CN103030689A - 一种cart多肽化合物及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种18F标记的CART多肽化合物18F-Al-NOTA-CART及其制备方法和应用，该标记方法利用双功能螯合剂NOTA既能与多肽的非活性序列端共价结合，又能与金属离子形成稳定络合物的特性，将18F与CART肽进行了连接，形成了多肽化合物18F-Al-NOTA-CART。本发明所述的18F-Al-NOTA-CART具有与CART肽相同的生物性能，稳定性好，标记产物纯度高，放化纯大于90％；同时其制备方法简单，整个反应仅需30min，成本低；18F-Al-NOTA-CART可以作为研究CART肽作用机制的重要工具，在以CART肽为靶向的新药开发中起到重要作用。
Description
技术领域
本发明涉及一种18F标记的多肽化合物18F-Al-NOTA-CART及其制备方法和应用，属于医药学技术领域。
背景技术
***-***调节转录肽(***e and amphetamine regulatedtranscript，CART肽)是一种在体内分布广泛的神经肽类物质。研究证明，CART肽参与成瘾、食欲、应激、精神焦虑和内分泌等生理过程。尤其CART肽在与药物成瘾有关方面的作用研究使其迅速成为神经肽方面的研究热点。
CART肽首先是由Spiess等人(1981)在羊下丘脑的抽提物中分离出来的，当时认为它是一种类似于生长抑素之类的多肽，并未引起人们的重视。直到1995年Douglass等人发现，在急性给予精神活性药物***和***后，CART mRNA的水平急剧增加，一些相似的研究也陆续被报道，这使得CART肽受到了极大的关注。随后的研究发现CART mRNA的细胞核群具有CART肽的免疫反应性,WesternBlotting也证实了CART肽分布广泛。目前已知大鼠脑垂体、肠道、肾上腺内至少有6种不同的CART肽(从4KD到14KD)，包括大分子量的preproCART、proCART和小分子量具有生理活性CART55-102和62-102。有研究表明，CART肽可抑制动物的摄食行为，降低肥胖大鼠的体重，并受瘦素(leptin)的调节；大鼠腹侧被盖区注射CART肽有精神***类似的效应，可改变大鼠的行为；CART神经元与多巴胺能神经元共定位，并可调节脑内多巴胺的代谢；CART肽调节下丘脑垂体激素的释放；CART肽与药物依赖相关等等。
到目前为止，大鼠、小鼠、金鱼及人类的CART基因已得以分离并完全测序，它们都由3个外显子和2个内含子组成。大小鼠的CART基因通过选择性剪接形成两种不同的产物，较长的含有129个氨基酸，较短的含有116个氨基酸。人类的CART基因大约2.5kb，定位于染色体5q13-q14；CART基因通过选择性剪接形成两个长度的mRNA，从而产生两个不同长度的前体（propeptide）proCART1-89和proCART1-102。有趣的是，这两个前体均能在大鼠中找到，而在人类中只存在proCART1-89。前体中包含几个切割位点，经过翻译后加工形成至少两种有生物活性的CART肽。proCART1-102会形成CART55-102和CART62-102；proCART1-89会形成CART42-89和CART49-89，目前大部分的研究都集中在CART55-102和CART62-102上。
CART肽也是目前发现的少数几种可通过血脑屏障（BBB）的肽类物质，如果能以CART肽的结构为基础，合成CART肽受体的拮抗剂或阻断剂，那么这些与CART肽结构相似的肽类物质就能通过BBB，从而抑制***依赖；另外，也有研究报道CART肽是一种内源性的神经保护剂，它可以抑制Aβ（β淀粉样蛋白）神经毒性所致的神经损伤，改善认知功能，对阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease，AD)病理过程中的不同靶点均有影响，有望成为治疗AD的新型药物；Elefteriou等人(Nature434：514-520(2005))认为CART肽在骨吸收中起作用，DeokAh等人(Endocrinology147(7)：3196-3202(2006))认为CART信号传导是造成骨吸收下降的原因。
