CN107858393B - 一种从核桃粕中提取蛋白多肽的方法 - Google Patents

一种从核桃粕中提取蛋白多肽的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种从核桃粕中提取蛋白多肽的方法，包括如下步骤：步骤（1）、原料的预处理；步骤（2）、碱溶与酶解；步骤（3）、高温灭酶；步骤（4）、固‑液分离；步骤（5）、过滤干燥。本发明工艺简单且经济，蛋白提取和多肽制备同时进行，有效地缩短了蛋白提取及多肽制备的时间，且蛋白的提取率和多肽转化率进一步提高；生产过程绿色环保，产物具备较好抗氧化活性、降压等功能，可直接应用于功能性食品、药品、化妆品等领域；材料来源广泛，价格低廉，可变废为宝，提高核桃粕附价值。

Description

一种从核桃粕中提取蛋白多肽的方法
技术领域
本发明涉及一种提取蛋白多肽的方法，尤其是一种从核桃粕中提取蛋白多肽的方法，食品加工领域。
背景技术
我国核桃种植面积和产量均居世界第一，云南又是全国之首，截止2015年，云南省核桃种植面积4230万亩、产量85万吨，产量、面积均居全国第一。随着核桃产量越来越高，目前，国内的核桃榨油生产厂家越来越多，随之产生大量的脱脂核桃粕。核桃粕常被作为饲料和肥料或丢弃，废物排放污染环境，其附价值较低。研究表明，通过冷榨脱油后的核桃粕中蛋白含量高达50%，为优质的蛋白资源，开发前景广阔。
近年来科学研究发现，人类摄取蛋白质经消化酶作用后，并非主要以氨基酸的形式吸收，而是以肽的形式吸收，一些肽不仅能提供人体生长、发育所需营养物质，同时具有多种生理功能，如能改善和提高矿物质运输和吸收、抗菌和病毒、提高免疫力、抗氧化、降胆固醇、抗癌作用、清除自由基抗衰老等作用。因此，利用蛋白酶水解核桃粕中蛋白制备核桃肽粉，实现了利用核桃粕提高其附价值的目的。同时，所制得的核桃肽粉具有增强免疫力、抗氧化活性、降压、恢复疲劳等功能。
目前，现有的核桃（仁/粕）蛋白多肽制备技术主要有两类，一类是将核桃（仁/粕）原料直接进行磨浆后进行酶解，蛋白提取率较低；另一类是将核桃（仁/粕）进行粉碎后通过碱溶酸沉的方法先提取蛋白质，再根据酶的特性调节pH值后进行酶解，工艺复杂。由于核桃粕中还含有10~15%油脂，这两类方法采用核桃粕原料进行蛋白提取时，乳化现象严重，极大地限制了核桃粕中蛋白的溶出，使得蛋白提取率和蛋白纯度较低，相应的蛋白多肽转化率也较低，增加了生产成本。因此有必要对现有技术加以改进。
发明内容
为解决现有核桃粕蛋白多肽制备过程中蛋白提取率与蛋白纯度不高、乳化现象严重、多肽利率低、蛋白多肽制备工艺复杂等问题，本发明提供了一种从核桃粕中提取蛋白多肽的方法，可快速提取制备蛋白多肽。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案如下：
一种从核桃粕中提取蛋白多肽的方法，包括如下步骤：
步骤（1）、原料的预处理：将核桃粕原料粉碎过筛，得到核桃粕粉碎料，再与水混合，得到核桃粕混合液，向混合液中加入非蛋白复合酶，进行酶水解，时间为2～5h，酶水解温度为30～40℃，搅拌速度为30～60r/min，全程搅拌，制得核桃粕破壁的悬浮液；
步骤（2）、碱溶与酶解：向步骤（1）的悬浮液中加入碱液，调节pH为8.0～10.0，同时加入0.2～2%核桃粕粉碎料质量的碱性蛋白酶，使得碱溶和酶解同时进行，反应时间为3～10h，反应温度为40～60℃，pH保持8.0～10.0，搅拌速度为30～60r/min，全程搅拌，制得核桃粕酶解液；
步骤（3）、高温灭酶：将步骤（3）的核桃粕酶解液温度升至90～95℃，高温灭酶5～10min，得到经灭酶的核桃粕酶解液；
步骤（4）、固-液分离：将步骤（3）的酶解液进行固液分离，5000～8000r/min下离心10～20min，取上清液，调pH至中性，制得核桃蛋白肽液；
