CN106011094A - 工程化酮还原酶多肽及其用于制备(3r,5s)-6-氯-3,5-二羟基己酸叔丁酯的方法 - Google Patents
工程化酮还原酶多肽及其用于制备(3r,5s)-6-氯-3,5-二羟基己酸叔丁酯的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN106011094A CN106011094A CN201610596347.6A CN201610596347A CN106011094A CN 106011094 A CN106011094 A CN 106011094A CN 201610596347 A CN201610596347 A CN 201610596347A CN 106011094 A CN106011094 A CN 106011094A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- chloro
- butyl ester
- sequence
- hecanoic acid
- dihydroxy
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
- C12P7/62—Carboxylic acid esters
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一种工程化酮还原酶多肽及其用于制备(3R,5S)‑6‑氯‑3,5‑二羟基己酸叔丁酯的方法,与现有技术相比,反应过程中采用了本发明的工程化酮还原酶多肽,其不仅酶用量低,而且反应时间短、底物浓度高,更加适合产业化应用。
Description
技术领域
本发明属于生物制药和生物转化领域,具体涉及一种工程化酮还原酶多肽及其用于制备(3R,5S)-6-氯-3,5-二羟基己酸叔丁酯的方法。
背景技术
(3R,5S)-6-氯-3,5-二羟基己酸叔丁酯是一种手性药物砌块,可以用于合成包括罗苏伐他汀(Rosuvastatin)等药物,其结构如式1所示。
(3R,5S)-6-氯-3,5-二羟基己酸叔丁酯的常见合成方法如式2所示,其关键步骤在于合成3-位的手性羟基中心,将含有羰基的前体6-氯-(5S)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯直接还原成手性醇无疑是较为理想的方法。
该反应的实现方法主要有化学法和生物法。化学法例如Angew.Chem.Int.Ed.2000,39:4306-4307等报道,低温下使用易燃易爆试剂,工艺复杂且环境友好性不高,产物de值较低(93%)。生物法中的整细胞催化法如《化学反应工程与工艺》,2006,26:554-559和Korean J.Chem.Eng.,2013,30:166-171等报道,存在底物浓度低(<50g/L),酶用量大(>50g/L),ee值低(95%)等问题。游离的酮还原酶催化如WO 2008042876等报道,底物浓度低(13g/L),酶用量高(酮还原酶3.3%,GDH 3.3%,辅酶0.67%),产物收率低(66.7%)。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足,提供一种工程化酮还原酶多肽及其用于制备(3R,5S)-6-氯-3,5-二羟基己酸叔丁酯的方法。
为达到上述目的,本发明采用的技术方案是:一种工程化酮还原酶多肽,能够以6-氯-(5S)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯为底物,在适合的条件下将其还原为(3R,5S)-6-氯-3,5-二羟基己酸叔丁酯,所述的酮还原酶多肽的氨基酸序列与序列2、4、6、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42及44中的任一序列具有至少90%的同源性。其中,序列2为来自Candida magnoliae的野生型酮还原酶,其他的序列通过易错PCR等随机突变和活性位点盒式突变(CASTing)等定点突变方法获得,突变体获得增强的活性和稳定性,可以通过高通量筛选(HTS)等方法探知,上述的改变氨基酸序列和筛选突变体库方法,均为本领域内的常规技术。
本发明提供了一种编码多肽的多核苷酸。优选地,所述的多核苷酸选自序列1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43中的任一序列,其表达的蛋白如上文所示。
本发明提供一种表达载体,所述表达载体包含与适合指导在宿主细胞中表达的控制序列可操作地连接的多核苷酸。该表达载体为pET30a。
本发明还提供一种宿主细胞,所述宿主细胞包含上述的表达载体,如大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆、黑曲霉、酿酒酵母和毕赤酵母等。优选地,该宿主细胞为大肠杆菌。
本发明还提供了一种使用上述酮还原酶多肽生物催化制备(3R,5S)-6-氯-3,5-二羟基己酸叔丁酯的方法,所述方法以6-氯-(5S)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯为底物,在适于将其还原为(3R,5S)-6-氯-3,5-二羟基己酸叔丁酯的反应条件下与上述的酮还原酶多肽接触。