因此，阐明CART肽具体的作用机制，找到CART受体及信号传导过程，有利于寻找模仿或者阻断CART作用，作为医疗试剂使用的激动剂或者受体拮抗剂，从而为药物筛选搭建平台，具有重要意义。许多实验室都试图用受体结合技术找到CART肽的受体，但是均以失败而告终，在大脑或切片中都没有特异性的受体结合。近年来一系列的实验室证据表明CART肽可以激活G蛋白信号通路，极大地支持了CART肽G蛋白偶联受体的存在；但是通过受体结合技术来验证这些结果时，存在着结合性低并且易变化等问题，还需要更多的实验来验证。
目前主要通过用125I标记CART55-102和CART62-102的方法来进行CART肽的受体结合实验（Aleksandra Vicentic et al，CART（***e-and amphetamine-regulated transcript）peptide receptors：Specificbinding in AtT20 cells，European Journal of Pharmacology，2005；Yiming Lin et al，CART peptide stimulation of G protein-mediatedsignaling in differentiated PC12 Cells：Identification of PACAP 6-38 asa CART antagonist，Neuropeptides，2011）。碘化反应的基本原理如下：通过氧化剂使碘化物（125I-）氧化成碘分子（125I2），碘分子再与多肽或蛋白质分子中的酪氨酸残基发生碘化作用。所以不管采用何种碘标记法，标记的化合物内必须有碘原子可结合的基团，即要含有酪胺基或组织胺残基。结构中含上述基团的蛋白质或肽类等抗原可直接用放射性碘进行标记。如不含上述基团的，放射性碘无法标记，必须在这些化合物的结构上连接上述基团后才能进行碘标记。因此影响蛋白质、多肽碘化效率的因素，主要决定于蛋白质、多肽分子中酪氨酸残基的数量及它们在分子结构中暴露的程度。鉴于CART肽中所含酪胺基或组织胺残基较少，会导致碘化效率的降低；同时直接标记的过程难以控制，还可能造成CART肽的结构、稳定性、生物活性和药代动力学发生不可预料的改变，因此，迫切需要开发出一种可以高效标记CART肽的标记方法，以及可以提高PET显像的灵敏度的示踪剂，，更好地追踪CART肽在神经中枢受体的分布情况，进而研究CART肽与其受体的具体作用机制。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是现有技术中CART肽的标记效率低进而影响PET显像的问题，从而提供一种标记效率高，纯度高，制备简单，稳定性好的以18F标记的CART多肽化合物及其制备方法；
并进一步的提供上述CART多肽化合物用作PET示踪剂的应用，以及其在监测CART肽在神经中枢的受体分布中的应用。
为解决上述技术问题，本发明是通过以下技术方案实现的：
一种CART多肽化合物，具有如下所示的结构：18F-Al-NOTA-CART，其中，所述CART肽为来源于人、大鼠、小鼠或金鱼的CART肽。
所述CART肽包括SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列。
所述CART肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2，SEQID NO：3或SEQ ID NO：4所示。
所述CART多肽化合物的制备方法包括如下步骤：
S01：通过18O（p，n）18F反应生成无载体18F-，并将其富集在QMA柱上，用KHCO3溶液将18F-洗脱，加入乙腈共沸蒸干，以冰醋酸缓冲溶液调节pH至3.8-4.2，得到所需的18F-反应液；所述18O（p，n）18F反应可以采用本领域技术人员熟知的方式及设备进行，本发明各实施例中选择回旋加速器进行反应，所述QMA柱先用本领域技术人员熟知且常用类型即可；
S02：取含有NOTA的醋酸缓冲液以及选定的CART肽，加入乙腈在40-50℃下油浴反应，得到NOTA-CART溶液；
S03：向所述步骤S01中所得的18F-反应液中加入AlCl3溶液以及步骤S02中配制的NOTA-CART溶液，并用醋酸钠缓冲溶液调节pH为3.9-4.5，保持95-105℃反应；
S04：用反相HPLC柱进行纯化，得到所述的多肽化合物18F-Al-NOTA-CART。
