CN104833810A - 一种补体c3检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种补体C3检测方法，所述检测方法基于胶乳增强免疫比浊法，为液体双试剂，包括试剂R1与R2，所述试剂R1含PH6.0磷酸盐缓冲液，吐温-20(Tween 20)，乙二胺四乙酸二钠(EDTA-2Na)，氯化钠，聚乙二醇(PEG6000)，叠氮钠；试剂R2为含有补体C3胶乳颗粒的溶液，其特点在于应用化学方法交联，通过水溶性碳化二亚胺(EDC)与N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)使羊抗人补体C3抗血清与羧化聚苯乙烯胶乳共价交联，形成补体C3胶乳试剂。本试剂灵敏度高，特异性强，试剂配制简单，值得进一步推广使用。
Description
技术领域：
本发明属于生物技术领域，提供一种补体C3检测方法，具有灵敏度高，特异性强，试剂配制简单的特点，值得进一步推广使用。
背景技术：
C3是血清中含量最高的补体成分，由巨噬细胞、单核细胞、淋巴组织、骨髓、腹膜和肝脏等合成的一种β球蛋白，在C3转化酶的作用下，裂解成C3a和C3b两个片段，在补体经典激活途径和旁路激活途径中均发挥重要作用。
C3是补体各成分中含量最高的一种，且是补体激活途径中最重要的环节，故其含量的测定非常重要。C3增多与减少与总补体活性基本相符，但更为敏感。约70％-80％的急性肾小球肾炎、狼疮性肾炎患者血清C3含量减少，病情缓解后可恢复正常，故C3的测定不仅有助于诊断，还可以观察疗效和监测预后。C3降低还可见于自身免疫性疾病、新生儿呼吸窘迫综合征、菌血症、组织损害和慢性肝炎。
补体C3的检测方法有单向免疫扩散法、ELISA法、免疫透射比浊法等。单向免疫扩散法费时，变异大，结果不易观察，测量直径不精确；ELISA法重复性不好，易出现假阳性，受温度和时间影响最大；免疫透射比浊法相对优于之前两种方法，但存在所需抗血清量大的缺点。本发明采用胶乳增强免疫比浊法，不仅灵敏度高，准确性好，不费时的优点，而且所需的样本量极少，更加经济节约。
发明内容：
本发明的目的在于，大量制备补体C3胶乳试剂，以提高补体C3检测效率，增强检测准确性。
本发明的技术方案：应用化学方法交联，通过水溶性碳化二亚胺(EDC)与N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)使羊抗人补体C3抗血清与羧化聚苯乙烯胶乳共价交联，形成补体C3胶乳试剂。具体操作如下：
补体C3胶乳试剂的制备：
取粒径为100nm浓度为5％胶乳微球1ml，加入100mmol/L，PH6.0的磷酸盐缓冲液9ml，混合均匀后分别加入5mg水溶性碳化二亚胺(EDC)与N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，室温搅拌20min，2-8℃离心30min(转速12000)，用100mmol/L，PH6.0的磷酸盐缓冲液洗涤三次，除去上清液，取沉淀用100mmol/L，PH6.0的磷酸盐缓冲液1ml重悬，并加入200μl羊抗人补体C3抗血清，室温搅拌5h，2-8℃离心30min(转速12000)，沉淀用含0.05％吐温-20(Tween 20)，100mmol/L，PH6.0的磷酸盐缓冲液洗涤三次，除去上清液，所得沉淀用100mmol/L，PH6.0的磷酸盐缓冲液进行稀释，2-8℃密封保存。
本检测方法的原理为将羊抗人补体C3抗体交联于胶乳微粒上，与待测样品中的补体C3发生抗原-抗体反应，引起微粒凝集，形成一定的浊度，在340nm波长下，通过同样处理的校准品对照，定量检测出样品中补体C3的含量。
附图说明：
图1分别采用本发明试剂与市售试剂A，采用奥林巴斯400全自动生化分析仪，对50份样本(包含正常和异常样本)，按各自参数进行测定，并对测定值进行相关分析。其中X轴表示的是本发明试剂的测定值，Y轴表示的是市售试剂A的测定值。相关系数：r2＝0.9948，线性方程为：y＝1.041x-0.054。
图2：采用奥林巴斯400全自动生化分析仪，对5个梯度浓度的试剂进行测定，并对测定值进行相关分析。其中X轴表示的是稀释浓度，Y轴表示的是测定值均值。相关系数：r2＝0.9963，线性方程为：y＝1.0272x-0.0007。
具体实施方式：
实施例
将本发明方法配制成试剂盒，进行与市售试剂盒进行性能比较：
本发明试剂配成试剂盒的具体成分如下：
补体C3检测试剂的使用：
1)检测仪器：具有340nm波长、37℃恒温装置的生化分析仪。
2)待测样本：新鲜不溶血血清，2-8℃可稳定七天。-20℃可稳定一个月。
3)具体检测程序：
4)计算结果：补体C3浓度(g/L)＝ΔAT/ΔAS×Cs
ΔAT：样品管吸光度
ΔAS：校准管吸光度
Cs：校准品浓度值
5)参考值范围：0.9～1.5g/L
6)精密度：批内CV≤4％；批间相对极差≤6％。
7)准确度：相对偏差控制在±10％内。
8)线性范围：在0.1～3g/L范围内，相关系数r≥0.990。
对照的市售进口试剂A，其信息如下：
产品名称：补体C3检测试剂盒(免疫比浊法)
检测原理：人血清中补体C3与抗血清试剂中的C3抗体形成抗原抗体复合物，使反应液出现浊度，在340nm下检测吸光度的变化与标准品比较测得血清中补体C3的浓度。
主要组成成份：
试剂R1：TRIS缓冲液：100mmol/L，pH 8.0
聚乙二醇：3.0％
防腐剂
试剂R2：抗人C3/C3b/C3c抗体(山羊)：根据滴度
TRIS缓冲液：33mmol/L
防腐剂
市售试剂A按说明书操作。