步骤（5）、过滤干燥：对步骤（4）的核桃蛋白肽液进行浓缩喷雾干燥，得到核桃蛋白多肽粉；或者，采用再生纤维素膜截留步骤（4）的核桃蛋白肽液，得到分子量为1～5kD的低聚多肽液，然后再进行浓缩喷雾干燥得到核桃低聚肽或小分子肽粉。
进一步地，步骤（1）中，核桃粕原料是核桃经液压榨油机压榨后的粕，蛋白含量≥50%，粉碎后过40～100目筛，再将核桃粕粉碎料与水按重量比1:5～10的比例混合均匀后，得到核桃粕混合液。
进一步地，步骤（1）中，非蛋白复合酶是纤维素酶、果胶酶和淀粉酶按配比为1～5：0.5～4：0.5～5的组成，非蛋白复合酶的添加量为核桃粕粉碎料质量的0.05～1.00%，酶解条件温度为30～40℃；
进一步地，步骤（2）中，碱溶为NaOH或Ca(OH)2溶液；
进一步地，步骤（5）中，肽液先在40～60℃下真空浓缩至原液体积的1/5~1/3，再将浓缩液进行喷雾干燥，出风温度为50℃～80℃，进风温度为120℃～180℃，干燥后即得到核桃多肽粉。
植物细胞壁主要由果胶和纤维素等多糖类物质组成，蛋白质被包裹在其中，本申请方法可以有效地瓦解细胞壁，促使细胞内蛋白的溶出。非蛋白酶（纤维素酶、果胶酶、淀粉酶等）可以降解植物细胞壁的纤维素骨架、崩溃细胞壁，还可以将原料中不可溶的淀粉类物质、纤维素物质、果胶类物质酶解为短链的可溶性物质，从而达到与原料中蛋白原料分开的目的，而蛋白酶则可以明显改善乳化现象，增加蛋白的提取率和蛋白纯度。
与现有技术相比，本发明的有益效果及优点如下：
（1）变废为宝，提高核桃粕附价值。充分利用了核桃压榨制油后的废料-核桃粕作为原料，粕中富含的高蛋白资源，解决了核桃蛋白质的降解问题，可将脱脂核桃粕中的蛋白营养成分降解，使其水解成能为人体直接迅速吸收的、营养丰富的核桃肽粉，具有增强人体免疫力、抗衰老、抗氧化、恢复疲劳等功能。本发明生产核桃肽粉的方法，能提高核桃粕的附价值，实施工艺简便且经济，适合规模化工业生产。
（2）生产过程绿色环保，蛋白的提取率和纯度进一步提高。其中，淀粉酶、纤维素酶和果胶酶三种非蛋白酶进行联合酶解，不仅可以有效地降解细胞壁，使得核桃粕粉原料细胞中的蛋白充分溶出，极大地缩短了核桃蛋白的提取时间，还可以将原料中不可溶的淀粉类物质、纤维素物质、果胶类物质酶解为短链的可溶性物质，从而达到与原料中蛋白原料分开的目的，进一步提高蛋白的提取率和纯度，并且生产过程中不产生污染，生产周期短、成本低、不产生任何有毒有害物质，绿色安全，无毒副作用，制备的蛋白多肽粉可直接应用于功能性食品、药品、化妆品等领域。
（3）核桃粕蛋白多肽提取制备工艺简化，蛋白提取和多肽制备同时进行。在碱溶的过程中，直接加入碱性蛋白酶进行酶水解反应，而且碱性蛋白酶有效的改善了乳化现象，增加蛋白的提取率和蛋白纯度。整体工艺避免了酸沉的过程，比起现有的先碱溶再酸沉提取蛋白质后，再调pH进行酶水解反应，极大地简化了核桃蛋白提取酶解工艺，缩短了蛋白提取和多肽制备的时间，有效提高了核桃粕蛋白的提取率（≥93%）和纯度（≥88%），而且使蛋白质降解为肽的转化率提高，可达85%以上。本发明蛋白提取率、蛋白纯度、多肽转化率远高于现有技术中的相关指标。
（4）产物具备较好抗氧化活性、降压等功能。本发明可制得核桃小分子肽粉，分子量小于2000道尔顿，OH·清除率≥70%、氧自由基清除率≥68%、DPPH·清除率≥83%，具备较强的抗氧化活性；ACE抑制率≥73%降压功效显著。
具体实施方式
下面将结合实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是对本发明一部分实例，而不是全部的实例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有付出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