所述步骤S04中，所述HPLC的条件为：选用的填料为十八烷基硅烷键合硅胶，流动相为乙腈-水，其比例为55∶45，所述流动相的流速为0.8mL/min，检测波长为254nm，收集出峰时间为15min时的产品；本发明各实施例中选用C18柱(Agilent，5um，4.6*250mm）进行纯化处理。
所述步骤S03中，所述NOTA-CART溶液以及所述AlCl3溶液的摩尔比为1.5∶1～2∶1。
进一步的，所述含有NOTA-CART溶液中，所述NOTA与所述CART肽的摩尔比为1.5∶1～2∶1。
所述含有NOTA的醋酸缓冲液的浓度为8～10mg/mL，本发明优选10mg/mL，配制方法为：0.25mg的NOTA（1,4,7-三氮环壬烷-1,4,7-三乙酸，CAS号：56491-86-2，购于华益埃索托普公司（国内））溶于25uL浓度为0.1M的醋酸缓冲溶液；或者本领域技术人员可以根据需要选用其他合理的浓度也可以实现发明的目的。
所述步骤S01中，本领域技术人员可根据所选择设备的性能选择合理浓度的洗脱液，本发明中选用KHCO3作为洗脱液，且所述KHCO3溶液的浓度优选为0.4mol/L。
本发明还提供根据上述所述的方法制备得到的CART多肽化合物。
进一步的，本发明还提供了一种PET示踪剂，即为所述的CART多肽化合物。
本发明还提供了一种检测CART肽在神经中枢受体分布的技术，即使用所述的PET示踪剂对神经中枢中CART肽受体的分布情况进行PET显像。
分子影像学（Molecular Imaging）是应用影像学方法对活体状态下的生物过程进行细胞和分子水平的定性和定量研究。在临床前医药研究和临床疾病诊断、疗效评估、预后判断等中已有大量应用。特别是基于计算机断层扫描的核医学分子影像是目前分子影像中最具活力和最具前景的影像技术，它是以体内特定分子作为成像对比度的医学影像学技术，能在真实、完整的人或动物体内，通过图像直接显示细胞或分子水平的生理和病理过程。它在临床前分子生物学与临床医学之间架起了相互连接的桥梁，也成为目前转化医学（TranslationalMedicine）研究重要的工具之一。
PET全称为正电子发射计算机断层显像(positron emissiontomography，PET)，它是通过将极其微量的正电子核素示踪剂注射到人体内，然后采用特殊的体外测量仪器(PET)探测这些正电子核素在人体全身各脏器的分布情况，通过计算机断层显像的方法显示人体全身主要器官的生理代谢功能和结构。PET是γ照相机之后在核素显像又一次重大进展，代表了核医学显像技术的最新成就，它已成为内分泌疾病诊断和研究、药物血浓度监测、某些肿瘤和传染病的诊断分型和受体研究的重要手段，应用广泛。
PET技术的灵敏度和特异性明显地取决于使用的信号传导物质(示踪剂)及其在体内的分布。PET扫描中使用的放射性核素通常是具有短半衰期的正电子发射同位素，例如11C(20min)、13N(10min)、15O(2min)、18F(110min)、131I(8天)和124I(4.2天)。这些放射性核素并入诸如葡萄糖(或葡萄糖类似物)、水或氨的身体常用的化合物中，或者并入结合受体或其他药物作用部位的分子中。
本发明的上述技术方案相比现有技术具有以下优点：
（1）本发明所述的18F标记的多肽化合物18F-Al-NOTA-CART，是通过双功能螯合剂NOTA实现18F和CART肽的连接的；由于NOTA可与CART肽的N末端通过脱水缩合反应进行连接，再通过螯合反应被放射性核素标记，化学过程相对简单明了，且反应产物单一，便于分离纯化；相对于其他标记方法需要与某种特定氨基酸结合导致标记范围受限，本发明所述的方法有效避免了因为CART肽中酪氨酸残基含量的多少及其在分子中的暴露程度对标记效率产生影响的问题，从而提高CART肽的放射性标记效率，将其作为示踪剂进行PET显像处理时，有效提高了PET显像的灵敏度，便于对CART肽受体进行进一步的研究；
（2）由于氟在常温下是淡黄色气体，化学性质活泼，几乎所有物质都能被其氧化成氟化物；且化合物分子中的氢被氟取代后，如果取代部位不是生物活性中心，则不会影响该化合物的生物活性；并且由于18F的半衰期相对较长(110min)，有利于一些较复杂的合成标记；另外，18F标记的小分子多肽易穿透组织，且具有生物专一性；因此，本发明所述的18F标记的CART多肽化合物具有与CART相近似的活性，可以有效的显示CART受体的分布情况；
