CN103013165A - 一种利用固定化酶制备红曲红色素的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种红曲色素的制备方法，特别涉及一种利用固定化酶制备红曲红色素的方法。该方法以红曲霉菌液体发酵液为原料，通过均化、固定化酶酶解、碱化、过滤得红曲红色素溶液；红曲红色素溶液通过酸沉淀，沉淀洗涤中和、脱水、干燥，即得到红曲红色素。本发明的优点在于利用胶体磨有效地分散、破碎、乳化、混合发酵液，提高后续酶解效率，同时让菌体中的红曲红色素充分释放出来；另一方面，酶制剂可循环利用，反应条件温和，经酸沉淀法富集，工艺简单、耗能低，产物易分离。经本方法制备的红曲红色素，可明显降低其生产成本。产品最大吸收为499nm，具有良好的水溶性，以及光、热、酸、碱和金属离子稳定性，有利于红曲色素产业推进。
Description
技术领域
本发明涉及一种红曲色素的制备方法，特别涉及一种利用固定化酶制备红曲红色素的方法。
背景技术
随着食品工业的发展和人们生活水平的日益提高，食品色素作为食品添加剂中重要的组成部分已经越来越受到人们的重视，特别是近几年，随着国民对食品安全问题的重视，采用天然色素代替合成色素已是大势所趋。红曲红色素作为农产品的深加工产品，安全性高，稳定性好，具有良好的开发应用前景。
中国发明专利ZL200510044948.8公开了一种利用酶解法提取水溶性红曲色素的方法，本发明的一种利用酶解法提取水溶性红曲色素的方法，包括如下步骤：红曲米→浸泡碱解→加热糊化→酶解→过滤分离→酸沉淀→洗涤→中和→干燥→粉碎→包装。该发明以红曲米为原料，经浸泡碱解，加热糊化，酶解、酸沉淀等工艺，提取水溶性红曲色素。该专利采用游离的酶液进行酶解，由于游离酶溶解于反应体系中，使酶无法从反应体系中分离回收，导致红曲红色素的生产成本高，不利于连续的工业化生产。
发明内容
本发明的目的是提供一种以红曲霉菌液体发酵液为原料，通过均化、固定化酶酶解、酸沉淀富集，制备红曲红色素的方法。有效地分散、破碎、乳化、混合发酵液，提高后续酶解效率，同时让菌体中的红曲红色素充分释放出来，提高色素浸提得率；并解决决传统工艺中酶液不易分离回收，纯化富集过程复杂，成本高，产品色价低的问题，并可提高资源利用率。
本发明以红曲霉菌液体发酵液为原料，通过均化、固定化酶酶解、碱化、过滤得红曲红色素溶液；红曲红色素溶液通过酸沉淀，沉淀洗涤中和、脱水、干燥，即得到红曲红色素。
首先，利用胶体磨处理红曲菌发酵液，利用流体物料受离心力的作用, 强制通过在高速相对运动的定子与转子之间进行剪切、磨擦、高频震动, 有效地进行粉碎、乳化、均质、分散、混合等, 从而获得精细加工的物料，促使菌体中的色素组分充分的释放出来，同时有利于提高后期酶解的效率。
利用固定化复合酶对发酵液进行酶解处理，一方面其中的蛋白酶可以使发酵液体系中的蛋白质迅速水解成可溶性的蛋白片段，明显改善红曲红色素的水溶性，有效提高产品的品质；另一方面，淀粉酶和/或果胶酶和/或纤维素酶和/或木聚糖酶和/或β—葡聚糖酶可以促使菌体细胞壁降解，增加菌体透性，有利于红曲红色素组分的释放，进而提高了资源的利用率。过程通过回收固定化酶，实现酶的循环利用，降低物耗。
酶解液经过碱化，使其中的红曲色素分子中的内酯键打开，生成羧酸盐，促使色素组分溶于溶液体系，提高红曲红色素的收率。
碱化结束后，过滤除去其中的不溶物，得到红曲色素溶液。然后利用酸沉淀使红曲红色素从反应液中沉淀出来，实现富集的目的；再经碱中和溶解的方法，使红曲红色素酸沉淀物生成易溶于水的羧酸盐，提高色素的水溶性和均匀性，得到红曲红色素。
其转化过程如下：
本发明一种利用固定化酶制备红曲红色素的方法，具体步骤如下：
（1）固定化酶的制备
高分子化合物载体加水配制成15 g/L ～100g/L浓度的溶液，在温度为20℃～60℃条件下，搅拌，使其溶解；然后加入与高分子化合物载体质量比为1：1～1：50的酶，搅拌均匀，置于20℃～60℃的恒温摇床上，振荡0.5h～6h；将上述混合液逐滴滴入0.1mol/L～2.5 mol/L的氯化钙溶液中，在3℃～5℃条件下静置30min～150min，使其凝聚固化，收集凝胶小球，并用0.08 mol/L ～0.3 mol/L的氯化钠溶液洗涤，抽滤除去游离水分，收集得到的凝胶小球即为固定化酶；
