3个或全部位置(根据野生型胰高血糖素的氨基酸编号)取代α，α-二取代氨基酸Aib。
在示例性实施方案中，分子内桥是盐桥。
在其它示例性实施方案中，分子内桥为共价键，例如内酰胺桥。在一些实施方案中，内酰胺桥在9和12位的氨基酸、12和16位的氨基酸、16和20位的氨基酸、20和24位的氨基酸或者24和28
位的氨基酸(根据SEQ ID NO：1401的氨基酸编号)之间。
在示例性实施方案中，酰化或烷基化在6、10、20或24位或者N-末端或C-末端(根据野生型胰高血糖素SEQ ID NO：1401的氨基酸编号)。
在示例性实施方案中，修饰包括：
(i)用半胱氨酸、谷氨酸、高谷氨酸和同型半胱氨酸取代15位的Asp(根据SEQ ID NO：1401的编号)；
(ii)用半胱氨酸、谷氨酸、高谷氨酸和同型半胱氨酸取代16位的Ser(根据SEQ ID NO：1401的编号)；
(iii)用荷电氨基酸取代28位的Asn；
(iv)用选自Lys、Arg、His、Asp、Glu、半胱氨酸和同型半胱氨酸的荷电氨基酸酸取代28位的Asn；
(v)用Asn、Asp或Glu取代28位；
(vi)用Asp取代28位；
(vii)用Glu取代28位；
(viii)用荷电氨基酸取代29位的Thr；
(ix)用选自Lys、Arg、His、Asp、Glu、半胱氨酸和同型半胱氨酸的荷电氨基酸取代29位的Thr；
(x)用Asp、Glu或Lys取代29位；
(xi)用Glu取代29位；
(xii)在29位之后***1-3个荷电氨基酸；
(xiii)在29位之后***Glu或Lys；
(xiv)在29位之后***Gly-Lys或Lys-Lys；
或其组合。
提高GLP-1受体激动剂活性、胰高血糖素受体拮抗剂活性、肽溶解性和/或肽稳定性的以上描述的任何修饰可单独或组合应用。
提高稳定性的修饰
根据一些实施方案，本文公开的5类肽可被进一步修饰，以包括连接于5类肽的羧基末端氨基酸(24位)，并给予个体以引起体重减轻或助于保持体重的SEQ ID NO：1421(GPSSGAPPPS)或SEQ IDNO：1450的氨基酸序列。更具体地讲，5类肽包含选自SEQ ID NO：1405、SEQ ID NO：1406、SEQ ID NO：1407、SEQ ID NO：1408、SEQ ID NO：1409、SEQ ID NO：1412、SEQ ID NO：1413、SEQ IDNO：1414、SEQ ID NO：1416、SEQ ID NO：1417、SEQ ID NO：1418、SEQ ID NO：1419、SEQ ID NO：1422、SEQ ID NO：1423、SEQ ID NO：1424和SEQ ID NO：1425的序列，并且进一步包含连接于肽或5类肽的羧基末端氨基酸(24位)的SEQ ID NO：1421(GPSSGAPPPS)或SEQ ID NO：1450的氨基酸序列，用于抑制抑制食欲和引起体重减轻/保持体重。在一些实施方案中，所给予的肽或5类肽包含选自SEQ ID NO：1416、SEQ ID NO：1417、SEQ ID NO：1418和SEQ ID NO：1419的序列，进一步包含连接于5类肽的羧基末端氨基酸(24位)的SEQ ID NO：1421(GPSSGAPPPS)的氨基酸序列。在一些实施方案中，方法包括给予包含SEQ ID NO：1445或SEQ IDNO：1446的序列的肽或5类肽。
因此，预计本文公开的5类肽可被类似地修饰，以降低其对在含水缓冲液中过早化学裂解的敏感性。根据一些实施方案，通过用选自半胱氨酸、谷氨酸、高谷氨酸和同型半胱氨酸的氨基酸替代位于原生胰高血糖素的对应15位的原生天冬氨酸氨基酸，本文描述的5类肽可被进一步修饰，以增强其在水溶液中的稳定性。根据一些实施方案，SEQ ID NO：1405、SEQ ID NO：1406、SEQ ID NO：1407或SEQID NO：1408的5类肽的10位天冬氨酸残基可用选自半胱氨酸、谷氨酸、高谷氨酸和同型半胱氨酸的氨基酸取代，并且在一些实施方案中，SEQ ID NO：1405、SEQ ID NO：1406、SEQ ID NO：1407或SEQ ID NO：1408的10位原生天冬氨酸被谷氨酸替代。根据一些实施方案，提供在水溶液中具有改善的稳定性的5类肽，其中拮抗剂包含SEQ ID NO：1409的修饰的序列，其中修饰包含用Glu取代SEQ ID NO：1409的10位Asp。在一些实施方案中，提供包含选自SEQ ID NO：1422、SEQ IDNO：1423、SEQ ID NO：1424和SEQ ID NO：1425的序列的5类肽。在一些实施方案中，5类肽被酰胺化。
原生胰高血糖素的15-16位的Asp-Ser序列被确定为导致原生激素在含水缓冲液中过早化学裂解的独特不稳定的二肽。例如，当在37℃下的0.01N HCl中保持2周时，多于50％的原生胰高血糖素可裂解为碎片。两种释放的裂解肽1-15和16-29没有胰高血糖素样生物活性，并且因此代表对胰高血糖素及其相关类似物的水成预配制的限制。原生胰高血糖素的15位Asp用Glu进行选择性的化学取代，观察到几乎消除15-16肽键的化学裂解。
在另外的其它示例性实施方案中，通过修饰对应于原生胰高血糖素的15或16位的氨基酸，以减少尤其是在酸性或碱性缓冲液中肽随着时间推移的降解，任何一种上述化合物可被进一步修饰以改善稳定性。
提高溶解性的修饰
5类肽可被进一步修饰，以改善肽在生理pH下的水溶液中的溶解性，在某些方面同时保留胰高血糖素拮抗剂和GLP-1激动剂活性。在对应于SEQ ID NO：1405肽的12、15、16、19和24位的位置，或在SEQ ID NO：1406肽的12、16、19或24位引入亲水性基团，可改善生成的肽在具有生理pH的溶液中的溶解性，同时保留母体化合物胰高血糖素拮抗剂和GLP激动剂活性。因此，在一些实施方案中，目前公开的5类肽，其被进一步修饰以包含一个或多个亲水性基团，这种亲水性基团共价连接于对应于SEQ ID NO：1405或SEQ ID NO：1406肽的12、15、16、19和24位氨基酸的氨基酸侧链。在其它的实施方案中，对应于SEQ ID NO：1405或SEQ ID NO：1406的16和19位氨基酸的氨基酸侧链共价键合于亲水性基团，并且在一些实施方案中亲水性基团为聚乙二醇(PEG)。
5类胰高血糖素相关肽可通过在其羧基末端引入电荷进行修饰，以增强肽的溶解性，同时保留肽的激动剂性能。增强的溶解性使得能够以近中性pH准备和储存胰高血糖素溶液。以相对中性pHs(例如约6.0-约8.0的pH)配制胰高血糖素溶液改善5类肽的长期稳定性。
申请人预计本文公开的5类肽可被类似地进行修饰，以增强其在相对中性pH(例如约6.0-约8.0的pH)的水溶液中的溶解性，在一些情况中同时保留胰高血糖素拮抗剂和GLP-1活性。因此，一些实施方案涉及SEQ ID NO：1405、SEQ ID NO：1406、SEQ ID NO：1407或SEQ ID NO：1408的高血糖素拮抗剂/GLP-1，其相对于存在于野生型胰高血糖素(SEQ ID NO：1401)的6-29位的原生氨基酸已被进一步修饰，以通过用荷电氨基酸取代原生的非荷电氨基酸，或者在羧基末端增加荷电氨基酸对肽增加电荷。根据一些实施方案，本文公开的5类肽的1-3个非荷电原生氨基酸用荷电氨基酸替代。在一些实施方案中，荷电氨基酸选自赖氨酸、精氨酸、组氨酸、天冬氨酸和谷氨酸。更具体地讲，申请人已经发现，用荷电氨基酸取代对应于28和/或29位通常存在的氨基酸(相对于原生胰高血糖素)，和/或在肽的羧基末端增加1-2个荷电氨基酸，增强5类肽在生理相关pHs(即约6.5-约7.5的pH)下的水溶液中的溶解性和稳定性。因此，5类肽的这样的修饰预计对在水溶液中，特别是在约5.5-约8.0范围内的pH下的溶解性具有类似作用，同时保留母体肽的生物活性。
根据一些实施方案，通过用荷负电的氨基酸(例如天冬氨酸或谷氨酸)取代在那些序列的23和/或24位的原生氨基酸，和任选地在肽的羧基末端增加荷负电的氨基酸(例如天冬氨酸或谷氨酸)，修饰SEQ ID NO：1405、SEQ ID NO：1406、SEQ ID NO：1407或SEQ IDNO：1408的5类肽。在备选的实施方案中，通过用荷正电的氨基酸(例如赖氨酸、精氨酸或组氨酸)取代在SEQ ID NO：1405、SEQ IDNO：1406、SEQ ID NO：1407或SEQ ID NO：1408的24位的原生氨基酸，和任选地在肽的羧基末端增加1或2个荷正电的氨基酸(例如赖氨酸、精氨酸或组氨酸)，修饰包含SEQ ID NO：1405、SEQ ID NO：1406、SEQ ID NO：1407或SEQ ID NO：1408的5类肽。根据一些实施方案，提供具有改善的溶解性和稳定性的5类肽，其中类似物包含SEQ ID NO：1415或SEQ ID NO：1451的氨基酸序列，条件是SEQ IDNO：1415或SEQ ID NO：1451的23或24位的至少一个氨基酸用酸性氨基酸取代，和/或在SEQ ID NO：1415或SEQ ID NO：1451的羧基末端增加另外的酸性氨基酸。在一些实施方案中，酸性氨基酸独立地选自Asp、Glu、半胱氨酸和同型半胱氨酸。
根据一些实施方案，提供具有改善的溶解性和稳定性的5类肽，其中拮抗剂包含SEQ ID NO：1416、SEQ ID NO：1417、SEQ IDNO：1418或SEQ ID NO：1419的氨基酸序列。根据一些实施方案，提供包含SEQ ID NO：1416或SEQ ID NO：1417的序列的胰高血糖素激动剂。在一些实施方案中，5类肽包含SEQ ID NO：1420的序列。
根据一些实施方案，提供包含SEQ ID NO：1415或SEQ IDNO：1451的序列的5类肽。在一些实施方案中，SEQ ID NO：1415或SEQ ID NO：1451的4位为天冬氨酸、谷氨酸、高谷氨酸、半胱氨酸或同型半胱氨酸，并且在一些实施方案中4位为天冬氨酸、谷氨酸、半胱氨酸或同型半胱氨酸，并且在其它的实施方案中SEQ ID NO：1415或SEQ ID NO：1451的4位为天冬氨酸或谷氨酸，并且在一些实施方案中SEQ ID NO：1415或SEQ ID NO：1451的4位为天冬氨酸。在一些实施方案中，提供包含SEQ ID NO：1415或SEQ ID NO：1451的序列的5类肽，其中SEQ ID NO：1415的4位为天冬氨酸和SEQ IDNO：1415的10位为谷氨酸。在其它的实施方案中，SEQ ID NO：1415或SEQ ID NO：1451的C-末端氨基酸被修饰，以用电荷中性的基团例如酰胺或酯替代原生羧酸基团。
5类肽融合体
在其它的实施方案中，本文描述的5类肽的羧基末端氨基酸共价键合于包含选自SEQ ID NOs：1421、1426、1427和1450的序列的第二个肽。例如，在一些实施方案中，SEQ ID NO：1415、SEQ ID NO：1451、SEQ ID NO：1405、SEQ ID NO：1406、SEQ ID NO：1407、SEQID NO：1408、SEQ ID NO：1412、SEQ ID NO：1413、SEQ ID NO：1414、SEQ ID NO：1416、SEQ ID NO：1417、SEQ ID NO：1418、SEQ ID NO：1419、SEQ ID NO：1422、SEQ ID NO：1423、SEQ ID NO：1424和SEQID NO：1425的5类肽共价键合于包含选自SEQ ID NO：1421(GPSSGAPPPS)、SEQ ID NO：1426(KRNRNNIA)、SEQ ID NO：1427(KRNR)和SEQ ID NO：1450(GPSSGAPPPSX)的序列的第二个肽。
在一些实施方案中，提供包含两个独立地选自SEQ ID NO：1405、SEQ ID NO：1406、SEQ ID NO：1407、SEQ ID NO：1408、SEQ ID NO：1409、SEQ ID NO：1422、SEQ ID NO：1423、SEQ IDNO：1424和SEQ ID NO：1425的序列的5类肽二聚体，其进一步包含连接于5类肽的羧基末端氨基酸的SEQ ID NO：1421的氨基酸序列(GPSSGAPPPS)。
在一些实施方案中，通过截短或缺失肽的C-末端的1或2个氨基酸(即截短原生胰高血糖素的29位或者28和29位氨基酸)，进一步修饰5类肽。优选地截短不影响5类肽的活性(例如胰高血糖素拮抗/GLP-1激动作用)。
5类肽缀合物
还提供5类肽缀合物，其中的胰高血糖素肽任选经共价连接和任选经连接基连至缀合物部分。
在其中的5类肽包括聚乙二醇链的那些实施方案中，聚乙二醇链可呈直链形式或者它可为支链。根据某些实施方案，聚乙二醇链具有选自约500-约10,000道尔顿范围的平均分子量。在某些实施方案中，聚乙二醇链具有选自约1,000-约5,000道尔顿范围的平均分子量。在某些实施方案中，聚乙二醇链具有选自约1,000-约5,000道尔顿范围的平均分子量。在某些实施方案中，聚乙二醇链具有选自约1,000-约2,000道尔顿的平均分子量。在某些实施方案中，聚乙二醇链的平均分子量为约1,000道尔顿。
在一些实施方案中，聚乙二醇化的5类肽包含由SEQ ID NO：1415或SEQ ID NO：1451的序列组成的肽，其中聚乙二醇链连接于选自SEQ ID NO：1415或SEQ ID NO：1451的11、12、15、16、19和24位氨基酸，并且PEG链的分子量为约1000-约5000道尔顿。在一些实施方案中，聚乙二醇化的5类肽包含由SEQ ID NO：1415或SEQID NO：1451的序列组成的肽，其中聚乙二醇链连接于SEQ ID NO：1415或SEQ ID NO：1451的16或19位的氨基酸，并且PEG链的分子量为约1000-约5000道尔顿。在其它的实施方案中，修饰的5类肽包含两个或更多个共价键合于肽的聚乙二醇链，其中胰高血糖素链的总分子量为约1000-约5000道尔顿。在一些实施方案中，5类肽包含SEQ ID NO：1415或SEQ ID NO：1451的序列，其中聚乙二醇链连接于SEQ ID NO：1415或SEQ ID NO：1451的16和19位的氨基酸，并且两个PEG链的合并分子量为约1000-约5000道尔顿。
5类胰高血糖素相关肽可包含SEQ ID NOs：1401-1518中任何一种的氨基酸序列，任选地具有最多1、2、3、4或5个保留胰高血糖素拮抗剂和GLP-1激动剂活性的其它修饰。
连接基团(L)
如本文描述的那样，本公开提供与具有式Q-L-Y的NHR配体结合的胰高血糖素超家族肽，其中L为连接基团或化学键。在一些实施方案中，L为体内稳定的。在一些实施方案中，L可在体内水解。在一些实施方案中，L为在体内亚稳态的。
可采用标准的交联剂和本领域技术人员已知的程序使Q和Y经L连在一起。在一些方面，Q和Y直接融合并且L为键。在其它方面，Q和Y通过连接基团L融合。例如，在一些实施方案中，Q和Y通过肽键，任选地通过肽或氨基酸间隔区连接在一起。在一些实施方案中，Q和Y通过化学缀合，任选地通过连接基团(L)连接在一起。在一些实施方案中，L直接缀合于Q和Y中的每一个。
化学缀合可通过一种化合物的亲核反应性基团与另一种化合物的亲电反应性基团反应而发生。在一些实施方案中，当L为键时，通过Q上的亲核反应性部分与Y上的亲电反应性部分反应，或者通过Q上的亲电反应性部分与Y上的亲核反应性部分反应，Q缀合于Y。在一些实施方案中，当L为将Q和Y连接在一起的基团时，通过Q和/或Y上的亲核反应性部分与L上的亲电反应性部分反应，或者通过Q和/或Y上的亲电反应性部分与L上的亲核反应性部分反应，Q和/或Y可缀合于L。亲核反应性基团的非限制性实例包括氨基、硫醇和羟基。亲电反应性基团的非限制性实例包括羧基、酰氯、酐、酯、琥珀酰亚胺酯、烷基卤化物、磺酸酯、马来酰亚胺基、卤代乙酰基和异氰酸酯。在其中Q和Y通过使羧酸与胺反应结合在一起的实施方案中，活化剂可用于形成羧酸的活化酯。
羧酸的活化酯可为例如N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、甲苯磺酸酯(Tos)、甲磺酸酯、三氟甲磺酸酯、碳二亚胺或六氟磷酸酯。在一些实施方案中，碳二亚胺为1，3-二环己基碳二亚胺(DCC)、1，1’-羰基二咪唑(CDI)、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)或1，3-二异丙基碳二亚胺(DICD)。在一些实施方案中，六氟磷酸盐(酯)选自六氟磷酸酯苯并***-1-基-氧基-三(二甲基氨基)膦鎓六氟磷酸盐(BOP)、苯并***-1-基-氧基三吡咯烷基膦鎓六氟磷酸盐(PyBOP)、2-(1H-7-氮杂苯并***-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲鎓六氟磷酸盐(HATU)和o-苯并***-N，N，N’，N’-四甲基-脲鎓-六氟磷酸盐(HBTU)。
在一些实施方案中，Q包含能够缀合于Y或L上的亲电反应性基团的亲核反应性基团(例如赖氨酸、半胱氨酸或丝氨酸侧链的氨基、硫醇基或羟基)。在一些实施方案中，Q包含能够缀合于Y或L上的亲核反应性基团的亲电反应性基团(例如Asp或Glu侧链的羧酸酯基)。在一些实施方案中，Q被化学修饰以包含能够直接缀合于Y或L的反应性基团。在一些实施方案中，Q在C-末端被修饰以包含具有亲核侧链的天然或非天然氨基酸，例如由式I、式II或式III表示的氨基酸，如本文先前描述的那样(参见酰化和烷基化)。在示例性实施方案中，Q的C-末端氨基酸选自赖氨酸、鸟氨酸、丝氨酸、半胱氨酸和同型半胱氨酸。例如Q的C-末端氨基酸可被修饰以包含赖氨酸残基。在一些实施方案中，Q在C-末端氨基酸被修饰，以包含具有亲电侧链的天然或非天然氨基酸，例如Asp和Glu。在一些实施方案中，Q的内部氨基酸用具有亲核侧链的天然或非天然氨基酸取代，例如由式I、式II或式III表示的氨基酸，如本文先前描述的那样(参见酰化和烷基化)。在示例性实施方案中，被取代的Q的内部氨基酸选自赖氨酸、鸟氨酸、丝氨酸、半胱氨酸和同型半胱氨酸。例如，Q的内部氨基酸可用赖氨酸残基取代。在一些实施方案中，Q的内部氨基酸用具有亲电侧链的天然或非天然氨基酸例如Asp和Glu取代。
在一些实施方案中，Y包含能够直接缀合于Q或L的反应性基团。在一些实施方案中，Y包含能够缀合于Q或L的亲电反应性基团的亲核反应性基团(例如氨、硫醇、羟基)。在一些实施方案中，Y包含能够缀合于Q或L的亲核反应性基团的亲电反应性基团(例如羧基、羧基的活化形式、具有离去基团的化合物)。在一些实施方案中，Y被化学修饰以包含能够缀合于Q或L的亲电反应性基团的亲核反应性基团。在一些实施方案中，Y被化学修饰以包含能够缀合于Q或L的亲核反应性基团的亲电反应性基团。
在一些实施方案中，缀合可通过有机硅烷例如用戊二醛处理的氨基硅烷、硅烷醇基的羰基二咪唑(CDI)活化；或者采用树状聚体实施。各种树状聚体为本领域已知的，并且包括聚酰胺-胺(PAMAM)树状聚体，其通过发散法(divergent method)自氨或乙二胺引发剂核心试剂开始合成；基于三氨基乙烯亚胺核心的PAMAM树状聚体子类；径向分层的聚酰胺-胺-有机硅树状聚体(PAMAMOS)，其颠倒由亲水性、亲核性的聚酰胺-胺(PAMAM)内层和疏水性的有机硅(OS)外层组成的单分子的胶束；聚丙烯亚胺(PPI)树状聚体，其通常为具有伯胺作为端基的聚烷基胺，而树状聚体内层由众多的叔三丙烯胺组成；聚丙烯胺(POPAM)树状聚体；丁二胺(DAB)树状聚体；两亲性树状聚体；为水溶性超支化聚苯的单分子胶束的胶束树状聚体；聚赖氨酸树状聚体；和基于聚苄基醚超支化骨架的树状聚体。
在一些实施方案中，缀合可通过烯烃复分解反应实施。在一些实施方案中，Y和Q、Y和L或者Q和L两者包含能够经历复分解反应的烯烃或炔烃部分。在一些实施方案中，合适的催化剂(例如铜、钌)用于加速复分解反应。实施烯烃复分解反应的合适方法在本领域得到描述。参见例如Schafmeister et al.，J.Am.Chem.Soc.122：5891-5892(2000)，Walensky et al.，Science 305：1466-1470(2004)和Blackwell et al.，Angew，Chem.，Int.Ed.37：3281-3284(1998)。