（3）由于18F分子相对于小分子多肽的体积较大，常常会引起分子结构变形，进而影响其生物活性，因而本发明所述的方法采用18F标记双功能螯合剂的方式与Al金属离子形成稳定的络合物，进一步稳定了标记产物的生物活性，因此本发明所述的18F标记的多肽化合物18F-Al-NOTA-CART中，18F对标记的多肽生物活性影响较小；因此18F-Al-NOTA-CART能够得到与CART肽相同的生物性能；
（4）通过双功能螯合剂的使用，使得本发明所述的18F标记的多肽化合物18F-Al-NOTA-CART，其制备过程仅需30min，工艺简单易行，且标记效率高达45％，并且放化纯度高，成本低；
（5）利用本发明所述的CART多肽化合物为示踪剂，应用PET显像技术在体内外各水平对CART肽的体内过程进行研究，考察CART肽在神经中枢的受体分布情况及其用于精神活性物质依赖靶标的作用机制；
（6）实验证明，本发明所述的18F标记的多肽化合物18F-Al-NOTA-CART具有良好的生物性能，ICR小鼠各脏器对18F-Al-NOTA-CART的放射性摄取的SUV值并无统计学差异，说明两者具有相同的生物学性质；且18F-Al-NOTA-CART靶/非靶比值达到了4倍多，可以满足CART肽体内和体外作用过程的研究。
附图说明
为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面结合附图，对本发明作进一步详细的说明，其中，
图1是实施例1所制备的18F-Al-NOTA-CART的放射性TLC图
谱；
图2是对ICR小鼠注射实施例1所制备的18F-Al-NOTA-CART30min后的Micro PET脑部扫描图；
图3是对ICR小鼠注射实施例5所制备的18F-SFB-CART30min后的Micro PET脑部扫描图。
具体实施方式
实施例1
本实施例所制备的具有18F-Al-NOTA-CART结构的CART多肽化合物是对SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的CART进行18F标记，所述具有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的CART肽来源于大鼠或小鼠，其制备过程包括如下步骤：
S01：采用回旋加速器，通过18O（p，n）18F反应生成无载体18F-并将其富集在QMA柱上，用200μL浓度为0.4mol/L的KHCO3溶液将18F-洗脱进反应管，加入乙腈共沸蒸干两次，以0.1mol/L的冰醋酸缓冲溶液调节pH至4.0，得到所需的18F-反应液，采用CRC-15R活度计（CAPINTEC）测定其放射剂量为387mCi；
S02：取含有NOTA的醋酸缓冲液（NOTA浓度为10mg/mL）25μL以及氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示的CART肽25μg，加入25μL乙腈在45℃下油浴反应，得到NOTA-CART溶液，其浓度为10mg/ml；
S03：向所述步骤S01中所得的18F-反应液中加入3μL浓度为2mg/mL的AlCl3溶液以及步骤S02中配制的NOTA-CART溶液30μL，并用0.1mol/L的醋酸钠缓冲溶液调节pH为4.1，100℃反应15min；
S04：用填料为十八烷基硅烷键合硅胶，流动相为乙腈：水=55∶45，检测波长为254nm，流速为0.8mL/min的反相HPLC柱进行纯化，收集15min的产品，即得到所述的多肽化合物18F-Al-NOTA-CART，采用CRC-15R活度计（CAPINTEC）测定其放射剂量为182mCi。
实施例2
本实施例所制备的具有18F-Al-NOTA-CART结构的CART多肽化合物是对SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的CART进行18F标记，所述具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的CART肽来源于大鼠或小鼠，其制备过程包括如下步骤：