（2）红曲红色素的制备
①原料：以红曲霉菌液体发酵液为原料；
②均化：将发酵液进胶体磨研磨，碎细度在0.1μm～10μm, 胶体磨作用时间为5 min~120min，得均化后液体；
③酶解：调节步骤②均化后的液体至pH 4.0～ pH 6.0，然后向其中加入步骤（1）制备的固定化酶进行酶解，固定化酶与均化液的质量比为1：1～1：100，酶解条件为20℃～70℃，酶解时间为1h～48h；
④固定化酶回收：将步骤③酶解处理后的反应液粗过滤，回收固定化酶，同时得到滤液即为酶解液；
⑤碱化：向步骤④得到的酶解液中加碱液，调节酶解液至pH 8.0～ pH13.0，碱液浓度为0.5mol/L～10.0 mol/L。
⑥过滤：将步骤⑤反应液过滤，除去不溶物，得到红曲红色素溶液；
⑦酸沉淀：向步骤⑥所得的红曲红色素溶液中加入酸溶液，调节溶液至pH 1～pH3，使其沉淀，静置0.5h～24h后，收集沉淀物；
⑧洗涤、中和：将步骤⑦得到的沉淀物用水洗涤至pH5～pH6，用0.01 mol/L～5.0 mol/L的碱溶液溶解沉淀物，并调节至pH 7～pH12，得到红曲红色素水溶液；
⑨干燥、粉碎：将步骤⑧得到的红曲红色素水溶液进行脱水、干燥处理，得到的干燥粉末即为所制备的红曲红色素。
其中步骤（1）所述的高分子化合物载体为海藻酸钠，以及海藻酸钠与明胶、变性淀粉、果胶和环糊精中的一种或几种的混合物；
步骤（2）所述的碱解中的碱溶液为氢氧化钠溶液、氢氧化钾溶液、碳酸钠溶液和碳酸氢钠溶液中的一种或几种的混合物；
步骤（2）所述的酸沉淀中的酸溶液为盐酸、硫酸、醋酸、柠檬酸、磷酸和乳酸中的一种或几种的混合物；
步骤（2）所述的洗涤、中和所用的碱溶液为氢氧化钠溶液、氢氧化钾溶液、碳酸钠溶液、碳酸钾溶液、碳酸氢钠溶液、碳酸氢钾溶液和碳酸氢铵溶液中的一种或几种的混合物。
上述用于酶解的酶为固定化酶，被固定的酶为含有蛋白酶和淀粉酶和/或果胶酶和/或纤维素酶和/或木聚糖酶和/或β—葡聚糖酶的复合酶。固定化酶酶解过程为在反应器中进行的搅拌酶解，或是将固定化酶装入填充柱中，再将酸化液泵入填充柱进行的循环酶解。
本发明方法制备的红曲红色素，易溶于水；具备良好的热稳定性，0℃～120℃环境下对色素无影响；色素在pH>3范围内具有良好的稳定性，氧化剂和还原剂对色素没有不良影响，葡萄糖和蔗糖溶液对色素没有影响，各种常见食品添加剂的使用基本不影响色素的品质，对金属离子稳定。
本发明方法制备的红曲红色素可以用于纺织工业、塑胶工业和印刷业的着色；可以作为食品着色剂用于粮食、肉制品、水产品等行业加工的着色，可用于配制酒、碳酸饮料、果汁(味)型饮料、果酱、糖果、糕点等；可以用于医药品和化妆品等行业的加工着色。
本发明将胶体磨辅助均化技术和固定化酶技术用于制备红曲红色素，可降低生产成本，提高色素浸提得率，并减少酶液对色素产品造成的杂质污染，有利于提高产品质量。
本发明同传统方法相比较，具有以下优点：
1、利用胶体磨对红曲霉菌发酵液进行均化处理，有效地进行粉碎、乳化、均质、分散、混合等,提高菌体中的色素组分的释率，同时有利于提高后期酶解的效率。
2、利用固定化酶进行酶解，使酶的稳定性增加，易从反应***中分离回收，可节省资源，降低成本。
3、本发明红曲红色素的制备方法，通过酸沉淀和碱性溶液溶解来实现对红曲红色素的纯化富集，可降低能耗。
采用本发明方法制备的红曲红色素，其最大吸收波长为499nm，色价高于200，红曲色素提取率达95%以上。
关键技术说明：
1、胶体磨均化技术
胶体磨是利用流体或半流体物料受离心力的作用, 强制通过在高速相对运动的定子与转子之间进行剪切、磨擦、高频震动, 有效地进行粉碎、乳化、均质、分散、混合等, 其中碎细度和胶体磨作用时间，对物料的处理效果影响较大，本发明一种利用固定化酶制备红曲红色素的方法，将发酵液进胶体磨研磨，碎细度在0.1μm～10μm, 胶体磨作用时间为5 min~120min，得均化后液体。
2、固定化酶酶解技术
