JP5461582B2 - 無細胞による化学物質の生産方法 - Google Patents
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Description
疎水性化学物質とは、水にほとんど溶解せず、周囲大気圧および温度で固体または液体状態で存在する化学物質である。疎水性化学物質が水と相分離を起こさず混和される濃度は限られており、20%(w/w)以下である。本発明に係る疎水性化学物質の具体的な例としては、n−ブタノール、2−ブタノール、および、イソブタノールが挙げられる。
本発明は、炭素源からの、具体的には、疎水性化学物質、例えばn−ブタノール、イソブタノールまたは2−ブタノールなどのC4アルコールからの、および、親水性および中間的な化学物質、例えばエタノールからの、バイオテクノロジーによる化学物質生産のための無細胞方法を対象とする。
本発明のさらに好ましい実施態様によれば、本明細書においてさらに説明されるように、炭素源の化合物はプロセスに連続的に供給され、標的有機化合物は連続的に取り出される。
・グルコース脱水素酵素(EC1.1.1.47)、
・グルコノラクトナーゼ(EC3.1.1.17)、
・グルコン酸デヒドラターゼ(EC4.2.1.39)、
・2−ケト−3−デオキシグルコン酸アルドラーゼ(EC4.1.2.14)、
・アルデヒド脱水素酵素(EC1.2.1.3)、
・グリセリン酸脱水素酵素(EC1.1.1.29)、または、ヒドロキシピルビン酸還元酵素(EC1.1.1.81)、
・セリン−ピルビン酸トランスアミナーゼ(EC2.6.1.51)、
・L−セリンアンモニア−リアーゼ(EC4.3.1.17)、および、
・アラニン脱水素酵素(EC1.4.1.1)。
・グルコース脱水素酵素(EC1.1.1.47)、
・グルコノラクトナーゼ(EC3.1.1.17)、
・グルコン酸デヒドラターゼ(EC4.2.1.39)
・2−ケト−3−デオキシグルコン酸アルドラーゼ(EC4.1.2.14)
・アルデヒド脱水素酵素(EC1.2.1.3)、および、
・グリセリン酸デヒドラターゼ(EC4.2.1.)。
好ましい一つの形態によれば、本発明の製造方法は、以下の4つの工程を含む:
I.炭素源を化学物質(本明細書においては「標的化学物質」または「標的有機化合物」とも称される)に変換するための酵素(「標的酵素」)を微生物細胞を用いて生産する工程;
II.工程Iで用いられる微生物細胞から、標的酵素を放出させる工程(ここで好ましくは、補因子の放出、および、非標的酵素の余分な活性の不活性化も共に行う);
III.工程IIの標的酵素を、炭素源を標的化学物質に変換するのに適した条件下で炭素源と接触させる工程;
IV.標的化学物質を反応混合物から分離する工程。
工程I:
工程Iにおいて、標的酵素は、微生物細胞を用いて生産される。
本発明の方法の一実施態様によれば、標的酵素は、高レベルの標的化学物質に対する耐性を有し、任意に、標的化学物質の分離を促進するために分離した相に任意に添加される可能性があるその他の有機溶媒に対する耐性を有していてもよい。標的酵素は、好ましくは2質量%より高い、より好ましくは6質量%より高い、最も好ましくは12質量%より高い標的化学物質濃度に対する耐性を有する。特に好ましい実施態様において、標的酵素は、水に溶解する最大濃度までの標的化学物質濃度に対する耐性を有する。
工程II:
工程IIにおいて、標的酵素を細胞から放出させる。
工程IIIにおいて、炭素源は、多段階の酵素反応において酵素混合物によって標的化学物質に変換される。
工程IVにおいて、1種またはそれより多くの標的化学物質が、反応混合物から分離される。
以下で、n−ブタノール、イソブタノール、エタノール、および、2−ブタノールの生産に関するいくつかの好ましい実施態様を説明する。
本発明の一実施態様において、標的化学物質はn−ブタノールであり、n−ブタノールを生成する標的酵素混合物は、19種未満の異なる酵素活性を含む。標的酵素混合物は、好ましくは17種またはそれ未満の異なる酵素活性、より好ましくは、16種またはそれ未満の酵素活性、さらにより好ましくは、15種またはそれ未満の酵素活性、最も好ましくは12種のみの異なる酵素活性を含む。酵素の生産は、本方法における主なコスト要因であるため、これは、その他の方法を超える主要な利点を与える。