在一些实施方案中，缀合可使用点击化学实施。“点击反应”范围广泛并且易于实施，仅使用易于得到的试剂，并且对氧和水不敏感。在一些实施方案中，点击反应为炔基和叠氮基之间形成***基的环加成反应。在一些实施方案中，点击反应使用铜或钌催化剂。实施点击反应的合适方法在本领域有描述。参见例如Kolb et al.，DrugDiscovery Today 8：1128(2003)；Kolb et al.，Angew.Chem.Int.Ed.40：2004(2001)；Rostovtsev et al.，Angew.Chem.Int.Ed.41：2596(2002)；Tornoe et al.，J.Org.Chem.67：3057(2002)；Manetsch et al.，J.Am.Chem.Soc.126：12809(2004)；Lewis et al.，Angew.Chem.Int.Ed.41：1053(2002)；Speers，J.Am.Chem.Soc.125：4686(2003)；Chan et al.Org.Lett.6：2853(2004)；Zhang et al.，J.Am.Chem.Soc.127：15998(2005)和Waser et al.，J.Am.Chem.Soc.127：8294(2005)。
还预期通过高亲和性特异性结合伴侣例如链霉亲和素/生物素或亲和素/生物素或凝集素/碳水化合物的间接缀合。
Q和/或Y的化学修饰
在一些实施方案中，Q和/或Y用有机衍化剂官能化以包含亲核反应性基团或亲电反应性基团。衍化剂能够与Q上靶向氨基酸的选择的侧链或者N-或C-末端残基和Y上的官能团反应。Q和/或Y的反应性基团包括例如醛、氨基、酯、硫醇、α-卤代乙酰基、马来酰亚胺基或肼基。衍化剂包括例如马来酰亚胺基苯甲酰基磺基琥珀酰亚胺酯(通过半胱氨酸残基缀合)、N-羟基琥珀酰亚胺(通过赖氨酸残基)、戊二醛、琥珀酸酐或者本领域已知的其它试剂。或者Q和/或Y可通过中间载体例如多糖或多肽载体彼此间接连接。多糖载体的实例包括氨基葡聚糖。合适的多肽载体的实例包括聚赖氨酸、聚谷氨酸、聚天冬氨酸、其共聚物，和这些氨基酸等例如丝氨酸的混合聚合物，以在生成的负载载体上给予合乎需要的溶解性质。
半胱氨酰残基最常见地与α-卤代乙酸酯(和相应的胺)例如氯乙酸或氯乙酰胺反应，得到羧甲基或羧基酰胺基甲基衍生物。半胱氨酰残基也通过与溴代三氟丙酮、α-溴代-β-(5-咪唑酰基(imidozoyl))丙酸、氯乙酰基磷酸酯、N-烷基马来酰亚胺、3-硝基-2-吡啶基二硫化物、甲基2-吡啶基二硫化物、对-氯汞苯甲酸酯、2-氯汞-4-硝基苯酚或氯代-7-硝基苯并-2-氧杂-1，3-二唑反应而衍化。
组氨酰残基通过在pH 5.5-7.0下与焦碳酸二乙酯反应衍化，因为该试剂对组氨酰侧链为相对特异性的。对-溴苯甲酰甲基溴也是有用的；反应优选地在pH 6.0下于0.1M二甲砷酸钠中进行。
赖氨酰和氨基-末端残基与琥珀酸的或其它羧酸的酸酐反应。用这些试剂衍化具有逆转赖氨酰残基的电荷的作用。用于衍化含有α-氨基的残基的其它合适试剂包括酰亚胺酯，例如甲基吡啶亚氨酸甲酯、磷酸吡哆醛、吡哆醛、氯硼氢化物、三硝基苯磺酸、O-甲基异脲、2，4-戊二酮和与乙醛酸转氨酶催化的反应。
精氨酰残基通过与苯甲酰甲醛、2，3-丁二酮、1，2-环己二酮和茚三酮它们中的一种或几种常规试剂反应进行修饰。精氨酸残基的衍化由于胍官能团的高pKa需要反应在碱性条件下进行。另外，这些试剂可与赖氨酸的基团以及精氨酸ε-氨基反应。
可进行酪氨酰残基的特殊的修饰，特别感兴趣的是通过与芳族重氮化合物或四硝基甲烷反应向酪氨酰残基引入光谱标记。最常见地，N-乙酰基咪唑和四硝基甲烷分别用于形成O-乙酰基酪氨酰种类和3-硝基衍生物。
羧基侧基(天冬氨酰或谷氨酰)通过与碳二亚胺(R-N＝C＝N-R’)反应选择性地进行修饰，其中R和R’为不同的烷基，例如1-环己基-3-(2-吗啉基-4-乙基)碳二亚胺或1-乙基-3-(4-氮鎓-4，4-二甲基戊基)碳二亚胺。另外，天冬氨酰和谷氨酰残基通过与铵离子反应转化为天冬酰胺酰和谷氨酰胺酰残基。
其它修饰包括脯氨酸和赖氨酸的羟基化，丝氨酰或苏氨酰残基的羟基的磷酸化，赖氨酸、精氨酸和组氨酸侧链α-氨基的甲基化(T.E.Creighton，Proteins：蛋白：结构和分子性质(Structure andMolecular Properties)，W.H.Freeman&Co.，San Francisco，第79-86页(1983))，天冬酰胺或谷氨酰胺的脱酰胺作用，N-末端胺的乙酰化和/或C-末端羧酸基团的酰胺化或酯化。
另一类型的共价修饰包括化学或酶促把苷偶合于肽。糖可连接于(a)精氨酸和组氨酸，(b)游离羧基，(c)游离巯基例如半胱氨酸的那些基团，(d)游离的羟基例如丝氨酸、苏氨酸或羟基脯氨酸的那些基团，(e)芳族残基例如酪氨酸或色氨酸的那些基团，或(f)谷氨酰胺的酰胺基。这些方法描述于1987年9月11日公开的WO87/05330和在Aplin和Wriston，CRC Crit.Rev.Biochem.，第259-306页(1981)中。
L的结构
在一些实施方案中，L为键。在这些实施方案中，Q和Y通过使Q的亲核性反应性部分与Y的亲电性反应性部分反应缀合在一起。在备选的实施方案中，Q和Y通过使Q的亲电性反应性部分与Y的亲核性部分反应缀合在一起。在示例性实施方案中，L为Q的胺(例如赖氨酸残基的ε-胺)与Y的羧基反应形成的酰胺键。在备选的实施方案中，Q和/或Y在缀合之前用衍化剂衍化。
在一些实施方案中，L为连接基团。在一些实施方案中，L为双功能连接基并且在与Q和Y缀合之前仅包含两个反应性基团。在其中Q和Y两者皆具有亲电性反应性基团的实施方案中，L在缀合于Q和Y之前包含两个相同或两个不同的亲核基团(例如胺、羟基、巯基)。在其中Q和Y两者皆具有亲核性反应性基团的实施方案中，L在缀合于Q和Y之前包含两个相同或两个不同亲电基团(例如羧基、羧基的活化形式、具有离去基团的化合物)。在其中Q或Y中的一个具有亲核性反应性基团和Q或Y中的另一个具有亲电性反应性基团的实施方案中，L在缀合于Q和Y之前包含一个亲核性反应性基团和一个亲电性基团。
L可为带至少两个能与Q和Y中的每一个反应的反应性基团的任何分子(在缀合至Q和Y之前)。在某些实施方案中，L只有两个反应性基团并为双官能团。L(在缀合至肽之前)可由式VI表示：
Figure BPA00001673726802841
其中A和B独立地为亲核或亲电性反应性基团。在一些实施方案中，A和B或者两者皆为亲核性基团或者两者皆为亲电性基团。在一些实施方案中，A或B中的一个为亲核性基团并且A或B中的另一个为亲电性基团。A和B的非限制性组合显示如下。
Figure BPA00001673726802842
Figure BPA00001673726802851
Figure BPA00001673726802871
在一些实施方案中，A和B可包括适合于烯烃复分解反应的烯烃和/或炔烃官能团。在一些实施方案中，A和B包括适合于点击化学的部分(例如烯烃、炔烃、腈、叠氮化物)。反应性基团(A和B)的其它非限制性实例包括吡啶二硫醇、芳基叠氮化物、双吖丙啶(diazirine)、碳二亚胺和酰肼。
在一些实施方案中，L为疏水性的。疏水性连接基为本领域已知的。参见例如Bioconjugate Techniques，G.T.Hermanson(AcademicPress，San Diego，CA，1996)，其通过引用以其全部结合到本文中。本领域已知的合适的疏水性连接基团包括例如8-羟基辛酸和8-巯基辛酸。在缀合于组合物的肽之前，疏水性连接基团包含至少两个如本文描述并如以下显示的反应性基团(A和B)：
在一些实施方案中，疏水性连接基团包含马来酰亚胺基或碘乙酰基并且羧酸或活化的羧酸(例如NHS酯)作为反应性基团。在这些实施方案中，马来酰亚胺基或碘乙酰基可偶合于Q或Y的硫醇部分，并且羧酸或活化的羧酸可使用或不使用偶联剂偶合于Q或Y的胺。本领域技术人员已知的任何偶联剂可用于偶合羧酸与游离胺，例如DCC、DIC、HATU、HBTU、TBTU和本文描述的其它活化剂。在特别的实施方案中，亲水性连接基团包含2-100个亚甲基的脂肪链，其中A和B为羧基或其衍生物(例如琥珀酸)。在其它特别的实施方案中，L为碘乙酸。
在一些实施方案中，连接基团为亲水性的，例如聚亚烷基二醇。在缀合于组合物的肽之前，亲水性连接基团包含至少两个如本文描述并如以下显示的反应性基团(A和B)：
Figure BPA00001673726802891
在特别的实施方案中，连接基团为聚乙二醇(PEG)。PEG在某些实施方案中具有约100道尔顿-约10000道尔顿的分子量，例如约500道尔顿-约5000道尔顿。PEG在一些实施方案中具有约10000道尔顿-约40000道尔顿的分子量。
在一些实施方案中，亲水性连接基团包含马来酰亚胺基或碘乙酰基并且羧酸或活化的羧酸(例如NHS酯)作为反应性基团。在这些实施方案中，马来酰亚胺基或碘乙酰基可偶合于Q或Y的硫醇部分，并且羧酸或活化的羧酸可使用或不使用偶联剂偶合于Q或Y的胺。本领域技术人员已知的任何合适的偶联剂可用于偶合羧酸与胺，例如DCC，DIC、HATU、HBTU、TBTU和本文描述的其它活化剂。在一些实施方案中，连接基团为马来酰亚胺基-PEG(20kDa)-COOH、碘乙酰基-PEG(20kDa)-COOH、马来酰亚胺基-PEG(20kDa)-NHS或碘乙酰基-PEG(20kDa)-NHS。
在一些实施方案中，连接基团由氨基酸、二肽、三肽或多肽组成，其中氨基酸、二肽、三肽或多肽包含至少两个如本文中描述的活化基团。在一些实施方案中，连接基团(L)包含选自氨基、醚、硫醚、马来酰亚胺基、二硫化物、酰胺、酯、硫代酯、烯烃、环烯烃、炔烃、trizoyl、氨基甲酸酯、碳酸酯、组织蛋白酶B可裂解的和腙的部分。
在一些实施方案中，L包含1-约60、或1-30个原子或者更长、2-5个原子、2-10个原子、5-10个原子或10-20个原子长度的原子链。在一些实施方案中，链原子全部为碳原子。在一些实施方案中，连接基骨架中的链原子选自C、O、N和S。链原子和连接基可根据其预期的溶解性(亲水性)进行选择，以致提供更加可溶性的缀合物。在一些实施方案中，L提供受到酶或其它催化剂或在靶标组织或器官或细胞内发现的水解条件裂解的官能团。在一些实施方案中，L的长度足以减少位阻的可能性。
L的体内稳定性
在一些实施方案中，L在体内稳定。在一些实施方案中，当在血清中温育5分钟的时间时，L在血清中稳定至少5分钟，例如少于25％、20％、15％、10％或5％的缀合物裂解。在其它的实施方案中，L在血清中稳定至少10、或20、或25、或30、或60、或90、或120分钟、或者3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、18或24小时。在这些实施方案中，L不包含能够经历体内水解的官能团。在一些示例性实施方案中，L在血清中稳定至少约72小时。不能在体内显著水解的官能团的非限制性实例包括酰胺、醚和硫醚。例如，以下化合物不能在体内显著水解：
Figure BPA00001673726802901
在一些实施方案中，L可在体内水解。在这些实施方案中，L包含能够经历体内水解的官能团。能够经历体内水解的官能团的非限制性实例包括酯、酐和硫代酸酯。例如以下化合物能够经历体内水解，因为其包含酯基：
在一些示例性实施方案中，L为不稳定的并且于37℃下在血浆中3小时内经历显著水解，6小时内完全水解。在一些示例性实施方案中，L为稳定的。
在一些实施方案中，L为在体内亚稳态的。在这些实施例中，L包含任选地经过一段时间能够在体内化学或酶促裂解的官能团(例如酸不稳定的、还原不稳定的或酶不稳定的官能团)。在这些实施方案中，L可包含例如腙部分、二硫化物部分或组织蛋白酶可裂解的部分。当L为亚稳态的，并且不打算受到任何具体理论的束缚，Q-L-Y缀合物在细胞外环境中是稳定的，例如在血清中稳定以上描述的时间段，但是在细胞内环境或模拟细胞内环境的条件下不稳定，使得其在进入细胞时裂解。在一些实施方案中，当L为亚稳态的，L在血清中稳定至少约24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、42或48小时，例如至少约48、54、60、66或72小时，或约24-48、48-72、24-60、36-48、36-72或48-72小时。
Q - L - Y缀合物
Q和Y的缀合
Q通过L缀合于Y能够在Q中的任何位置进行，包括1-29位、C-末端延伸中的位置或C-末端氨基酸中的任何位置，条件是保留Q的活性(如果不增强的话)。非限制性的实例包括5、7、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、24、27、28、29、30、37、38、39、40、41、42或43位(根据SEQ ID NO：1601的氨基酸的编号)。在一些实施方案中，Y通过L在10、20、24、30、37、38、39、40、41、32或43位中的一个或多个位置缀合于Q。在特别的实施方案中，Y通过L在Q的10和/或40位缀合于Q。
活性
对胰高血糖素受体和核激素受体的活性
在某些实施方案中，Q-L-Y对胰高血糖素受体和核激素受体都表现出活性。在某些实施方案中，Q对胰高血糖素受体的活性(例如，EC50或相对活性或功效)与Y对核激素受体的活性(例如，EC50或相对活性或功效)的差距(更高或更低)在约100倍、约75倍、约60倍、约50倍、约40倍、约30倍、约20倍、约10倍或约5倍之内。在一些实施方案中，Q的胰高血糖素功效与Y的功效相差(更高或更低)约25、约20、约15、约10、或约5倍之内。
在某些实施方案中，Q对胰高血糖素受体的相对活性或EC50或功效除以相对活性或Y对核激素受体的EC50或功效之比小于或为约X，其中X选自100、75、60、50、40、30、20、15、10或5。在一些实施方案中，Q对胰高血糖素受体的EC50或功效或相对活性除以Y对核激素受体的EC50或功效或相对活性之比为5以下(例如约4、约3、约2、约1)。在一些实施方案中，Q的胰高血糖素功效与Y的核激素功效之比小于或为约Z，其中Z选自100、75、60、50、40、30、20、15、10和5。在某些实施方案中，Q的胰高血糖素功效相较于Y的核激素功效为5以下(例如约4、约3、约2、约1)。在某些实施方案中，Q对胰高血糖素受体的EC50为Y对核激素受体的EC50的2-10倍(例如，2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍)。
在某些实施方案中，Y对核激素受体的相对活性或功效或EC50除以Q对胰高血糖素受体的相对活性或功效或EC50的比率少于或为约V，其中V选自100、75、60、50、40、30、20、15、10或5。在某些实施方案中，Y对核激素受体的EC50或功效或相对活性除以Q对胰高血糖素受体的EC50或功效或相对活性之比少于5(例如约4、约3、约2、约1)。在某些实施方案中，Y的核激素功效相较于Q的胰高血糖素功效之比小于或为约W，其中W选自100、75、60、50、40、30、20、15、10和5。在某些实施方案中，Y的核激素功效相较于Q的胰高血糖素功效之比为少于5(例如约4、约3、约2、约1)。在某些实施方案中，Y对核激素受体的EC50为Q对胰高血糖素受体的EC50的大约2-约10倍(例如，2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍)。
在某些实施方案中，Y呈现至少0.1％(例如，约0.5％或更多，约1％或更多，约5％或更多，约10％或更多，或更多)的内源性配体对核激素受体的活性(核激素功效)和Q呈现至少0.1％(例如，约0.5％或更多，约1％或更多，约5％或更多，约10％或更多，或更多)的原生胰高血糖素对胰高血糖素受体的活性(胰高血糖素功效)。
对GLP-1受体和核激素受体的活性
在某些实施方案中，Q-L-Y对GLP-1受体和核激素受体都表现出活性。在某些实施方案中，Q对GLP-1受体的活性(例如，EC50或相对活性或功效)与Y对核激素受体的活性(例如，EC50或相对活性或功效)的相差(更高或更低)在约100倍、约75倍、约60倍、约50倍、约40倍、约30倍、约20倍、约10倍或约5倍之内。在某些实施方案中，Q的GLP-1功效与Y的功效的差距(更高或更低)在约25、约20、约15、约10-或约5倍之内。
在某些实施方案中，Q对GLP-1受体的相对活性或EC50或功效除以相对Y对核激素受体的活性或EC50或功效之比小于或为约X，其中X选自100、75、60、50、40、30、20、15、10或5。在某些实施方案中，Q对GLP-1受体的EC50或功效或相对活性除以Y对核激素受体的EC50或功效或相对活性之比为5以下(例如约4、约3、约2、约1)。在某些实施方案中，Q的GLP-1功效相较于Y的核激素功效之比小于或为约Z，其中Z选自100、75、60、50、40、30、20、15、10和5。在某些实施方案中，Q的GLP-1功效相较于Y的核激素功效之比少于5(例如约4、约3、约2、约1)。在某些实施方案中，Q对GLP-1受体的EC50为Y对核激素受体的EC50的2-10倍(例如，2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍)。
在某些实施方案中，Y对核激素受体的相对活性或功效或EC50除以Q对GLP-1受体的相对活性或功效或EC50之比小于或为约V，其中V选自100、75、60、50、40、30、20、15、10或5。在某些实施方案中，Y对核激素受体的EC50或功效或相对活性除以Q对GLP-1受体的EC50或功效或相对活性之比为少于5(例如约4、约3、约2、约1)。在某些实施方案中，Y的核激素功效相较于Q的GLP-1功效之比小于或为约W，其中W选自100、75、60、50、40、30、20、15、10和5。在某些实施方案中，Y的核激素功效相较于Q的GLP-1功效之比少于5(例如约4、约3、约2、约1)。在某些实施方案中，Y对核激素受体的EC50为Q对GLP-1受体的EC50的约2-约10倍(例如，2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍)。
在某些实施方案中，Y呈现至少0.1％(例如，约0.5％或更多，约1％或更多，约5％或更多，约10％或更多，或更多)的内源性配体对核激素受体活性(核激素功效)和Q呈现至少0.1％(例如，约0.5％或更多，约1％或更多，约5％或更多，约10％或更多，或更多)的原生GLP-1对GLP-1受体的活性(GLP-1功效)。
对GIP受体和核激素受体的活性
在某些实施方案中，Q-L-Y对GIP受体和核激素受体都表现出活性。在某些实施方案中，Q对GIP受体的活性(例如，EC50或相对活性或功效)与Y对核激素受体的活性(例如，EC50或相对活性或功效)的差距(更高或更低)在约100倍、约75倍、约60倍、约50倍、约40倍、约30倍、约20倍、约10倍或约5倍之内。在某些实施方案中，Q的GIP功效Y的功效的差距(更高或更低)在约25、约20、约15、约10-或约5倍之内。
在某些实施方案中，Q对GIP受体的相对活性或EC50或功效除以Y对核激素受体的相对活性或EC50或功效之比小于或为约X，其中X选自100、75、60、50、40、30、20、15、10或5。在某些实施方案中，Q对GIP受体的EC50或功效或相对活性除以Y对核激素受体的EC50或功效或相对活性之比为约1少于5(例如约4、约3、约2、约1)。在某些实施方案中，Q的GIP功效相较于Y的核激素功效之比为小于或为约Z，其中Z选自100，75，60，50，40，30，20，15，10，和5。在某些实施方案中，Q的GIP功效相较于Y的核激素功效之比为少于5(例如约4、约3、约2、约1)。在某些实施方案中，Q对GIP受体的EC50大于Y对核激素受体的EC502-10倍(例如，2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍)。