高分子化合物载体加水配制成15 g/L ～100g/L浓度的溶液，在温度为20℃～60℃条件下，搅拌，使其溶解；然后加入与高分子化合物载体质量比为1：1～1：50的酶，搅拌均匀，置于20℃～60℃的恒温摇床上，振荡0.5h～6h；将上述混合液逐滴滴入0.1mol/L～2.5 mol/L的氯化钙溶液中，在3℃～5℃条件下静置30min～150min，使其凝聚固化，收集凝胶小球，并用0.08 mol/L ～0.3 mol/L的氯化钠溶液洗涤，抽滤除去游离水分，收集得到的凝胶小球即为固定化酶；所用的高分子化合物载体包括海藻酸钠，以及海藻酸钠与明胶、变性淀粉、果胶和环糊精中的一种或几种的混合物。所述的酶为固定化酶，被固定的酶为含有蛋白酶和淀粉酶和/或果胶酶和/或纤维素酶和/或木聚糖酶和/或β—葡聚糖酶的复合酶。
固定化酶酶解条件为20℃～70℃，pH 4.0～ pH 6.0，酶解时间为1h～48h；固定化酶与均化液的质量比为1：1～1：100，酶解过程为在反应器中进行的搅拌酶解，或是将固定化酶装入填充柱中，再将酸化液泵入填充柱进行的循环酶解。固定化酶重复利用20次仍保持90%以上的酶解得率。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作更进一步的说明，以便本领域的技术人员更了解本发明，但并不因此限制本发明。
实施例1
（1）固定化酶的制备
将35 g的海藻酸钠与25 g明胶混合，加到1L水中，在45℃条件下，搅拌溶解，加入35g的复合酶，搅拌混匀，在45℃恒温摇床上，100r/min振荡0.5h，然后将该混合液逐滴注入1.5mol/L的氯化钙溶液中，在4℃条件下静置50min，使其凝聚固化，收集凝胶小球，用0.2 mol/L的氯化钠溶液洗涤，抽滤除去游离水分，收集凝胶小球得到固定化酶。
（2）红曲红色素的制备
将红曲霉菌的液体发酵液进胶体磨进行均化处理，碎细度为5μm，处理时间为30min；均化结束后，调节溶液至pH4.5，按照湿重与均化液的质量比为1：50的量加入固定化复合酶，于50℃摇床酶解8小时后过滤，回收固定化酶；然后用浓度为0.5mol/L的氢氧化钠溶液调节酶解液至pH8.0，过滤，除去不溶物，得红曲红色素溶液，用5 mol/L的磷酸溶液调节反应液至pH 2.7，静置2小时，过滤，收集沉淀，水洗沉淀至pH5，用0.1 mol/L的碳酸钠溶液溶解沉淀物，并调节至pH8.0，经喷雾干燥，即得红曲红色素粉末。
实施例2
（1）固定化酶的制备
将4g的海藻酸钠溶液与2g的变性淀粉混合，加到100ml水中，在45℃条件下，搅拌溶解，加入2g的复合酶，搅拌混匀，在37℃恒温摇床上，60r/min振荡1.5h，然后将该混合液逐滴注入1.5mol/L的氯化钙溶液中，在4℃条件下静置110min，使其凝聚固化，收集凝胶小球，用0.2 mol/L的氯化钠溶液洗涤，抽滤除去游离水分，收集凝胶小球得到固定化酶。
（2）红曲红色素的制备
将红曲霉菌的液体发酵液进胶体磨进行均化处理，碎细度为1μm，处理时间为20min；均化结束后，调节溶液至pH5.0，按照湿重与均化液的质量比为1：30的量加入固定化复合酶，于55℃摇床酶解6小时后过滤，回收固定化酶；然后用浓度为0.8mol/L的氢氧化钠溶液调节酶解液至pH8.5，过滤，除去不溶物，得红曲红色素溶液，用5.5 mol/L的柠檬酸溶液调节反应液至pH 2.5，放置4小时，离心，收集沉淀，水洗沉淀至pH5，用0.1 mol/L的氢氧化钠溶液溶解沉淀物，并调节至pH8，经喷雾干燥，即得红曲红色素粉末。
实施例3
（1）固定化酶的制备
将100g海藻酸钠加到8L水中，在40℃下搅拌溶解，加入50g的复合酶，搅拌混匀，在37℃恒温摇床上，90r/min振荡0.6h，将该混合液逐滴注入2.0mol/L的氯化钙溶液中，在3℃条件下静置120min，使其凝聚固化，收集凝胶小球，用0.15mol/L的氯化钠溶液洗涤，抽滤除去游离水分，收集凝胶小球得到固定化酶。
（2）红曲红色素的制备