S01：采用回旋加速器，通过18O（p,n）18F反应生成无载体18F-，并将其富集在QMA柱上，用200μL浓度为0.4mol/L的KHCO3溶液将18F-洗脱进反应管，加入乙腈共沸蒸干，以0.1mol/L的冰醋酸缓冲溶液调节pH至4.0，得到所需的18F-反应液,采用CRC-15R活度计（CAPINTEC）测定其放射剂量为379mCi；
S02：取含有NOTA的醋酸缓冲液（NOTA浓度为10mg/mL）18μL以及氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示的CART肽25μg，加入乙腈25μL在45℃下油浴反应，得到NOTA-CART溶液，其浓度为10mg/ml；
S03：向所述步骤S01中所得的18F-反应液中加入3μL浓度为2mg/mL的AlCl3溶液以及步骤S02中配制的NOTA-CART溶液22μL，并用0.1mol/L的醋酸钠缓冲溶液调节pH为4.1，保持100℃反应15min；
S04：用填料为十八烷基硅烷键合硅胶，流动相为乙腈：水=55∶45，检测波长为254nm，流速为0.8mL/min的反相HPLC柱进行纯化，收集15min的产品，得到所述的多肽化合物18F-Al-NOTA-CART，采用CRC-15R活度计（CAPINTEC）测定其放射剂量为171mCi。
实施例3
本实施例所制备的具有18F-Al-NOTA-CART结构的CART多肽化合物是对SEQ ID NO：3所示氨基酸序列的CART进行18F标记，所述具有SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列的CART肽来源于人，其制备过程包括如下步骤：
S01：采用回旋加速器，通过18O（p,n）18F反应生成无载体18F-，并将其富集在QMA柱上，用200μL浓度为0.4mol/L的KHCO3溶液将18F-洗脱进反应管，加入乙腈共沸蒸干，以0.1mol/L的冰醋酸缓冲溶液调节pH至3.8，得到所需的18F-反应液,采用CRC-15R活度计（CAPINTEC）测定其放射剂量为400mCi；
S02：取含有NOTA的醋酸缓冲液（NOTA浓度为10mg/mL）20μL以及氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示的CART肽25μg，加入乙腈25μL在40℃下油浴反应，得到NOTA-CART溶液，其浓度为10mg/ml；
S03：向所述步骤S01中所得的18F-反应液中加入3μL浓度为2mg/mL的AlCl3溶液以及步骤S02中配制的NOTA-CART溶液25μL，并用0.1mol/L的醋酸钠缓冲溶液调节pH为4.5，保持95℃反应15min；
S04：用填料为十八烷基硅烷键合硅胶，流动相为乙腈：水=55∶45，检测波长为254nm，流速为0.8mL/min的反相HPLC柱进行纯化，收集15min的产品，得到所述的多肽化合物18F-Al-NOTA-CART，采用CRC-15R活度计（CAPINTEC）测定其放射剂量为172mCi。
实施例4
本实施例所制备的具有18F-Al-NOTA-CART结构的CART多肽化合物是对SEQ ID NO：4所示氨基酸序列的CART进行18F标记，所述具有SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列的CART肽来源于大鼠和小鼠，其制备过程包括如下步骤：
S01：采用回旋加速器，通过18O（p,n）18F反应生成无载体18F-，并将其富集在QMA柱上，用200μL浓度为0.4mol/L的KHCO3溶液将18F-洗脱进反应管，加入乙腈共沸蒸干，以0.1mol/L的冰醋酸缓冲溶液调节pH至4.2，得到所需的18F-反应液,采用CRC-15R活度计（CAPINTEC）测定其放射剂量为390mCi；
S02：取含有NOTA的醋酸缓冲液（NOTA浓度为10mg/mL）22μL以及氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示的CART肽25μg，加入25μL乙腈在50℃下油浴反应，得到NOTA-CART溶液，其浓度为10mg/ml；
S03：向所述步骤S01中所得的18F-反应液中加入3μL浓度为2mg/mL的AlCl3溶液以及步骤S02中配制的NOTA-CART溶液28μL，并用0.1mol/L的醋酸钠缓冲溶液调节pH为3.9，保持105℃反应15min；