优选地,所述反应是在辅酶和辅酶再生***的存在下,在pH为6.0~7.0、温度为25℃~30℃的缓冲溶液中进行的,其中,所述的辅酶为NADP,所述的辅酶再生***为葡萄糖和葡萄糖脱氢酶。常见的辅因子再生***包括但不限于葡萄糖和葡萄糖脱氢酶、甲酸和甲酸脱氢酶、葡萄糖-6-磷酸和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、仲醇(如异丙醇)和仲醇脱氢酶、亚磷酸和亚磷酸脱氢酶、分子氢和氢化酶以及电化学等方法。
优选地,所述葡萄糖脱氢酶为购自苏州汉酶生物技术有限公司生产的牌号为EW002的葡萄糖脱氢酶。
由于上述技术方案的运用,本发明与现有技术相比具有下列优点:在制备(3R,5S)-6-氯-3,5-二羟基己酸叔丁酯过程中,采用了包括来源于Candida magnoliae IFO0705的野生型酮还原酶多肽和及其工程化还原酶多肽的***酮还原酶,与现有技术相比,酶用量降低至0.25%,底物浓度提高至100g/L,反应时间缩短至6小时,底物转化率99%,具有重要的应用价值。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步详细的说明,但本发明并不限于以下实施例。实施例中采用的实施条件可以根据具体使用的不同要求做进一步调整,未注明的实施条件为常规实验中的条件。
实施例1(酮还原酶的制备):
采用常规方法制备获得了酮还原酶催化剂:序列表中1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43的基因片段由苏州金唯智生物科技有限公司合成,与pET30a(Novagen)质粒的酶切产物连接,转入感受态E.coli BL21(DE3)菌株,筛选得到阳性克隆子,接种到含有抗性的液体LB培养基中,于37℃培养至OD600至0.8,加入诱导剂IPTG,继续培养16小时,离心收集沉淀,加入磷酸盐缓冲液悬浮,冰水浴中超声波破碎10分钟,离心取上清,冷冻得到酮还原酶酶粉。
实施例2(酮还原酶的筛选)
由序列1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43在大肠杆菌中表达获得的酮还原酶2mg,GDH(采购自苏州汉酶生物技术有限公司,牌号EW002)2mg,NADP 1mg,底物6-氯-(5S)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯50mg、葡萄糖50mg加至装有2mL0.05M三乙醇胺缓冲液的5mL反应器中,30℃1000rpm搅拌,1h后取样HPLC检测,序列43的转化率和ee均为>99%,因此采用序列43作为进一步研究对象。
实施例3(酶催化反应)
底物6-氯-(5S)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯6g、葡萄糖20g加至装有50mL 50mM pH6.5的磷酸盐缓冲溶液的100mL反应器中,加入由序列43在大肠杆菌中表达获得的酮还原酶15mg,GDH(采购自苏州汉酶生物技术有限公司,牌号EW002)15mg,NADP 3mg,在25℃下,用浓度为15%的碳酸钠溶液调节控制pH 6.0-6.5,搅拌6小时,HPLC/MS检测反应完全,加入等体积乙酸乙酯过滤后取有机相,水相用等体积乙酸乙酯萃取3次,合并有机相旋蒸获得产物(3R,5S)-6-氯-3,5-二羟基己酸叔丁酯的淡黄色液体5.5g,de值99.9%,纯度99.0%。
上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点,其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施,并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰,都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种工程化酮还原酶多肽,能够以6-氯-(5S)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯为底物,在适合的条件下将其还原为(3R,5S)-6-氯-3,5-二羟基己酸叔丁酯,其特征在于,所述的酮还原酶多肽的氨基酸序列与序列2、4、6、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42及44中的任一序列具有至少90%的同源性。
2.一种编码如权利要求1所述的多肽的多核苷酸。
3.根据权利要求2所述的多核苷酸,其选自序列1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43中的任一序列。
4.一种表达载体,所述表达载体包含与适合指导在宿主细胞中表达的控制序列可操作地连接的权利要求3所述的多核苷酸。
5.一种宿主细胞,所述宿主细胞包含权利要求4所述的表达载体。
6.根据权利要求5所述的宿主细胞,其为大肠杆菌。
7.一种使用权利要求1中所述的酮还原酶多肽生物催化制备(3R,5S)-6-氯-3,5-二羟基己酸叔丁酯的方法,其特征在于,所述方法以6-氯-(5S)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯为底物,在适于将其还原为(3R,5S)-6-氯-3,5-二羟基己酸叔丁酯的反应条件下与权利要求1所述的酮还原酶多肽接触。
8.根据权利要求7所述的制备(3R,5S)-6-氯-3,5-二羟基己酸叔丁酯的方法,其特征在于,所述反应是在辅酶和辅酶再生***的存在下,在pH为6.0~7.0、温度为25℃~30℃的缓冲溶液中进行的,其中,所述的辅酶为NADP,所述的辅酶再生***为葡萄糖和葡萄糖脱氢酶。