将红曲霉菌的液体发酵液进胶体磨进行均化处理，碎细度为4μm，处理时间为60min；均化结束后，调节溶液至pH4.5，按照湿重与均化液的质量比为1：40的量加入固定化复合酶，于65℃摇床酶解5小时后过滤，回收固定化酶；然后用浓度为2mol/L的氢氧化钾溶液调节酶解液至pH10.0，过滤，除去不溶物，得红曲红色素溶液，用5 mol/L的盐酸溶液调节反应液至pH 2.0，放置3小时，过滤，收集沉淀，水洗沉淀至pH5，用0.3 mol/L的碳酸钠溶液溶解沉淀物，并调节至pH8.5，经喷雾干燥，即得红曲红色素粉末。
实施例4
（1）固定化酶的制备
将30 g海藻酸钠与20g环糊精加到1L水中，在37℃下搅拌溶解，加入30g复合酶，搅拌混匀，在37℃恒温摇床上，120r/min振荡2.5h，将该混合液逐滴注入1.0mol/L的氯化钙溶液中，在5℃条件下静置30min，使其凝聚固化，收集凝胶小球，用0.2 mol/L的氯化钠溶液洗涤，抽滤除去游离水分，收集凝胶小球得到固定化酶，将固定化酶装入玻璃柱中，制成固定化酶柱；
（2）红曲红色素的制备
将红曲霉菌的液体发酵液进胶体磨进行均化处理，碎细度为8μm，处理时间为50min；均化结束后，调节溶液至pH4.5，将均化液泵入固定化酶柱进行酶解，酶解流出液回到不锈钢反应器中，如此循环反应，酶解温度55℃，酶解时间10小时，酶解结束后，回收固定化酶；然后用浓度为4mol/L的碳酸钠溶液调节酶解液至pH9.0，过滤，除去不溶物，得红曲红色素溶液，用6mol/L的盐酸溶液调节反应液至pH 2.0，放置6小时，离心，收集沉淀，水洗沉淀至pH5，用0.3 mol/L的碳酸氢钠溶液溶解沉淀物，并调节至pH7.5，经喷雾干燥，即得红曲红色素粉末。
实施例5
（1）固定化酶的制备
将30 g海藻酸钠和20g果胶加到1L水中，在45℃下搅拌溶解，加入10g的复合酶，搅拌混匀，在45℃恒温摇床上，150r/min振荡1.5h，将该混合液逐滴注入2mol/L的氯化钙溶液中，在4℃条件下静置120min，使其凝聚固化，收集凝胶小球，用0.1 mol/L的氯化钠溶液洗涤，抽滤除去游离水分，收集凝胶小球得到固定化酶；
（2）红曲红色素的制备
将红曲霉菌的液体发酵液进胶体磨进行均化处理，碎细度为0.5μm，处理时间为15min；均化结束后，调节溶液至pH5.0，按照湿重与均化液的质量比为1：80的量加入固定化复合酶，于60℃摇床酶解2小时后过滤，回收固定化酶；然后用浓度为1 mol/L的氢氧化钾溶液调节酶解液至pH9.0，过滤，除去不溶物，得红曲红色素溶液，用6mol/L的硫酸溶液调节反应液至pH 2.5，放置6小时，过滤，收集沉淀，水洗沉淀至pH5，用0.1 mol/L的碳酸氢钠溶液溶解沉淀物，并调节至pH8.5，经喷雾干燥，即得红曲红色素粉末。
上述实施例1～6中，高分子化合物载体包括海藻酸钠，以及海藻酸钠与明胶、变性淀粉、果胶和环糊精中的一种或几种的混合物；被固定的酶为含有蛋白酶和淀粉酶和/或果胶酶和/或纤维素酶和/或木聚糖酶和/或β—葡聚糖酶的复合酶；用于碱解的碱包括氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钠和碳酸氢钠中的一种或几种的混合物；酶解过程为在反应器中进行的搅拌酶解，或是将固定化酶装入填充柱中，再将酸化液泵入填充柱进行的循环酶解；用于酸沉淀的酸包括盐酸、硫酸、醋酸、柠檬酸、磷酸和乳酸中的一种或几种的混合物；用于中和并溶解酸沉淀物的碱包括氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钠、碳酸钾、碳酸氢钠、碳酸氢钾和碳酸氢铵中的一种或几种的混合物；其种类和用量及固定化酶的循环使用次数应视具体情况来做适当的调整。
Claims (9)
1.一种利用固定化酶制备红曲红色素的方法，包括下述的步骤：以红曲霉菌液体发酵液为原料，通过均化、固定化酶酶解、碱化、过滤得红曲红色素溶液；红曲红色素溶液通过酸沉淀，沉淀洗涤中和、脱水、干燥，即得到红曲红色素。
2.根据权利要求1所述的利用固定化酶制备红曲红色素的方法，具体包括下述的步骤：
（1）固定化酶的制备