本实施例的核桃蛋白多肽粉提取制备的方法，包括以下步骤：
步骤（1）、原料的预处理：将核桃粕原料用粉碎机粉碎，并过60目筛，得到核桃粕粉碎料，再与水按重量比1：5的比例混合，得到核桃粕混合液，向混合液中加入非蛋白复合酶，非蛋白复合酶为纤维素酶、果胶酶和淀粉酶按配比5：2：3组成，非蛋白复合酶的添加量为核桃粉碎料质量的0.1%，反应温度为35℃，反应时间3h，全程搅拌，搅拌速度为30r/min，制得核桃粕破壁的悬浮液；
步骤（2）、碱溶与酶解：将上述悬浮液加入反应罐，向上述悬浮液中加入Ca(OH)2溶液，调节悬浮液的pH至8.0，再加入核桃粉碎料质量的0.2%的碱性蛋白酶，酶活力为30万U/g，进行蛋白溶出和蛋白酶水解，反应时间6h，反应温度为50℃，pH值保持不变，全程搅拌，搅拌速度为60r/min，制得核桃粕酶解液；
步骤（3）、高温灭酶：将反应罐内温度升至90℃，高温灭酶8min；
步骤（4）、固-液分离：将步骤（3）的灭酶的酶解液固液分离，5000r/min离心10min，去除不溶性固体，取上清液，得到核桃蛋白肽液；
步骤（5）、浓缩干燥：将上述核桃蛋白肽液在50℃下真空浓缩至原液体积的1/5，再将浓缩液进行喷雾干燥，出风温度为70℃，进风温度为150℃，干燥后即得到核桃蛋白多肽粉。
实施例2
本实施例的核桃多肽粉提取制备方法，包括以下步骤：
步骤（2）、原料的预处理：将核桃粕原料用粉碎机粉碎，并过60目筛，得到核桃粕粉碎料，再与水按重量比1：6的比例混合，得到核桃粕混合液，向混合液中加入非蛋白复合酶，非蛋白复合酶是纤维素酶、果胶酶和淀粉酶按配比4.5：2：3.5组成，非蛋白复合酶的添加量为核桃粉碎料质量的0.2%，反应温度为37℃，反应时间4h，全程搅拌，搅拌速度为30r/min，制得核桃粕破壁的悬浮液；
步骤（2）、碱溶与酶解：将上述悬浮液加入反应罐，向上述悬浮液中加入NaOH溶液，调节悬浮液的pH至8.5，再加入核桃粉碎料质量的0.3%的碱性蛋白酶，酶活力为30万U/g，进行蛋白溶出和蛋白酶水解，反应时间7h，反应温度为52℃，pH值保持不变，全程搅拌，搅拌速度为60r/min，制得核桃粕酶解液；
步骤（3）、高温灭酶：将反应罐温度升至92℃，高温灭酶7min；
步骤（4）、固-液分离：将步骤（3）的灭酶的酶解液进行固液分离，6000r/min离心5min，去除不溶性固体，取上清液，制得核桃蛋白肽液；
步骤（5）、过滤干燥：采用再生纤维素膜截留分子量小于5000道尔顿的多肽液，然后55℃下真空浓缩至原液体积的1/4，再将浓缩液进行喷雾干燥，出风温度为75℃，进风温度为155℃，干燥后即得到核桃多肽粉。
实施例3
本实施例的核桃多肽粉提取制备方法，包括以下步骤：
步骤（1）、原料的预处理：将核桃粕原料用粉碎机粉碎，并过60目筛，得到得核桃粕粉碎料，再与水按重量比1：7的比例混合后制得核桃粕混合液，向混合液中加入非蛋白复合酶，非蛋白复合酶是纤维素酶、果胶酶和淀粉酶按配比5：1.5：3.5组成，非蛋白复合酶的添加量为核桃粉碎料质量的0.3%，酶水解温度为40℃，酶水解时间5h，全程搅拌，搅拌速度为30r/min，制得核桃粕破壁的悬浮液；
步骤（2）、碱溶与酶解：将上述悬浮液加入反应罐，向上述悬浮液中加入NaOH溶液，调节悬浮液的pH至9.0，再加入0.25%核桃粉碎料质量的碱性蛋白酶，酶活力为30万U/g，进行蛋白溶出和蛋白酶水解，反应时间8h，反应温度为54℃，pH值保持不变，全程搅拌，搅拌速度为60r/min，制得核桃粕酶解液；
步骤（3）、高温灭酶：将反应罐温度升至95℃，高温灭酶5min；