实例1本发明试剂与市售试剂A的性能指标比较：
1)精密度测定：同一样品中连续抽取20次进行测定，计算测定值的均数、标准差和变异系数，
表1精密度检测结果
变异系数CV通常用于衡量一项测定方法的精密度，CV值越小，表示该测定方法的结果精密度越好。对于临床化学检验项目而言，CV小于5％的方法精密度公认是可以接受的。表1中本发明试剂的CV值小于市售试剂A，表明本发明方法的精密度略优于市售试剂A。
2)线性测定：分别采用本发明试剂与市售试剂A，采用奥林巴斯400全自动生化分析仪，对50份样本(包含正常和异常样本)，按各自参数进行测定，并对测定值进行相关分析(结果见图1，X轴表示的是本发明试的测定值，Y轴表示的是市售试剂A的测定值)。相关系数：r2＝0.9948，线性方程为：y＝1.041x-0.054，结果表明本试剂与市售试剂相关性良好。
表2线性相关检测结果
实例2本发明试剂配制成试剂盒相关性能评估
1)精密度测定：同一样品中连续抽取20次进行测定，计算测定值的均数、标准差和变异系数，
表3精密度检测结果
变异系数CV通常用于衡量一项测定方法的精密度，CV值越小，表示该测定方法的结果精密度越好。对于临床化学检验项目而言，CV小于5％的方法精密度公认是可以接受的。表3中CV值小于3％，表明本发明方法具有优良的精密度。
2)准确度测定：用同一质控品，重复测定3次，取平均值，与质控品靶值相对偏差应在±10％范围内。
表4准确度检测结果
表4中相对偏差CB＝-2.00％，处于±10％范围内，表明本发明方法具有优良的准确度。
3)线性测定：使用去离子水将试剂稀释成5个梯度浓度，每个梯度浓度检测3次，取平均值，对测定值与预期值作回归分析，计算r值和相对偏差(结果见图2，单位g/L)。
表5线性相关检测结果
通过表5得到相关系数：r2＝0.9963，线性方程为：y＝1.0272x-0.0007，结果表明本试剂相关性良好。
4)稳定性测定：将本发明检测试剂分别放置在室温和4℃冰箱，以新鲜配制的3.0g/L人补体C3标准品替代样品，每隔1个月测定1次，记录出现凝集所需时间，结果见表6。结果表明，试剂盒在4℃冰箱放置至少6个月以上不会有明显活性丧失，但不宜在室温存放。
表6稳定性检测结果
| 室温下 | 出现凝集的时间(min) | 4℃下 | 出现凝集的时间(min) |
| 新配制 | 1 | 新配制 | 1 |
| 存放1个月 | 2 | 存放1个月 | 1 |
| 存放2个月 | 不凝集 | 存放2个月 | 1 |
| 存放3个月 | 不凝集 | 存放3个月 | 1 |
| 存放4个月 | 不凝集 | 存放4个月 | 1 |
| 存放5个月 | 不凝集 | 存放5个月 | 1 |
| 存放6个月 | 不凝集 | 存放6个月 | 1 |
5)特异性测定：选取3种潜在干扰物进行干扰实验测定，均无抑制效果，表明该试剂盒有良好特异性，结果如表7所示：
表7特异性检测结果
Claims (4)
1.本发明提供一种补体C3检测方法，所述检测方法基于胶乳增强免疫比浊法，为液体双试剂，包括试剂R1与R2，所述试剂R1含PH6.0磷酸盐缓冲液，吐温-20(Tween 20)，乙二胺四乙酸二钠(EDTA-2Na)，氯化钠，聚乙二醇(PEG6000)，叠氮钠；试剂R2为含有补体C3胶乳颗粒的溶液，其特点在于应用化学方法交联，通过水溶性碳化二亚胺(EDC)与N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)使羊抗人补体C3抗血清与羧化聚苯乙烯胶乳共价交联，形成补体C3胶乳试剂。
2.根据权利要求1所述化学交联方法制备补体C3胶乳试剂，其特征在于所用的羧化聚苯乙烯胶乳粒径为100nm。
3.根据权利要求1所述化学交联方法制备补体C3胶乳试剂，其特征在于羧化聚苯乙烯胶乳与羊抗人C3抗血清共价交联过程中分别添加水溶性碳化二亚胺(EDC)与N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)。
4.根据权利要求1所述，其特征在于样品中mAlb的计算公式为：
样品中补体C3浓度(g/L)＝Cs×ΔAT/ΔAS
式中：ΔAT以空白管吸光度为对照的样品管吸光度；
ΔAS以空白管吸光度为对照的校准管吸光度；
CS校准液中补体C3的浓度。
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Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106483299A (zh) * | 2016-10-03 | 2017-03-08 | 王贤俊 | 一种用于检测人血清中超氧化物歧化酶含量的方法 |
| CN107490676A (zh) * | 2017-08-10 | 2017-12-19 | 迈克生物股份有限公司 | 一种补体c3检测试剂盒及检测方法 |
| CN109752332A (zh) * | 2017-11-07 | 2019-05-14 | 重庆中元汇吉生物技术有限公司 | 一种补体C1q检测试剂盒 |
| CN111693697A (zh) * | 2020-07-07 | 2020-09-22 | 上海怡珏生物科技有限公司 | C3c抗体在制备检测试剂盒中的用途 |
-
2015
- 2015-05-02 CN CN201510226757.7A patent/CN104833810A/zh active Pending
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