この工程は、全てではないがほとんどの生物において、異なる代謝経路(例えば、エムデン−マイエルホーフ−パルナス経路、エントナー−ドウドロフ経路)が存在したとしても、ほとんどの場合において共通である。工程(A)の具体的な形態は、表1(酵素の組み合わせA.1)で列挙したように10種の酵素活性を含む、エムデン−マイエルホーフ−パルナス経路からの酵素を使用している。この酵素の組み合わせによって触媒される反応経路はリン酸化酵素を含み、それにより正味のATP生産が生じる(グルコース1分子あたり2分子のATPが生成する)。
ピルビン酸のアセチルCoAへの変換のための様々な選択肢が存在する。
本発明の一実施態様において、以下の酵素のうち1種またはそれより多くが変換に用いられる:(i)補因子としてフェレドキシンを用いたピルビン酸オキシド還元酵素;(ii)補因子としてNAD(P)Hを用いたピルビン酸脱水素酵素;(iii)ピルビン酸ギ酸リアーゼ;(iv)ピルビン酸脱水素酵素複合体。
工程(C):アセチルCoAのn−ブタノールへの変換
アセチルCoAをn−ブタノールに変換するための様々な選択肢が存在するが、これは、数種の微生物がこの経路を介してn−ブタノールを生産するためである(例えば、C.アセトブチリカム(C.acetobutylicum)、C.ベイジェリンキ)。
本発明のその他の実施態様において、標的化学物質は、イソブタノールである。
特に好ましい実施態様において、イソブタノールは、グルコースから中間体のピルビン酸を介して生産される。グルコースからのイソブタノールの生産は、任意に、さらに二段階:(A)1分子のグルコースの2分子のピルビン酸への変換;および、(D)2分子のピルビン酸の1分子のイソブタノールへの変換、に細分化することができる。
この工程はn−ブタノールの生産における工程(A)と同じである(上記参照)。
工程(D):ピルビン酸のイソブタノールへの変換
本発明の好ましい実施態様において、表7で列挙したような酵素活性は、イソブタノールの無細胞生産のための工程(D)で用いられる。
本発明のその他の実施態様において、標的化学物質は、エタノールである。エタノールはどのような比率でも完全に水に溶解し、分離した有機相の形成による簡単な精製ができない。それにもかかわらず、無細胞生産のための本発明の方法は、再生可能な炭素源からエタノールを生産するコスト効率の高い方法を提供する。
この工程は、n−ブタノールの生産における工程(A)と同じである(上記参照)。
工程(E):ピルビン酸のエタノールへの変換
本発明の好ましい実施態様において、表8で列挙したような酵素活性は、ピルビン酸のエタノールへの変換に用いられる。
本発明のその他の実施態様において、標的化学物質は、2−ブタノールである。
特に好ましい実施態様において、2−ブタノールは、グルコースから中間体のピルビン酸を介して生産される。グルコースからの2−ブタノールの生産は、任意にさらに二段階:(A)1分子のグルコースの2分子のピルビン酸への変換;および、(F)2分子のピルビン酸の1分子の2−ブタノールへの変換、に細分化することができる。
この工程は、n−ブタノールの生産における工程(A)と同じである(上記参照)。
工程(F):ピルビン酸の2−ブタノールへの変換
本発明の好ましい実施態様において、表9で列挙したような酵素活性は、2−ブタノールの無細胞生産のための工程(F)で用いられる。好ましい実施態様において、基質としてアセトイン、加えて2−ブタノンを使用するアルコール脱水素酵素が用いられる。
上述したエタノール、n−ブタノール、イソブタノール、2−ブタノールまたはその他の化学物質を生産するための本発明の経路は、基質としてのグルコースの使用に限定されない。本方法に適用されるグルコース脱水素酵素の選択性に応じて、例えばその他のC6糖も基質として用いることができる。加えてスターチは、アミラーゼ/グルコアミラーゼ活性の組み合わせと共に、基質として用いることができる。セルロース系材料は、エンドセルラーゼ(endocellulase)/エキソセルラーゼ(exocellulase)/グルコシダーゼ活性と共に、基質として用いることができる。またラクトース、スクロースおよびその他のオリゴマーまたは高分子糖誘導体も、それに対応する、これらを単体のヘキソースに変換する酵素と共に用いることができる。