在某些实施方案中，Y对核激素受体的相对活性或功效或EC50除以Q对GIP受体的相对活性或功效或EC50之比小于或为约V，其中V选自100、75、60、50、40、30、20、15、10或5。在某些实施方案中，Y对核激素受体的EC50或功效或相对活性除以Q对GIP受体的EC50或功效或相对活性之比为少于5(例如，约4，约3，约2，约1)。在某些实施方案中，Y的核激素功效相较于Q的GIP功效之比为小于或为约W，其中W选自100、75、60、50、40、30、20、15、10和5。在某些实施方案中，Y的核激素功效相较于Q的GIP功效之比为少于5(例如，约4，约3，约2，约1)。在某些实施方案中，Y对核激素受体的EC50为Q对GIP受体的EC50的约2-约10倍(例如，2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍)。
在某些实施方案中，Y呈现至少0.1％(例如，约0.5％或更多，约1％或更多，约5％或更多，约10％或更多，或更多)的内源性配体对核激素受体的活性(核激素功效)和Q呈现至少0.1％(例如，约0.5％或更多，约1％或更多，约5％或更多，约10％或更多，或更多)的原生GIP对GIP受体的活性(GIP功效)。
Q-L - Y的前药
在本发明的一些方面，提供Q-L-Y的前药，其中前药包含通过酰胺键共价连接于Q的活性位点的二肽前药元件(A-B)，如在国际专利申请号PCT US09/68745(2009年12月18日递交)中公开的那样，其通过引用以其全部到结合本文中。随后在生理条件下除去二肽并在酶促活性不存在下恢复Q-L-Y缀合物的全部活性。
在一些实施方案中，提供具有通式结构A-B-Q-L-Y的Q-L-Y前药。在这些实施方案中，A为氨基酸或含氧酸和B为通过在B(在A-B中)的羧基与Q的胺之间形成酰胺键连接于Q的N-烷基化氨基酸。另外，在一些实施方案中，A、B、或A-B连接的Q的氨基酸为非编码的氨基酸，并且A-B自Q的化学裂解在生理条件下于PBS中在约1-约720小时内至少完成约90％。在另一个实施方案中，A-B自Q的化学裂解在生理条件下于PBS中在约1小时-约1周内至少完成约50％。
在一些实施方案中，二肽前药元件(A-B)包含具有以下通式结构的化合物：
Figure BPA00001673726802951
其中
R1、R2、R4和R8独立地选自H，C1-C18烷基、C2-C18链烯基、(C1-C18烷基)OH、(C1-C18烷基)SH、(C2-C3烷基)SCH3、(C1-C4烷基)CONH2、(C1-C4烷基)COOH、(C 1-C4烷基)NH2、(C 1-C4烷基)NHC(NH2+)NH2、(C0-C4烷基)(C3-C6环烷基)、(C0-C4烷基)(C2-C5杂环)、(C0-C4烷基)(C6-C10烷基)R7、(C1-C4烷基)(C3-C9杂芳基)和C1-C12烷基(W1)C1-C12烷基，其中W1为选自N、S和O的杂原子，或者R1和R2与它们连接的原子一起形成C3-C12环烷基；或者R4和R8与它们连接的原子一起形成C3-C6环烷基；
R3选自C1-C18烷基、(C1-C18烷基)OH、(C1-C18烷基)NH2、(C1-C18烷基)SH、(C0-C4烷基)(C3-C6)环烷基、(C0-C4烷基)(C2-C5杂环)、(C0-C4烷基)(C6-C10芳基)R7和(C1-C4烷基)(C3-C9杂芳基)或者R4和R3与它们连接的原子一起形成4、5或6元杂环；
R5为NHR6或OH；
R6为H、C1-C18烷基或者R6和R1与它们连接的原子一起形成4、5或6元杂环；和
R7选自氢、C1-C18烷基、C2-C18链烯基、(C0-C4烷基)CONH2、(C0-C4烷基)COOH、(C0-C4烷基)NH2、(C0-C4烷基)OH和卤素。
在一些实施方案中，二肽前药元件连接于Q的氨基末端。在另一个实施方案中，二肽前药连接于Q的中间氨基酸，如在国际专利申请第PCT US09/68745号中描述的那样。
Q-L-Y的示例性实施方案
在本发明的某些实施方案中，可用下式表示胰高血糖素超家族肽缀合物：
Q-L-Y
其中Q是胰高血糖素超家族肽，Y是NHR配体和L是连接基团或键。
在特定的方面，Q包括基于原生人GLP-1(SEQ ID NO.：1603)的氨基酸序列的氨基酸序列。在某些方面，Q包括修饰的氨基酸序列SEQ ID NO：1603，其相对于原生人GLP-1序列(SEQ ID NO：1603)，包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15，和在某些情况下，16或更多(例如，17、18、19、20、21、22、23、24、25等)个氨基酸修饰和最多1、最多2、最多3、最多4、最多5、最多6、最多7、最多8、最多9、最多10个氨基酸修饰(例如，酰化、烷基化、聚乙二醇化、在C-末端处截短、取代)。例如，Q可为GLP-1(Aib2E16Cex K40)(SEQ ID NO.：1647)，GLP-1(Aib2A22Cex K40)(SEQ ID NO.：1648)，dGLP-1(A1Aib2A22Cex K40)(SEQ ID NO.：1649)，GLP-1(Aib2E16C24(PEG-40kDa)Cex K40)(SEQ ID NO.：1650)。
在特定的方面，Y是类固醇或其衍生物，并作用于***受体、雄激素受体、糖皮质激素受体或RAR相关孤儿受体。在某些实施方案中，Y包括允许或促进对***受体、雄激素受体、糖皮质激素受体或RAR相关孤儿受体的激动剂活性的结构，而在其它实施方案中，Y是***受体、雄激素受体、糖皮质激素受体或RAR相关孤儿受体的拮抗剂。例如，Y可为***、雌酮或胆固醇。
在特定情况下，L在体内是稳定的。在某些实施方案中，L包含，例如，酰胺、醚、氨基甲酸酯或硫醚。在供选择的方面，L是可体内水解的。在某些实施方案中，L包括酯、酐或硫代酸酯。在其它方面，L是体内亚稳态的。在某些方面，L是酸不稳定的(例如，包括腙部分)、易还原的(例如，包括二硫化物部分)或酶不稳定的(例如，包括组织蛋白酶B-可裂解的部分)。
经稳定的键缀合至***的基于GLP-1的胰高血糖素超家族肽的非限制性实例表示于下文(SEQ ID NOs.：1651-1654，1667)。
Figure BPA00001673726802981
Figure BPA00001673726802991
经稳定的键缀合至胆固醇的基于GLP-1的胰高血糖素超家族肽的非限制性实例表示于下文(SEQ ID NOs.：1660-1661)。
Figure BPA00001673726803001
经可水解键缀合至***或雌酮的基于GLP-1的胰高血糖素超家族肽的非限制性实例表示如下(SEQ ID NOs.：1655-1659，1666)。
Figure BPA00001673726803011
Figure BPA00001673726803031
经酸不稳定的键缀合至***的基于GLP-1的胰高血糖素超家族肽的非限制性实例表示于下文(SEQ ID NO.：1662)。
Figure BPA00001673726803041
经易还原的键缀合至***的基于GLP-1的胰高血糖素超家族肽的非限制性实例表示于下文(SEQ ID NOs.：1663-1664)。
经酶不稳定的键缀合至***的基于GLP-1的胰高血糖素超家族肽的非限制性实例表示于下文(SEQ ID NOs.：1665，1668)。
Figure BPA00001673726803061
在某些实施方案中，任何SEQ ID NOs.：1-760，801-919、1001-1275、1301-1371、1401-1518、1601-1646可取代在以上示例性实施方案中的SEQ ID NOs.：1647-1650。
本文资料证实，包含本发明的胰高血糖素超家族肽(Q)和***(Y)的缀合物具有协同药理学。这些缀合物的Q部分可将缀合物的***部分导向想要起作用的靶标而远离典型的妇科组织，以产生改善的血糖控制和能量平衡，其中治疗指数大大提高。
胰腺β细胞功能障碍的特征在于胰岛素生物合成和分泌丧失以及由于β细胞凋亡引起的功能性质量下降，这源于慢性葡萄糖&脂质氧化(糖脂毒性(glucolipotoxicity))以及补偿性机能亢进(ER应激)。因为2型糖尿病继发于β细胞功能障碍，所以旨在保护生成胰岛素的β细胞免于凋亡或恢复β细胞功能质量的策略代表在2型糖尿病治疗中的治疗性干预的主要机会。
***对啮齿动物和人β细胞以及体内的其它靶组织具有很强的抗细胞凋亡作用。***在肝脏中抑制脂肪生成和恢复胰岛素敏感性的胰腺外功能可间接改善β细胞功能。其也作用于丘脑下部以减少食物摄取和增加能量消耗。然而，这些***作用可能有害于妇科靶组织，因为已经表明激素替代治疗增加乳腺癌的发病率。不打算受任何特定理论的束缚，选择地将***作用导向β细胞、肝脏和/或丘脑下部可能是有益的。
***的临床应用已经受限，因为担心其致癌可能性和妇科作用。为提高***的治疗指数，基于肠降血糖素的本发明缀合物允许***优先靶向想要的组织，而使其对***和子宫内膜组织的作用最小。本文实施例中的资料表明，通过对胰腺β细胞的促胰岛素活性和合成代谢活性与对丘脑下部的厌食作用的结合，胰高血糖素超家族肽和***的缀合物对血糖控制具有协同的有益作用(例如如由下降的葡萄糖水平所测定)和能量动态平衡(例如如经减少的体重和/或脂肪质量所测定)。
为研究缀合物(例如，GLP-1部分和***部分)的各个别组分调节血糖和体重能量的能力，合成一组肽-***缀合物，其以少于0.1％至超过100％体外活性的范围和能在血浆中差异性(differential)***释放的连接基团化学(稳定的、不稳定的和亚稳态的)而具有完全的GLP-1激动作用。***的特异性释放经测定在稳定的化学形式至在数小时内完全释放***的其它形式的宽范围内变化。
例如，在膳食介导的肥胖小鼠中，具有稳定连接的***的完全活化的GLP-1激动剂一直被证实在减少血糖和体重方面较对比的GLP-1对照物更加有效。如通过对缺乏子宫营养活性的切除卵巢的小鼠所评估的，证实稳定的***-肽缀合物缺乏典型的***的活性，而不稳定的***-肽缀合物呈现对子宫的营养活性。剔除GLP-1激动作用和/或使***在血浆中不稳定的化学衍生物比稳定的GLP-1/***缀合物表现出更少的功效，表明GLP-1和靶向***的结合存在可使葡萄糖和体重较多地下降。
所制备“亚”-稳态的肽-***缀合物在血浆中稳定，但能在细胞内化时释放***。这些具有亚稳态的胰高血糖素超家族肽/***缀合物比带不稳定键的缀合物能降低葡萄糖水平和体重至更大的程度，同时没有有害的子宫营养活性。
当相较于适当的对照物时，在减轻肥胖的非糖尿病小鼠的体重、食物摄取和脂肪质量方面，稳定或亚稳定地连着***的胰高血糖素超家族肽总是呈现出增强的功效。在***为药理学不稳定的情况下，在缀合物不存在这种增强的功效，且在胰高血糖素超家族肽被有意失活的情况下，在缀合物中未能观察到这种增强的功效。***稳定和亚稳地连接至胰高血糖素超家族肽相对于不稳定缀合物差异性地缺乏***活性，且与不稳定的缀合物相比并不显示子宫生长。总之，这些发现表明，衍生自本发明的稳定和亚稳定地连接的胰高血糖素超家族肽/***缀合物对代谢功能不全的肥胖小鼠的增强的功效，而无限制***的医学应用的典型的***作用的证据。
在示例性实施方案中，缀合物可用于治疗本文描述的任何疾病，包括但不限于高血糖医学病症、肥胖症、代谢综合征和NAFLD。
药用组合物
盐
在一些实施方案中，本文描述的Q-L-Y缀合物以盐例如药学上可接受的盐的形式存在。本文使用的术语“药学上可接受的盐”指的是保留母体化合物的生物活性，并且它们不是生物活性的或者为不合需要的的化合物的盐。这样的盐可在缀合物的最后分离和纯化期间就地制备，或者通过使游离碱官能团与合适的酸反应单独地制备。本文公开的许多化合物能够通过存在氨基和/或羧基或与其类似的基团形成酸和/或碱盐。
自无机和有机酸可制备药学上可接受的酸加成盐。代表性的酸加成盐包括但不限于乙酸盐、己二酸盐、海藻酸盐、柠檬酸盐、天冬氨酸盐、苯甲酸盐、苯磺酸盐、硫酸氢盐、丁酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、二葡萄糖酸盐(digluconate)、甘油磷酸盐、半硫酸盐、庚酸盐、己酸盐、富马酸盐、盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、2-羟基乙磺酸盐(异硫代硫酸盐(isothionate))、乳酸盐、马来酸盐、甲磺酸盐、烟酸盐、2-萘磺酸盐、草酸盐、棕榈酸盐、果胶酸盐、过硫酸盐、3-苯基丙酸盐、苦味酸盐、三甲基乙酸盐、丙酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、硫氰酸盐、磷酸盐、谷氨酸盐、碳酸氢盐、对-甲苯磺酸盐和十一烷酸盐。衍生于无机酸包括盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等的盐。衍生于有机酸包括乙酸、丙酸、羟基乙酸、丙酮酸、草酸、苹果酸、丙二酸、琥珀酸、马来酸、富马酸、酒石酸、柠檬酸、苯甲酸、肉桂酸、扁桃酸、甲磺酸、乙磺酸、对-甲苯磺酸、水杨酸等的盐。可用于形成药学上可接受的酸加成盐的酸的实例包括例如无机酸，例如盐酸、氢溴酸、硫酸和磷酸，和有机酸，例如草酸、马来酸、琥珀酸和柠檬酸。
碱加成盐也可在水杨酸来源的最后分离和纯化期间，或者通过使含有羧酸的部分与合适的碱例如药学上可接受的金属阳离子的氢氧化物、碳酸盐或碳酸氢盐反应、或者与氨或有机伯、仲或叔胺反应就地制备。药学上可接受的盐包括但不限于基于碱金属或碱土金属的阳离子例如锂、钠、钾、钙、镁和铝盐等，和包括铵、四甲基铵、四乙基铵、甲基铵、二甲基铵、三甲基铵、三乙基铵、二乙基铵和乙基铵等的非毒性季铵和胺阳离子。用于形成碱加成盐的其它代表性的有机胺包括例如乙二胺、乙醇胺、二乙醇胺、哌啶、哌嗪等。衍生于有机碱的盐包括但不限于伯、仲和叔胺的盐。
另外，碱性含氮基团可用本公开的缀合物季铵化为低级烷基卤化物，例如甲基、乙基、丙基和丁基的氯化物、溴化物和碘化物，长链卤化物例如癸基、十二烷基、十四烷基和十八烷基的氯化物、溴化物和碘化物，芳烷基卤化物如苄基和苯乙基溴化物等。从而得到水或油溶性或可分散的产物。
制剂
根据一些实施方案提供药用组合物，其中组合物包含本公开的Q-L-Y缀合物或其药学上可接受的盐和药学上可接受的载体。药用组合物可包含任何药学上可接受的成分，包括例如酸化剂、添加剂、吸附剂、气溶胶喷射剂、空气驱除剂、碱化剂、抗结剂、抗凝剂、抗菌防腐剂、抗氧化剂、防腐剂、基质、粘合剂、缓冲剂、螯合剂、包衣剂、着色剂、干燥剂、洗涤剂、稀释剂、消毒剂、崩解剂、分散剂、溶解增强剂、染料、润滑剂、乳化剂、乳化稳定剂、填充剂、成膜剂、增味剂、矫味剂、流动增强剂、胶凝剂、造粒剂、湿润剂、润滑剂、粘膜粘附剂、膏剂基质、膏剂、油质媒介物、有机基质、锭剂基质、颜料、增塑剂、抛光剂、防腐剂、螯合剂、皮肤渗透剂、助溶剂、溶剂、稳定剂、栓剂基质、表面活性剂、表面活性剂、助悬剂、甜味剂、治疗药物、增稠剂、等渗调节剂(tonicity agents)、毒性剂、粘度增强剂、吸水剂、水混溶性助溶剂、软水剂或润湿剂。
在一些实施方案中，药用组合物包含以下组分的任何一种或组合：***胶、乙酰磺胺酸钾(acesulfame potassium)、乙酰柠檬酸三丁酯、乙酰柠檬酸三乙酯、琼脂、白蛋白、乙醇、无水乙醇、变性酒精、稀乙醇、紫胶桐酸、海藻酸、脂肪族聚酯、氧化铝、氢氧化铝、硬脂酸铝、支链淀粉、α-直链淀粉、抗坏血酸、抗坏血酸棕榈酸酯、阿斯巴甜、抑菌性注射用水、膨润土、膨润土岩浆、苯扎氯铵、苄索氯铵、苯甲酸、苄醇、苯甲酸苄酯、溴硝丙二醇、丁羟茴醚、丁羟甲苯、对羟基苯甲酸丁酯、对羟基苯甲酸丁酯钠盐、海藻酸钙、抗坏血酸钙、碳酸钙、环己基氨基磺酸钙、无水磷酸氢钙、磷酸氢钙脱水物、磷酸三钙、丙酸钙、硅酸钙、山梨酸钙、硬脂酸钙、硫酸钙、半水硫酸钙、菜籽油、卡波姆、二氧化碳、羧甲基纤维素钙、羧甲基纤维素钠、β-胡萝卜素、角叉菜胶、蓖麻油、氢化蓖麻油、阳离子乳化蜡、醋酸纤维素、邻苯二甲酸乙酸纤维素、乙基纤维素、微晶纤维素、粉状纤维素、硅化微晶纤维素、羧甲基纤维素钠、十八醇十六醇混合物、溴化十六烷基三甲铵、鲸蜡醇、氯己定、氯丁醇、氯甲酚、胆固醇、乙酸氯己定、葡萄糖酸氯己定、盐酸氯己定、二氟氯乙烷(chlorodifluoroethane，HCFC)、二氟氯甲烷、氯氟烃(CFC)、2-(3-氯苯氧基)乙醇(chlorophenoxyethanol)、氯二甲苯酚、玉米糖浆干粉、无水柠檬酸、柠檬酸一水合物、可可脂、着色剂、玉米油、棉籽油、甲酚、间-甲酚、邻-甲酚、对-甲酚、交联羧甲基纤维素钠、交聚维酮(crospovidone)、环拉酸、环糊精、葡萄糖结合剂、糊精、葡聚糖、无水葡聚糖、重氮咪唑烷基脲(diazolidinyl urea)、邻苯二甲酸二丁酯、癸二酸二丁酯、二乙醇胺、邻苯二甲酸二乙酯、二氟乙烷(HFC)、二甲基-β-环糊精、环糊精型化合物例如Captisol
Figure BPA00001673726803111
