CN102965361A

CN102965361A - 一种普鲁兰酶XWPu2及其基因

Info

Publication number: CN102965361A
Application number: CN2012105114546A
Authority: CN
Inventors: 黄遵锡
Original assignee: Kunming Qactive Biological Science & Technology Co Ltd
Current assignee: Kunming Qactive Biological Science & Technology Co Ltd
Priority date: 2012-12-04
Filing date: 2012-12-04
Publication date: 2013-03-13
Anticipated expiration: 2032-12-04
Also published as: CN102965361B

Abstract

本发明是一种普鲁兰酶XWPu2及其基因。其氨基酸序列如SEQIDNO.1所示，其核苷酸序列如SEQIDNO.2所示，提供普鲁兰酶基因XWPu2的重组载体和重组菌株。本发明以普鲁兰糖为底物的普鲁兰酶XWPu2具有以下性质：最适温度50℃；最适pH5.8-6.8；终浓度1mM的β-巯基乙醇和1mM金属离子Ca²⁺、Mn²⁺、Fe²⁺和K⁺对酶有较强的激活作用；37℃和50℃保温140min残余酶活依次在84%和52%以上；pH5.0和pH8.6的缓冲液下处理90min残余酶活在74%和57%以上；比活力383.5U/mg。此外，薄层层析定性分析普鲁兰酶XWPu2彻底水解普鲁兰糖生成单一麦芽三糖；水解玉米支链淀粉生成糊精；水解环糊精生成葡萄糖。以上研究表明，普鲁兰酶XWPu2在食品、化工、制药、能源等行业中有潜在的应用前景。

Description

一种普鲁兰酶XWPu2及其基因

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体地说是一种嗜碱性类芽孢杆菌XW-6-66来源的I型普鲁兰酶XWPu2及其基因。

背景技术

普鲁兰酶（Pullulanase, E C 3.2.1.41）即α-糊精-6-葡聚糖水解酶，能专一性地水解多糖的α-1，6-糖苷键，使支链型多糖的分支链脱支，形成一系列链长不一的直链淀粉（Yu B, Wang J P, Zhang H X, et al. Molecules,2011,16:3010-3017）。在淀粉水解过程中，普鲁兰酶与α-淀粉酶、糖化酶配合使用，可以将淀粉彻底降解为葡萄糖；与β-淀粉酶配合用时可以将淀粉完全转化成麦芽糖，在淀粉加工中发挥着重要作用。另外，普鲁兰酶与其他糖苷水解酶类协同作用于不同类型底物还可以获得不同类型的终产物，因此，普鲁兰酶在化工和制药等行业中是一种不可或缺的酶类。

普鲁兰酶是一种重要的工业用酶，然而天然菌株产酶低、难以大量生产，生产成本高，限制了其推广应用。利用分子生物学手段构建高效生物反应器，可以提高普鲁兰酶的表达量，实现其大规模工业化生产。本文从嗜碱性类芽孢杆菌（Paenibacillus sp.）XW-6-66基因组中克隆普鲁兰酶基因XWPu2与表达载体pET28a(+)连接后，转化到大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达并对普鲁兰酶XWPu2酶学性质及水解淀粉、多糖进行了初步研究，为后期推广普鲁兰酶的应用奠定了一定的基础。