高分子化合物载体加水配制成15 ～100g/L浓度的溶液，在温度为20℃～60℃条件下，搅拌至其溶解；然后加入与高分子化合物载体质量比为1：1～1：50的酶，搅拌均匀，置于20℃～60℃的恒温摇床上，振荡0.5h～6h；将上述混合液逐滴滴入0.1mol/L～2.5 mol/L的氯化钙溶液中，在3℃～5℃条件下静置30～150min，使其凝聚固化，收集凝胶小球，并用0.08 mol/L ～0.3 mol/L的氯化钠溶液洗涤，抽滤除去游离水分，收集得到的凝胶小球即为固定化酶；
（2）红曲红色素的制备
①原料：以红曲霉菌液体发酵液为原料；
②均化：将发酵液进胶体磨研磨，碎细度在0.1～10μm, 胶体磨作用时间为5 min～120min，得均化后液体；
③酶解：调节步骤②均化后的液体至pH 4.0～ 6.0，然后向其中加入步骤（1）制备的固定化酶进行酶解，固定化酶与均化液的质量比为1：1～1：100，酶解条件为20℃～70℃，酶解时间为1～48h；
④固定化酶回收：将步骤③酶解处理后的反应液粗过滤，回收固定化酶，同时得到滤液即为酶解液；
⑤碱化：向步骤④得到的酶解液中加碱液，调节酶解液至pH 8.0～13.0，碱液浓度为0.5～10.0 mol/L；
⑥过滤：将步骤⑤反应液过滤，除去不溶物，得到红曲红色素溶液；
⑦酸沉淀：向步骤⑥所得的红曲红色素溶液中加入酸溶液，调节溶液至pH 1～3，使其沉淀，静置0.5h～24h后，收集沉淀物；
⑧洗涤、中和：将步骤⑦得到的沉淀物用水洗涤至pH5～pH6，用0.01～5.0 mol/L的碱溶液溶解沉淀物，并调节至pH 7～12，得到红曲红色素水溶液；
⑨干燥、粉碎：将步骤⑧得到的红曲红色素水溶液进行脱水、干燥处理，得到的干燥粉末即为所制备的红曲红色素。
3.根据权利要求2所述的利用固定化酶制备红曲红色素的方法，其特征在于：步骤（1）所述的高分子化合物载体为海藻酸钠，以及海藻酸钠与明胶、变性淀粉、果胶和环糊精中的至少一种。
4.根据权利要求2所述的利用固定化酶制备红曲红色素的方法，其特征在于：步骤（2）所述的碱化中的碱溶液为氢氧化钠溶液、氢氧化钾溶液、碳酸钠溶液和碳酸氢钠溶液中的至少一种。
5.根据权利要求2所述的利用固定化酶制备红曲红色素的方法，其特征在于：步骤（2）所述的酸沉淀中的酸溶液为盐酸、硫酸、醋酸、柠檬酸、磷酸和乳酸中的至少一种。
6.根据权利要求2所述的利用固定化酶制备红曲红色素的方法，其特征在于：步骤（2）所述的洗涤、中和所用的碱溶液为氢氧化钠溶液、氢氧化钾溶液、碳酸钠溶液、碳酸钾溶液、碳酸氢钠溶液、碳酸氢钾溶液和碳酸氢铵溶液中的至少一种。
7.根据权利要求2所述的一种利用固定化酶制备红曲红色素的方法，其特征在于：步骤（1）所述的酶为含有蛋白酶和淀粉酶、果胶酶、纤维素酶、木聚糖酶、β—葡聚糖酶中的至少一种。
8.根据权利要求2所述的一种利用固定化酶制备红曲红色素的方法，其特征在于：步骤（2）所述的酶解过程为在反应器中进行的搅拌酶解。
9.根据权利要求2所述的一种利用固定化酶制备红曲红色素的方法，其特征在于：步骤（2）所述的酶解过程为：将固定化酶装入填充柱中，再将酸化液泵入填充柱进行的循环酶解。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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Owner name: SHANDONG ZHONGHUI BIOTECHNOLOGY CO., LTD. Free format text: FORMER NAME: ZHONGHUI FOOD CO., LTD., SHANGDONG |
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Address after: 251707, No. 108, King sang Road, Wei Town, Huimin County, Shandong, Binzhou Patentee after: SHANDONG ZHONGHUI BIOTECHNOLOGY CO.,LTD. Patentee after: Zhao Jixing Address before: 251707, No. 108, King sang Road, Wei Town, Huimin County, Shandong, Binzhou Patentee before: Shandong Zhonghui Food Co.,Ltd. Patentee before: Zhao Jixing |