二甲醚、邻苯二甲酸二甲酯、乙二胺四乙酸二钾、乙二胺四乙酸二钠、磷酸氢二钠、多库酯钙(docusate calcium)、多库酯钾、多库酯钠、没食子酸十二酯、十二烷基三甲基溴化铵、乙二胺四乙酸二钠钙、edtic酸、葡乙胺、乙醇、乙基纤维素、没食子酸乙酯、月桂酸乙酯、乙基麦芽酚、油酸乙酯、尼泊金乙酯、尼泊金乙酯钾、尼泊金乙酯钠、乙基香草醛、果糖、果糖液、碾碎果糖、无热原果糖、粉状果糖、富马酸、明胶、葡萄糖、液体葡萄糖、饱和植物脂肪酸的甘油酯混合物、甘油、山嵛酸甘油酯、单油酸甘油酯、单硬脂酸甘油酯、自乳化单硬脂酸甘油酯、棕榈酸硬脂酸甘油酯、甘氨酸、二醇类、四氢呋喃聚乙二醇醚(glycofurol)、瓜尔胶、七氟丙烷(HFC)、十六烷基三甲基溴化铵、高果糖糖浆、人血清白蛋白、烃类(HC)、稀盐酸、氢化植物油、II型、羟乙基纤维素、2-羟乙基-β-环糊精、羟丙基甲基纤维素、低取代的羟丙基纤维素、2-羟丙基-β-环糊精、羟丙基甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯、咪唑烷基脲(imidurea)、靛蓝胭脂红、离子交换剂、氧化铁、异丙醇、肉豆蔻酸异丙酯、棕榈酸异丙酯、等渗盐水、高岭土、乳酸、乳糖醇、乳糖、羊毛脂、羊毛脂醇、无水羊毛脂、卵磷脂、硅酸镁铝、碳酸镁、正常碳酸镁、无水碳酸镁、碱式碳酸镁(magnesium carbonatehydroxide)、氢氧化镁、十二烷基硫酸镁、氧化镁、硅酸镁、硬脂酸镁、三硅酸镁、无水三硅酸镁、苹果酸、麦芽、麦芽糖醇、麦芽糖醇溶液、麦芽糊精、麦芽醇(maltol)、麦芽糖、甘露醇、中链甘油三酯、葡甲胺、薄荷醇、甲基纤维素、甲基丙烯酸甲酯、油酸甲酯、尼泊金甲酯、尼泊金甲酯钾、尼泊金甲酯钠、微晶纤维素和羧甲基纤维素钠、矿物油、轻质矿物油、矿物油和羊毛脂醇、油、橄榄油、单乙醇胺、蒙脱石、没食子酸辛酯、油酸、棕榈酸、石蜡、花生油、矿脂、矿脂和羊毛脂醇、药用釉、苯酚、液体酚、苯氧乙醇、苯氧丙醇、苯乙醇、醋酸苯汞、硼酸苯汞、硝酸苯汞、波拉克林(polacrilin)、波拉克林钾、泊洛沙姆、聚葡萄糖、聚乙二醇、聚环氧乙烷、聚丙烯酸酯、聚乙烯聚氧丙烯嵌段聚合物、聚甲基丙烯酸酯、聚氧乙烯烷基醚、聚氧乙烯蓖麻油衍生物、聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯、聚氧乙烯硬脂酸酯、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、海藻酸钾、苯甲酸钾、碳酸氢钾、亚硫酸氢钾、氯化钾、柠檬酸钾、无水柠檬酸钾、磷酸氢钾、焦亚硫酸钾、磷酸二氢钾、丙酸钾、山梨酸钾、聚烯吡酮、丙醇、丙酸、碳酸丙烯酯、丙二醇、海藻酸丙二醇酯、没食子酸丙酯、尼泊金丙酯、尼泊金丙酯钾、尼泊金丙酯钠、硫酸鱼精蛋白、菜籽油、林格氏溶液、糖精、糖精铵、糖精钙、糖精钠、红花油、皂石、血清蛋白、芝麻油、硅胶、胶态二氧化硅、海藻酸钠、抗坏血酸钠、苯甲酸钠、碳酸氢钠、亚硫酸氢钠、氯化钠、无水柠檬酸钠、脱水柠檬酸钠、氯化钠、环己基氨基磺酸钠、乙二胺四乙酸钠、十二烷基硫酸钠、月桂基硫酸钠、焦亚硫酸钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、磷酸三钠、无水丙酸钠、丙酸钠、山梨酸钠、羧基乙酸淀粉钠、硬脂酰富马酸钠、亚硫酸钠、山梨酸、失水山梨醇酯(失水山梨醇脂肪酸酯)、山梨醇、70％山梨醇溶液、大豆油、鲸蜡、淀粉、玉米淀粉、马铃薯淀粉、预胶凝淀粉、灭菌玉米淀粉、硬脂酸、纯化硬脂酸、硬脂醇、蔗糖、糖、可压缩糖、糖粉(confectioner’s sugar)、糖球、转化糖、蔗糖-转化糖聚合物(Sugartab)、晚霞黄FCF、合成石蜡、滑石粉、酒石酸、柠檬黄、四氟乙烷(HFC)、可可豆油、硫柳汞、二氧化钛、α-生育酚、醋酸生育酚、α-生育酚酸琥珀酸酯、β-生育酚、δ-生育酚、γ-生育酚、黄蓍胶、三乙酸甘油酯、柠檬酸三丁酯、三乙醇胺、柠檬酸三乙酯、三甲基-β-环糊精、十四烷基三甲基溴化铵、tris缓冲液、乙二胺四乙酸三钠、香草醛、I型氢化植物油、水、软水、硬水、不含二氧化碳的水、无热原水、注射用水、无菌吸入用水、无菌注射用水、无菌灌注用水、蜡、阴离子乳化蜡、巴西棕榈蜡、阳离子乳化蜡、十六烷基酯蜡、微晶蜡、非离子型乳化蜡、栓剂蜡、白蜡、黄蜡、白矿脂、羊毛脂、黄原胶、木糖醇、玉米蛋白、丙酸锌、锌盐、硬脂酸锌或者在药用赋形剂手册(Handbook of PharmaceuticalExcipients)，第3版，A.H.Kibbe(Pharmaceutical Press，London，UK，2000)中的任何赋形剂，其通过引用以其全部结合到本文中。雷明顿氏药物科学(Remington’s Pharmaceutical Sciences)，第16版E.W.Martin(Mack Publishing Co.，Easton，Pa.，1980)，其通过引用以其全部结合到本文中，公开了用于配制药学上可接受的组合物的各种组分和用于其制备的已知技术。除非任何常规药物与药用组合物不兼容，否则考虑其在药用组合物中的用途。补充活性成分也可掺入到组合物中。[00845]在一些实施方案中，上述组分可以任何浓度存在于药用组合物中，例如至少A，其中A为0.0001％w/v、0.001％w/v、0.01％w/v、0.1％w/v、1％w/v、2％w/v、5％w/v、10％w/v、20％w/v、30％w/v、40％w/v、50％w/v、60％w/v、70％w/v、80％w/v、或90％w/v。在一些实施方案中，上述组分可以任何浓度存在于药用组合物中，例如至多B，其中B为90％w/v、80％w/v、70％w/v、60％w/v、50％w/v、40％w/v、30％w/v、20％w/v、10％w/v、5％w/v、2％w/v、1％w/v、0.1％w/v、0.001％w/v或0.0001％。在其它的实施方案中，上述组分可以任何浓度范围存在于药用组合物中，例如自约A-约B。在一些实施方案中，A为0.0001％和B为90％。
可配制药用组合物以获得生理学上相容的pH。在一些实施方案中，依制剂和给药途径而定，药用组合物的pH可为至少5、至少5.5、至少6、至少6.5、至少7、至少7.5、至少8、至少8.5、至少9、至少9.5、至少10或至少10.5最高可达并且包括pH 11。在某些实施方案中，药用组合物可包含缓冲剂以获得生理学相容的pH。缓冲剂可包括能够在要求的pH下缓冲的任何化合物，例如磷酸盐缓冲液(例如PBS)、三乙醇胺、Tris、N，N-二羟乙基甘氨酸、TAPS、N-三(羟甲基)甲基甘氨酸(tricine)、HEPES、TES、MOPS、PIPES、二甲砷酸盐、MES等。在某些实施方案中，缓冲剂的强度为至少0.5mM、至少1mM、至少5mM、至少10mM、至少20mM、至少30mM、至少40mM、至少50mM、至少60mM、至少70mM、至少80mM、至少90mM、至少100mM、至少120mM、至少150mM或至少200mM。在一些实施方案中，缓冲剂的强度不多于300mM(例如至多200mM、至多100mM、至多90mM、至多80mM、至多70mM、至多60mM、至多50mM、至多40mM、至多30mM、至多20mM、至多10mM、至多5mM、至多1mM)。
给药途径
就给药途径的以下讨论只为说明示例性实施方案而提供而不应被解释为以任何方式限制其范围。
适合于口服给药的制剂可由以下组成：(a)液体溶液，例如溶解于稀释剂例如水、盐水或橙汁中的有效量的本公开缀合物；(b)胶囊剂、香囊剂、片剂、锭剂和糖锭剂，每一个含有预定量的作为固体或颗粒的活性成分；(c)粉剂；(d)在合适液体中的混悬剂；和(e)合适的乳剂。液体剂型可包括稀释剂例如水和醇类，例如乙醇、苄醇和聚乙烯醇，其或者添加或者不添加药学上可接受的表面活性剂。胶囊剂形式可属于含有以下的常规硬或软壳明胶型，例如，表面活性剂、润滑剂和惰性填充剂，例如乳糖、蔗糖、磷酸钙、和玉米淀粉。片剂形式可包括以下成分中的一种或多种：乳糖、蔗糖、甘露醇、玉米淀粉、马铃薯淀粉、海藻酸、微晶纤维素、***胶、明胶、瓜尔胶、胶态二氧化硅、交联羧甲基纤维素钠、滑石粉、硬脂酸镁、硬脂酸钙、硬脂酸锌、硬脂酸和其它赋形剂、着色剂、稀释剂、缓冲剂、崩解剂、润湿剂、防腐剂、矫味剂和其它药学上可相容的赋形剂。锭剂形式可包含在矫味剂，通常为在蔗糖和***胶或黄蓍胶中的本公开的缀合物，以及包含在惰性基质例如明胶和甘油、或蔗糖和***胶中的本公开缀合物的锭剂，除此之外还含有本领域已知的这样的赋形剂，乳剂、胶凝剂等。
本公开的缀合物，单独或与其它合适的组分组合，可通过肺部给予传递，并可制成经吸入给予的气雾剂型。这些气雾剂型可置于压力可接受的抛射剂例如二氯二氟甲烷、丙烷、氮气等中。它们也可配制成用于非加压制剂的药物，例如在喷雾器或雾化剂中。这种喷雾剂型也可用于喷雾粘膜。在一些实施方案中，缀合物被配制成粉末混合物或者配制成微粒或纳米粒。合适的肺部制剂为本领域已知的。参见例如Qian等，Int J Pharm 366：218-220(2009)；Adjei and Garren，Pharmaceutical Research，7(6)：565-569(1990)；Kawashima等，JControlled Release 62(1-2)：279-287(1999)；Liu等，Pharm Res 10(2)：228-232(1993)；国际专利申请公布号WO 2007/133747和WO2007/141411。
适合于非肠道给予的剂型包括水和非水等渗灭菌注射溶液剂，其可含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和使得剂型与打算的接受者的血液等渗的溶质；及水和非水灭菌混悬剂，其可包括助悬剂、增溶剂、增稠剂、稳定剂和防腐剂。术语“非肠道”意指不通过消化道而是通过一些其它途径例如皮下、肌内、脊柱内或静脉内。本公开的缀合物可与以药用载体形式存在的生理学上可接受的稀释剂一起给予，药用载体为例如灭菌液体或液体的混合物，包括水、盐水、葡萄糖水溶液和相关的糖溶液、醇例如乙醇或十六烷基醇、二醇例如丙二醇或聚乙二醇、二甲基亚砜、甘油、缩酮例如2，2-二甲基-153-二氧戊环-4-甲醇、醚、聚(乙二醇)400、油、脂肪酸、脂肪酸酯或甘油酯、或者乙酰化脂肪酸甘油酯，伴随加入或不加入药学上可接受的表面活性剂例如肥皂或洗涤剂、助悬剂例如果胶、卡波姆、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素或羧甲基纤维素、或乳化剂和其它药用辅剂。
可用于非肠道制剂的油包括石油、动物、植物或合成油类。油的具体实例包括花生油、大豆油、芝麻油、棉籽油、玉米油、橄榄油、矿脂和矿物油。用于非肠道制剂的合适的脂肪酸包括油酸、硬脂酸和异硬脂酸。油酸乙酯和肉豆蔻酸异丙酯为合适的脂肪酸酯的实例。
用于非肠道剂型的合适的肥皂包括脂肪碱金属、铵和三乙醇胺盐，和合适的洗涤剂包括(a)阳离子洗涤剂例如二甲基二烷基卤化铵和烷基吡啶鎓卤化物，(b)阴离子洗涤剂例如烷基、芳基和烯烃磺酸盐；烷基、烯烃、醚和单甘油酯硫酸盐；以及磺基琥珀酸酯，(c)非离子型洗涤剂例如脂肪胺氧化物、脂肪酸烷醇酰胺和聚氧乙烯聚丙烯共聚物，(d)两性洗涤剂例如烷基-β-氨基丙酸盐(酯)和2-烷基-咪唑啉季铵盐，和(e)其混合物。
非肠道制剂通常含有按重量计在溶液中的约0.5％-约25％的本公开的Q-L-Y缀合物。可使用防腐剂和缓冲剂。为了在注射部位最小化或消除刺激，这种组合物可含有一种或多种具有约12-约17的亲水-亲脂平衡值(HLB)的非离子型表面活性剂。表面活性剂在这样的剂型中的量按重量计通常在约5％-约15％的范围内。合适的表面活性剂包括聚乙二醇失水山梨醇脂肪酸酯，例如失水山梨醇单油酸酯和环氧乙烷与通过环氧丙烷与丙二醇缩合形成的疏水性基质的高分子量加合物。非肠道制剂可以单位剂量或多剂量密封容器例如安瓿和小瓶的形式存在，并且可在冷冻干燥(冻干)条件下贮存，仅需在临用前加入灭菌液体赋形剂例如注射用水。可自先前描述的种类的灭菌粉末、颗粒和片剂制备临时注射用溶液剂和混悬液。
注射剂与本发明相一致。对于注射用组合物的有效药用载体的需要为本领域普通技术人员所熟知(参见例如Pharmaceutics andPharmacy Practice，J.B.Lippincott Company，Philadelphia，PA，Bankerand Chalmers，编著，第238-250页(1982)，和ASHP Handbook onInjectable Drugs，Toissel，第4版，第622-630页(1986))。
另外，通过使各种基质例如乳化基质或水溶性基质混合，本公开的缀合物可制成用于直肠给予的栓剂。适合于***给予的制剂可作为***栓、棉塞、霜剂、凝胶剂、糊剂、泡沫剂或喷雾剂型呈现，这些剂型除活性成分以外还含有如本领域技术人员已知为合适的载体。
本领域技术人员应理解，除上述药用组合物之外，可将本公开的缀合物配制为包合复合物(inclusion complexes)，诸如环糊精包合复合物或脂质体。
剂量
认为本公开的Q-L-Y缀合物可用于治疗疾病或医学病症的方法，其中胰高血糖素受体激动作用、GLP-1受体激动作用、GIP受体激动作用、胰高血糖素受体/GLP-1受体共激动作用，胰高血糖素受体/GIP受体共激动作用，GLP-1受体/GIP受体共激动作用或胰高血糖素受体/GLP-1受体/GIP受体三重激动作用起作用。出于本公开的目的，所给予的本公开缀合物的量或剂量应足以经合理时间范围内实现对受试者或动物例如，治疗或预防响应。例如，本公开缀合物的剂量应在在给药时间后约1-4分钟，1-4小时或1-4周或更长时间段内，例如，5-20周或20周以上足以如本文描述的刺激cAMP从细胞分泌或足以降低哺乳动物的血糖水平、脂肪水平、食物摄取水平或体重。在某些实施方案中，时间段甚至可以更长。剂量将取决于具体本公开缀合物的功效和要治疗的动物(例如，人)的病症以及要治疗的动物(例如，人)的体重。
确定给药剂量的许多试验为本领域所知。出于本文的目的，包括在分别给予不同剂量的缀合物的一组哺乳动物当中比较一经给予哺乳动物给定剂量的本公开缀合物被降低的血糖水平的程度的试验可用来确定要给予哺乳动物的开始剂量。通过本领域已知的方法，包括，比如，本文描述的在实施例章节中的方法，可检测一经给予某一剂量，血糖水平被降低的程度。
也可通过可能伴随具体本公开缀合物的给予的任何副作用的存在、性质和程度，确定本公开缀合物的剂量。通常，主治医生会考虑各种因素，诸如年龄、体重、一般健康情况、饮食、性别、要给予的本公开缀合物、给药途径和要治疗的病症的严重性，决定用来治疗各个个体患者的本公开缀合物的剂量。借助实施例而不打算限制本发明，本公开缀合物的剂量可为约0.0001-约1g/kg要治疗的受试者体重/日，约0.0001-约0.001g/kg体重/日或约0.01mg-约1g/kg体重/日。
在某些实施方案中，药用组合物包括适于给予患者的纯度的任何本文描述的缀合物。在某些实施方案中，缀合物的纯度为至少约90％，约91％，约92％，约93％，约94％，约95％，约96％，约97％，约98％或约99％和药学上可接受的稀释剂、载体或赋形剂。在某些情况下药用组合物包括浓度为至少A的本公开缀合物，其中A为约0.001mg/ml，约0.01mg/ml，约0.1mg/ml，约0.5mg/ml，约1mg/ml，约2mg/ml，约3mg/ml，约4mg/ml，约5mg/ml，约6mg/ml，约7mg/ml，约8mg/ml，约9mg/ml，约10mg/ml，约11mg/ml，约12mg/ml，约13mg/ml，约14mg/ml，约15mg/ml，约16mg/ml，约17mg/ml，约18mg/ml，约19mg/ml，约20mg/ml，约21mg/ml，约22mg/ml，约23mg/ml，约24mg/ml，约25mg/ml或以上。在某些实施方案中，药用组合物包括浓度为最多B的缀合物，其中B为约30mg/ml，约25mg/ml，约24mg/ml，约23mg/ml，约22mg/ml，约21mg/ml，约20mg/ml，约19mg/ml，约18mg/ml，约17mg/ml，约16mg/ml，约15mg/ml，约14mg/ml，约13mg/ml，约12mg/ml，约11mg/ml，约10mg/ml，约9mg/ml，约8mg/ml，约7mg/ml，约6mg/ml，约5mg/ml，约4mg/ml，约3mg/ml，约2mg/ml，约1mg/ml或约0.1mg/ml。在某些实施方案中，组合物可含有A-B mg/ml，例如，约0.001-约30.0mg/ml浓度范围下的缀合物。
靶向形式
本领域普通技术人员易于理解，可以多种任何方式修饰本公开Q-L-Y缀合物，以致本公开缀合物的治疗或预防功效通过修饰而增加。比如，本公开缀合物可直接或间接地通过连接基团进一步结合至靶向部分。将化合物，例如，本文描述的胰高血糖素缀合物结合至靶向部分的实践为本领域已知的。参见，比如，Wadhwa等，J DrugTargeting，3，111-127(1995)和美国专利号5,087,616。如本文用的术语″靶向部分″指特异性识别并结合至细胞表面受体，以致靶向部分将本公开缀合物的递送导向在表达受体(胰高血糖素受体、GLP-1受体)的表面上的细胞群体的任何分子或药剂。靶向部分包括，但不限于，抗体或其片段、肽、激素、生长因子、细胞活素，和其它任何天然或非天然，其结合至细胞表面受体(例如，上皮生长因子受体(EGFR)，T-细胞受体(TCR)，B-细胞受体(BCR)，CD28，血小板衍生生长因子受体(PDGF)，烟碱型乙酰胆碱受体(nAChR)等)。如本文用的″连接基团″是使两个分开的实例相互结合的键、分子或分子基团。连接基团可提供两个实体的最佳间隔或可进一步提供允许两个实体相互分开的不稳定键合。不稳定键合包括光可裂解基团、酸不稳定部分、碱不稳定部分、可水解基团和酶可裂解基团。在某些实施方案中，术语″连接基团″指将本公开缀合物桥连至靶向部分任何试剂或分子。本领域普通技术人员认可，并非本公开缀合物的功能所必需的本公开缀合物上的位点是连接连接基团和/或靶向部分的理想位点，前提是一旦连至本公开缀合物，连接基团和/或靶向部分就不干涉本公开缀合物的功能，即，刺激cAMP自细胞分泌、治疗糖尿病或肥胖症的能力。本领域普通技术人员认可，并非本公开肽(例如，胰高血糖素激动剂肽、胰高血糖素拮抗剂肽、GLP-1激动剂肽、GIP激动剂肽或任何前述的组合)的功能所必需的本公开肽(Q)上的位点是连接连接基团和/或靶向部分的理想位点，前提是连接基团和/或靶向部分一旦连至本公开肽(Q)不会干扰本公开肽的功能。
控制释放制剂
作为选择，可将本文描述的胰高血糖素缀合物修饰成可为贮库制剂形式，以便相对于时间和体内位置控制本公开缀合物释放进入以其给药的体内的方式(参见，例如，美国专利号4,450,150)。本公开缀合物的贮库制剂形式可为，例如，包含本公开缀合物和多孔或无孔材料，诸如聚合物的植入式组合物，其中的本公开缀合物被材料胶囊化和/或随无孔材料的降解扩散到整个材料。然后将贮库制剂植入体内想要的位置，本公开缀合物自植入物以预定速度释放。
在某些情况下，修饰药用组合物以具有任何形式的体内释概况。在某些情况下，药用组合物经即时释放、控制释放、持续释放、延长释放、延迟释放或双相释放制剂。控制释放的肽或缀合物的配制方法为本领域所知。参见，例如，Qian等、J Pharm 374：46-52(2009)和国际专利申请公开号WO 2008/130158、WO2004/033036；WO2000/032218；和WO 1999/040942。
本组合物可进一步包含，例如，微泡或脂质体或某些其它胶囊化形式或可以延长释放形式给药，以提供延长的贮存和/或递药效果。可根据任何方案包括，例如，每日(每日1次，每日2次、每日3次、每日4次、每日5次、每日6次)、每两天一次、每三天一次、每四天一次、每五天一次、每六天一次、每周一次、每两周一次、每三周一次、每月一次或每两月一次给予本公开药用制剂。
用途
基于本文首次提供的信息，预期本文描述的Q-L-Y缀合物和相关药用组合物用于治疗疾病或医学病症，其中例如，对胰高血糖素受体、GLP-1受体、GIP受体或任何前述的组合缺乏活性是疾病或医学病症的发病和/或发展的因素。因此，本发明提供治疗或预防患者疾病或医学病症的方法，其中的疾病或医学病症是医学病症的疾病，其中缺乏GLP-1受体活化和/或胰高血糖素受体活化和/或GIP活化与医学步骤的疾病的发病和/或发展有关。方法包括以有效治疗或预防疾病或医学病症的量提供给患者根据本文描述的那些中的任何一种的缀合物。
在某些实施方案中，疾病或医学病症是代谢综合征。代谢综合征，也称为代谢综合征X、胰岛素抗性综合征或Reaven氏综合征，是影响超过五千万美国人的障碍。代谢综合征的典型特征通常为至少三种或更多种以下风险因素的集合：(1)腹型肥胖症(在腹部和其周围有过量脂肪组织)，(2)致动脉粥样化性血脂异常(血脂障碍包括促进斑块在动脉壁积聚的高甘油三酸酯、低HDL胆固醇和高LDL胆固醇)，(3)升高的血压(4)胰岛素抗性或葡萄糖不耐，(5)促血栓形成状态(例如，血液中的高纤维蛋白原或血纤维蛋白原活化剂抑制剂-1)，和(6)促炎性状态(例如，血流中升高的C-反应蛋白)。其它风险因素可包括老龄化、激素失衡和遗传倾向性。
代谢综合征涉及冠心病和与血管斑块积聚有关的其它障碍，诸如中风和外周血管疾病(称为动脉粥样硬化性心血管疾病(ASCVD))的增加的风险。代谢综合征患者可从早期的胰岛素抗性状态发展至充分发展的II型糖尿病，伴有ASCVD风险的进一步增加。不打算受任何特定理论的束缚，胰岛素抗性、代谢综合征和血管疾病之间的关系可涉及一种或多种并存发病机制，包括受损的胰岛素刺激性血管扩张、因氧化应激增强引起的胰岛素抗性相关性NO可用性降低和脂肪细胞衍生的激素诸如脂连蛋白异常(Lteif和Mather，Can.J.Cardiol.20(suppl.B)：66B-76B(2004))。
根据2001国家胆固醇教育计划成人治疗专家组(ATP III)，同一个体存在以下特征中的任何三种符合代谢综合征的标准：(a)腹型肥胖症(男性腰围超过102cm和女性超过88cm)；(b)血清甘油三酸酯(150mg/dl或以上)；(c)HDL胆固醇(男性40mg/dl或更低和女性50mg/dl或更低)；(d)血压(130/85或更高)；和(e)空腹血糖(110mg/dl或以上)。根据世界卫生组织(WHO)，具有高胰岛素水平(单独的空腹血糖升高或餐后葡萄糖升高)伴有以下标准中的至少两个的个体即符合代谢综合征标准：(a)腹型肥胖症(腰围与臀部之比大于0.9，体重指数为至少30kg/m2或腰围测量值大于37英寸)；(b)显示至少150mg/dl的甘油三酸酯水平或低过35mg/dl的HDL胆固醇的胆固醇范围(panel)；(c)血压140/90或更高，或在进行高血压治疗)。(Mathur，Ruchi，“代谢综合征，”Shiel，Jr.，William C.编辑，MedicineNet.com，2009年5月11日)。
出于本文的目的，如果个体符合2001国家胆固醇教育计划成人治疗专家组或WHO提出的标准中的任一个或二个标准，即认为个体患有代谢综合征.