S.セレビジエを12%グルコースを含むYPD培地で30℃で嫌気的に増殖させる。エタノールの形成は、1時間ごとのサンプリングとガスクロマトグラフィーでの解析によってモニターする。エタノール生成が最大の相で細胞を回収し、4倍量の反応緩衝液(20mMのリン酸カリウム、pH6.5;5mMのメルカプトエタノール、10mMのNaCl、10mMのMgSO4、500μMのZnSO4、500μMのCoCl2、200μMのMnCl2)で懸濁する。続いて細胞をフレンチプレスで破壊することによって溶解させ、細胞上清を遠心分離で精製し、ろ過滅菌して全ての残存した細胞を除去する。
実施例1からのC.サッカロブチリカムの細胞溶解産物を以下の酵素とインキュベートする:ヘキソキナーゼ(20μ/ml)、ホスホヘキソイソメラーゼ(15μ/ml)、ホスホフルクトキナーゼ(4μ/ml)、アルドラーゼ(16μ/ml)、ホスホトリオースイソメラーゼ(300μ/ml)、グリセリンアルデヒド−3−リン酸脱水素酵素(60μ/ml)、ホスホグリセリン酸キナーゼ(120μ/ml)、ホスホグリセリン酸ムターゼ(60μ/ml)、エノラーゼ(11μ/ml)、ピルビン酸キナーゼ(15μ/ml)、ピルビン酸脱水素酵素(20μ/ml)、リン酸トランスアセチラーゼ(15μ/ml)(全ての酵素はシグマ(Sigma)から得た;以下の表を参照;ホスホグリセリン酸ムターゼのみ、USB(26111マイルズロード,オハイオ州クリーブランド)から得たものであり(製品番号26118 100UG)、これは、組換えによってE.コリで発現されたヒト酵素である)。20mMのリン酸カリウム(pH6.5);5mMのメルカプトエタノール、10mMのNaCl、10mMのMgSO4、500μMのZnSO4、500μMのCoCl2、200μMのMnCl2、4mMのATP、1mMのADP、1mMのNADH、1mMのNAD、1mMのコエンザイムA、および、200mMのグルコース中で嫌気性条件下で30℃でインキュベートする。用いる全ての試薬は、標準的な方法によって脱酸素する。10分後、ATPアーゼ(0.5μ/ml)を添加して、初期でのATP形成を回避する。3時間後、生産されたn−ブタノールを定量する。
酵素チオラーゼ(EC2.3.1.16、クロストリジウム・アセトブチリカム、NCBI遺伝子番号:NP_349476.1)、3−ヒドロキシブチリル−CoA脱水素酵素(EC1.1.1.157、NP_349314.1)、クロトナーゼ(EC4.2.1.55、クロストリジウム・アセトブチリカム、NP_349318.1)、ブチリル−CoA脱水素酵素(EC1.3.99.2、クロストリジウム・アセトブチリカム、NCBI遺伝子番号:NP_349317.1)、アルデヒド脱水素酵素をアシル化するコエンザイムA(EC1.2.1.57、クロストリジウム・ベイジェリンキ、NCBI遺伝子番号:AF132754_1)、NADH依存性ブタノール脱水素酵素B(BDH II)(EC1.1.1.−、クロストリジウム・アセトブチリカム、NCBI遺伝子番号:NP_349891.1)、および、電子移動フラビンタンパク質(etfAおよびB、クロストリジウム・アセトブチリカム、NCBI遺伝子番号:NP_349315.1、および、NP_349316.1)を合成し、説明されているようにして組換えによってE.コリ(E.coli)中で発現させる。5mlの反応溶液(20mMのリン酸カリウム、pH6.5;5mMのメルカプトエタノール、10mMのNaCl、10mMのMgSO4、500μMのZnSO4、500μMのCoCl2、200μMのMnCl2、4mMのATP、1mMのADP、1mMのNADH、1mMのNAD、1mMのコエンザイムA)中で全ての酵素を合わせる(各1mg)。上記の表9(グルコースのアセチルCoAへの変換)で列挙した等しい体積の酵素混合物を添加する:ヘキソキナーゼ(200μ/ml)、ホスホヘキソイソメラーゼ(150μ/ml)、ホスホフルクトキナーゼ(40μ/ml)、アルドラーゼ(160μ/ml)、ホスホトリオースイソメラーゼ(3000μ/ml)、グリセリンアルデヒド−3−リン酸脱水素酵素(600μ/ml)、ホスホグリセリン酸キナーゼ(1200μ/ml)、ホスホグリセリン酸ムターゼ(600μ/ml)、エノラーゼ(110μ/ml)、ピルビン酸キナーゼ(150μ/ml)、ピルビン酸脱水素酵素(200μ/ml)、リン酸トランスアセチラーゼ(150μ/ml)、ATPアーゼ(4,5μ/ml)を、500mMのグルコースを含む20mMのリン酸カリウム緩衝液(pH6.5)中で合わせる。この反応液を30℃で嫌気性条件下で撹拌する。3時間後、生産されたn−ブタノールを定量する。