发明内容

本发明的目的是提供一种普鲁兰酶XWPu2。

本发明的再一目的是提供编码上述普鲁兰酶XWPu2的基因。

本发明的另一目的是提供包含上述基因的重组载体。

本发明的另一目的是提供包含上述基因的重组菌株。

本发明所述普鲁兰酶XWPu2来自嗜碱性类芽孢杆菌（Paenibacillus sp.），XWPu2的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明的普鲁兰酶XWPu2总共含有653个氨基酸，理论分子量为74.02 kDa。以普鲁兰糖为底物：最适温度50℃；最适pH5.8-6.8；终浓度1 mM的β-巯基乙醇和1 mM金属离子Ca²⁺、Mn²⁺、Fe²⁺和K⁺对酶有较强的激活作用，Cu²⁺、Hg⁺、Co⁺ 、Zn²⁺ 、Pb⁺、SDS和EDTA有较强的抑制作用；普鲁兰酶XWPu2热稳定性研究表明，37 ℃和50 ℃保温140 min残余酶活依次在84%和52%以上；pH稳定性研究表明，pH5.0 、pH5.8和pH8.6的缓冲液下处理90 min残余酶活依次在74%、74.5%和57%以上；普鲁兰酶XWPu2的比活力为383.5 U/mg。此外，薄层层析定性分析普鲁兰酶XWPu2彻底水解普鲁兰糖生成单一麦芽三糖；水解玉米支链淀粉生成糊精；水解环糊精生成葡萄糖。以上研究表明，普鲁兰酶XWPu2在食品、化工、制药、能源等行业中有潜在的应用前景。

本发明提供了编码上述普鲁兰酶的基因XWPu2，该基因序列如SEQ ID NO.2。

本发明通过PCR的方法克隆了普鲁兰酶XWPu2的编码基因XWPu2，其全长1959 bp，起始密码为ATG，终止密码为TAA。经BLAST 在GeneBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)数据库进行比对分析，该普鲁兰酶基因XWPu2编码的氨基酸序列与GeneBank中Paenibacillus lactis 154来源的潜在Ⅰ型普鲁兰酶（ZP_09000293.1）具有最高一致性，为67%；与Paenibacillus vortex V453来源潜在Ⅰ型普鲁兰酶（ZP_07901047.1）具有最高一致性，为65%，说明普鲁兰酶XWPu2是一种新的普鲁兰酶。

本发明还提供了包含上述普鲁兰酶基因XWPu2的重组载体，优选为pET-XWPu2。将本发明的普鲁兰酶基因***到表达载体合适的限制性内切酶位点之间，使其核苷酸序列与表达调控序列相连接。作为本发明的一个最优选的实施方案，将本发明的普鲁兰酶基因***到质粒pET-28a(+)上的EcoRⅠ和XhoⅠ限制性酶切位点之间，得到重组大肠杆菌表达质粒pET-XWPu2。

本发明还提供了包含上述普鲁兰酶基因XWPu2的重组菌株，优选所述菌株为大肠杆菌、酵母菌、芽孢杆菌或乳酸杆菌，优选为重组菌株BL21(DE3)/ XWPu2。

本发明制备普鲁兰酶XWPu2的方法按以下步骤进行：

1）用上述的重组载体转化宿主细胞，得重组菌株；

2）培养重组菌株，诱导重组普鲁兰酶表达；

3）回收并纯化所表达的普鲁兰酶XWPu2。

其中，优选所述宿主细胞为大肠杆菌细胞，优选将重组大肠杆菌表达质粒转化大肠杆菌细胞BL21(DE3)，得到重组菌株BL21(DE3)/ XWPu2。

本发明提供了一个新的普鲁兰酶基因，其编码的普鲁兰酶以普鲁兰糖为底物：最适温度50℃；最适pH5.8-6.8；终浓度1 mM的β-巯基乙醇和1 mM金属离子Ca²⁺、Mn²⁺、Fe²⁺和K⁺对酶有较强的激活作用，Cu²⁺、Hg⁺、Co⁺ 、Zn²⁺ 、Pb⁺、SDS和EDTA有较强的抑制作用；普鲁兰酶XWPu2热稳定性研究表明，37℃和50 ℃保温140 min残余酶活依次在84%和52%以上；pH稳定性研究表明，pH5.0 、pH5.8和pH8.6的缓冲液下处理90 min残余酶活依次在74%、74.5%和57%以上；普鲁兰酶XWPu2的比活力为383.5 U/mg。此外，薄层层析定性分析普鲁兰酶XWPu2彻底水解普鲁兰糖生成单一麦芽三糖；水解玉米支链淀粉生成糊精；水解环糊精生成葡萄糖。以上研究表明，普鲁兰酶XWPu2在食品、化工、制药、能源等行业中有较广的应用前景。