S04：用填料为十八烷基硅烷键合硅胶，流动相为乙腈：水=55∶45，检测波长为254nm，流速为0.8mL/min的反相HPLC柱进行纯化，收集15min的产品，得到所述的多肽化合物18F-Al-NOTA-CART，采用CRC-15R活度计（CAPINTEC）测定其放射剂量为176mCi。
实施例5
本实施例所制备的具有18F-SFB-CART结构的CART多肽化合物是对SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的CART进行18F标记，所述具有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的CART肽来源于大鼠和小鼠，其制备过程包括如下步骤：
S11：采用回旋加速器，由18O（p，n）18F反应生成的无载体18F-富集在QMA柱上，用K2.2.2/K2CO3溶液将18F-洗脱进反应管，加入乙腈共沸蒸干两次，得到18F-，采用CRC-15R活度计（CAPINTEC）测定其放射剂量为390mCi；
S12：向所述步骤S11所得的反应液中加入4-三甲胺苯甲酸乙酯三氟磺酸盐12mg，90℃反应10min，冷却10min；加入0.5M的NaOH0.5mL，90℃水解5min，得到澄清透明的溶液；冷却10min，加入0.1M的HCl7.5ml和1.5ml乙腈，再通过一个活化的Sep-Pak C18柱，用3ml乙腈洗脱，得到4-18F-氟苯甲酸；
S13：向所述步骤S11所得的反应液中加入12mg TSTU（O-（N-琥珀酰亚胺）-1，1,3,3-四甲基脲四氟硼酸酯），在90℃下密闭反应5min，冷却10min，加入0.1M的HCl溶液5ml，再通过一个活化的Sep-PakC18柱，用2ml乙腈洗脱，得到18F-SFB（N-琥珀酰亚胺-4-18F-氟苯甲酸酯）；
S14：取1mg CART加入pH=8.4的0.1M的碳酸缓冲溶液1ml放入反应管，再快速取18F-SFB0.05ml加入反应管中，65℃油浴反应30min，得到18F-SFB-CART，采用CRC-15R活度计（CAPINTEC）测定其放射剂量为3.5mCi。
实施例6
本实施例所制备的具有125I-CART结构的CART多肽化合物是对SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的CART进行I125标记，所述具有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的CART肽来源于大鼠和小鼠，其制备过程包括如下步骤：
S21：将10μl CART肽(10mg/ml)与7μl NaI125(8.0mCi)、20μl0.2mol/L PB（pH8.5）、10μl氯胺-T（5mg/ml）,在15-60℃下涡旋震荡30-60s；
S22：加入20μl偏重亚硫酸钠（10mg/ml），涡旋振荡2-5min终止反应；
S23：用平衡好的C18固相萃取小柱将反应液解析分离纯化，先用蒸馏水将游离碘等易放射性杂质洗去，125I-CART吸附在C18固相萃取小柱上，再用10mM盐酸乙醇将125I-CART从C18柱上洗脱，得到125I-CART,采用CRC-15R活度计（CAPINTEC）测定其放射剂量为2.8mCi。
分别测定实施例1-6中所制备得到的CART多肽化合物的标记效率及放化纯。
计算标记效率的公式为：
18F标记CART的标记效率=产品的放射剂量（mCi）/洗脱进反应管中的18F-的放射剂量（mCi）*100%；
125I标记CART肽的标记效率=产品的放射剂量（mCi）/NaI125的放射剂量（mCi）*100%；因此，
实施例1中，18F-Al-NOTA-CART的标记效率=182/387*100％=47％；
实施例2中，18F-Al-NOTA-CART的标记效率=171/379*100％=45％；
实施例3中，18F-Al-NOTA-CART的标记效率=172/400*100％=43％；
实施例4中，18F-Al-NOTA-CART的标记效率=176/390*100％=45％；
实施例5中，18F-SFB-CART的标记效率=3.5*40/390*100％=36％；
实施例6中，125I-CART的标记效率=2.8/8.0*100％*100％=35％。