T.マリティマを80℃で5%グルコースで増殖させる。グルコースが全て消費される前に、細胞を回収し、4倍量の反応緩衝液(20mMのリン酸カリウム、pH6.5;5mMのメルカプトエタノール、10mMのNaCl、10mMのMgSO4、500μMのZnSO4、500μMのCoCl2、200μMのMnCl2)に再懸濁し、フレンチプレスで破壊することによって溶解させる。細胞上清を遠心分離で精製し、ろ過滅菌する。バリン生合成に関する遺伝子ilvICD(アセト乳酸合成酵素、EC:2.2.1.6、NCBI遺伝子番号:NP_228358.1;ケトール酸レダクトイソメラーゼ、EC.1.1.1.86、NCBI遺伝子番号:NP_228360.1、および、ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ、EC:4.2.1.9、NCBI遺伝子番号:NP_228361.1)を、サーモトガ・マリティマ(Thermotoga maritime)からクローニングし、標準的な方法で組換えによってE.コリで発現させる。ラクトコッカス・ラクティス(Lactococcus lactis)(EC4.1.1.−、NCBI遺伝子番号:CAG34226.1)由来のα−ケトイソ吉草酸脱炭酸酵素をクローニングし、標準的な方法で組換えによってE.コリで発現させる。S.セレビジエ由来のアルコール脱水素酵素(EC:1.1.1.1)はシグマ−アルドリッチ(Sigma−Aldrich)(A3263)から購入する。
以下の酵素に関する遺伝子:グルコース脱水素酵素(EC1.1.1.47、S.ソルファタリカス(S.solfataricus)、NCBI遺伝子番号:NP_344316.1)、グルコノラクトナーゼ(EC3.1.1.17、ピクロフィルス・トリダス(Picrophilus torridus)、NCBI遺伝子番号:YP_023685.1)、グルコン酸デヒドラターゼ(EC4.2.1.39、スルフォロブス・ソルファタリカス、NCBI遺伝子番号:NP_344505、突然変異株I9L)、2−ケト−3−デオキシグルコン酸アルドラーゼ(EC4.1.2.14、スルフォロブス・ソルファタリカス(Sulflobus solfataricus)、NCBI遺伝子番号:NP_344504.1)、アルデヒド脱水素酵素(EC1.2.1.3、フラボバクテリウム・フリギディマリス(Flavobacterium frigidimaris)、NCBI遺伝子番号:BAB96577.1)、グリセリン酸キナーゼ(EC2.7.1.−、スルフォロブス・ソルファタリカス、NCBI遺伝子番号:NP_342180.1)、エノラーゼ(EC4.2.1.11、スルフォロブス・ソルファタリカス、NCBI遺伝子番号:NP_342405.1)、および、ピルビン酸キナーゼ(EC2.7.1.40、スルフォロブス・ソルファタリカス、NCBI遺伝子番号:NP_342465.1)を合成し、クローニングのためにNdeIおよびBamHIを用いて標準的な方法で発現ベクターpET3bにクローニングする。細胞増殖、タンパク質発現および部分的な精製は、Lamble等(2003)によって説明されている通りに行なうが、それに加えて、全ての緩衝液に5mMのメルカプトエタノールを供給し、加熱沈殿の一般的な温度として80℃を用いる(アルデヒド脱水素酵素の場合、60℃を用いる)。タンパク質生産は通常、5〜50mg/lであった。S.セレビジエ由来のピルビン酸脱炭酸酵素およびアルデヒド脱水素酵素は、シグマ−アルドリッチ(製品番号29163および82884)から得る。