附图说明

图1：在大肠杆菌中表达的重组普鲁兰酶XWPu2的SDS-PAGE分析，其中，M：低分子量蛋白质Marker；1：纯化的重组普鲁兰酶XWPu2。

图2：重组普鲁兰酶XWPu2的最适温度。

图3：重组普鲁兰酶XWPu2的热稳定性。

图4：重组普鲁兰酶XWPu2的最适pH。

图5：重组普鲁兰酶XWPu2的pH稳定性。

图6：不同金属离子及化学试剂对重组普鲁兰酶XWPu2活性的影响。

图7：薄层层析定性分析重组普鲁兰酶XWPu2的水解产物，其中图7-（A）：1，麦芽糖标准品；2，普鲁兰糖对照；3，普鲁兰酶XWPu2水解普鲁兰糖；4，麦芽三糖标准品；5，糊精；图7-（B）：1，α-环糊精对照；2，普鲁兰酶XWPu2水解α-环糊精；3，普鲁兰酶XWPu2水解β-环糊精；4，β-环糊精对照；5，普鲁兰酶XWPu2水解玉米支链淀粉； 6，玉米支链淀粉对照； 7，普鲁兰酶XWPu2水解糊精；8，糊精对照；9，糊精。

具体实施方式

实验材料和试剂

1、菌株及载体：嗜碱性类芽孢杆菌（Paenibacillus sp.与保藏编号为CGMCC No.2096的芽孢杆菌属菌株LZ-10性质相似）；大肠杆菌Escherichia coli BL21（DE3）和表达载体pET-28a（+）可购于Novagen公司。

2、酶类及其它生化试剂：限制性内切酶、DNA聚合酶和dNTP购自TaKaRa公司；T4连接酶购自Promega公司；普鲁兰糖和玉米支链淀粉购自Sigma公司；其它试剂均购自国药集团。

3、培养基：

LB培养基：蛋白胨 1%，酵母粉 0.5%，氯化钠1%，pH自然（约为7.0）。固体培养基在此基础上加2.0%（w/v）琼脂。

说明：以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》（第三版）J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。

实施例1：普鲁兰酶基因XWPu2的克隆

提取嗜碱性类芽孢杆菌（Paenibacillus sp.）基因组DNA：CTAB裂解法，具体步骤为：将液体培养12 h的新鲜菌液离心取菌体，加入800 μL溶液Ⅰ（ 20 mM Tris, pH8.0, 2 mM Na₂-EDTA, 终浓度20 mg/mL溶菌酶），37 ℃保温30 min，加100 μL 10% SDS上下颠倒混匀，再加10 μL 10 mg/mL的蛋白酶K，37 ℃保温30 min，加150 μL 5 M NaCl和150 μL 10% CTAB溶液上下颠倒混匀，65 ℃保温20 min，分装成600 μL每管，再加入600 μL酚/氯仿/异丙醇（体积比25：24：1）进行抽提，在4 ℃下12000 rpm离心10 min，取上清300 μL于300 μL氯仿/异丙醇（体积比24：1）中再次抽提除去杂蛋白，4 ℃下12000 rpm离心10 min，再取上清200 μL并加入2倍体积无水乙醇和1/10体积的pH5.2 3 M NaAc，-70 ℃沉淀1h，4 ℃下13500 rpm离心20 min，弃上清，再用70%的乙醇洗涤两次，真空干燥，加入适量TE溶解，置于-20 ℃备用。

根据嗜碱性类芽孢杆菌（Paenibacillus sp.）全基因组测序及基因注释分析普鲁兰酶基因XWPu2并设计表达引物CarF和CarR：

上游引物CarF: 5’ CCGGAATTCATGGCGGTGCAGAAGGATAGGA 3’（划线部分为EcoRⅠ酶切位点）

下游引物CarR: 5’ CCGCTCGAGTTACCTGTCACAGCCGAGAATGACC 3’ （划线部分为XhoⅠ酶切位点）

上游引物T7: 5’TAATACGACTCACTATAGGG 3’

下游引物T7ter: 5’TGCTAGTTATTGCTCAGCGG 3’为PCR检测阳性克隆子引物。

以嗜碱性类芽孢杆菌（Paenibacillus sp.）基因组DNA为模板进行PCR扩增。PCR反应参数为：94 ℃预变性5 min；然后94 ℃变性30 sec；60 ℃退火30 sec；72 ℃延伸1 min30 sec；30个循环后72 ℃保温5 min。 PCR纯化产物经EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切，回收目的片段，再与经过同样酶切处理过的表达载体pET-28a(+)连接构建质粒pET-XWPu2，4 ℃过夜。取10 μl连接产物pET-XWPu2转化到100 μl Escherichia coli BL21(DE3)感受态细胞中，涂布于含Kan的LB固体平板上，37 ℃温箱培养13 h，从转化板上挑取几株单菌落，使用引物（T7，T7ter）进行菌落PCR扩增筛选阳性克隆子，从而获得重组大肠杆菌菌株BL21(DE3)/XWPu2。

实施例2：重组普鲁兰酶XWPu2的制备

取含有重组质粒pET-XWPu2的Escherichia coli BL21(DE3)菌株和只含有pET-28a(+)的空质粒Escherichia coli BL21(DE3)菌株，以0.1%的接种量接种于LB（含50 μg/mL Kan）培养液中，37 ℃快速振荡16 h。然后将此活化的菌液以1%接种量接种到新鲜的LB（含50 μg/mL Kan）培养液中，快速振荡培养约2–3 h（OD₆₀₀达到0.6–1.0）后，加入终浓度0.7 mM的IPTG进行诱导，于20 ℃继续振荡培养约20 h或26 ℃振荡培养约8 h。12000 rpm离心5 min，收集菌体。用适量的pH7.0 Tris-HCl缓冲液悬浮菌体后，于低温水浴下超声波破碎菌体。以上胞内浓缩的粗酶液经13,000 rpm离心10 min后，吸取上清并用Nickel-NTA Agarose纯化目的蛋白。SDS-PAGE结果（图1）表明，重组普鲁兰酶在大肠杆菌中得到了表达，经Nickel-NTA Agarose纯化后为单一条带，蛋白质分子量大小约74 kDa。

纯化的重组普鲁兰酶XWPu2的性质测定

1、重组普鲁兰酶XWPu2的活性分析

实施例2纯化的重组普鲁兰酶XWPu2的活性测定方法采用DNS法：取三支10 ml试管，分别编号1、2、3，1号和2号试管为实验组，3号为对照组。分别向1号、2号和3号试管中加入0.9 ml 1%普鲁兰糖底物（底物为50 mmol/L pH6.6的磷酸钾缓冲液配制），40 ℃预热5 min，向1号和2号试管中加入100 μl适当稀释的酶液，40 ℃水浴锅中反应30 min，然后向1号、2号和3号试管中加入1.5 ml DNS终止反应，并将在3号试管中补加100 μl酶液，取出三支试管沸水浴7 min，震荡混匀，流动冷水冷却后，在分光光度计540 nm下测定其吸光度值。1个酶活单位（U/mL）定义为一定条件下，每分钟分解底物普鲁兰糖生成1 μmoL 葡萄糖所需要的酶量。

2、重组普鲁兰酶XWPu2的最适温度和热稳定性的测定：

酶的最适温度的测定：将普鲁兰酶XWPu2在含1 mM Ca²⁺的50 mmol/L pH6.6的磷酸钾缓冲液下，分别在23 ℃、30 ℃、37 ℃、40 ℃、45 ℃、50 ℃、55 ℃、60 ℃和65 ℃下进行酶促反应。温度稳定性的测定：将普鲁兰酶XWPu2在含1 mM Ca²⁺的50 mmol/L pH6.6的磷酸钾缓冲液下，分别在37 ℃和50 ℃下分别保温20 min、40 min、60 min、80 min 、100 min、120 min、和140 min后在温度50 ℃，含1 mM Ca²⁺的50 mmol/L pH6.6的磷酸钾缓冲液进行酶促反应，以未处理的酶液作为对照。以1%普鲁兰糖为底物，反应30 min，测定纯化普鲁兰酶XWPu2的酶学性质。结果表明：XWPu2的最适温度50℃（图2）； 37℃和50 ℃保温140 min残余酶活依次在84%和52%以上（图3）。

3、重组普鲁兰酶XWPu2的最适pH和 pH稳定性的测定：

酶的最适pH的测定：将普鲁兰酶XWPu2在最适温度50 ℃，分别在含1 mM Ca²⁺的50 mM 醋酸缓冲液（pH3.6，4.6，5.0）、磷酸钾缓冲液（5.8，6.0，6.2，6.4，6.6，6.8，7.0，7.4，7.6，7.8，8.0）和甘氨酸-氢氧化钠缓冲液（8.6，9.0）条件下酶促反应。pH稳定性的测定：将普鲁兰酶XWPu2在最适温度50℃，在含1mM Ca²⁺的pH5.0、pH5.8和pH8.6缓冲液下分别耐受15 min、30 min、45 min、60 min、75 min和90 min后进行酶促反应，以未处理的酶液作为对照。以1%普鲁兰糖为底物，反应30min，测定纯化普鲁兰酶XWPu2的酶学性质。结果表明：XWPu2的最适pH6.6（图4）；在含1mM Ca²⁺的50 mM pH5.0、pH5.8和pH8.6缓冲液下处理90 min残余酶活依次在74%、74.5%和57%以上（图5）。普鲁兰酶XWPu2的比活力为383.5 U/mg

4、不同金属离子及化学试剂对重组普鲁兰酶XWPu2活性的影响：

在酶促反应体系中加入终浓度1 mM的金属离子及化学试剂，研究其对酶活性的影响。以1%普鲁兰糖为底物，在50 ℃、pH6.6条件下，反应30 min，测定纯化普鲁兰酶XWPu2的酶活力。结果（图6）表明，终浓度1 mM的β-巯基乙醇和1 mM金属离子Mn²⁺、Fe²⁺、K⁺和Ca²⁺对酶有较强的激活作用，Cu²⁺、Hg²⁺、Co²⁺、Zn²⁺ 、Pb²⁺、SDS和EDTA有较强的抑制作用。

5、薄层层析定性分析重组普鲁兰酶XWPu2的水解产物：

分别以1%普鲁兰糖、1%玉米支链淀粉、1%α-环糊精、1%β-环糊精和1%糊精为底物，在重组普鲁兰酶XWPu2最适反应条件（pH6.6，50℃）下进行水解反应30 min，产物经离心并稀释适当倍数取0.5 μl进行薄层层析分析，结果（如图7）表明，普鲁兰酶XWPu2彻底水解普鲁兰糖生成单一麦芽三糖；水解玉米支链淀粉生成糊精；水解环糊精生成葡萄糖。

SEQ ID NO.1：

Met Ala Val Gln Lys Asp Arg Asn Ile Arg Ile Asp Tyr Gly Asp Pro Glu Val Thr Lys

1 5 10 15 20

Gly Val Ser Val Leu Ser Gln Gln Phe Asp Glu Leu Tyr Val Tyr Asp Gly Ala Asp Leu

25 30 35 40

Gly Leu Thr Tyr Thr Pro Ala His Ser Ser Phe Arg Leu Trp Ala Pro Thr Ala Ser Lys

45 50 55 60

Ala Tyr Val Leu Leu Tyr Ser Asp Trp His Ser Glu Thr Pro Asp Arg His Pro Met Gln

65 70 75 80

Arg Asp Val Lys Gly Thr Trp Val Leu Gln Val Asp Gly Asp Leu Ala Gly Arg Tyr Tyr

85 90 95 100

Thr Tyr Leu Val Gln Val Gly Glu Gln Trp Asn Glu Ala Cys Asp Pro Tyr Ala Thr Ala

105 110 115 120

Val Gly Val Asn Gly Asp Arg Ala Ala Ile Val Asp Leu Gln Thr Thr Asn Pro Lys Arg

125 130 135 140

Trp Lys Ala Glu Arg Pro Pro Leu Ala Arg Pro Val Asp Ala Ile Ile Tyr Glu Leu His

145 150 155 160

Ile Arg Asp Tyr Thr Ile His Pro Gly Ser Gly Val Arg Gln Lys Gly Arg Tyr Leu Gly

165 170 175 180

Leu Thr Glu Thr Gly Thr Lys Gly Pro Ala Gln Ile Ala Thr Gly Leu Asp His Leu Thr

185 190 195 200

Gln Leu Gly Val Thr His Val Gln Leu Met Pro Val Phe Asp Tyr Ala Thr Glu Ser Val

205 210 215 220

Asp Glu Thr Arg Leu His Glu Pro Gln Tyr Asn Trp Gly Tyr Asp Pro Lys Asn Tyr Asn

225 230 235 240

Val Pro Glu Gly Ser Tyr Ala Thr Asp Pro Tyr Lys Pro Glu Val Arg Ile Arg Glu Leu

245 250 255 260

Lys Thr Leu Ile Gln Thr Leu His Asp His Gly Leu Arg Val Ile Met Asp Val Val Tyr

265 270 275 280

Asn His Val Tyr Asp Gly Tyr Val Ile His Phe Thr Lys Leu Val Pro Gly Tyr Tyr Leu

285 290 295 300

Arg Tyr Lys Pro Asp Gly Ser Met Ser Asn Gly Ser Gly Cys Gly Asn Asp Cys Ala Thr

305 310 315 320

Glu Arg Pro Met Met Arg Lys Tyr Ile Val Asp Ser Val Leu His Trp Ala Arg Glu Tyr

325 330 335 340

His Ile Asp Ala Phe Arg Phe Asp Leu Met Gly Leu Ile Asp Val Asp Thr Ile Asn Glu

345 350 355 360

Leu Arg Arg Arg Leu Asp Gln Ile Asp Pro Ser Ile Leu Met Leu Gly Glu Gly Trp Val

365 370 375 380

Met Asp Thr Glu Leu Pro Asp Asn Glu Arg Ala Asn Gln Ser His Ala Pro Arg Met Ala

385 390 395 400

Arg Val Ala His Phe Asn Gly Asp Leu Arg Asp Ala Val Lys Gly Glu Val Phe Asp Glu

405 410 415 420

Ala Lys Pro Gly Phe Val Asn Gly Gly Thr Gly Phe Glu Thr Arg Val Lys Gln Ala Val

425 430 435 440

Ala Gly Ala Ile Thr Tyr Ser Glu Gln Leu Arg Ser Phe Ala Ala Glu Pro Asp Gln Cys

445 450 455 460

Val Asn Tyr Ala Glu Cys His Asp Asn His Thr Met Trp Asp Lys Leu Ser Leu Ser Ala

465 470 475 480

Lys Asp Ala Pro Glu Glu Glu Arg Arg Ala Met His Arg Leu Ala Thr Ala Ile Val Leu

485 490 495 500

Thr Cys Gln Gly Ile Pro Phe Leu His Ala Gly Gln Glu Phe Tyr Arg Thr Lys His Gly

505 510 515 520

Val Asp Asn Ser Phe Asn Ala Gly Asp Glu Val Asn Arg Ile Asp Trp Glu Ala Ala Ala

525 530 535 540

Ala His Gln Ala Asp Val Arg Ala Val Arg Glu Leu Ile Glu Leu Arg Arg Arg His Pro

545 550 555 560

Ala Phe Arg Met Arg Ser Ala Glu Gln Ile Arg Lys His Leu Arg Phe Glu Glu Gly Pro

565 570 575 580

Ala His Thr Val Ala Tyr Thr Leu Arg Asp His Ala Asn Gly Glu Arg Tyr Arg His Leu

585 590 595 600

Tyr Val Leu Tyr His Ala Arg Ser Gly Val Thr Arg Leu Ala Leu Pro Pro Leu Gly Ser

605 610 615 620

Trp Glu Pro Val Phe Gly Ala Ala His Ile Glu His Gln Thr Ser Asp Thr Leu Thr Val

625 630 635 640

Arg Gly Ile Gly Met Val Ile Leu Gly Cys Asp Arg

645 650

SEQ ID NO.2：

1 atggcggtgc agaaggatag gaatatccgg atcgattacg gggatccgga agtgaccaag

61 ggagtatctg ttctatcaca gcagttcgac gagttgtatg tctatgatgg cgctgacctg

121 ggactgacgt atacccccgc acattccagc ttccgcttgt gggcaccgac agcgagcaag

181 gcgtatgtgc tgctgtacag cgattggcat tccgagacgc cggatcgtca tcctatgcag

241 cgcgatgtga aggggacatg ggtgctgcaa gtggacgggg atctggccgg acgatactac

301 acctatctgg ttcaggtcgg ggagcagtgg aatgaagctt gcgatcctta tgcgactgcg

361 gtgggggtca atggagaccg ggcggcgatt gtggatcttc agacaacaaa tccgaagcgg

421 tggaaggcgg agcgcccgcc attagcccgt ccggtcgatg ccatcatcta tgagcttcac

481 attcgcgatt acaccattca tcccggcagc ggcgtgcgcc agaaaggacg ctatctcggt

541 ctgaccgaga ctggcactaa ggggcctgca cagattgcaa ccggtctgga ccatctgacc

601 cagctgggcg tgacgcatgt tcagctgatg ccggtgtttg attacgcgac tgaaagcgtg

661 gatgagaccc ggcttcatga gccgcagtat aactggggat atgatccgaa aaattacaat

721 gtgcctgaag gctcctatgc gaccgatccg tataagccgg aagtgcggat tcgcgagttg

781 aaaacgctga tccagacgct gcacgatcac ggtcttaggg tcattatgga cgtggtgtac

841 aaccatgtgt acgacggtta tgttatccat tttacgaagc tggtgcccgg ctattatttg

901 cggtacaagc cggatggctc gatgtccaac gggtcggggt gcgggaatga ctgcgcgaca

961 gagcgcccga tgatgcggaa gtatattgtg gattcggttc tgcactgggc acgtgaatac

1021 catattgacg ccttccgctt tgacctcatg ggactgatcg atgtggatac gatcaatgag

1081 cttcggcgca ggctggatca gatcgaccca tcgattctga tgctggggga aggctgggtc

1141 atggacaccg agctgcctga caacgagcgg gcgaatcagt cgcatgcgcc ccggatggcg

1201 agagtggctc attttaacgg ggaccttcgg gatgcggtga aaggggaagt gtttgatgag

1261 gccaagcccg gcttcgtgaa tggggggacc gggttcgaga cgcgtgtgaa acaggcggtt

1321 gccggggcga tcacgtattc ggagcagctg cgctcctttg ccgccgagcc tgatcagtgt

1381 gtcaattatg ccgagtgtca tgacaatcat acgatgtggg acaagctgag cctgtcggca

1441 aaggatgctc cggaggagga gcggcgggcc atgcacaggc tggctaccgc tatcgttctg

1501 acctgccagg ggattccgtt tctgcatgcc ggccaggagt tttaccgcac caagcacggc

1561 gtggacaaca gctttaatgc aggcgacgag gtgaatcgga tcgactggga ggcggcggct

1621 gcccatcagg ctgacgtgcg cgcggttcgg gagcttattg agcttcggcg ccgccatccg

1681 gcctttcgca tgcgaagcgc ggaacagatc cggaagcatt tgcggtttga agagggaccg

1741 gcgcacacgg tcgcctacac gctgcgagat cacgccaacg gggaacgtta ccgccacctg

1801 tatgtgctgt atcacgccag gtccggggtg accagacttg ccctgccacc gctgggaagc

1861 tgggagccgg tatttggtgc tgcccatatc gagcatcaga cgagcgatac cttgacggtt

1921 agaggcatcg gaatggtcat tctcggctgt gacaggta

Claims

1.一种普鲁兰酶XWPu2，其特征在于其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一种编码权利要求1所述的普鲁兰酶XWPu2的普鲁兰酶基因XWPu2，其特征在于其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.一种包含权利要求2所述普鲁兰酶基因XWPu2的重组载体。

4.一种包含权利要求2所述普鲁兰酶基因XWPu2的重组菌株。