不受任何特定理论的束缚，本文描述的Q-L-Y缀合物用于治疗代谢综合征。因此，本发明提供预防或治疗受试者代谢综合征或降低其一种、两种、三种或更多种风险因素的方法，其包括以有效预防或治疗代谢综合征或降低其风险因素的量提供给受试者本文描述的缀合物。
在某些实施方案中，该方法治疗高血糖医学病症。在某些情况下，高血糖医学病症是胰岛素依赖性或非胰岛素依赖性的糖尿病、I型糖尿病、II型糖尿病或妊娠期糖尿病。在某些情况下，该方法通过减轻糖尿病的一种或多种并发症，包括肾病、视网膜病和血管疾病治疗高血糖医学病症。
在某些情况下，疾病或医学病症是肥胖症。在某些情况下，
肥胖症是药物介导的肥胖症。在某些情况下，该方法通过预防或减少患者的体重增加或增加体重减轻来治疗肥胖症。在某些情况下，该方法通过抑制食欲、减少食物摄取、降低患者的脂肪水平或降低食物通过胃肠***的移动速度治疗肥胖症。
因为肥胖症涉及其它疾病的发病或发展，治疗肥胖症的方法进一步用于减轻与肥胖症有关的并发症包括血管疾病(冠状动脉疾病、中风、外周血管疾病、缺血性再灌注等)、高血压、II型糖尿病的发病、高脂血症和肌肉骨骼***疾病的方法。因此，本发明提供治疗或预防这些肥胖症相关的并发症的方法。
在某些实施方案中，疾病或医学病症为非酒精性脂肪肝疾病(NAFLD)。NAFLD指介于单纯性脂肪肝(脂肪变性)至非酒精性脂肪肝疾病(NASH)至肝硬化(肝的不可逆的晚期瘢痕形成)的广泛范围的肝疾病。NAFLD的所有阶段都在肝细胞中有脂肪积聚(脂肪浸润)。单纯性脂肪肝是某种类型的脂肪、甘油三酸酯在肝细胞中异常积聚而无炎症或瘢痕形成。在NASH中，脂肪积聚涉及不同程序的肝的炎症(肝炎)和瘢痕形成(纤维化)有关。炎性细胞可破坏肝细胞(肝细胞坏死)。在术语″脂肪性肝炎″和″脂肪坏死″，脂肪(steato)指脂肪浸润，肝炎指肝脏炎症和坏死指肝细胞遭到破坏。NASH可最终导致肝的瘢痕形成(纤维化)且接着导致不可逆的晚期瘢痕形成(肝硬化)。NASH引起的肝硬化是NAFLD范围内最后和最严重的阶段(Mendler，Michel，“脂肪肝：非酒精性脂肪肝病(NAFLD)和非酒精性脂肪性肝炎(NASH)，”Schoenfield，Leslie J.编辑，MedicineNet.com，29，2005年8月29日)。
酒精性肝病或酒精介导的肝病涵盖涉及过量饮用酒精或由其引起的三种不同的病理学肝疾病：脂肪肝(脂肪变性)、慢性或急性肝炎和肝硬化。酒精性肝炎可从异常实验室检测仅为疾病迹象的轻度肝炎变化至伴有并发症诸如黄疸病(胆红素潴留引起的皮肤发黄)，肝性脑病(肝功能衰竭引起的神经功能障碍)，腹水(流体在腹部积聚)，食道静脉曲张出血(食道中的静脉曲张)，凝血异常及昏迷的严重肝功能障碍。酒精性肝炎在组织学上具有肝细胞气球性变性、具有中性白细胞炎症和有时有Mallory小体(细胞中间丝蛋白异常积聚)的特征性表现。肝硬化在解剖学上的特征为肝脏中的广泛结节并结合有纤维化(Worman，Howard J.，“酒精性肝病”，哥伦比亚大学医学中心网站)。
不受任何特定理论的束缚，本文描述的Q-L-Y缀合物用于治疗酒精性肝疾病，NAFLD或它们的任何阶段，包括，例如，脂肪变性、脂肪性肝炎、肝炎、肝脏炎症、NASH、肝硬化或其并发症。因此，本发明提供预防或治疗受试者酒精性肝疾病，NAFLD或它们的任何阶段的方法，其包括以有效预防或治疗酒精性肝疾病、NAFLD或其阶段的量提供给受试者本文描述的缀合物。这类治疗方法包括抑制以下情况的一种、两种、三种或更多种：肝脂肪含量，肝硬化的发病或发展，肝细胞癌的发病，炎症体征，例如，肝脏酶(例如，天冬氨酸转氨酶AST和/或丙氨酸转氨酶ALT或LDH)水平异常，升高的血清铁蛋白，升高的血清胆红素和/或纤维化体征，例如，升高的TGF-β水平。在优选实施方案中，本文描述的Q-L-Y缀合物用于治疗已经超出单纯脂肪肝(脂肪变性)发展且呈现炎症或肝炎体征的患者。这类方法可导致，例如，AST和/或ALT水平的下降。
已经表明GLP-1和毒蜥外泌肽-4具有某种神经保护作用。本发明还提供本文描述的Q-L-Y缀合物在治疗神经变性疾病，包括但不限于阿尔茨海默氏病、帕金森氏病、多发性硬化、肌萎缩性侧索硬化、其它髓鞘脱失相关障碍、老年性痴呆、皮质下痴呆、动脉硬化性痴呆、AIDS相关性痴呆或其它痴呆、中枢神经***癌症、创伤性脑损伤、
脊髓损伤、中风或大脑局部缺血、脑血管炎、癫痫、亨廷顿氏病、图雷特氏综合征(Tourette’s syndrome)、格巴二氏综合征(Guillain Barresyndrome)、威尔逊氏病(Wilson disease)、皮克病(Pick disease)、神经发炎性障碍、脑炎、脑脊髓炎或病毒源性、真菌源性或细胞源性脑膜炎或其它中枢神经***感染、朊病毒疾病、小脑共济失调、小脑退化、脊髓小脑退化综合征、弗里德赖希氏共济失调、共济失调性毛细血管扩张、脊髓营养不良、进行性核上麻痹、肌张力障碍、肌肉痉挛、震颤、色素性视网膜炎、纹状体与黑质体退化、线粒体性脑肌病、神经元蜡样质脂褐质沉积症、肝脏脑病、肾脏脑病、代谢性脑病、毒素介导的脑病和放射介导的脑损伤方面的用途。
在某些实施方案中，疾病或医学病症是低血糖。在某些实施方案中，患者是糖尿病患者和低血糖通过给予胰岛素介导。在特定情况下，该方法包括与胰岛素联合提供本公开的缀合物，以便缀合物减缓大剂量给予胰岛素的低血糖影响。
在某些实施方案中，在医院环境下，与肠胃外给予营养素联合将Q-L-Y缀合物用于非糖尿病患者，例如，给予接受肠胃外营养或全部肠胃外营养的患者。非限制性实例包括手术患者、昏迷患者、消化道疾病或非功能性胃肠道(例如由于手术切除、堵塞或吸收能力障碍、克罗恩氏病、溃疡性结肠炎、胃肠道障碍、胃肠道瘘、急性胰腺炎、缺血性肠、大型胃肠手术、某些先天胃肠道异常、长期腹泻或手术引起的短肠综合征)患者、休克患者和经历愈合过程的患者经常接受肠胃外给予碳水化合物以及脂质、电解质、矿物质、维生素和氨基酸的各种组合。可同时，不同时，相互之前或之后给予Q-L-Y缀合物和肠胃外营养组合物，前提是Q-L-Y缀合物在肠胃外营养组合物被消化时发挥想要的生物学作用。例如，可每日1、2或3次给予肠胃外营养，同时每隔一天、每周三次、每周两次、每周一次、每两周一次、每三周一次或每月一次给予胰高血糖素缀合物。
如本文用的术语″治疗″和″预防″以及源自其的词未必表示100％或完全的治疗或预防。而是，存在本领域普通技术人员称为具有潜在益处或治疗作用的不同程度的治疗或预防。就此而言，本发明方法可以治疗或预防哺乳动物疾病或医学病症的任何水平的任何量提供。此外，该方法提供的治疗或预防可包括治疗或预防疾病或医学病症的一种或多种病症或症状。例如，关于治疗肥胖症的方法，在某些实施方案中，该方法使患者的食物摄取减少或脂肪水平下降。还出于本文的目的，″预防″可涵盖疾病或其症状或病情的发作的延迟。
关于以上治疗方法，患者为任何宿主。在某些实施方案中，宿主是哺乳动物。如本文用的术语“哺乳动物”指哺乳动物纲的任何脊椎动物，包括，但不限于，任何单孔类动物、有袋类动物和有胎盘哺乳动物(placental taxas)。在某些实施方案中，哺乳动物是啮齿目哺乳动物(诸如小鼠和仓鼠)和兔形目哺乳动物(诸如兔子)中的一种。在某些实施方案中，哺乳动物来自食肉目，包括猫科动物(猫)和犬科动物(狗)。在某些实施方案中，哺乳动物来自偶蹄目，包括牛科动物(牛)和猪科动物(猪)或来自奇蹄目包括马科动物(马)。在某些情况下，哺乳动物属于灵长目、Ceboids或Simoids(猴)或类人目(Anthropoids)(人和猿)。在特定实施方案中，哺乳动物是人。
组合
可单独或与旨在治疗或预防本文描述的任何疾病或医学病症的在其它治疗剂联合给予本文描述的Q-L-Y缀合物。例如，本文描述的Q-L-Y缀合物可与抗糖尿病药或抗肥胖症药联合给予(同时或相继)。本领域已知的或研究中的抗糖尿病药包括胰岛素、来普汀(leptin)、肽YY(PYY)、胰腺肽(PP)、纤维母细胞生长因子21(FGF21)、Y2Y4受体激动剂、磺酰脲类诸如甲苯磺丁脲(Orinase)、醋磺己脲(Dymelor)、妥拉磺脲(Tolinase)、氯磺丙脲(Diabinese)、格列吡嗪(Glucotrol)、格列本脲(diabeta、Micronase、Glynase)、格列美脲(Amaryl)或格列齐特(Diamicron)；氯茴苯酸类诸如瑞格列萘(Prandin)或那格列奈(Starlix)；双胍类诸如二甲双胍(Glucophage)或苯乙双胍；噻唑烷二酮类诸如罗格列酮(Avandia)、匹格列酮(Actos)或曲格列酮(Rezulin)，或其它PPARγ抑制剂；抑制碳水化合物消化的α葡糖苷酶抑制剂诸如米格列醇(Glyset)、阿卡波糖(Precose/Glucobay)；艾塞那肽(Byetta)或普兰林肽；二肽基肽酶-4(DPP-4)抑制剂诸如维格列汀或西格列汀；SGLT(钠依赖葡萄糖转运蛋白1)抑制剂；葡萄糖激酶活化剂(GKA)；胰高血糖素受体拮抗剂(GRA)；或FBP酶(果糖1，6-二磷酸酶)抑制剂。
本领域已知的或研究中的抗肥胖症药包括食欲抑制药、包括苯乙胺型刺激剂、芬特明(任选与芬氟拉明或右芬氟拉明一起)、安非拉酮(Tenuate
Figure BPA00001673726803271
)、苯甲曲秦(Prelu-2Bontril
Figure BPA00001673726803273
)、苄非他明(二drex
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)、***(Meridia
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Reductil
Figure BPA00001673726803276
)；利莫纳班(Acomplia
Figure BPA00001673726803277
)、其它***素类受体拮抗剂；泌酸调节肽；盐酸氟西汀(Prozac)；Qnexa(托吡酯和芬特明)、Excalia(安非他酮和唑尼沙胺)或Contrave(安非他酮和纳曲酮)；或脂肪酶抑制剂、类似于赛尼可(Orlistat)或西替司他(也称为ATL-962)或GT 389-255。
在某些实施方案中，本文描述的Q-L-Y缀合物与非酒精性脂肪肝疾病或NASH的治疗药联合给予。用来治疗非酒精性脂肪肝疾病的药物包括熊去氧胆酸(也称为Actigall、URSO和Ursodiol)、二甲双胍(Glucophage)、罗格列酮(Avandia)、氯贝丁酯、吉非贝齐、多粘菌素B和甜菜碱。
在某些实施方案中，本文描述的Q-L-Y缀合物与神经变性疾病，例如，帕金森氏病的治疗药联合给予。此外，抗帕金森氏病药为本领域已知并包括，但不限于、左旋多巴、卡比名巴、抗胆碱能药、溴隐亭、普拉克索和罗匹尼罗、金刚烷胺和雷沙吉兰。
鉴于前述，本发明进一步提供包含这些其它治疗药中的一种的药用组合物和药剂盒。其它治疗药可与本公开的缀合物同时或相继给予。在某些情况下，在其它治疗药之前给予缀合物，而在其它情况下，在给予其它治疗药后给予缀合物。
药剂盒
可根据一个实施方案提供作为药剂盒一部分的本公开的Q-L-Y缀合物。因此，在某些实施方案中，提供给予有需要的患者Q-L-Y缀合物的药剂盒，其中的药剂盒包括如本文描述的Q-L-Y缀合物。
在一个实施方案中，提供的药剂盒具有给予患者Q-L-Y缀合物组合物的装置，例如注射针、笔式装置(pen device)、喷射器或其它无针注射器。作为选择或或者另外，药剂盒包括一个或多个容器，例如，小瓶、管、瓶、单室或多室预装填注射器、药筒、输液泵(外部或可植入式)、喷射器、预装填的笔式装置等，任选含有呈冻干形式或水溶液形式的胰高血糖素缀合物。在某些实施方案中，药剂盒包括使用说明书。根据一个实施方案，药剂盒装置为气雾剂分散装置，其中的组合物预装在喷雾装置内。在另一个实施方案中，药剂盒包括注射器和针，和在一个实施方案中，无菌胰高血糖素组合物预先包装在注射器内。
给出以下实施例只为举例说明本发明而不以任何方式限制其范围。
实施例
实施例1：胰高血糖素超家族肽的肽片段的合成
材料
除非另有说明，本文描述的所有肽都被酰胺化。在肽合成期间，采用MBHA(4-甲基二苯甲胺聚苯乙烯)树脂。MBHA树脂，100-180目，1％二乙烯基苯(DVB)交联聚苯乙烯；加载量0.7-1.0mmol/g)，Boc保护的(叔丁基氨基甲酸酯)和Fmoc保护的(9-芴基甲基氨基甲酸酯)氨基酸购自Midwest Biotech。采用Boc-保护的氨基酸在AppliedBiosystem 430A型肽合成器上进行固相肽合成。采用AppliedBiosystems 433型肽合成器进行Fmoc保护的氨基酸合成。在特定实施方案中，可采用以下程序：
采用Boc-化学策略的通用肽合成方案
在Applied Biosystem Model 430A肽型合成器上采用Boc化学进行肽的合成。通过相继将氨基酸加至含有2mmol的Boc保护的氨基酸筒中构建合成的肽。具体说来，采用3-(二乙氧基-磷酰氧基)-3H-苯并[d][1，2，3]三嗪-4-酮(DEPBT)或HBTU作为偶合剂以单次偶合进行合成。在偶合步骤结束时，用三氟乙酸(TFA)处理肽基树脂以除去N-末端Boc保护基团。然后反应用二甲甲酰胺(DMF)反复洗涤树脂，且重复该重复循环达到偶合步骤所需要的次数。从Midwest Biotech(Fishers，IN)得到Boc氨基酸和HBTU。所用通用侧链保护基团为：Arg(Tos)、Asn(Xan)、Asp(OcHex)、Cys(pMeBzl)、His(Bom)、Lys(2C1-Z)、Ser(OBzl)、Thr(OBzl)、Tyr(2Br-Z)和Trp(CHO)。将Boc-Glu(OFm)-OH和Boc-Lys(Fmoc)-OH(Chem-Impex，Wood dale，IL)用于内酰胺-桥键形成位点。
在装配肽之后，Fmoc保护的侧链使用20％哌啶处理脱除保护。对于内酰胺化，正交保护基选自Glu和Lys(例如Glu(Fm)、Lys(Fmoc))。在除去保护基之后和在HF裂解之前，如先前描述的那样进行环合(参见，例如，国际专利申请公布号WO2008/101017)。肽基-树脂的HF处理在装配肽之后，Fmoc保护的侧链使用20％哌啶处理脱除保护。对于内酰胺化，正交保护基选自Glu和Lys(例如Glu(Fm)、Lys(Fmoc))。在除去保护基之后和在HF裂解之前，如先前描述的那样进行环合(参见例如国际专利申请公布号WO2008/101017)。肽基-树脂的HF处理。
在对甲酚和二甲基硫醚存在下，用无水HF处理肽基-树脂，这通常得到约350mg(约50％产率)的粗品脱保护肽。具体地讲，把肽基-树脂(30mg至200mg)置于氟化氢(HF)反应容器中用于裂解。然后，把500μL的对甲酚作为碳正离子清除剂加入到容器中。把容器连接于HF***并浸渍在甲醇/干冰混合物中。用真空泵排空容器并把10mL的HF蒸馏到反应容器中。把肽基-树脂和HF的反应混合物于0℃下搅拌1小时，之后建立真空并快速排空HF(10-15分钟)。然后小心移去容器并用约35mL的***填充以沉淀肽，并提取对甲酚和自HF处理生成的小分子有机保护基团。采用聚四氟乙烯过滤器过滤混合物并重复两次以除去所有过量的甲酚。弃去该滤液。把沉淀的肽溶解于约20mL的10％乙酸(水溶液)中。收集含有要求的肽的滤液并冷冻干燥。
粗品可溶性肽的分析型HPLC分析在以下条件下进行[4.6X30mm Xterra C8，1.50mL/分钟，220nm，A缓冲液0.1％TFA/10％乙腈(CH3CN)，B缓冲液0.1％TFA/100％CH3CN，梯度5-95％B经15分钟]。用水把提取液稀释2倍并加载到2.2X 25cm Vydac C4制备型反相柱上，并在Waters HPLC***(0.1％TFA/10％CH3CN的A缓冲液，0.1％TFA/10％CH3CN的B缓冲液和梯度为0-100％B，经120分钟，流速为以15.00mL/分钟)上用乙腈梯度洗脱。纯化的肽的HPLC分析证实纯度大于95％，并且电喷雾电离质谱分析可用于确证肽的特性。
用Fmoc-化学策略的通用肽合成方案：
采用标准的Fmoc化学，以Rink MBHA酰胺树脂或第一氨基酸连接的Wang树脂(Novabiochem，San Diego，CA)，采用DIC/HOBT作为偶合剂，在ABI 433A自动化肽合成仪上合成肽。Nα-Fmoc[N-(9-芴基)甲氧基羰基]氨基酸的侧链保护基团如下：Arg，Pmc；Asp，OtBu；Cys，Trt；Gln，Trt；His，Trt；Lys，Boc；Ser，tBu，Tyr，tBu；和Trp，Boc(Pmc＝2，2，5，7，8-五甲基色满-6-磺酰基，OtBu＝叔丁基酯，Trt＝三苯甲基，Boc＝叔丁氧基羰基和tBu＝叔丁酯)。将
Fmoc-Glu(O-2-PhiPr)-OH和Fmoc-Lys(Mmt)-OH(Novabiochem，SanDiego，CA)结合进内酰胺-桥键形成位点。
在固相合成后，通过1％TFA/DCM冲洗肽基树脂除去Glu上的2-苯基异丙基(2-PhiPr)基团和Lys上的4-甲氧基三苯甲基(Mmt)基团。为形成内酰胺-桥，通常将150mg(0.5mmole，5倍)BEPBT加入10％DIEA/DMF中和反应2-4h直到茚三酮测试表示阴性。
用含有85％TFA、5％苯酚、5％水和5％茴香硫醚(当肽含有半胱氨酸时加入2.5％EDT)的裂解合剂自树脂裂解肽。把粗品肽在***中沉淀，离心并冻干。然后通过分析型HPLC分析肽并经ESI或MALDI-TOF质谱检验。通过通用HPLC纯化程序纯化肽。
肽酰化
如下制备酰化肽。用CS Bio 4886肽合成仪或AppliedBiosystems 430A肽合成仪在固相支持树脂上合成肽。如Schnolzer等，Int.J.Peptide Protein Res.40：180-193(1992)描述的，采用原位中和化学。对于酰化肽，用Nε-FMOC赖氨酸残基取代待酰化的目标氨基酸残基(例如10位，相对于SEQ ID NO：1601的氨基酸位置编号)。在DMF中用20％哌啶处理完成的N-末端上BOC保护的肽30分钟，以除去FMOC/甲酰基。通过使10倍摩尔过量的FMOC-保护的间隔区氨基酸(例如FMOC-Glu-OtBu)或酰基链(例如CH3(CH2)14-COOH)与苯并***-1-基-氧基三吡咯烷基磷鎓六氟磷酸盐(PyBOP)、N，N’-二异丙基碳二亚胺(DIC)、或DEPBT偶联剂在DMF/二异丙基乙胺(DIEA)中反应，得到偶合于游离的ε-氨基Lys残基。接着通过重复与酰基链偶合去除间隔区氨基酸的FMOC基团。用100％TFA最后处理，导致去除任何侧链保护基和N-末端BOC基团。用5％DIEA/DMF中和肽树脂，干燥，然后使用HF/对甲酚(95∶5)于0℃下自支撑物裂解1小时。在***提取之后，5％乙酸(HOAc)溶液用于使粗品肽溶剂化。然后通过ESI-MS证实溶液的样品含有正确分子量的肽。通常使用10％CH3CN/0.1％TFA-0.1％TFA在100％CH3CN中的线性梯度，经反相(RP)HPLC纯化正确的肽。Vydac C1822mm x 250mm蛋白柱可用于纯化。酰化的肽缀合物通常通过20∶80的缓冲比例完成洗脱。把各部分合并在一起并在分析型RP-HPLC上检查纯度。把纯的部分冷冻干燥，得到白色固体。
如果肽含有内酰胺桥和要酰化的目标残基，就在将该氨基酸加至肽骨架时进行酰化。
肽聚乙二醇化形成硫醚键
为了肽聚乙二醇化，使用把肽和PEG两者溶解成透明溶液需要的最小量溶剂(对使用2-3mg肽的反应通常少于2mL)，使40kDa甲氧基聚(乙二醇)碘乙酰胺与摩尔当量的肽在7M脲、50mM Tris-HCl缓冲液中反应。在室温下开始剧烈搅拌4-6小时并可通过分析型RP-HPLC分析反应。聚乙二醇化产物表现出与起始原料明显不同的减少的保留时间。可用与用于最初肽纯化的那些类似的条件，在VydacC4柱上进行纯化。洗脱以约50∶50的缓冲比例发生。分离纯的聚乙二醇化肽的部分并冷冻干燥。收率应为50％以上，随每一个反应不同而变化。
肽聚乙二醇化形成马来酰亚胺基键
为肽聚乙二醇化，将含有半胱氨酸的肽溶解于磷酸盐缓冲盐水(5-0mg/mL)和加入0.01M乙二胺四乙酸(10-15％总体积)。加入过量(2倍)马来酰亚胺基甲氧基PEG试剂(Dow)，室温下搅拌反应，同时用高效液相色谱(HPLC)监测反应进展。8-24hrs后，酸化反应混合物，并加载于制备型反相柱，用0.1％四氟乙酸(TFA)/乙腈以梯度模式纯化。合并适当的流分，并冻干，得到想要的聚乙二醇化衍生物。