正味のATP生産またはその他のあらゆる補因子なしで、グルコースからエタノールまたは化学物質および燃料を生産することは有利ではあるが、本方法から補因子としてのATPまたはADPが完全に除去されることがより有益である。それゆえに、実施例5で説明した酵素群、ただしグリセリン酸キナーゼ(EC2.7.1.−)、エノラーゼ(EC4.2.1.11)、および、ピルビン酸キナーゼ(EC2.7.1.40)を除く、を用いる。グリセリン酸脱水素酵素(別名ヒドロキシピルビン酸還元酵素(EC1.1.1.29/1.1.1.81))、セリン−ピルビン酸トランスアミナーゼ(EC2.6.1.51)、L−セリンアンモニア−リアーゼ(EC4.3.1.17)、および、アラニン脱水素酵素(EC1.4.1.1)を用いて、グリセリン酸のピルビン酸への変換が達成される。以下の酵素に関する遺伝子:グリセリン酸脱水素酵素/ヒドロキシピルビン酸還元酵素(EC1.1.1.29/1.1.1.81、ピクロフィルス・トリダス、NCBI遺伝子番号:YP_023894.1)、セリン−ピルビン酸トランスアミナーゼ(EC2.6.1.51、スルフォロブス・ソルファタリカス、NCBI遺伝子番号:NP_343929.1)、L−セリンアンモニア−リアーゼ(EC4.3.1.17、サーマス・サーモフィルス、YP_144295.1、および、YP_144005.1)、および、アラニン脱水素酵素(EC1.4.1.1、サーマス・サーモフィルス、NCBI遺伝子番号:YP_005739.1)を合成し(E.コリにおける生産に最適化したコドン)、NdeIおよびBamHIを用いて発現ベクター pET3bにクローニングする。タンパク質発現はE.コリで行なう。
グリセリン酸からのピルビン酸の形成は、エタノールまたはその他のピルビン酸誘導体の生産における重要な工程である。S.ソルファタリカス由来のジヒドロキシ酸デヒドラターゼ(EC4.2.1.9)は、異なる基質を受け入れることが示されている(Kim and Lee,2006)。ジヒドロキシ酸デヒドラターゼに関する遺伝子(EC4.2.1.9、S.ソルファタリカス、NP_344419.1)は、KimおよびLee(2006)によって説明されているように発現される。これらの酵素は、グリセリン酸をピルビン酸に変換することができる(しかしながら、天然基質と比較してより低い活性である)。またこれらの酵素は、グルコン酸に対しても活性である(しかしながら、天然基質と比較してより低い活性である)。
ピルビン酸シンターゼ4単位の遺伝子(EC1.2.7.1.、スルフォロブス・ソルファタリカス、NCBI遺伝子番号:NP_342664.1、NP_342663.1、NP_342666.1、NP_343517.1)、および、NADH フェレドキシン還元酵素の遺伝子(EC1.18.1.3、NCBI遺伝子番号:NP_342682.1)を合成し、pET3bでNdeIおよびBamHI部位を用いてクローニングする。これらの遺伝子を、説明されているようにして、E.コリ中で嫌気的に発現させ、一部精製する。グルコース脱水素酵素、グルコノラクトナーゼ、グルコン酸デヒドラターゼ、2−ケト−3−デオキシグルコン酸アルドラーゼ、アルデヒド脱水素酵素、グリセリン酸キナーゼ、エノラーゼ、および、ピルビン酸キナーゼを実施例5で説明されているように得た。実施例3で説明されているように、チオラーゼ、β−ヒドロキシブチリルCoA脱水素酵素、ブチリルCoA脱水素酵素、CoAアシル化ブタナール脱水素酵素、および、ブタノール脱水素酵素(etfAおよびetfB含む)が得られる。
グルコース脱水素酵素、グルコノラクトナーゼ、2−ケト−3−デオキシグルコン酸アルドラーゼ、および、アルデヒド脱水素酵素を実施例5で説明したようにして得る。ジヒドロキシ酸デヒドラターゼを実施例9で説明したようにして得る。NADH フェレドキシン還元酵素およびピルビン酸シンターゼを実施例10で説明したようにして得る。チオラーゼ、β−ヒドロキシブチリルCoA脱水素酵素、ブチリルCoA脱水素酵素、CoAアシル化ブタナール脱水素酵素、および、ブタノール脱水素酵素(etfAおよびetfBを含む)を実施例3で説明したようにして得る。