9.根据权利要求7所述的制备(3R,5S)-6-氯-3,5-二羟基己酸叔丁酯的方法,其特征在于,所述葡萄糖脱氢酶为购自苏州汉酶生物技术有限公司生产的牌号为EW002的葡萄糖脱氢酶。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201610596347.6A CN106011094B (zh) | 2016-07-27 | 2016-07-27 | 工程化酮还原酶多肽及其用于制备(3r,5s)-6-氯-3,5-二羟基己酸叔丁酯的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201610596347.6A CN106011094B (zh) | 2016-07-27 | 2016-07-27 | 工程化酮还原酶多肽及其用于制备(3r,5s)-6-氯-3,5-二羟基己酸叔丁酯的方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN106011094A true CN106011094A (zh) | 2016-10-12 |
CN106011094B CN106011094B (zh) | 2020-11-03 |
Family
ID=57115435
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201610596347.6A Active CN106011094B (zh) | 2016-07-27 | 2016-07-27 | 工程化酮还原酶多肽及其用于制备(3r,5s)-6-氯-3,5-二羟基己酸叔丁酯的方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN106011094B (zh) |
Citations (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN1274356A (zh) * | 1998-08-05 | 2000-11-22 | 钟渊化学工业株式会社 | 制备光学活性的2-[6-(羟甲基)-1,3-二噁烷-4-基]乙酸衍生物的方法 |
CN102965403A (zh) * | 2012-11-19 | 2013-03-13 | 苏州汉酶生物技术有限公司 | (3r,5s)-6-氯-3,5-二羟基己酸叔丁酯的生物制备方法 |
US8455223B2 (en) * | 2005-09-19 | 2013-06-04 | Basf Se | Dehydrogenases, the derivatives thereof, and method for the production of optically active alkanols |
CN104496780A (zh) * | 2010-11-09 | 2015-04-08 | 株式会社钟化 | 卤化茚酮类及使用其的光学活性茚满酮类或光学活性茚满醇类的制造方法 |
CN104630125A (zh) * | 2015-01-12 | 2015-05-20 | 浙江大学 | 工程菌及其在制备(3r, 5s)-6-氯-3,5-二羟基己酸叔丁酯中的应用 |
CN104726506A (zh) * | 2015-03-17 | 2015-06-24 | 苏州汉酶生物技术有限公司 | 一种(3r,5s)-6-氯-3,5-二羟基己酸叔丁酯的制备方法 |
CN106011092A (zh) * | 2016-06-20 | 2016-10-12 | 苏州汉酶生物技术有限公司 | 一种工程化酮还原酶多肽及其用于制备孟鲁斯特中间体的方法 |
-
2016
- 2016-07-27 CN CN201610596347.6A patent/CN106011094B/zh active Active
Patent Citations (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN1274356A (zh) * | 1998-08-05 | 2000-11-22 | 钟渊化学工业株式会社 | 制备光学活性的2-[6-(羟甲基)-1,3-二噁烷-4-基]乙酸衍生物的方法 |
US8455223B2 (en) * | 2005-09-19 | 2013-06-04 | Basf Se | Dehydrogenases, the derivatives thereof, and method for the production of optically active alkanols |
CN104496780A (zh) * | 2010-11-09 | 2015-04-08 | 株式会社钟化 | 卤化茚酮类及使用其的光学活性茚满酮类或光学活性茚满醇类的制造方法 |
CN102965403A (zh) * | 2012-11-19 | 2013-03-13 | 苏州汉酶生物技术有限公司 | (3r,5s)-6-氯-3,5-二羟基己酸叔丁酯的生物制备方法 |
CN104630125A (zh) * | 2015-01-12 | 2015-05-20 | 浙江大学 | 工程菌及其在制备(3r, 5s)-6-氯-3,5-二羟基己酸叔丁酯中的应用 |
CN104726506A (zh) * | 2015-03-17 | 2015-06-24 | 苏州汉酶生物技术有限公司 | 一种(3r,5s)-6-氯-3,5-二羟基己酸叔丁酯的制备方法 |