使用质谱分析
使用带有标准ESI离子源的Sciex API-III电喷雾四级杆质谱仪得到质谱。所使用的电离条件如下：ESI以正离子模式表示；离子喷雾电压，3.9kV，锥孔电压，60V。所使用的雾化和气帘气体为9L/分钟的氮气流速。以每步0.5Th和2msec停留时间自600-1800Thompsons记录质谱。把样品(约1mg/mL)溶解于含1％乙酸的50％乙腈水溶液中，并通过外部注射泵以5μL/分钟的速率导入。
当在PBS溶液中经ESI MS分析肽时，按照由制造商(Millipore Corporation，Billerica，MA，参见the Millipore website of theworld wide web at millipore.com/catalogue.nsf/docs/C5737)提供的说明书，它们首先使用含有0.6μL C4树脂的ZipTip固相萃取头脱盐。
高效液相色谱(HPLC)分析：
在磷酸盐缓冲盐水(PBS)缓冲液(pH，7.2)中用高效液相色谱(HPLC)和MALDI分析，用这些粗肽进行初步分析以得到相对转化率的近似值。使粗肽试样以1mg/mL的浓度溶解于PBS缓冲液。将生成的1mL溶液贮存于1.5mL HPLC小瓶，接着将其密封并于37℃下孵化。以各种时间间隔抽取100μl等份量，冷却至室温并经HPLC分析。
采用Beckman System Gold Chromatography system，使用UV检测器在214nm下进行HPLC分析。在150mm x 4.6mm C18 Vydac柱上进行HPLC分析。流速为1mL/min。溶剂A含有蒸馏水中的0.1％TFA和溶剂B含有90％CH3CN中的0.1％TFA。采用线性梯度(40％-70％B在15分钟内)。收集数据，并用eak Simple Chromatography软件分析。
实施例2
用基于萤火虫荧光素酶的报道基因试验测定每一种肽介导cAMP的能力。被介导的cAMP生成量与结合至胰高血糖素受体或GIP受体或GLP-1受体的胰高血糖素片段成正比。将用连接于cAMP应答元件的受体和荧光素酶基因共转染的HEK293细胞用于生物鉴定法。
在补充有0.25％牛生长血清(HyClone，Logan，UT)的Dulbecco改良的最低必需培养基(Invitrogen，Carlsbad，CA)中培养16小时，将细胞剥夺血清，然后在37℃，5％CO2下，用胰高血糖素片段的连续稀释液在96孔聚D-赖氨酸涂敷的“Biocoat”板(BD Biosciences，San Jose，CA)中培养在5小时。到培养结束时，将100μL LucLite发光底物试剂(Perkin Elmer，Wellesley，MA)加至各孔。短暂震摇该板，在暗处培养10min，用MicroB-1450液体闪烁计数器(Perkin-Elmer，Wellesley，MA)测定光输出。采用Origin软件(OriginLab，Northampton，MA)计算50％有效的浓度(EC50)和50％抑制浓度(IC50)。在以下实施例中，以nM报道所有的EC50s和IC50s，除非另有说明。
实施例3：GLP-1/***(3-醚)的制备
GLP-1类似物采用实施例1中公开的Boc方案合成，其在C-末端有Boc-Lys(Fmoc)-OH残基(在加入产物4之前，保护赖氨酸残基上的侧链胺的Fmoc基团经20％哌啶/DMF除去30分钟)。通过与2-溴乙酸乙酯反应在3-位衍生***17-醋酸酯。水解衍生的***并与GLP-1类似物的C-末端赖氨酸反应，生成GLP-1/***(3-醚)缀合物，如下文表示：
Figure BPA00001673726803341
具体说来，使等摩尔量的***17-醋酸酯(1)和2-溴醋酸乙酯(2)溶解于二噁烷/K2CO3，在回流条件下搅拌反应16小时。真空蒸发反应溶剂，使产物(3)再悬浮于二噁烷。缓慢加入NaOH(1N)并搅拌2小时。真空蒸发反应溶剂，和洗涤产物(4)三次并再悬浮于二氯甲烷中。缓慢加入HCl(1N)以酸化产物。在HOBt/DIC/NMP中混合产物4和结合树脂的肽4小时，过滤，经三氟乙酸处理，和用氢氟酸处理自树脂裂解。用反相HPLC纯化肽-***缀合物和用ESI质谱分析表征。
实施例4：GLP - 1/***(17 - 氨基甲酸酯)的制备
采用实施例1中公开的Boc方案合成GLP-1类似物，其在C-末端有Boc-Lys(Fmoc)-OH残基(在***衍生物的缀合之前，保护赖氨酸残基上的侧链胺的Fmoc基团经20％哌啶/DMF除去30分钟)。通过与氯甲酸4-硝基苯酯反应，在17-位置衍生B-***3-苯甲酸酯。衍生的***与GLP-1类似物的C-末端赖氨酸反应，生成GLP-1/***(17-酯)缀合物，如下所示：
Figure BPA00001673726803351
具体说来，在回流条件下，将β-***3-苯甲酸酯(1)与2倍过量的氯甲酸4-硝基苯酯(2)一起在吡啶、甲苯和DMAP中搅拌24小时。真空蒸发反应溶剂，使产物3-苯甲酸β-***17-硝基苯酯(3)再悬浮于乙酸乙酯中。用HCl(0.01N)水溶液洗涤反应产物两次，继而用水洗涤一次。真空蒸发乙酸乙酯，和用己烷沉淀产物(3)。产物3和结合树脂的肽在NMP/5％DIEA中混合4小时，过滤，用TFA处理和经HF处理从树脂裂解。肽-***缀合物用反相HPLC纯化和用ESI质谱分析表征。
实施例5：GLP-1/***(17-酯)的制备
采用实施例1中公开的Boc方案，用在C-末端上的Boc-Lys(Fmoc)-OH残基合成GLP-1类似物。(在***衍生物的缀合之前，保护赖氨酸残基上的侧链胺的Fmoc基团经20％哌啶/DMF除去30分钟)。通过与丁二酸酐反应在17-位置衍生***。衍生的***与GLP-1类似物的C-末端赖氨酸反应，生成GLP-1/***(17-酯)缀合物，如下文所示：
Figure BPA00001673726803361
具体说来，室温下，将β-***17-醋酸酯(1)和10倍过量的丁二酸酐(2)一起在含有5％DIEA和DMAP的DMF中搅拌48小时。在48小时后，真空蒸发反应溶剂，使产物(3)再悬浮于乙酸乙酯。用HCl水溶液(0.01N)洗涤反应产物(3)两次，继而用水洗涤一次。真空蒸发乙酸乙酯，使产物(3)再悬浮于MeOH/乙腈/水的混合物中。***衍生产物(3)经反相HPLC纯化。冻干的产物(3)和结合树脂的肽在HOBt/DIC/NMP中混合4小时，过滤，用TFA处理，经HF处理从树脂裂解。肽-***缀合物用反相HPLC纯化和用ESI质谱分析表征。
实施例6：GLP-1/***(3-酯)的制备
采用实施例1中公开的Boc方案，用C-末端上的Boc-Lys(Fmoc)-OH残基合成GLP-1类似物。(在***衍生物的缀合之前，保护赖氨酸残基上的侧链胺的Fmoc基团经20％哌啶/DMF除去30分钟)。通过与丁二酸酐反应在3-位置衍生***17-乙酸酯。衍生的***与GLP-1类似物的C-末端赖氨酸反应，生成GLP-1/***(3-酯)缀合物，如下文所示：
具体说来，在室温下，将β-***17-乙酸酯(1)和10倍过量的丁二酸酐(2)在含有5％DIEA和DMAP的DMF中一起搅拌48小时。48小时后，真空蒸发反应溶剂，使产物(3)再悬浮于乙酸乙酯。用HCl水溶液(0.01N)洗涤反应产物(3)两次，继而用水洗涤一次。真空蒸发乙酸乙酯，使产物(3)再悬浮于MeOH/乙腈/水的混合物中。***衍生物产物(3)经反相HPLC纯化。冻干的产物(3)和结合树脂的肽在HOBt/DIC/NMP中混合4小时，过滤，用TFA处理，经HF处理从树脂裂解。肽-***缀合物用反相HPLC纯化和用ESI质谱分析表征。
实施例7：GLP-1/雌酮3 - 酯)的制备
采用实施例1中公开的Boc方案，合成在C-末端带有Boc-Lys(Fmoc)-OH残基的GLP-1类似物。(在***衍生物的缀合之前，保护赖氨酸残基上的侧链胺的Fmoc基团经20％哌啶/DMF除去30分钟)。通过与丁二酸酐反应在3-位置衍生雌酮。衍生的雌酮与GLP-1类似物的C-末端赖氨酸反应生成GLP-1/雌酮(3-酯)缀合物，如下文所示：
Figure BPA00001673726803381
具体说来，在室温下，将雌酮(1)和10倍过量的丁二酸酐(2)在含有5％DIEA和DMAP的DMF中一起搅拌48小时。48小时后，真空蒸发反应溶剂，使产物(3)再悬浮于乙酸乙酯中。用HCl水溶液(0.01N)洗涤反应产物(3)两次，继而用水洗涤一次。真空蒸发乙酸乙酯，使产物(3)再悬浮于MeOH/乙腈/水的混合物。雌酮衍生物产物(3)经反相HPLC纯化。将冻干的产物(3)和结合树脂的肽在HOBt/DIC/NMP中混合4小时，过滤，用TFA处理，经HF处理从树脂裂解。肽-***缀合物用反相HPLC纯化和用ESI质谱分析表征。
实施例8：GLP - 1/***(17 - 腙)的制备
采用实施例1中公开的Boc方案合成GLP-1类似物。用基于Boc的原位中和化学合成在C-末端上有Boc-Cys(4-MeBzl)-OH残基的肽，以促使***的添加。通过与马来酰亚胺基己酰肼反应在17-位置衍生雌酮。衍生的雌酮与GLP-1类似物的C-末端半胱氨酸反应，生成GLP-1/***(17-腙)缀合物，如下文所示：
Figure BPA00001673726803391
具体说来，在室温下，将等摩尔量的雌酮(1)和ε-马来酰亚胺基己酰肼(2)在含有0.1％TFA的MeOH中一起搅拌4小时。4小时后，真空蒸发反应溶剂，和产物(3)在冷***中沉淀和在硅胶柱上纯化。在室温，pH 7.55下，将5倍过量的产物3与裂解和纯化肽在DMF、CAN、Tris和水的混合物中混合24小时，生成肽-***缀合物。肽-***缀合物用反相HPLC纯化和用ESI质谱分析表征。
实施例9：GLP - 1/***(17 - 氨基甲酸酯二硫化物)(位阻和无位阻)的制 备
采用实施例1中公开的Boc方案合成GLP-1类似物。用基于Boc的原位中和化学合成在C-末端有Boc-Cys(4-MeBzl)-OH残基(生成无位阻二硫化物缀合物)或Boc-Pen(4-MeBzl)-OH残基(生成位阻二硫化物缀合物)的肽，以促使添加***。经与氯甲酸4-硝基苯酯反应，在17-位置衍生B-***3-苯甲酸酯。然后再使中间体与吡啶基二硫基-乙胺-HCl反应和与GLP-1类似物的C-末端半胱氨酸进行二硫化物交换反应，生成GLP-1/***(17-氨基甲酸酯二硫化物)缀合物，如下文所示：
Figure BPA00001673726803401
首先，室温下，将等摩尔量的2，2’-二硫基二吡啶(Aldrithiol-2)(1)和2-巯基乙胺HCl(2)在含有2％AcOH的MeOH中一起搅拌48小时。48小时后，真空蒸发反应溶剂，和产物(3)在冷***中沉淀。其次，在回流条件下，将β-***3-苯甲酸酯(4)和2倍过量的氯甲酸4-硝基苯酯(5)在吡啶、甲苯和DMAP中一起搅拌4小时。真空蒸发反应溶剂，使产物3-苯甲酸β-***17-硝基苯酯(6)再悬浮于乙酸乙酯中。用HCl水溶液洗涤该反应产物两次(0.01N)，继而用水洗涤一次，在分流漏斗中移除。真空蒸发乙酸乙酯，用己烷沉淀产物(6)。
Figure BPA00001673726803402
在室温下，将等摩尔量的吡啶基二硫基-乙胺HCl(3)和3-苯甲酸β-***17-硝基苯基酯(6)在含有5％DIEA和DMAP的吡啶中一起搅拌48小时。48小时后，真空蒸发反应溶剂，和使产物(7)再悬浮于乙酸乙酯中。用HCl水溶液(0.01N)洗涤该反应产物两次，继而用水洗涤一次，并真空蒸发乙酸乙酯。室温下，通过用在二噁烷和甲醇中的0.25％K2CO3处理3小时，除去产物(7)上的3-苯甲酸酯基团，生成产物β-***17-氨基甲酸酯S-S-NPy(8)，其经硅胶柱纯化。在室温，pH 7.5下，在NMP和Tris中，使5倍过量的产物8与裂解和纯化的肽(在位置40具有半胱氨酸残基或青霉胺(penicilamine)残基)混合48小时，生成肽-***缀合物。用反相HPLC纯化肽-***缀合物和用ESI质谱分析表征。
实施例10：GLP - 1/***(17 - 组织蛋白酶二氨基乙胺)的制备
采用实施例1中公开的Boc方案合成GLP-1类似物。用基于Boc的原位中和化学合成在N-末端有Z-His(BOM)-OH残基和在C-末端有Boc-Lys(Fmoc)-OH的肽，以促使二肽间隔区和***的添加。在17-位置衍生苯甲酸B-***17-硝基苯基酯，生成GLP-1/***(17-组织蛋白酶二氨基乙烷)缀合物，如下文所示：
Figure BPA00001673726803411
采用基于Fmoc的原位中和化学在Wang树脂上合成Fmoc-Phy-Lys(Cl-Z)-OH(1)，并用TFA/DCM从树脂裂解。室温下，将等摩尔量的Fmoc-Phe-Lys(Cl-Z)-OH(1)和Boc-乙二胺(2)在HOBt、DIC和DCM中一起搅拌4小时。用HCl水溶液(0.01N)洗涤该反应产物两次，继而用水洗涤一次，将其在分液漏斗中移出，并真空蒸发乙酸乙酯。在洗涤步骤后，用20％哌啶在DMF中处理反应产物30分钟，除去N-末端的Fmoc基团，生成NH2-Phe-Lys(Cl-Z)-EDA-Boc(3)，其在真空除去哌啶/DMF溶剂后，在冷***中沉淀。室温下，在DMF、5％DIEA和DMAP中，将NH2-Phe-Lys(Cl-Z)-EDA-Boc(3)与2倍过量的丁二酸酐(4)一起搅拌16小时，在真空蒸发反应溶剂后，再悬浮于MeOH、乙腈和水中。反应产物半丁二酸酯-Phe-Lys(Cl-Z)-EDA-Boc(5)经反相HPLC纯化。使5倍过量的冻干产物(5)和结合树脂的肽在HOBt/DIC/NMP中混合16小时，过滤和用TFA处理，生成产物GLP-1+半丁二酸酯-Phe-Lys(Cl-Z)-EDA(6)。使该结合树脂的产物(6)与5倍过量的3-苯甲酸β-***17-硝基苯基酯(7)在NMP/5％DIEA中混合16小时，过滤和经HF处理从树脂裂解，生成最终产物(8)。用反相HPLC纯化肽-***缀合物和用ESI质谱分析表征。
实施例11：GLP - 1/胆固醇(3 - 酰胺)的制备
采用实施例1中公开的Boc方案合成GLP-1类似物。用基于Boc的原位中和化学合成在C-末端有Boc-Lys(Fmoc)-OH残基的肽。使胆固醇3-羧酸与GLP-1类似物的C-末端赖氨酸反应，生成GLP-1/胆固醇(3-酰胺)缀合物，如下文所示：
具体说来，将胆固醇3-羧酸(1)和结合树脂的肽在HOBt/DIC/NMP中混合16小时，过滤，用TFA处理，经HF处理从树脂裂解。在加入产物4之前，保护赖氨酸残基上的侧链胺的Fmoc基团经20％哌啶/DMF除去30分钟。用反相HPLC纯化肽-胆固醇缀合物(2)和用ESI质谱分析表征。如果肽主链被聚乙二醇化，则半胱氨酸残基被加在序列中的位置24上，以有助于PEG部分的添加，其通过在7M脲/0.05M Tris(pH 8.5)缓冲液中，使等摩尔量的碘乙酰基40kPEG与缀合物混合1小时，将其加至肽-胆固醇缀合物中。
实施例12：***受体结合试验使用纯化的ERα&Millipore过滤板的磷光影像仪方案
以下试剂用于进行***受体结合试验：配体结合缓冲液(pH7.6)、50mM HEPES-钠盐、1mM CaCl2、5mM MgCl2、0.5％BSA、蔗糖缓冲液(pH 7.6)、20％蔗糖、120mM NaCl、40mM tris-HCl、0.4％BSA、聚亚乙基亚胺(PEI)和0.25％PEI。
“冷”***的滴定
制备为最高所需测试浓度5倍的冷***的贮备稀释液。测试的最高浓度为10μM。因此，制备总体积为500μl的50μM贮备液。将40μl结合缓冲液准确加至滴定板的各孔，不包括第11和12列。将60μl贮备浓缩液准确加至滴定板的11列的各孔。通过将20μl从11列转移至10列并混合，进行3倍滴定。滴定随后的列至第1列。准确将20μl从滴定板的各孔移至试验板的对应孔。将20μl结合缓冲液准确加至“总结合”孔(孔12(A-D))。将20μl 100μM的冷***准确加至“非特异性结合”孔(孔12(E-H))。
“热”***的恒定浓度
制备为所需测试浓度的5倍的经标记的***的贮备溶液，测试浓度为0.05nM。因此，制备总体积为至少2.3mL的0.25nM经标记的***的贮备液。将标记的***制成体积为100μl的10uCi溶液，该浓度采用2200Ci/mmol转换率，其与45.45nM浓度有相关性。对于2.3mL的0.25nM贮备液，将12.65μL经标记的***加入2.29ml的结合缓冲液中，根据设计，将20μL贮备溶液准确加至试验板的各孔。
纯化的***受体α的滴定
以1.5nM的浓度测试纯化的***受体。因为将60μL的***受体加至各孔，所以制备1.667倍的贮备液浓度。对于1.5nM的测试浓度，制备2.5nM的贮备浓度。通过将8.4μL贮备液加至6.99mL结合缓冲液中，制备7.0mL体积的2.5nM受体。然后将60μL的受体准确转移至试验板的适当孔中。
试验
室温下，温育试验板(含有冷配体、热配体和胞溶产物)2小时。将25μL的0.25％PEI准确加至过滤板的各孔。温育过滤板20分钟，之后真空清洁各孔。将试验板中的80μL悬液准确转移至涂有PEI的过滤板。采用真空歧管经过滤板将试样抽真空。过滤板用结合缓冲液洗涤板数次，然后包于玻璃纸中。将各板固定在磷光体成像屏幕的表面上，孔底部最靠近屏幕。将磷光体成像屏幕和板置于放射薄膜袋中并曝光48小时。用磷光影像仪扫描成像屏幕，收集曝光档案。
实施例13
用媒介或40或400μg/kg的以下物质中的一种每天一次皮下注射小鼠(db/db，N＝6，平均初始体重＝54g)4周：
(a)GLP-1(Aib2A22CexK40)(400μg/kg-日)，
(b)GLP-1(Aib2A22CexK40)/***(17-酯)(40μg/kg-日)或
(c)GLP-1(Aib2A22CexK40)/***(17-酯)(400μg/kg-日).
23天后测量体重，确定体重变化(图2a)。给予高剂量GLP-1(Aib2A22CexK40)/***(17-酯)缀合物的小鼠经历体重的下降程度大于单独给予GLP-1的小鼠。
还确定经23天时间GLP-1(Aib2A22CexK40)/***(17-酯)缀合物对累积食物摄取的影响。给予高剂量GLP-1(17-酯)/***(17-酯)缀合物的小鼠所消耗的食物少于单独给予GLP-1的那些。
图2b和2c表示GLP-1(Aib2A22CexK40)/***(17-酯)缀合物对血糖水平(mg/dL)的影响。给予高剂量GLP-1(Aib2A22CexK40)/***(17-酯)缀合物的小鼠在0-14天之间经历最大的血糖水平下降。
实施例14.GLP - 1/***缀合物的体内作用
用媒介或4、40或400μg/kg以下物质中的一种，对膳食介导的肥胖症(DIO)小鼠(每组N＝8，6小鼠，平均初始体重＝58g)每天一次进行皮下注射4周：
(a)GLP-1(Aib2E16CexK40)(40μg/kg-日)，
(b)GLP-1(Aib2A22CexK40)(400μg/kg-日)或
(c)GLP-1(Aib2A22CexK40)/***(17-酯)(4、40或400μg/kg-日)。
在第7天和21天的0时间点以1.5g/kg体重的剂量注射包含25％(v/v)葡萄糖的盐水溶液。在第7天和21天的0、15、30、60和120min时间点测量血糖(图3a)。
23天后测量体重，确定体重变化、脂肪质量变化和肌肉质量变化(图3b-d)。给予高剂量GLP-1(Aib2A22CexK40)/***(17-酯)缀合物的小鼠经历最大的体重和脂肪质量的下降，肌肉质量损失量最小。
还确定经23天时间GLP-1(Aib2A22CexK40)/***(17-酯)缀合物对累积食物摄取的影响。给予高剂量GLP-1(Aib2A22CexK40)/***(17-酯)的小鼠食用最少量的食物。
图3e表示GLP-1(Aib2A22CexK40)/***(17-酯)缀合物对血糖变化的影响。给予高剂量GLP-1(Aib2A22CexK40)/***(17-酯)缀合物的小鼠在0和14天之间经历最大的血糖水平下降。这些结果表明将***加至基于A22的弱GLP-1激动剂可增加剂量依赖性功效。
实施例15.