アセト乳酸合成酵素(EC2.2.1.6、スルフォロブス・ソルファタリカス、NCBI遺伝子番号:NP_342102.1)、ケトール酸レダクトイソメラーゼ(EC1.1.1.86、スルフォロブス・ソルファタリカス、NCBI遺伝子番号:NP_342100.1)、分枝2−オキソ酸脱炭酸酵素(EC4.1.1.72、ラクトコッカス・ラクティス、NCBI遺伝子番号)、および、アルコール脱水素酵素(EC1.1.1.1、フラボバクテリウム・フリギディマリス、NCBI遺伝子番号:BAB91411.1)の触媒単位を、pET3b中でNdeIおよびBamHI部位を用いてクローニングする。この遺伝子をE.コリで発現させる。これらの酵素は、ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ(実施例7を参照)と共に、ピルビン酸からイソブタノールへの経路を構成する。グルコース脱水素酵素、グルコノラクトナーゼ、グルコン酸デヒドラターゼ、2−ケト−3−デオキシグルコン酸アルドラーゼ、アルデヒド脱水素酵素、グリセリン酸キナーゼ、エノラーゼ、および、ピルビン酸キナーゼを実施例5で説明したようにして得る。ジヒドロキシ酸デヒドラターゼを実施例5で説明したようにして得る。
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Claims (13)
- グルコース、またはグルコースを含むオリゴマーもしくはポリマーからの無細胞酵素系によるピルビン酸由来の有機化合物の製造方法であって、該方法は、
(i)グルコースを、中間生成物であるグルコノラクトン、グルコン酸、2−ケト−デオキシグルコン酸、及びグリセリン酸を介してピルビン酸へと変換すること、ここで正味のATP生産は生じず、また、1モルのグルコース当たり2モルのピルビン酸が生じる、及び
(ii)前記ピルビン酸を、前記ピルビン酸由来の有機化合物へと変換すること、
を含む上記方法。 - 前記ピルビン酸由来の有機化合物が、エタノール、n−ブタノール、イソブタノール、または2−ブタノールである、請求項1に記載の方法。
- グリセリン酸が、中間生成物であるグリセリン酸−2−リン酸およびホスホエノールピルビン酸を介してピルビン酸へと反応する、請求項1または2に記載の方法。
- 酵素であるグリセリン酸キナーゼ(EC2.7.1)、エノラーゼ(EC4.2.1.11)、及びピルビン酸キナーゼ(EC2.7.1.40)が、グリセリン酸からグリセリン酸−2−リン酸への反応、グリセリン酸−2−リン酸からホスホエノールピルビン酸への反応、及びホスホエノールピルビン酸からピルビン酸への反応にそれぞれ用いられる、請求項3に記載の方法。
- グルコースからピルビン酸への変換が、補因子としてATPおよび/またはADPなしでも完全に機能する、請求項1に記載の方法。
- グリセリン酸が、中間生成物であるヒドロキシピルビン酸を介してピルビン酸へと反応し、ピルビン酸が、セリン−ピルビン酸トランスアミナーゼに触媒されてアラニンと反応してセリンおよびピルビン酸を提供し、セリンが、ピルビン酸およびアンモニアへと変換されて、次いで、アラニンへと変換される、請求項1または5に記載の方法。
- 酵素であるグリセリン酸脱水素酵素(EC1.1.1.29)、セリン−ピルビン酸トランスアミナーゼ(EC2.6.1.51)、L−セリンアンモニアリアーゼ(EC4.3.1.17)、及びアラニン脱水素酵素(EC1.4.1.1)が、グリセリン酸からヒドロキシピルビン酸への反応、ヒドロキシピルビン酸からヒドロキシピルビン酸+アラニンを介してセリン+ピルビン酸への反応、セリンからピルビン酸+アンモニアへの反応、及びピルビン酸+アンモニアからアラニンへの反応にそれぞれ用いられる、請求項6に記載の方法。
- グリセリン酸が直接にピルビン酸へと変換される、請求項1または5に記載の方法。
- 酵素であるグリセリン酸デヒドラターゼ(EC4.2.1)がグリセリン酸からピルビン酸への直接の反応に用いられる、請求項8に記載の方法。
- 前記製造方法が、2つに分離した相を含む液体系中で行われ、前記ピルビン酸由来の有機化合物は、主として分離した相の一方に存在しているか、または、分離した相の一方を形成しており、前記ピルビン酸由来の有機化合物はその分離した相から回収される、請求項1〜9のいずれか1項に記載の方法。
- 2つの別の相を形成するために、有機溶媒が添加される、請求項1〜10のいずれか一項に記載の方法。
- グルコース、またはグルコースを含むオリゴマーもしくはポリマーが前記方法に連続的に供給され、前記ピルビン酸由来の有機化合物が連続的に取り出される、請求項1〜11のいずれか一項に記載の方法。
- ATPアーゼが用いられない、請求項1〜12のいずれか一項に記載の方法。
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