产品的放化纯的检测是通过薄层色谱（TLC）法进行检测，分析***如下：展开剂为V(乙腈)/V(水)=95:5，支持物为硅胶板，通过薄层分析仪检测得到产品的放化纯。
仅以实施例1为例，实施例1所制备的18F-Al-NOTA-CART的放射性TLC图谱如图1所示，根据峰面积积分得出产品的放化纯为98%。
上述实施例1-6中所述各标记方法的反应性能等情况见下表：
| 项目 | 标记位点 | 标记效率 | 产品的放化纯 | 总反应耗时 |
| 实施例1 | N末端 | 47% | 98% | 30min |
| 实施例2 | N末端 | 45% | 90% | 30min |
| 实施例3 | N末端 | 43% | 93% | 30min |
| 实施例4 | N末端 | 45% | 91% | 30min |
| 实施例5 | 酪氨酸残基 | 36% | 78% | 90min |
| 实施例6 | 酪氨酸残基 | 35% | 83% | 20min |
实施例1-4通过采用双功能螯合剂NOTA将CART肽与18F相连接，整个制备过程仅需30min，工艺简单，标记效率高约45%，成本低，产物放化纯度高（90%以上，高达98%）；而通过辅基SFB连接18F和CART肽的整个过程繁琐，需要多次进行色谱层析才能完成标记过程，总耗时约90min，使其应用受到了一定的限制；碘直接标记CART肽虽然操作简单，耗时较少，但是碘化标记的效率比较低，仅为35%左右；同时直接标记可能造成CART肽的结构、稳定性、生物活性和药代动力学发生不可预料的改变，从而影响CART肽的各项研究，其应用也有一定的局限性。
实施例718F-Al-NOTA-CART的生物学性能分析
通过大鼠行为学测定检验分析18F-Al-NOTA-CART的生物学性能。所用的18F-Al-NOTA-CART分别由实施例1-4制备，所用对照分别为具有SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：3和SEQID NO：4所示的氨基酸序列的CART肽。
实验1
实验材料：SD大鼠27只，体重（200~220g）
实验方法：将大鼠随机分为9组：模型组3只、CART组12只、18F-Al-NOTA-CART组12只；其中CART组又分为4组，每组3只，各组分别对应具有SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列的CART肽，分别标记为CART-1，CART-2，CART-3，CART-4，；相应地，18F-Al-NOTA-CART组也分为4组，每组3只，各组分别对应实施例1-4制备的18F-Al-NOTA-CART，分别标记为18F-Al-NOTA-CART-1，18F-Al-NOTA-CART-2，18F-Al-NOTA-CART-3，18F-Al-NOTA-CART-4；各大鼠分笼饲养(每笼一只)。所述模型组不给药作为对照之用，给药组24只10%水合氯醛麻醉，常规侧脑室埋植注射用导管，手术7天后大鼠禁食24h,自由饮水。禁食24h后给药组分别侧脑室注射含有CART、18F-Al-NOTA-CART 5μg/㎏的人工脑脊液。观察大鼠给药后进食行为，并于24h后称取剩余食物计算摄食量。观察CART及18F-Al-NOTA-CART对大鼠饥饿后进食行为的影响。
实验结果：如表1所示
表1CART、18F-CART对饥饿大鼠摄食量的影响
注：各组样本数n=3，与对照组比较：*p<0.05，**p<0.01
实验结果表明，尾静脉注射CART肽能显著抑制饥饿小鼠的进食行为；尾静脉注射18F-Al-NOTA-CART同样能抑制小鼠的进食行为；这就说明各实施例中标记后的18F-Al-NOTA-CART具有与CART肽相同的生物性能。
实施例818F-Al-NOTA-CART和18F-SFB-CART在ICR小鼠体内的分布及小鼠脑部Micro PET显像
为进一步考察两种标记方法标记的CART的生物学性能，我们将实施例1制备得到的18F-Al-NOTA-CART和实施例5制备得到的18F-SFB-CART进行了Micro PET扫描，分2组ICR小鼠，每组6只，扫描方法为尾静脉注射（50-100uCi/只）30min后，采用小动物麻醉仪，通入异氟烷和氧气的混合气体麻醉小鼠，然后进行Micro PET扫描10min，图像经OSEM3D重建，勾画个脏器的感兴趣区域，计算组织摄取SUV值如下表2：