用媒介或以下物质中的一种对膳食介导的肥胖症(DIO)小鼠(N＝8，平均初始体重＝59g)每天一次进行皮下注射4周：
(a)GLP-1(Aib2E16Cex K40)(40或400μg/kg-日)，
(b)GLP-1(Aib2E16Cex K40)/***(17-酯)(40或400μg/kg-日)或
(c)GLP-1(Aib2E16Cex K40)/***(3-醚)(40或400μg/kg-日)。
在第14天的0min时间以1.5g/kg体重的剂量注射包含25％(v/v)葡萄糖的盐水溶液。在0、15、30、60和120min时间点测量血糖水平。图4a呈现这个实验的数据。
21天后测量体重，确定总体重变化和脂肪质量变化(图4b-c)。给予高剂量的GLP-1/***缀合物的小鼠总体重(图4b)下降最大。相对于用媒介处理的动物，用高剂量***醚缀合物的脂肪质量有所下降(图4c)。酯缀合物比醚缀合物对总体重有更大的影响，和醚缀合物比酯缀合物对脂肪质量有更大的影响。
还确定经21天时间GLP-1(Aib2E16Cex K40)/***缀合物对累积食物摄取的影响。给予GLP-1/***缀合物的小鼠比单独给予GLP-1(Aib2E16Cex K40)的小鼠食用更少的食物。
图4d表示GLP-1(Aib2E16Cex K40)/***缀合物对血糖水平(mg/dL)的影响。以高剂量给予任一GLP-1(Aib2E16Cex K40)/***缀合物的小鼠在0-21天之间的血糖水平比单独给予GLP-1(Aib2E16CexK40)的小鼠经历更大的变化。
实施例16
用媒介或以下物质中的一种对喂以糖尿病饮食9个月的小鼠(N＝8、11月龄，平均体重60g)进行皮下注射：
(a)GLP-1(Aib2E16Cex K40)(40或400μg/kg/日)，
(b)GLP-1(Aib2E16Cex K40)/***(3-醚)(40或400μg/kg-日)，
(c)dGLP-1(A1Aib2A22Cex K40)/***(3-醚)(40或400μg/kg-日)，
(d)GLP-1(Aib2E16C24(PEG-40kDa)Cex K40)/***(3-醚)(40，400μg/kg-日)，
(e)GLP-1(Aib2E16C24(PEG-40kDa)Cex K40)/***(3-醚)(40μg/kg-周)或
(f)GLP-1(Aib2E16C24(PEG-40kDa)Cex K40)(40μg/kg-周)。
7天后测量体重，确定体重变化(图5a)。给予高剂量GLP-1/***缀合物的小鼠体重下降最大，然而给予低日剂量的GLP-1/***缀合物的小鼠体重也显著下降。
还确定经7天时间的GLP-1(Aib2E16K40Cex)/***(3-醚)、dGLP-1(A1Aib2A22Cex K40)/***(3-醚)和
GLP-1(Aib2E16C24(PEG-40kDa)Cex K40)/***(3-醚)缀合物对累积食物摄取的影响。给予高或低剂量GLP-1(Aib2E16K40Cex)/***(3-醚)和GLP-1(Aib2E16K40Cex)或低日剂量的GLP-1(Aib2E16C24(PEG-40kDa)Cex K40)的小鼠食用最少量的食物。
图5b表示GLP-1(Aib2E16K40Cex)/***(3-醚)、dGLP-1(A1Aib2A22Cex K40)/***(3-醚)和
GLP-1(Aib2E16C24(PEG-40kDa)Cex K40)/***(3-醚)缀合物对血糖水平变化的影响(mg/dL)。给予高或低剂量GLP-1(Aib2E16K40Cex)的小鼠与给予高剂量GLP-1(Aib2E16K40Cex)/***(3-醚)的小鼠的血糖变化最大。
实施例17
用媒介或40μg/kg以下物质中的一种每天一次对膳食介导的肥胖症(DIO)小鼠(N＝8，平均初始体重＝65g)进行皮下注射一周：
(a)GLP-1(Aib2E16Cex K40)，
(b)dGLP-1(A1Aib2A22Cex K40)，
(c)GLP-1(Aib2A22Cex K40)，
(d)GLP-1(Aib2E16Cex K40)/***(3-醚)，
(e)dGLP-1(A1Aib2A22Cex K40)/***(3-醚)，
(f)GLP-1(Aib2A22Cex K40)/***(3-醚)，
(g)GLP-1(Aib2E16Cex K40)/***(17-酯)，
(h)dGLP-1(A1Aib2A22Cex K40)/***(17-酯)或
(i)GLP-1(Aib2A22Cex K40)/***(17-酯)。
7天后测量体重，确定体重和脂肪质量变化(图6a-b)。给予任一***缀合物的小鼠总体重下降最大。脂肪质量分析(图6b)随总体重减轻而相对恒定。
图6c表示GLP-1/***缀合物对血糖(mg/dL)变化的影响。给予GLP-1(Aib2E16K40Cex)/***(3-醚)或GLP-1(Aib2E16K40Cex)/***(17-酯)缀合物的小鼠在0-7天之间的血糖变化最大。
实施例18
用媒介或400μg/kg以下物质中的一种每日一次皮下注射给予喂以糖尿病饮食9个月的小鼠(N＝8、11月龄，平均体重60g)一周：
(a)GLP-1(Aib2E16Cex K40)，
(b)GLP-1(Aib2E16Cex K40)/***(3-醚)，
(c)GLP-1(Aib2E16Cex K40)/***(17-酯)，
(d)dGLP-1(A1Aib2A22Cex K40)，
(e)dGLP-1(A1Aib2A22Cex K40)/***(3-醚)，
(f)dGLP-1(A1Aib2A22Cex K40)/***(17-酯)，
(g)GLP-1(Aib2A22Cex K40)，
(h)GLP-1(Aib2A22Cex K40)/***(3-醚)或
(i)GLP-1(Aib2A22Cex K40)/***(17-酯)。
7天后测量体重，确定体重变化(图7a)。给予GLP-1(Aib2A22Cex K40)/***缀合物的小鼠总体重下降最大。相较于未结合至***的相应GLP-1肽，GLP-1/***缀合物表现出更大的体重减轻。
还确定经7天时间GLP-1/***缀合物对累积食物摄取的影响。给予GLP-1(Aib2A22Cex K40)/***缀合物的小鼠食用最少量的食物。
图7b表示GLP-1/***缀合物对血糖变化的影响(mg/dL)。给予GLP-1(Aib2A22Cex K40)/***缀合物的小鼠在0-7天之间的血糖变化最大。
相对于GLP-1(Aib2E16Cex K40)/***缀合物，含有A22或含有d-氨基酸的肽都没有表现出很大的降低。此外，GLP-1(Aib2E16CexK40)的***缀合物显然比相同肽的非***形式更加有效。
实施例19
用媒介或以下物质中的一种每日一次皮下注射对小鼠(N＝8，平均体重55g)给药一周：
(a)GLP-1(Aib2E16Cex K40)(120或400μg/kg-日)，
(b)GLP-1(Aib2E16Cex K40)/***(3-酯)(120或400μg/kg-日)，
(c)dGLP-1(A1Aib2A22Cex K40)(400或1200μg/kg-日)或
(d)dGLP-1(A1Aib2A22Cex K40)/***(3-酯)(400或1200μg/kg-日)。
含有d-氨基酸的肽在全部功效测量方面明显次于含有l-氨基酸的肽。7天后测量体重，确定体重变化(图8a)。在存在或不存在***下，这些剂量下的肽在体重减轻方面没有多少明显差别。
图8b表示各种GLP-1/***缀合物对血糖水平(mg/dL)变化的影响。给予GLP-1(Aib2E16Cex K40)/***(3-酯)缀合物的小鼠在0-7天之间的体内血糖水平变化最大，远超过用相同肽但未用***处理的动物。这表明直接改善血糖而与体重差异无关。
图8c表明给予所示GLP-1缀合物对脂肪质量变化的影响。
实施例20
用媒介或40，400，1200或4000μg/kg以下物质中的一种每天一次皮下注射对饮食介导的肥胖症小鼠(DIO)(N＝8，平均体重61g)给药一周或两周：
(a)GLP-1(Aib2E16Cex K40)/***(3-醚)(40μg/kg-日)，
(b)dGLP-1(A1Aib2A22Cex K40)(4000μg/kg-日)，
(c)dGLP-1(A1Aib2A22Cex K40)/***(3-酯)(400，1200，4000μg/kg-日)，
(d)GLP-1(Aib2E16C24(PEG-40kDa)Cex K40)(40μg/kg-日)，
(e)GLP-1(Aib2E16C24(PEG-40kDa)Cex K40)/***(3-醚)(40μg/kg-日)或
(f)GLP-1(Aib2E16C24(PEG-40kDa)Cex K40)/胆固醇(40μg/kg-日)。
7天后测量体重，确定体重变化。给予GLP-1/***(3-酯)缀合物的小鼠体重下降(图9a)下降最大和脂肪质量的量最小(图9b)。
还确定经7天时间GLP-1/***(3-酯)缀合物对累积食物摄取的影响。与仅给予GLP-1的小鼠相比，给予GLP-1(Aib2E16Cex K40)/***(3-酯)缀合物(无PEG)的小鼠食用显著更少的食物。
图9c表示GLP-1/***(3-酯)缀合物对血糖变化的影响。在0-7天之间，含d-氨基酸的GLP-1/***(3-酯)缀合物存在明显的剂量依赖性葡萄糖降低作用，且相对于单独给予GLP-1的小鼠在最高剂量下有所增强(图9c)。
实施例21
用媒介或以下物质中的一种每日一次对喂以糖尿病饮食的小鼠(N＝8，14月龄)进行皮下注射一周：
(a)d-GLP-1(A1Aib2A22Cex K40)/***(3-酯)(1200，4000μg/kg)，
(b)d-GLP-1(A1Aib2A22Cex K40)/***(3-醚)(1200，4000μg/kg)或
(c)d-GLP-1(Aib2E16K40Cex)(4000μg/kg)，
7天后测量体重，确定体重变化(图10a)。给予小鼠含有d-氨基酸的GLP-1/***缀合物，其中***以稳定的酰胺或体内不稳定的酯共价连接。用不稳定的酯缀合物处理的动物总体重下降最大。
还确定经7天时间GLP-1/***缀合物对累积食物摄取的影响。与给予其余缀合物的小鼠相比，给予不稳定的酯缀合物的小鼠食用显著更少的食物。
还确定GLP-1/***缀合物对血糖水平(mg/dL)变化的影响。图10b表明，与给予相当的含有d-氨基酸但具有稳定的***缀合物的肽的小鼠相比，在0-7天之间给予含d-氨基酸的GLP-1/***酯缀合物的小鼠血糖水平变化更大。
实施例22.活性GLP-1/***缀合物的体外受体试验
制备以下化合物的连续稀释液：
(i)***，
(ii)GLP-1，
(iii)活性、***稳定的GLP-1/***(3-醚)缀合物。
(iv)活性、***不稳定的GLP-1/***(3-酯)缀合物，
(v)活性、***稳定的GLP-1/***(17-酯)缀合物，
(vi)活性、亚稳态的酸不稳定的GLP-1/***(17-腙)缀合物，
(vii)活性、亚稳态的硫醇易还原的GLP-1/***(17-氨基甲酸酯二硫化物)缀合物，和
(viii)活化***不稳定的活性GLP-1/***(3-酯，17-OAc)。
GLP-1活性(cAMP介导)-将(ii)、(iii)和(iv)的连续稀释液与经GLP-1受体和融合至cAMP响应元件(CRE)的荧光素酶基因共转染的HEK293细胞一起培养。在细胞溶解和与荧光素一起培养后测量发光。表示于下表的结果表明，GLP-1缀合至***不影响GLP-1对GLP-1受体的固有活性。
GLP-1结合—将(ii)、(iii)和(iv)的连续稀释液与GLP-1受体细胞膜提取物、[I125]-GLP-1和涂有凝结素的SPA珠粒一起培养，之后测量闪烁。下表中显示的结果表明，GLP-1缀合至***不影响GLP-1对GLP-1受体的结合。
Figure BPA00001673726803511
***活性—将(i)、(iii)和(iv)的连接稀释液与经融合至***响应元件(ERE)的荧光素酶基因转染的T47D细胞一起培养。在细胞溶解和与荧光素一起培养后测量发光。显示于下表的结果表明，***稳定连接至GLP-1显著减少***的细胞内的***活性，而不稳定缀合物呈现高度的细胞内***活性。
ERα结合—将(i)、(iii)，和(iv)的连续稀释液与经纯化的ERα和[I125]-***一起培养。过滤后，经磷光体成像定量放射配体结合。表示于下表的结果表明，***稳定连接至GLP-1显著减少***结合至***受体的能力，而不稳定的缀合物呈现***受体结合，其为在生物试验条件下酯缀合的不稳定性函数。
Figure BPA00001673726803521
GLP-1活性(cAMP介导)-将(ii)、(iii)、(iv)、(v)、(vi)、(vii)和(viii)的连续稀释液与用GLP-1受体和融合至cAMP响应元件(CRE)的荧光素酶基因共转染的HEK293细胞一起培养。在细胞溶解和与荧光素一起培养后测量发光。活性亚稳态的GLP-1/***缀合物对GLP-1受体具有相同活性(图11a)。
***活性—(i)、(iii)、(iv)、(v)、(vi)、(vii)和(viii)的连续稀释液与用融合至***响应元件(ERE)的荧光素酶基因转染的T47D细胞一起培养。在细胞溶解和与荧光素一起培养后测量发光。活性亚稳态的GLP-1/***缀合物对***受体具有可变的活性(图11b)。当有意用例如，酸、硫醇或酶(例如，组织蛋白酶)处理这些活性的亚稳态的缀合物时，亚稳态的GLP-1/***缀合物恢复几乎完全的***功效。因此，作为共价缀合物的活性亚稳态的GLP-1/***缀合物呈现下降的***活性和需要释放以具有活性。
实施例23.非活性GLP-1/***缀合物的体外受体试验
制备以下化合物的连续稀释液：
(i)非活性GLP-1，
(ii)非活性、***稳定的GLP-1/***(3-醚)缀合物，和
(iii)非活性、***不稳定的GLP-1/***(3-酯)缀合物。
GLP-1活性(cAMP介导)-将(i)、(ii)和(iii)的连续稀释液用GLP-1受体和融合至cAMP响应元件(CRE)的荧光素酶基因共转染的HEK293细胞一起培养。在细胞溶解和与荧光素一起培养后测量发光。结果显示于下表。
Figure BPA00001673726803531
实施例24
用媒介或400或4000μg/kg以下物质中的一种每天一次皮下注射给予饮食介导的肥胖症小鼠(DIO)(N＝8，平均体重51g)两周：
(a)含有d-氨基酸的GLP-1(A1Aib2E16K40Cex)(4000μg/kg)，
(b)含有d-氨基酸的GLP-1(A1Aib2A22Cex K40)/***(3-酯)(400，4000μg/kg)或
(c)含有d-氨基酸的GLP-1(A1Aib2A22Cex K40)/***(3-醚)(400，4000μg/kg)。
15天后测量体重，确定体重变化。给予非活性、***不稳定的含d-氨基酸的GLP-1/***(3-酯)缀合物的小鼠体重下降最大，高剂量下影响更为显著(图12a)。
还确定经15天时间非活性GLP-1和非活性GLP-1/***缀合物对累积食物摄取的影响。与仅给予非活性GLP-1或非活性、***稳定的含d-氨基酸的GLP-1/***(3-醚)缀合物的小鼠相比，给予非活性、***不稳定的含d-氨基酸的GLP-1/***(3-酯)缀合物的小鼠消耗显著更少的食物，高剂量下影响更显著(图12b)。
图12c显示非活性GLP-1和非活性含d-氨基酸的GLP-1/***缀合物对血糖变化的影响。在0和14天之间，高剂量的非活性含d-氨基酸的GLP-1/***(3-酯)缀合物降低血糖。
15天后测量肝脏重量，确定肝脏重量的变化。与给予***稳定、非活性的含d-氨基酸的GLP-1/***(3-酯)缀合物的小鼠相比，给予***不稳定、非活性的含d-氨基酸的GLP-1/***(3-醚)缀合物的小鼠的肝脏重量减轻更大(图12d)。
15天后测定子宫重量，确定子宫重量的变化。与单独给予非活性GLP-1或非活性、***稳定的含d-氨基酸的GLP-1/***(3-醚)缀合物的小鼠相比，给予非活性、***不稳定的含d-氨基酸的GLP-1/***(3-酯)缀合物的小鼠的子宫重量增加显著更大(图12e)。
实施例25
对进行标准饮食的C57BI/6小鼠(N＝8，平均体重19.6g)进行卵巢切除，允许5天恢复，之后每天一次皮下注射给予媒介或4000μg/kg以下物质中的一种7天：
(a)GLP-1激动剂，
(b)含有d-氨基酸的GLP-1(A1Aib2A22Cex K40)/雌酮(3-酯)，
(c)含有d-氨基酸的GLP-1(A1Aib2A22Cex K40)/***(3-醚)或
(d)GLP-1激动剂/***(3-醚)。
研究结束时，处死小鼠，收集子宫并称重。
7天后测量体重，确定体重变化。与单独给予活性、GLP-1激动剂(图13a)、非活性、***不稳定的含d-氨基酸的GLP-1/雌酮(3-酯)缀合物或非活性、***稳定的含d-氨基酸的GLP-1/***(3-醚)缀合物的小鼠相比，给予活性、***稳定的GLP-1激动剂/***(3-醚)缀合物的小鼠体重下降更大。给予GLP-1激动剂、非活性、***不稳定的含d-氨基酸的GLP-1/雌酮(3-酯)缀合物和活性、***稳定的GLP-1激动剂/***(3-醚)缀合物的小鼠呈现脂肪质量降低(图13b)。
还确定经7天时间GLP-1缀合物对累积食物摄取的影响。与给予单独的活性、GLP-1激动剂、非活性、***不稳定的含d-氨基酸的GLP-1/雌酮(3-酯)缀合物或非活性、***稳定的含d-氨基酸的GLP-1/***(3-醚)缀合物的小鼠相比，给予活性、***稳定的GLP-1激动剂/***(3-醚)缀合物的小鼠消耗更少的食物(图13c)。
图13d表示GLP-1缀合物对血糖变化的影响。给予非活性、***不稳定的非活性含d-氨基酸的GLP-1/雌酮(3-酯)缀合物或活性的稳定GLP-1激动剂/***(3-醚)缀合物的小鼠的血糖水平下降大于媒介组。给予非活性、***稳定的含d-氨基酸的GLP-1/***(3-醚)缀合物的小鼠未呈现血糖水平下降。
7天后测量子宫重量，确定子宫重量变化。与仅给予GLP-1、非活性、***稳定的含d-氨基酸的GLP-1/***(3-醚)缀合物或活性、***稳定的GLP-1/***(3-醚)缀合物的小鼠相比，给予非活性、***不稳定的含d-氨基酸的GLP-1/雌酮(3-酯)缀合物的小鼠子宫重量的增加显著更大(图13e)。
实施例26
对按标准进食的小鼠(N＝8，平均体重19.1g)进行卵巢切除，允许5天恢复，之后每天一次皮下注射给予媒介或4000μg/kg以下物质中的一种7天：
(a)GLP-1激动剂/雌酮(3-酯)，
(b)GLP-1激动剂/***(17-氨基甲酸酯二硫化物)，
(c)GLP-1激动剂/***(17-腙)或
(d)GLP-1激动剂/***(17-组织蛋白酶)。
研究结束时，处死小鼠，收集子宫并称重。
7天后测量体重，确定体重变化。与给予单独的活性、GLP-1激动剂或活性、***不稳定的GLP-1激动剂/雌酮(3-酯)缀合物小鼠相比，给予亚稳态的GLP-1激动剂/***缀合物的小鼠的体重和脂肪质量下降更大(图14a和14b)。分别给予亚稳态的酶-和酸不稳定的缀合物、GLP-1激动剂/***(17-组织蛋白酶)和GLP-1激动剂/***(17-腙)的小鼠初始具有最大的体重下降，而亚稳态的硫醇易还原的缀合物、GLP-1激动剂/***(17-氨基甲酸酯二硫化物)，经7天研究呈现最大的总体重下降。
图14c表示亚稳态的GLP-1缀合物对血糖变化的影响。与不稳定的GLP-1激动剂/雌酮(3-酯)缀合物相比，分别给予亚稳态的硫醇还原不稳定和酸不稳定的缀合物、GLP-1激动剂/***(17-氨基甲酸酯二硫化物)和GLP-1激动剂/***(17-腙)的小鼠经研究过程的血糖水平下降更大。
7天后测定子宫重量，确定子宫重量的变化。与给予亚稳态的GLP-1/***缀合物的小鼠相比，给予***不稳定GLP-1/雌酮(3-酯)缀合物的小鼠的子宫重量增加显著更大(图14d)。
实施例27
每天一次皮下注射给予饮食介导的肥胖症小鼠媒介或40或400μg/kg的以下物质中的一种两周：
(a)GLP-1激动剂，
(b)GLP-1激动剂/***(3-酯)或
(c)GLP-1激动剂/***(3-醚)。
15天后测量体重，确定体重变化。与给予单独的活性、GLP-1激动剂或活性、***不稳定的GLP-1激动剂/***(3-酯)缀合物的小鼠相比，给予活性、***稳定的GLP-1激动剂/***(3-醚)缀合物的小鼠的体重下降显著更大(图15a)。