步骤（4）、固-液分离：将步骤（3）的灭酶的酶解液进行固液分离，5000r/min离心12min，去除不溶性固体，取上清液，制得核桃蛋白肽液；
步骤（5）、过滤干燥：
采用再生纤维素膜截留步骤（4）的核桃蛋白肽液，得到分子量小于2000道尔顿的多肽液，然后60℃下真空浓缩至原液体积的1/3，再将浓缩液进行喷雾干燥，出风温度为70℃，进风温度为170℃，干燥后即得到核桃小分子多肽粉。
将实施例3方法得到的核桃小分子多肽粉进行抗氧化活性和ACE抑制率进行检测分析，结果如表1所示：
表1抗氧化活性和ACE抑制率结果
Figure DEST_PATH_IMAGE002
由表1看出，小分子多肽粉的OH·清除率≥70%、氧自由基清除率≥68%、DPPH·清除率≥83%，具备较强的抗氧化活性，ACE抑制率≥73%降压效果显著。
对本发明方法中的蛋白提取率、纯度、多肽转化率进行检测分析，并对现有技术方法也进行了试验对比检测分析，处理组都采用碱性蛋白酶进行酶解，结果如表2所示。
表2现有技术与本申请的蛋白提取率、纯度、多肽转化率对比
Figure DEST_PATH_IMAGE004
由表2可以看出，本发明蛋白提取率、蛋白纯度、多肽转化率远高于现有技术方法所测得的相关指标。本发明核桃粕蛋白的提取率高达93%、纯度高达88%、蛋白质降解为肽的转化率高达85%，效果显著。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (4)

1.一种从核桃粕中提取蛋白多肽的方法，其特征在于：
包括如下步骤：
步骤（1）、原料的预处理：将核桃粕原料粉碎过筛，得到核桃粕粉碎料，再与水混合，得到核桃粕混合液，向混合液中加入非蛋白复合酶，进行酶水解，时间为3～5h，酶水解温度为35～40℃，搅拌速度为30～60r/min，全程搅拌，制得核桃粕破壁的悬浮液；
非蛋白复合酶是纤维素酶、果胶酶和淀粉酶按配比为4.5～5︰1.5～2︰3～3.5的组成，非蛋白复合酶的添加量为核桃粕粉碎料质量的0.1～0.3%；
步骤（2）、碱溶与酶解：向步骤（1）的悬浮液中加入碱液，调节pH为8.0～9.0，同时加入0.2～0.3%核桃粕粉碎料质量的碱性蛋白酶，使得碱溶和酶解同时进行，反应时间为6～8h，反应温度为50～54℃，pH保持8.0～9.0，搅拌速度为30～60r/min，全程搅拌，制得核桃粕酶解液；
步骤（3）、高温灭酶：将步骤（2）的核桃粕酶解液温度升至90～95℃，高温灭酶5～10min，得到经灭酶的核桃粕酶解液；
步骤（4）、固-液分离：将步骤（3）的酶解液进行固液分离，5000～8000r/min下离心10～20min，取上清液，调pH至中性，制得核桃蛋白肽液；
步骤（5）、过滤干燥：对步骤（4）的核桃蛋白肽液进行浓缩喷雾干燥，得到核桃蛋白多肽粉；或者，采用再生纤维素膜截留步骤（4）的核桃蛋白肽液，得到分子量为1～5kD的低聚多肽液，然后再进行浓缩喷雾干燥得到核桃低聚肽或小分子肽粉。
2.根据权利要求1所述的从核桃粕中提取蛋白多肽的方法，其特征在于：步骤（1）中，核桃粕原料是核桃经液压榨油机压榨后的粕，蛋白含量≥50%，粉碎后过40～100目筛，再将核桃粕粉碎料与水按重量比1:5～10的比例混合均匀后，得到核桃粕混合液。
3.据权利要求1所述的从核桃粕中提取蛋白多肽的方法，其特征在于，步骤（2）中，碱溶为NaOH或Ca(OH)2溶液。
4.根据权利要求1所述的从核桃粕中提取蛋白多肽的方法，其特征在于，步骤（5）中，肽液先在40～60℃下真空浓缩至原液体积的1/5~1/3，再将浓缩液进行喷雾干燥，出风温度为50℃～80℃，进风温度为120℃～180℃，干燥后即得到核桃多肽粉。
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