表2：注射后30min18F-Al-NOTA-CART和18F-SFB-CART在ICR小鼠体内的分布数据（n=6，mean±sd）
| 18F-Al-NOTA-CART | 18F-SFB-CART | |
| 心 | 5.21±0.68 | 4.89±0.33 |
| 肝 | 8.72±0.94 | 9.54±0.29 |
| 肾 | 18.28±2.00 | 19.96±0.87 |
| 肠 | 4.41±0.39 | 4.23±0.38 |
| 脑 | 3.67±0.76 | 3.17±0.43 |
| 肌 | 0.83±0.08 | 0.81±0.10 |
Micro PET扫描ICR小鼠脑部图如图2和图3所示。
Micro PET扫描结果显示，18F-Al-NOTA-CART和18F-SFB-CART在动物体内，主要分布于心、肝、肾、肠和脑等组织器官，主要通过肾脏***，注射后30min肾脏摄取的SUV值分别达到18.28±2.00和19.96±0.87，各脏器对两种标记物（18F-Al-NOTA-CART和18F-SFB-CART）放射性摄取的SUV值无统计学差异，表明两者具有相同的体内分布和生物学性质。尤为重要的是，两种标记物在脑部摄取的SUV值结果（3.67±0.76和3.17±0.43）显示，两个标记物都能透过血脑屏障，注射后30min的脑/肌肉放射性比值达到4倍之多。
因此，可通过Micro PET/PET进行CART肽动物或人体扫描，可以在体内外各水平对CART肽的体内过程进行研究，考察CART肽在神经中枢的受体分布情况及其用于精神活性物质依赖靶标的作用机制。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
Claims (10)
1.一种CART多肽化合物，具有如下所示的结构：18F-Al-NOTA-CART，其中，所述CART为来源于人、大鼠、小鼠或金鱼的CART肽。
2.根据权利要求1所述的CART多肽化合物，其特征在于，所述CART肽包括SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列。
3.根据权利要求1或2所述的CART多肽化合物，其特征在于，所述CART肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4所示。
4.一种制备权利要求1-3任一所述CART多肽化合物的方法，其特征在于，包括如下步骤：
S01：通过18O（p，n）18F反应生成无载体18F-，并将其富集在QMA柱上，用KHCO3溶液将18F-洗脱，加入乙腈共沸蒸干，以冰醋酸缓冲溶液调节pH至3.8-4.2，得到所需的18F-反应液；
S02：取含有NOTA的醋酸缓冲液以及选定的CART肽混合，加入乙腈在40-50℃下油浴反应，得到NOTA-CART溶液；
S03：向所述步骤S01中所得的18F-反应液中加入AlCl3溶液以及步骤S02中配制的NOTA-CART溶液，并用醋酸钠缓冲溶液调节pH为3.9-4.5，保持95-105℃反应；
S04：用反相HPLC柱进行纯化，得到所述的多肽化合物18F-Al-NOTA-CART。
5.根据权利要求4所述的制备CART多肽化合物的方法，其特征在于，所述步骤S04中，所述HPLC的条件为：选用的填料为十八烷基硅烷键合硅胶，流动相为乙腈-水，其比例为55∶45，所述流动相的流速为0.8mL/min，检测波长为254nm，收集出峰时间为15min时的产品。
6.根据权利要求4或5所述的制备CART多肽化合物的方法，其特征在于，所述步骤S03中，所述NOTA-CART溶液以及所述AlCl3溶液的摩尔比为1.5∶1～2∶1。
7.根据权利要求6所述的制备CART多肽化合物的方法，其特征在于，所述含有NOTA-CART溶液中，所述NOTA与所述CART肽的摩尔比为1.5∶1～2∶1。
8.根据权利要求4-7任一所述的方法制备得到的CART多肽化合物。
9.一种PET示踪剂，其特征在于，为权利要求1或2或3或8所述的CART多肽化合物。
10.一种检测CART肽在神经中枢受体分布的技术，其特征在于，使用权利要求9所述的PET示踪剂进行PET显像。
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