还确定经15天时间活性GLP-1和活性GLP-1/***缀合物对累积食物摄取的影响。与给予单独的活性、GLP-1激动剂或活性、***不稳定的GLP-1激动剂/***(3-酯)缀合物的小鼠相比，给予活性、***稳定的GLP-1激动剂/***(3-醚)缀合物的小鼠消耗显著更少的食物(图15b)。
实施例28.GLP-1/***缀合物的稳定性分析
在100％人血浆中，于pH 7.4和37℃下培养肽缀合物(1mg/mL)。抽取等分试样，使血浆蛋白沉淀，经微离心法除去。如在实施例1中描述的，经HPLC和MS分析等分试样。活性***稳定的GLP-1/***(3-醚)缀合物(例如，实施例3)经72小时未呈现***释放，而活性***不稳定的GLP-1/***(3-酯)缀合物(例如，实施例6)3小时后显示充分的***释放并在6小时内***完全释放(图16a)。酸不稳定的缀合物、GLP-1/***(17-腙)(例如，实施例7)经48小时在生理学pH下在血浆中未呈现***释放，但在3小时内经暴露于酸(pH 5.0)，释放***，在6小时内，发生完全的***释放(图16b)。无位阻硫醇易还原的缀合物(例如，实施例9)24小时后显示充分的***释放和在48小时内***完全释放，而位阻硫醇易还原的缀合物、GLP-1/***(17-氨基甲酸酯二硫化物)(例如，实施例9)，在血浆经72小时未呈现***释放(图16c)。该位阻硫醇易还原的缀合物在细胞外谷胱甘肽浓度(例如，15μM)下也未呈现***释放，但在6小时内在15mM细胞内谷胱甘肽浓度下释放***(图16d)。酶不稳定的GLP-1/***(组织蛋白酶)缀合物(例如，实施例10)在血浆中经72小时未呈现***释放(图16e)。
实施例29
每天一次皮下注射给予膳食介导的肥胖症小鼠媒介或400μg/kg以下物质中的一种7天：
(a)GLP-1激动剂，
(b)GLP-1激动剂/***(3-醚)，
(c)GIP激动剂，
(d)GIP激动剂/***(3-醚)，
(e)胰高血糖素激动剂或
(f)胰高血糖素激动剂/***(3-醚)。
7天后测量体重，确定体重变化(图17a)。给予GLP-1激动剂/***(3-醚)缀合物的小鼠体重下降最大，且体重下降显著大于单独给予GLP-1激动剂的小鼠。单独给予GIP激动剂和GIP激动剂/***(3-醚)缀合物的小鼠表现出类似的体重下降。与给予媒介的小鼠相比，给予GIP激动剂和GIP激动剂/***(3-醚)缀合物的小鼠呈现出更大的体重下降。单独给予胰高血糖素激动剂和胰高血糖素激动剂/***(3-醚)缀合物的小鼠表现出类似的体重下降。给予胰高血糖素激动剂或胰高血糖素激动剂/***(3-醚)缀合物的小鼠的体重下降类似于给予媒介的小鼠的体重下降。不打算受任何特定理论的束缚，靶向GLP-1受体的肽显示较好的使***靶向细胞的能力，其中其可使体重产生有意义的差异。在该实验中，就减轻体重而言，GLP-1活性肽(GLP-1激动剂)的缀合物比主要靶向GIP或胰高血糖素受体的肽(GIP激动剂或胰高血糖素激动剂)表现更佳。
还确定缀合物对累积食物摄取的影响(图17b)。给予GLP-1、GIP和胰高血糖素的***缀合物的小鼠比分别给予GLP-1激动剂、GIP激动剂或胰高血糖素激动剂的小鼠消耗更少的食物。给予GLP-1激动剂/***(3-醚)缀合物的小鼠经7天时间消耗最少量的食物。
还确定缀合物对血糖变化的影响。给予GLP-1激动剂和GLP-1激动剂/***(3-醚)缀合物的小鼠，经7天时间，二者都呈现出血糖水平的下降，其中给予所述缀合物的小鼠下降更大。给予GIP激动剂和GIP激动剂/***(3-醚)缀合物的小鼠经7天时间还显示出血糖水平的下降。给予胰高血糖素激动剂的小鼠经7天显示出血糖水平的增加，而给予胰高血糖素激动剂/***(3-醚)缀合物的小鼠经7天显示出血糖水平的下降(图17c)。
实施例30
每天一次皮下注射给予膳食介导的肥胖症野生型小鼠、***受体β剔除(ERβKO)小鼠和***受体α剔除(ERαKO)小鼠媒介或400μg/kg以下物质中的一种两周：
(a)GLP-1激动剂或
(b)GLP-1激动剂/***(3-醚)。
14天后测量体重，确定体重变化(图18a)。给予GLP-1激动剂/***(3-醚)缀合物的野生型小鼠显示出超过给予媒介或GLP-1激动剂的小鼠的更大的体重下降。给予媒介的野生型小鼠经两周时间显示出约10％的体重增加，当给予GLP-1激动剂时体重增加约3％和当给予GLP-1激动剂/***(3-醚)缀合物时体重下降约10％。给予GLP-1激动剂/***(3-醚)缀合物的ERαKO小鼠比当给予媒介或GLP-1激动剂时显示出更大的体重下降。当给予媒介时ERαKO小鼠未显示出体重的变化，当给予GLP-1激动剂时体重下降约10％，当给予GLP-1激动剂/***(3-醚)缀合物时，体重下降约20％。给予GLP-1激动剂/***(3-醚)缀合物的ERβKO小鼠与给予GLP-1激动剂的小鼠相比呈现类似的体重下降。当给予媒介时，ERβKO小鼠呈现约2％的体重下降和当给予或者GLP-1激动剂或者GLP-1激动剂/***(3-醚)缀合物时体重下降约15％。不打算受任何特定理论的束缚，这些数据表明，ERβ受体对额外的体重下降负责。当剔除ERβ受体时，在GLP-1激动剂和GLP-1激动剂/***(3-醚)缀合物之间，小鼠未呈现体重减轻的差异。
还确定GLP-1缀合物对野生型小鼠和基因敲除小鼠的累积食物摄取的影响(图18b)。给予GLP-1激动剂/***(3-酯)缀合物的基因敲除小鼠消耗最少量的食物。
还确定GLP-1缀合物对野生型小鼠和基因敲除小鼠的血糖变化的影响。给予GLP-1激动剂/***(3-酯)缀合物的ERαKO小鼠呈现出最大的血糖水平下降(图18c)。
实施例31
给予500mg/dl血糖水平的雄性db/db小鼠皮下剂量的媒介或50nmol/kg以下物质中的一种：
(a)GLP-1激动剂，
(b)GLP-1激动剂/***(3-醚)或
(c)GLP-1激动剂/***(3-酯)。
给予GLP-1激动剂的小鼠经48小时呈现最小的有效血糖降低(除媒介外)，而给予***稳定的GLP-1激动剂/***(3-醚)缀合物的小鼠经48小时呈现最有效的血糖降低(图19)。
以上实验的结果与用作I型糖尿病模型的链佐星(STZ)介导的糖尿病模型一致。

Claims (44)

1.一种包含结构Q-L-Y的化合物；
其中Q为胰高血糖素超家族肽；
Y是活化核激素受体的NHR配体，具有约1μM或者更小的EC50，并且具有最多约1000道尔顿的分子量；和
L为连接基团或键。
2.权利要求1的化合物，其中Q对GLP-1受体表现出原生GLP-1的至少0.1％的活性。
3.权利要求1或2的化合物，其中Q对胰高血糖素受体表现出原生胰高血糖素的至少0.1％的活性。
4.权利要求1、2或3中任何一项的化合物，其中Q对GIP受体表现出原生GIP的至少0.1％的活性。
5.任何一项前述权利要求的化合物，其中Q对GLP-1受体具有Y对对核激素受体的EC50的10倍以内的EC50。
6.任何一项前述权利要求的化合物，其中Q对胰高血糖素受体具有Y对核激素受体的EC50的10倍以内的EC50。
7.任何一项前述权利要求的化合物，其中Q对GIP受体具有Y对核激素受体的EC50的10倍以内的EC50。
8.任何一项前述权利要求的化合物，其中的Y是对I型或II型核激素受体起作用的NHR配体。
9.权利要求8的化合物，其中的Y是对选自***受体、糖皮质激素受体、盐皮质激素受体、孕酮受体、雄激素受体、甲状腺激素受体、视黄酸受体、过氧化物酶体增殖物激活受体、肝X受体、法呢酯衍生物X受体、维生素D受体、RAR相关孤儿受体和娠烷X受体的核激素受体起作用的NHR配体。
10.权利要求9的化合物，其中Y是激活***受体、雄激素受体、糖皮质激素受体或RAR相关孤儿受体的NHR配体。
11.权利要求10的化合物，其中的Y是激活***受体的NHR配体。
12.任何一项前述权利要求的化合物，其中的Y选自脂肪酸及其衍生物、胆汁酸及其衍生物、胆固醇及其衍生物和类固醇及其衍生物。
13.权利要求12的化合物，其中的Y选自***及其衍生物、雌酮及其衍生物、睾酮及其衍生物和皮质醇及其衍生物。
14.任何一项前述权利要求的化合物，其中的L是体内稳定的。
15.任何一项前述权利要求的化合物，其中的L是可体内水解的。
16.任何一项前述权利要求的化合物，其中的L是体内亚稳态的。
17.权利要求14的化合物，其中的L包括醚部分或酰胺部分。
18.权利要求15的化合物，其中的L包括酯部分。
19.权利要求16的化合物，其中的L包括酸不稳定、易还原或酶不稳定的部分。
20.权利要求19的化合物，其中的L包含腙部分、二硫化物部分或组织蛋白酶可裂解的部分腙。
21.任何一项前述权利要求的化合物，其中的Q包括与原生胰高血糖素至少50％相同的氨基酸序列，该序列保留对应于原生胰高血糖素
(SEQ ID NO：1601)的氨基酸12-29的氨基酸的α-螺旋构象。
22.任何一项前述权利要求的化合物，其中的Q包括与原生GLP-1至少50％相同的氨基酸序列，该序列保留对应于原生GLP-1(SEQ ID NO：1603)的氨基酸12-29的氨基酸的α-螺旋构象。
23.任何一项前述权利要求的化合物，其中Q包含以下氨基酸序列：
X1-X2-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Z(SEQ ID NO：839)，其上具有1-3个氨基酸修饰，
(a)其中X1和/或X2为减少胰高血糖素肽对经二肽基肽酶IV(DPP-IV)裂解的敏感性的非原生氨基酸序列(相对于SEQ ID NO：1601)，
(b)其中Z选自-COOH、-Asn-COOH、Asn-Thr-COOH和W-COOH，其中W为1-2个氨基酸或GPSSGAPPPS，
(c)其中Q包含选自以下的修饰：
(i)在i和i+4位的氨基酸侧链之间的内酰胺桥，其中i为12、16、
20或24，和
(ii)在胰高血糖素肽的16、20、21和24位的1个、2个、3个或全部氨基酸被α，α二取代的氨基酸取代；
其中Q表现出胰高血糖素激动剂活性。
24.权利要求23的化合物，其中Q包括氨基酸序列SEQ ID NO：1601并包括：
(a)选自以下的至少一个氨基酸修饰：
(i)用荷电氨基酸取代29位的Thr；
(ii)用选自Lys、Arg、His、Asp、Glu、半胱氨酸和同型半胱氨酸的荷电氨基酸取代29位的Thr；
(iii)在29位用Asp、Glu或Lys取代；
(iv)在29位用Glu取代；
(v)在29位之后***1-3个荷电氨基酸；
(vi)在29位之后***Glu或Lys；
(vii)在29位之后***Gly-Lys或Lys-Lys；
(viii)在3-位用包含以下结构I、II或III的侧链的氨基酸取代Gln：
Figure FPA00001673726700031
其中R1为C0-3烷基或C0-3杂烷基；R2为NHR4或C1-3烷基；R3为C1-3烷基；R4为H或C1-3烷基；X为NH、O或S；和Y为NHR4、SR3或OR3；和
(ix)其组合；
(b)在16位用Thr、Glu或Aib和选自以下的至少一个氨基酸修饰取代Ser：
(i)在1位用减少胰高血糖素肽对经二肽基肽酶IV(DPP-IV)裂解的敏感性的非原生氨基酸取代His，
(ii)在2位用减少胰高血糖素肽对经二肽基肽酶IV(DPP-IV)裂解的敏感性的非原生氨基酸取代Ser，
(iii)在7位用Ile、Abu或Val取代Thr，
(iv)在20位用Ser、Thr、Ala、Aib、Arg或Lys取代Gln，
(v)在27位用Leu或Nle取代Met，
(vi)在28-29位氨基酸缺失，
(vii)在29位氨基酸缺失，
(viii)向C-末端增加氨基酸序列GPSSGAPPPS；和
(ix)向C-末端增加氨基酸序列GPSSGAPPPSX，其中X为任何氨基酸；和
(x)其组合；
其中Q表现出胰高血糖素激动剂活性。
25.权利要求1-22中任一项的化合物，其中Q包含具有以下修饰的
SEQ ID NO：1601的胰高血糖素相关肽：
(a)赋予GIP激动剂活性的在1位的氨基酸修饰，
(b)选自以下的修饰：
(i)在i和i+4位的氨基酸侧链之间或在j和j+3位的氨基酸侧链之间的内酰胺桥，其中i为12、13、16、17、20或24，和其中j为17，和
(ii)在类似物的16、20、21和24位的1个、2个、3个或全部氨基酸被α，α二取代的氨基酸取代，
(c)1-10个其它的氨基酸修饰；
其中Q对GIP受体表现出活性。
26.权利要求25的化合物，其中的1-10处另外的氨基酸修饰选自：
(i)在2位用D-Ser、Ala、D-Ala、Gly、N-甲基-Ser、Aib、Val或ε-氨基-N-丁酸取代丝氨酸；
(ii)在16位用Glu、Gln、高谷氨酸、同型半胱氨酸、Thr、Gly或Aib取代丝氨酸；
(iii)在20位用Ser、Thr、Ala、Lys、瓜氨酸、Arg、Orn或Aib取代谷氨酰胺；
(iv)在27位用Leu取代蛋氨酸；
(v)在28位用Ala取代精氨酸；
(vi)在29位用Gly取代苏氨酸；
(vii)在2、5、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、20、21、24、27、28和29位中的任何位置的保守取代；
(viii)向C-末端增加1-21个氨基酸；
(ix)向C-末端增加氨基酸序列GPSSGAPPPS；
(x)向C-末端增加氨基酸序列GPSSGAPPPSX，其中X为任何氨基酸；(xi)用酰胺或羧酸酯取代C-末端羧基，和
(xii)其组合。
27.权利要求1-22中任一项的化合物，其中Q包括氨基酸序列：
X1-X2-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-X3-Ser-X4-Tyr-Leu-X5-X6-X7-X8-Ala-X9-X10-Phe-X11-X12-Trp-Leu-X13-X14-X15(SEQ ID NO：55)，或其类似物，其中所述类似物与SEQ ID NO：55的不同之处在于1-3个选自1、2、3、5、7、10、11、13、14、17、18、19、21和25位的氨基酸修饰，其中：
(a)X1为His、D-His、(脱-氨基)His、羟基-His、乙酰基-His、高-His
或α，α-二甲基咪唑乙酸(DMIA)、N-甲基His、α-甲基His或咪唑乙酸；(b)X2为Ser、D-Ser、Ala、D-Ala、Val、Gly、N-甲基Ser、氨基异丁酸(Aib)或N-甲基Ala；
(c)X3、X4、X5、X10、X11和X14各自为任何氨基酸；
(d)X6为Ser、Glu、Gln、高谷氨酸或同型半胱氨酸；
(e)X7为Arg、Gln、Lys、Cys、Orn、同型半胱氨酸或乙酰基苯丙氨酸；
(f)X8为Arg、Ala、Lys、Cys、Orn、同型半胱氨酸或乙酰基苯丙氨酸；(g)X9为Gln、Lys、Arg、Orn或瓜氨酸；
(h)X12为Ala、Gln、Glu、Lys、Cys、Orn、同型半胱氨酸或乙酰基苯丙氨酸；
(i)X13为Met、Leu或Nle；
(j)X15为Thr、Gly、Lys、Cys、Orn、同型半胱氨酸或乙酰基苯丙氨酸；并且任选地包含以下修饰之一：
(a)在28-29位氨基酸缺失；
(b)在29位氨基酸缺失；
(c)向C-末端增加氨基酸序列GPSSGAPPPS；和
(d)向C-末端增加氨基酸序列GPSSGAPPPSX，其中X为任何氨基酸；和
(e)其组合。
28.权利要求1-22中任一项的化合物，其中Q包括因不超过十处氨基酸修饰而不同于SEQ ID NO：1601的氨基酸序列，修饰包括：
(a)在16、20、21和/或24位的一个或多个氨基酸用Aib取代，和
(b)提供对经二肽基肽酶IV的裂解的敏感性减少的在1和/或2位的氨基酸修饰，并且
任选地包含一种或多种以下的修饰：
(a)在28和29位氨基酸缺失；
(b)在29位氨基酸缺失；
(c)向C-末端增加氨基酸序列GPSSGAPPPS；
(d)向C-末端增加氨基酸序列GPSSGAPPPSX，其中X为任何氨基酸；(e)用酰胺或羧酸酯取代C-末端羧基，并且
其中Q表现出GLP-1激动剂活性和胰高血糖素激动剂活性。
29.任何一项前述权利要求的化合物，其中L-Y共价缀合于Q的N-末端、C-末端或氨基酸侧链。
30.权利要求26的化合物，其中L-Y被缀合至对应于原生胰高血糖素(SEQ ID NO：1601)的10、30、37、38、39、40、41、42或43位的Q的氨基酸侧链。
31.权利要求27的化合物，其中L-Y被缀合至对应于包含原生胰高血糖素(SEQ ID NO：1601)的序列的10和/或40位的Q的氨基酸侧链。
32.一种包含结构A-B的前述权利要求中任一项中的化合物的前药，其中
A为氨基酸或含氧酸；
B为通过在B的羧基部分和Q的胺之间的酰胺键连接于Q的N-烷基化氨基酸；
A、B或者A-B被连接的Q的氨基酸为非编码的氨基酸，进一步地其中在生理条件下，A-B自Q在PBS中的化学裂解半衰期(t1/2)为至少约1小时-约1周。
33.权利要求32的化合物，其中A-B包括结构：
Figure FPA00001673726700071
其中
(a)R1、R2、R4和R8独立地选自H、C1-C18烷基、C2-C18链烯基、(C1-C18烷基)OH、(C1-C18烷基)SH、(C2-C3烷基)SCH3、(C1-C4烷基)CONH2、(C1-C4烷基)COOH、(C1-C4烷基)NH2、(C1-C4烷基)NHC(NH2 +)NH2、(C0-C4烷基)(C3-C6环烷基)、(C0-C4烷基)(C2-C5杂环基)、(C0-C4烷基)(C6-C10芳基)R7、(C1-C4烷基)(C3-C9杂芳基)和C1-C12烷基(W1)C1-C12烷基，其中W1为选自N、S和O的杂原子，或
(ii)R1和R2与它们连接的原子一起形成C3-C12环烷基或芳基；或
(iii)R4和R8与它们连接的原子一起形成C3-C6环烷基；
(b)R3选自C1-C18烷基、(C1-C18烷基)OH、(C1-C18烷基)NH2、(C1-C18烷基)SH、(C0-C4烷基)(C3-C6环烷基)、(C0-C4烷基)(C2-C5杂环基)、(C0-C4烷基)(C6-C10芳基)R7和(C1-C4烷基)(C3-C9杂芳基)，或者R4和R3与它们连接的原子一起形成4、5或6元杂环；
(c)R5为NHR6或OH；
(d)R6为H、C1-C8烷基，或者R6和R2与它们连接的原子一起形成4、5或6元杂环；和
(e)R7选自H和OH。
34.任何一项前述权利要求的化合物，所述化合物进一步包含经烷基胺、酰胺、醚、酯、硫醚或硫代酸酯连键共价连接于酰基或烷基的Q上的氨基酸侧链，其酰基或烷基相对于天然存在的氨基酸而言为非原生的。
35.权利要求34的化合物，其中酰基或烷基所连的氨基酸在对应于包含原生胰高血糖素的序列的10、20、24、30、37、38、39、40、41、32或43位或C-末端氨基酸的的位置。
36.权利要求35的化合物，其中酰基或烷基所连的氨基酸在对应于包含原生胰高血糖素的序列的10和/或40位的位置。
37.权利要求36的化合物，其中的酰基或烷基经间隔区连至氨基酸的侧链。
38.权利要求37的化合物，其中的间隔区是酸性氨基酸或酸性二肽。
39.任何一项前述权利要求的化合物，其中的Q共价连至一个或多个异源部分。
40.权利要求39的化合物，其中的一个或多个异源部分选自肽、多肽、核酸分子、其片段抗体、聚合物、量子点、小分子、毒素、诊断剂和任何前述物质的组合。
41.任何一项前述权利要求的化合物，其中Q选自：SEQ ID NOs：1-564、566-570、573-575、577、579-580、585-612、616、618-632、634-642、647、657-692、694-695、715-718、722、724-725、729、731-760、801-878、883-919、1001-1275、1301-1371、1401-1518和1601-1650。
42.一种二聚体或多聚体，其包含任何一项前述权利要求的化合物。
43.一种药用组合物，所述组合物包含任何一项前述权利要求的化合物、权利要求42的二聚体或多聚体，或其组合，以及药学上可接受的载体。
44.一种治疗患者的疾病或医学病症的方法，其中所述疾病或医学病症选自代谢综合征、糖尿病、肥胖症、脂肪肝和神经退行性疾病，所述方法包括以有效治疗疾病或医学病症的量给予患者权利要求43的药用组合物。
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