CN106011092A (zh) * | 2016-06-20 | 2016-10-12 | 苏州汉酶生物技术有限公司 | 一种工程化酮还原酶多肽及其用于制备孟鲁斯特中间体的方法 |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
ANONYMOUS: "ABB91668.1", 《GENBANK》 * |
ANONYMOUS: "DQ288129.1", 《GENBANK》 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN106011094B (zh) | 2020-11-03 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Mitsukura et al. | A NADPH-dependent (S)-imine reductase (SIR) from Streptomyces sp. GF3546 for asymmetric synthesis of optically active amines: purification, characterization, gene cloning, and expression | |
JP6061862B2 (ja) | 3‐ヒドロキシプロピオン酸生産用の組成物及び方法 | |
Weckbecker et al. | Improved synthesis of chiral alcohols with Escherichia coli cells co-expressing pyridine nucleotide transhydrogenase, NADP+-dependent alcohol dehydrogenase and NAD+-dependent formate dehydrogenase | |
JP2022025108A (ja) | Fdcaの真菌による生産 | |
CN108239609B (zh) | 重组酵母及其应用 | |
CN106011095B (zh) | 工程化酮还原酶多肽及使用其制备依替米贝中间体的方法 | |
CN108949852B (zh) | 一种利用全细胞催化制备木糖醇的方法 | |
WO2014075439A1 (zh) | (3r,5s)-6-氯-3,5-二羟基己酸叔丁酯的生物制备方法 | |
Wang et al. | Discovery of a new NADPH-dependent aldo-keto reductase from Candida orthopsilosis catalyzing the stereospecific synthesis of (R)-pantolactone by genome mining | |
CN107312766B (zh) | 一种酶活提高的丙酮酸脱羧酶突变体 | |
WO2019008131A1 (en) | PSEUDOMONAS PUTIDA RECOMBINANT FOR THE PRODUCTION OF D-XYLONATE FROM D-XYLOSE | |
CN105177078A (zh) | 一种羟基四氢嘧啶的制备方法 | |
US10844363B2 (en) | Xylose isomerase-modified yeast strains and methods for bioproduct production | |
CN105385700A (zh) | 一种葡萄糖基转移酶基因及其制备方法和重组工程菌及其构建方法和应用 | |
US20110207190A1 (en) | Methods of xylitol preparation | |
WO2013059326A1 (en) | Xylitol production from cellulosic biomass | |
CN106011096B (zh) | 工程化酮还原酶多肽及其用于制备(s)-3-(二甲胺基)-1-(噻吩-2-基)-1-丙醇的方法 | |
CN106011094A (zh) | 工程化酮还原酶多肽及其用于制备(3r,5s)-6-氯-3,5-二羟基己酸叔丁酯的方法 | |
CN103725718A (zh) | 一种生物法合成乙偶姻及其衍生物的方法 | |
WO2018207931A1 (ja) | 組換え微生物、組換え微生物を用いたピリドキサミン又はその塩の製造方法、及び組換え微生物を用いたピリドキサール又はその塩の製造方法 | |
EP2558585B1 (en) | A recombinant process for the production of R-aromatic alpha-hydroxy ketones | |
CN106011092A (zh) | 一种工程化酮还原酶多肽及其用于制备孟鲁斯特中间体的方法 | |
WO2015141705A1 (ja) | 耐酸耐塩性付与方法と耐酸耐塩性酵母を用いた有用物質生産 | |
US10337033B2 (en) | Carbonyl reductase oligomers and their application in synthesis of chiral alcohols | |
CN109295021A (zh) | 酮还原酶及其在不对称合成r-3,5-双(三氟甲基)苯乙醇中的应用 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant |