CN103571862B

CN103571862B - 一种碱性普鲁兰酶的制备方法及应用

Info

Publication number: CN103571862B
Application number: CN201310250392.2A
Authority: CN
Inventors: 周梅先; 陈逍遥; 阮灵伟
Original assignee: Third Institute of Oceanography SOA
Current assignee: Third Institute of Oceanography SOA
Priority date: 2013-06-21
Filing date: 2013-06-21
Publication date: 2015-08-26
Anticipated expiration: 2033-06-21
Also published as: CN103571862A

Abstract

本发明公开了一种碱性普鲁兰酶的制备方法及应用。本发明以好热地芽孢杆菌Geobacillus kaustophilus MCCC1A02570的基因组DNA为模板，设计并合成引物，通过PCR扩增普鲁兰酶基因,将该基因克隆入pET-22b表达载体上，在大肠杆菌E.coli BL21中进行诱导表达，采用Ni-Sepharose亲和层析纯化得到高纯度的重组普鲁兰酶蛋白。该酶的最适温度为70℃，最适pH为8.0，在碱性条件下具有较高的活性和良好的耐热性。该酶的最适底物为普鲁兰糖，并且其水解支链淀粉和糯米淀粉的能力明显高于直链淀粉，显示其具有较好的水解支链的能力。该酶在生产高麦芽糖浆和高葡萄糖浆以及在洗涤剂工业中有潜在的应用前景。

Description

一种碱性普鲁兰酶的制备方法及应用

技术领域

本发明涉及采用基因工程手段获得一种碱性普鲁兰酶及其制备方法，属于生物工程技术领域。

背景技术

淀粉中的葡萄糖残基主要以α-(1,4)糖苷键相连，支链淀粉中平均每24～30个葡萄糖单位中就有一个分支，分支处以α-(1,6)糖苷键相连，α-(1,6)糖苷键约占支链淀粉糖苷键总量的4～6%。工业生产常用的谷类淀粉中，支链淀粉含量高达70～95%。传统的淀粉酶仅能水解α-(1,4)糖苷键，因此在工业生产中无法实现对支链淀粉的高效利用。异淀粉酶能够水解α-(1,6)糖苷键，因此被广泛用于淀粉酶工业中，然而其不能水解由2～3个葡萄糖残基构成的短支链，仍然无法实现对支链淀粉的充分利用。普鲁兰酶不仅能专一性地水解α-(1,6)糖苷键，并且还能将最小单位的支链分解，因此可最大限度地利用淀粉原料。目前普鲁兰酶已被广泛地应用于淀粉糖化、生产高葡萄糖浆、生产高麦芽糖浆、生产环糊精等淀粉加工工业。有报道称鉴于普鲁兰酶具有较强的α-(1,6)糖苷键水解能力，有研究人员正在尝试将普鲁兰酶用于低热量啤酒的生产和牙菌斑的防治以及用作面包制作的抗氧化剂。

到目前为止，全世界用于工业生产的普鲁兰酶主要由丹麦NOVO公司和美国杰能科公司供应，其生产的酸性普鲁兰酶在市场上具有垄断地位。目前我国的普鲁兰酶还仅限于实验室研究，工业生产上严重依赖进口，定价权掌握在少数外国公司手中，导致国内普鲁兰酶价格昂贵。碱性普鲁兰酶在碱性条件下有较稳定的酶活，且耐热性也比较好，可显著提高淀粉原料的利用率。另外，碱性普鲁兰酶还可作为有效添加剂应用于洗涤剂中，从而拓宽了普鲁兰酶在工业生产中的应用。高温碱性普鲁兰酶具有广阔的市场前景，然而其在世界范围内都尚处于研究阶段。

嗜热菌是一类生活在高温环境中的微生物，其产生的高温酶具有很高的热稳定性，是获取高温碱性普鲁兰酶的良好来源。嗜热微生物最适生长温度很高，发酵工艺非常困难，因此利用基因工程技术改造菌株成为生产普鲁兰酶的有效手段。好热地芽孢杆菌（Geobacillus kaustophilus MCCC1A02570）是一株从深海热液口分离得到的嗜热细菌，其最适生长温度为55℃。该菌对极端环境具有较好的适应性，其可在pH2-12、温度5-78℃、盐度0-30%的极端环境中生长。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种高温碱性普鲁兰酶及其制备方法及产品。

该酶的最适温度为70℃，最适pH为8.0，在碱性条件下具有较高的活性和良好的耐热性。

该酶的核苷酸序列如下：（SEQ ID NO1）

1 ATGCTTCACA TCAGCCGAAC GTTTGCCGCC TATTTGGACG AGATGGATCA

51 AATCGTTGTG CTTGCGCCGA AATCGCTCGG CTTTGATGGA ATGGCGCCGT

101 TTACGCTCGT GGCGCCGAGC GGCGAGGAGA TTCCGCTGTC CGTGCAGCAC

151 GTCGAGGATG TTGGGGAGAC GGTGAAATAT GTGTGCCGGT TTGCATCCGC

201 GTTCGAGTTT GGAGCGACAT ACTGGGTGCG TTCTTGCCGC GGGGAGGAGA

251 CCGATGTTCA AATCGGCGCC GTTGTGCGCA CTCCCGCATT TGATGATCGG

301 TTTTTCTATG ATGGGCCGTT AGGAGCGGAG TATTTCAAAG AACAGACCGT

351 ATTTCGCGTC TGGGCGCCGA CCGCCACCGC GGTTAGCGTC AAGCTGGTTC

401 ATCCGCATCT CGACGAGATC CGCTGCGTGC CGCTTGTGCG CGGCGAACGC

451 GGCGTATGGT CAGCCGTCGT CCCCGGCGAT TGGGAGCGAG CGCGTTACAC

501 ATATATCGCC TGCATCAACC GCGTATGGCG CGAGGCGGTG GACCCGTATG

551 CGACCGCGGT TTCGGTCAAT GGCGAGTTCG GCGTCGTGAT CGACTGGGAG

601 AAAACGAAGC TGGCGCCGCC CTCTTTGCCG CTTCCACCGC TCTGTTCGCC

651 GACGGATGCC ATCATTTATG AGCTGAGCAT CCGCGACTTT ACCAGCCACC

701 CGGACAGCGG CGCCGTCCAT AAAGGGAAGT ATCTCGGGCT GGCCGAAACG

751 AACACGAGCG GGCCGAACGG GACGGCCACC GGGCTTTCGT ATGTCAAAGA

801 GCTGGGCGTC ACCCATGTGC AGCTCATGCC GTTTATGGAC TTTGCGGGCG

851 TCGATGAGCG CGACCCACAA GCGGCTTACA ACTGGGGATA CAATCCCCTT

901 CATCTATATG CGCCGGAAGG GAGTTATGCG ACCGATCCAG CGGATCCATA

951 CGCGCGCATT GTAGAATTGA AGCAGGCGAT CCACACGCTG CACGAAAATG

1001 GCTTGCGCGT CGTGATGGAT GCGGTCTACA ACCATGTCTA TGACCGGGAG

1051 CAATCGCCGC TTGAGAAGCT CGTTCCCGGT TATTACTTCC GCTACGACGC

1101 CTATGGCCAA CCGGCCAACG GCACCGGCGT CGGCAACGAC ATCGCTTCGG

1151 AGCGGCGGAT GGCGCGCCGC TGGATCGTCG ATTCGGTGGT GTTTTGGGCG

1201 AAAGAATATG GCATTGACGG GTTCCGCTTT GATTTGATGG GCGTGCACGA

1251 TATCGAGACG ATGAAAGCGG TGCGCGATGC CCTCGACGCC ATCGATCCGT

1301 CGATCCTTGT GTATGGGGAA GGGTGGGATT TGCCGACGCC TCTTCCACCG

1351 GAACAAAAGG CGACGATGGC CAACGCCAAG CAGCTGCCGC GCTTCGCTTA

1401 TTTCAATGAC CGGTTTCGCG ATGCGGTGAA AGGGAGCACC TTTCATTTGC

1451 CGGACCGTGG GTTCGCCCTC GGCAACCCAG GCGGGCGAGA ACAGGTGAAG

1501 CTCGCCATTG CCGGGAGCTT GCGAGCGCTC GGCGGGCTGT TTTGCCACCC

1551 GCGTCAGTCA ATCAATTACG TCGGATGTCA TGACAACCAT ACGTTTTGGG

1601 ATAAGATGGA GGCGGCCAAC CATGATGAGC CGGAATGGCT CCGGAGGAAG

1651 CGGCAAAAGC TGGCGACGGC GATCGTTCTG TTGGCGCAAG GCATTCCGTT

1701 TTTGCACAGC GGCCAAGAGT TTTATCGGAC GAAAGGCGGC GATGGGAACA

1751 GCTACCGATC GCCGGATGCG GTCAATCAGC TGGATTGGGG GCGGAAAAGC

1801 CGCTATGAAG ACGACGTCCG CTACGTTCAA GGATTGATCG CTCTTCGCCG

1851 CGCGCATGGC GCGTTCCGCC TCGCGACGGA AGCGGAAGTG CTGCGTCATT

1901 TCACGTTTCT TGAGCCGCTG CCGCCGTCGG TCATCGCCTA TCGGCTGCAT

1951 GATGTCGCCG TCTATGGGCC TTGGGAGGAC ATCATCGTCG TGCATCATAA

2001 CGAGGAGAAA GAGACAGCTA TTGCGCTCCC CGACGAGCGC GAGTGGGCGG

2051 TTGTATGCGA CGGACAGCGA TGCGGGACAA CGCCCTTTGG CCAAGCGCGC

2101 AGCATGCTTC GGTTCGACGG AGTCGGCACA TGGGTGCTCG TCCATCCTGC

2151 AGGGTGA

该酶的氨基酸序列如下：（SEQ ID NO2）

Met Leu His Ile Ser Arg Thr Phe Ala Ala Tyr Leu Asp Glu Met

Asp Gln Ile Val Val Leu Ala Pro Lys Ser Leu Gly Phe Asp Gly

Met Ala Pro Phe Thr Leu Val Ala Pro Ser Gly Glu Glu Ile Pro

Leu Ser Val Gln His Val Glu Asp Val Gly Glu Thr Val Lys Tyr

Val Cys Arg Phe Ala Ser Ala Phe Glu Phe Gly Ala Thr Tyr Trp

Val Arg Ser Cys Arg Gly Glu Glu Thr Asp Val Gln Ile Gly Ala

Val Val Arg Thr Pro Ala Phe Asp Asp Arg Phe Phe Tyr Asp Gly

Pro Leu Gly Ala Glu Tyr Phe Lys Glu Gln Thr Val Phe Arg Val

Trp Ala Pro Thr Ala Thr Ala Val Ser Val Lys Leu Val His Pro

His Leu Asp Glu Ile Arg Cys Val Pro Leu Val Arg Gly Glu Arg

Gly Val Trp Ser Ala Val Val Pro Gly Asp Trp Glu Arg Ala Arg

Tyr Thr Tyr Ile Ala Cys Ile Asn Arg Val Trp Arg Glu Ala Val

Asp Pro Tyr Ala Thr Ala Val Ser Val Asn Gly Glu Phe Gly Val

Val Ile Asp Trp Glu Lys Thr Lys Leu Ala Pro Pro Ser Leu Pro

Leu Pro Pro Leu Cys Ser Pro Thr Asp Ala Ile Ile Tyr Glu Leu

Ser Ile Arg Asp Phe Thr Ser His Pro Asp Ser Gly Ala Val His

Lys Gly Lys Tyr Leu Gly Leu Ala Glu Thr Asn Thr Ser Gly Pro

Asn Gly Thr Ala Thr Gly Leu Ser Tyr Val Lys Glu Leu Gly Val

Thr His Val Gln Leu Met Pro Phe Met Asp Phe Ala Gly Val Asp

Glu Arg Asp Pro Gln Ala Ala Tyr Asn Trp Gly Tyr Asn Pro Leu

His Leu Tyr Ala Pro Glu Gly Ser Tyr Ala Thr Asp Pro Ala Asp

Pro Tyr Ala Arg Ile Val Glu Leu Lys Gln Ala Ile His Thr Leu

His Glu Asn Gly Leu Arg Val Val Met Asp Ala Val Tyr Asn His

Val Tyr Asp Arg Glu Gln Ser Pro Leu Glu Lys Leu Val Pro Gly

Tyr Tyr Phe Arg Tyr Asp Ala Tyr Gly Gln Pro Ala Asn Gly Thr

Gly Val Gly Asn Asp Ile Ala Ser Glu Arg Arg Met Ala Arg Arg

Trp Ile Val Asp Ser Val Val Phe Trp Ala Lys Glu Tyr Gly Ile

Asp Gly Phe Arg Phe Asp Leu Met Gly Val His Asp Ile Glu Thr

Met Lys Ala Val Arg Asp Ala Leu Asp Ala Ile Asp Pro Ser Ile

Leu Val Tyr Gly Glu Gly Trp Asp Leu Pro Thr Pro Leu Pro Pro

Glu Gln Lys Ala Thr Met Ala Asn Ala Lys Gln Leu Pro Arg Phe

Ala Tyr Phe Asn Asp Arg Phe Arg Asp Ala Val Lys Gly Ser Thr

Phe His Leu Pro Asp Arg Gly Phe Ala Leu Gly Asn Pro Gly Gly

Arg Glu Gln Val Lys Leu Ala Ile Ala Gly Ser Leu Arg Ala Leu

Gly Gly Leu Phe Cys His Pro Arg Gln Ser Ile Asn Tyr Val Gly

Cys His Asp Asn His Thr Phe Trp Asp Lys Met Glu Ala Ala Asn

His Asp Glu Pro Glu Trp Leu Arg Arg Lys Arg Gln Lys Leu Ala

Thr Ala Ile Val Leu Leu Ala Gln Gly Ile Pro Phe Leu His Ser

Gly Gln Glu Phe Tyr Arg Thr Lys Gly Gly Asp Gly Asn Ser Tyr

Arg Ser Pro Asp Ala Val Asn Gln Leu Asp Trp Gly Arg Lys Ser

Arg Tyr Glu Asp Asp Val Arg Tyr Val Gln Gly Leu Ile Ala Leu

Arg Arg Ala His Gly Ala Phe Arg Leu Ala Thr Glu Ala Glu Val

Leu Arg His Phe Thr Phe Leu Glu Pro Leu Pro Pro Ser Val Ile

Ala Tyr Arg Leu His Asp Val Ala Val Tyr Gly Pro Trp Glu Asp

Ile Ile Val Val His His Asn Glu Glu Lys Glu Thr Ala Ile Ala

Leu Pro Asp Glu Arg Glu Trp Ala Val Val Cys Asp Gly Gln Arg

Cys Gly Thr Thr Pro Phe Gly Gln Ala Arg Ser Met Leu Arg Phe

Asp Gly Val Gly Thr Trp Val Leu Val His Pro Ala Gly

本发明的技术方案是：

一种高温碱性普鲁兰酶的制备方法，它的步骤如下：

（1）设计并合成扩增碱性普鲁兰酶基因的引物，其序列如下：

上游引物2570F:5’-CTATCATATGCTTCACATCAGCCGA-3’

下游引物2570R:5’-GTTACTCGAGCCCTGCAGGATGG-3’

（2）PCR扩增及重组质粒的构建：

用2570F和2570R引物，以好热地芽孢杆菌（Geobacillus kaustophilus MCCC1A02570）的基因组DNA为模板进行扩增。PCR扩增条件如下：95℃预变性5min；98℃10s，55℃30s，72℃140s，30个循环。PCR产物经限制性内切酶NdeI和XhoI酶切后被连接到经同样限制性内切酶酶切的表达载体pET-22b上，将连接产物转化大肠杆菌E.coli DH5α受体菌株，筛选含有普鲁兰酶基因的重组质粒，并进行双酶切和测序验证。

（3）普鲁兰酶的表达与纯化

将含有普鲁兰酶基因的重组质粒转化入大肠杆菌E.coli BL21受体菌株，用IPTG诱导普鲁兰酶蛋白表达，采用Ni-Sepharose亲和层析（Ni Sepharose^TM6Fast Flow试剂盒）纯化蛋白，纯化后的普鲁兰酶活力可达21U/mL。纯化后的普鲁兰酶的SDS-PAGE电泳检测结果如图1所示。

本发明的普鲁兰酶具有较宽的pH适用范围，不仅能用于淀粉糖化、生产高麦芽糖浆、生产高葡萄糖浆等淀粉加工工业，同时由于其在高温碱性条件下具有较高的酶活，还可在洗涤剂工业、烘焙食品加工方面进行应用，从而拓宽了普鲁兰酶在工业生产中的应用范围。

附图说明

图1为纯化后的普鲁兰酶蛋白的SDS-PAGE电泳；

图2为不同温度对酶活力的影响；

图3为不同热处理时间对酶活力的影响；

图4为不同pH对酶活力的影响；

图5为酶在碱性条件下的热稳定性检测；

图6为不同金属离子对酶活力的影响；

图7为酶对不同底物水解作用的效果。

具体实施方式

实施例1高温碱性普鲁兰酶的制备

实验材料

好热地芽孢杆菌Geobacillus kaustophilus MCCC1A02570（由中国海洋微生物菌种保藏管理中心保藏，保藏编号为1A02570，可通过购买方式得到），大肠杆菌E.coli DH5α和大肠杆菌E.coil BL21（DE3）（购自Takara公司，由本实验室保藏）；限制性内切酶NdeI、Xho I（购自Thermo公司）；PrimeSTAR HS DNA Polymerase(购自Takara公司)；表达载体pET-22b(购自Merck公司)；T4连接酶（购自Takara公司）；LB培养基（每升含Tryptone10g，Yeast Extract5g，NaCl10g）；结合缓冲液（500mM NaCl,20mM咪唑，20mM磷酸盐，pH7.4）；漂洗缓冲液（500mM NaCl,40mM咪唑，20mM磷酸盐，pH7.4）；洗脱缓冲液（500mM NaCl，500mM咪唑，20mM磷酸盐，pH7.4）；3，5－二硝基水杨酸（DNS）（购自上海生工）；氨苄青霉素（购自上海生工）；Ni Sepharose^TM6Fast Flow试剂盒（购自GE Healthcare公司）；0.22μm细菌过滤器（购自Merck公司）；35kDa超滤管（购自Merck公司）。本专利中使用的含氨苄青霉素的LB培养基，其氨苄青霉素浓度均为100μg/mL。

实验步骤

上游引物2570F：5’-CTATCATATGCTTCACATCAGCCGA-3’

下游引物2570R：5’-GTTACTCGAGCCCTGCAGGATGG-3’

（2）PCR扩增及重组质粒的构建

以好热地芽孢杆菌（Geobacillus kaustophilus MCCC1A02570）基因组DNA为模板，使用2570F和2570R引物进行扩增。扩增体系如下：2570F1μL，2570R1μL，5×PS buffer10μL，dNTP4μL，模板0.5μL，PrimeSTAR HS DNA Polymerase0.5μL，无菌水33μL。扩增条件如下：95℃预变性5min；98℃10s，55℃30s，72℃140s，30个循环。将PCR产物进行胶回收，对pET-22b载体及相应的目的片段用限制性内切酶NdeI和XhoI进行酶切后，用T4连接酶进行连接；将连接产物与受体菌E.coli DH5α感受态混合，冰上放置30min，42℃热激45s后，加入1mL LB液体培养基，37℃、220rpm复苏30min，离心后涂布于含氨苄青霉素的LB固体培养基上，37℃过夜培养，筛选重组质粒，并对重组质粒进行双酶切和测序验证。经过测序即可得到普鲁兰酶的相关核苷酸序列。

（3）基因的诱导表达及粗酶液的制备

将重组质粒转化入E.coli BL21(DE3)中，获得含有普鲁兰酶基因的重组菌株。将重组菌株接种于5mL含氨苄青霉素的LB液体培养基中过夜培养，取2mL过夜培养物按1:100接种于200mL含氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃、220rpm培养至OD₆₀₀为0.6～0.8，加入IPTG使其终浓度为1mM进行诱导，28℃、180rpm条件下继续培养8h，6000g离心5min收集菌体。将菌体重悬于10mL结合缓冲液中，加入溶菌酶至终浓度为1mg/mL，冰上裂解1h后，超声破碎至菌体完全裂解，16000g离心30min，收集上清即得到粗酶液。

（4）酶的纯化

将50mL粗酶液用0.22μm细菌过滤器进行过滤，加入至预先平衡好的His纯化柱NiSepharose^TM6Fast Flow，4℃混匀1h，然后弃去废液。之后用50mL的漂洗缓冲液漂洗两次，每次用量25mL。漂洗结束后用30mL的洗脱缓冲液洗脱三次，每次用量10mL，分批收集洗脱液，对洗脱液进行SDS-PAGE电泳检测其纯度。用35kDa超滤管进行超滤以去除咪唑和高浓度的NaCl，加入10mL Tris-HCl（20mM，pH7.4）缓冲液至超滤后的蛋白溶液中，即得纯化好的酶液。

实施例2

普鲁兰酶的酶学性质

（1）酶的作用温度

将稀释的酶液分别在40℃、50℃、60℃、65℃、70℃、75℃、80℃、90℃下，以100mMTris-HCl缓冲液（pH7.0）配制的1%的普鲁兰糖作为底物进行酶活测定，以最大酶活力为100%，计算不同温度下的相对酶活力。结果表明，在pH为7.0时，该普鲁兰酶的最适作用温度为70℃，结果见图2。

（2）酶的热稳定性

将稀释的酶液分别在65℃和70℃下，分别处理1～4h，再与100mM Tris-HCl（pH7.0）缓冲液配制的1%的普鲁兰糖反应进行酶活测定，以未经热处理的酶的活力为100%，计算不同处理的酶的相对活力。结果表明，该酶在65℃下稳定性较好，在热处理4h后酶活还能保持50%以上，但该酶在70℃下的热稳定性较差，结果见图3。

（3）酶的作用pH

将稀释的酶液在65℃下，以不同pH的100mM Tris-HCl缓冲液配制的1%的普鲁兰糖作为底物进行酶活测定，以最大酶活力为100%，计算不同pH下该酶的相对活力。结果表明，该酶的最适作用pH为8.0，具有较宽的pH适应范围，在pH5～8.5范围内相对酶活力还能保持70%以上，结果见图4。

（4）酶在碱性条件下的热稳定性

将稀释的酶液与等体积的100mM Tris-HCl（pH8.0）缓冲液混合，在65℃下分别处理1～4h，再加入用100mM Tris-HCl（pH8.0）缓冲液配制的1%的普鲁兰糖进行酶活测定，以相同体系中未经热处理的酶的活力为100%，计算不同处理的酶的相对活力。结果表明，该酶在pH8.0下具有较高的热稳定性，结果见图5。

（5）金属离子对酶的作用

在65℃、pH8.0的条件下，在反应体系中加入适量的0.1M的金属离子溶液，使其终浓度达到1.0mM，然后测定酶活，以未添加任何金属离子条件下的相对酶活力为100%，计算不同金属离子影响下的酶的相对活力。结果表明，K⁺(KCl)、Mn²⁺(MnSO₄)对普鲁兰酶有较强的激活作用，Mg²⁺(MgCl₂)对普鲁兰酶有一定的抑制作用，Zn²⁺(ZnSO₄)、Cu²⁺(CuSO₄)对普鲁兰酶有强烈的抑制作用，Ca²⁺(CaCl₂)对酶的活性影响不大。结果见图6。

（6）酶的底物特异性

在65℃、pH8.0的条件下，分别以1%的普鲁兰糖、糯米淀粉、支链淀粉和直链淀粉为底物进行酶活测定，以最大酶活力为100%，计算普鲁兰酶水解不同底物的相对活力。结果表明该酶的最适底物为普鲁兰糖，并且其水解支链淀粉和糯米淀粉的能力明显高于直链淀粉，显示其具有较好的水解支链的能力。

（7）普鲁兰酶活性测定方法

将100μL稀释的酶液和400μL Tris-HCl（100mM，pH8.0）缓冲液配制的1%的普鲁兰糖底物溶液混合，在65℃下反应30min。反应完成后加入1mL DNS试剂，100℃煮沸5min，16000g离心5min后取上清，测定OD₅₅₀值，根据标准曲线计算还原糖量和酶活力。酶活力单位定义：在上述测定条件下，每分钟水解普鲁兰糖产生1μmol还原糖（以葡萄糖计）所需酶量定义为一个酶活力单位（U）。

Claims

1.一种表达普鲁兰酶的核苷酸序列，其特征在于：其核苷酸序列如SEQ ID NO 1所示。

2.一种核苷酸序列，其和权利要求1所述的核苷酸序列互补。

3.一种普鲁兰酶，其特征在于：其氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示。

4.如权利要求3所述的普鲁兰酶在生产高麦芽糖浆和高葡萄糖浆以及在洗涤剂工业中的应用。

5.如权利要求3所述的普鲁兰酶的制备方法，包括如下步骤：

(1)设计并合成扩增碱性普鲁兰酶基因的引物，其序列如下：

上游引物2570F：5’-CTATCATATGCTTCACATCAGCCGA-3’

下游引物2570R：5’-GTTACTCGAGCCCTGCAGGATGG-3’

(2)PCR扩增及重组质粒的构建：

用2570F和2570R引物，以好热地芽孢杆菌Geobacillus kaustophilus MCCC 1A02570的基因组DNA为模板进行扩增；PCR产物经限制性内切酶NdeI和XhoI酶切后被连接到经同样限制性内切酶酶切的表达载体pET-22b上，将连接产物转化大肠杆菌E.coli DH5α，筛选含有普鲁兰酶基因的重组质粒，并进行双酶切和测序验证；

(3)普鲁兰酶的表达与纯化

将含有普鲁兰酶基因的重组质粒转化入大肠杆菌E.coli BL21，用IPTG诱导普鲁兰酶蛋白表达，之后蛋白纯化得到普鲁兰酶。

6.如权利要求5所述的普鲁兰酶的制备方法，其特征在于，步骤(2)PCR扩增条件如下：95℃预变性5min；98℃10s，55℃30s，72℃140s，30个循环。

7.如权利要求5所述的普鲁兰酶的制备方法，其特征在于，纯化蛋白采用Ni-Sepharose亲和层析。