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Denomination of invention: Method for preparing monascus red pigment by utilizing immobilized enzymes Effective date of registration: 20150409 Granted publication date: 20140528 Pledgee: Hengfeng bank Limited by Share Ltd. Binzhou branch Pledgor: Shandong Zhonghui Food Co.,Ltd.|Zhao Jixing Registration number: 2015990000269 |
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Date of cancellation: 20180702 Granted publication date: 20140528 Pledgee: Hengfeng bank Limited by Share Ltd. Binzhou branch Pledgor: SHANDONG ZHONGHUI BIOTECHNOLOGY CO.,LTD.|Zhao Jixing Registration number: 2015990000269 |
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| PC01 | Cancellation of the registration of the contract for pledge of patent right | ||
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| PM01 | Change of the registration of the contract for pledge of patent right |
Change date: 20180702 Registration number: 2015990000269 Pledgor after: SHANDONG ZHONGHUI BIOTECHNOLOGY CO.,LTD. Pledgor after: Zhao Jixing Pledgor before: Shandong Zhonghui Food Co.,Ltd. Pledgor before: Zhao Jixing |
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Denomination of invention: Method for preparing monascus red pigment by utilizing immobilized enzymes Effective date of registration: 20180903 Granted publication date: 20140528 Pledgee: China Co. truction Bank Corp Huimin subbranch Pledgor: SHANDONG ZHONGHUI BIOTECHNOLOGY CO.,LTD.|Zhao Jixing Registration number: 2018370000159 |
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